Introduction
Gjentatte transcranial magnetisk stimulering (rTMS), et verktøy for ikke-invasiv hjernestimulering og neuromodulation, er blitt anvendt i behandling av forskjellige tilstander, slik som sentral smerte 1,2, depresjon 3, migrene 4, og til og med slag 5-7. Raskt skiftende elektrisk strøm gjennom spolene på hodet induserer et elektrisk felt på den cerebrale cortex og en resulterende neuronal aktivering. Excitability av hjernebarken kan moduleres av rTMS, som kan vare i mer enn 30 minutter etter stimulering er avsluttet.
Foreslåtte mekanismer av rTMS etter-effekt omfatter langsiktig potense / depresjon-lignende effekt 8, forbigående endring i ionisk balanse 9, og metabolske endringer 10. I tillegg Di Lazzaro et al. antyder at intermitterende theta-burst stimulering påvirker de eksitatoriske synaptiske inngangene til pyramidale veis neuroner, både i den stimulerteog kontralaterale halvkule 11.
Betydelige begrensninger, har imidlertid hindret forskere fra å oversette on-benk bevis for kliniske situasjoner. Først i forrige dyrestudier, ble rTMS brukt for hel-hjerne stimulering 12. Hel-hjernestimulering er ganske forskjellig fra protokollene som brukes i humanstudier 9. Det andre problemet er relatert med stimulering varighet. Dette er i det minste delvis tilskrives det faktum at en effektiv kjølesystemet var utilgjengelig for små spoler i fortiden.
I de senere år har seminale artikler er publisert foreslå måter for å overvinne disse vanskeligheter i rTMS forsøket på små dyr hjernen. Av disse dyremodeller, ble det avslørt at rottehjernen viser også lignende cortical oppstemthet endringer som i menneskelig reaksjon på lavfrekvente rTMS 13. Enda viktigere, cellulære og molekylære mekanismer for rTMS er stadig being undersøkt ved hjelp av dyremodeller av rTMS. Et eksempel på dette er at en distinkt type hemmende interneuron er kjent for å være mest følsomme for periodisk theta burst stimulering 14. Gnager modeller av rTMS, og dermed gi nye muligheter for å utforske mye etterspurte spørsmål om de molekylære grunnlaget for rTMS-induserte endringer. Hvis små dyremodeller av rTMS kan brukes i flere laboratorier, kan det i stor grad akselerere og styrke forskning på dette området.
Vi beskriver nå hvordan du søker rTMS til ensidig halvkule av rottehjerne, en forlengelse av tidligere arbeid 15. Stimulering skapte endringer ble evaluert ved hjelp av mikro-positronemisjonstomografi (PET) og mRNA-mikromatriser å studere rTMS-induserte endringer i stimulert hjernebarken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ved hjelp av dyrene ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Seoul National University Hospital.
1. Forsøksoppsett
- Animal forberedelse
- Tillat Sprague-Dawley-rotter en uke til å tilpasse seg det nye miljøet før start av eksperimentet.
MERK: Selv om åtte uker gamle rotter ble brukt i denne studien, kan en utvikling eller voksen hjerne velges i henhold til forsknings hypoteser.
- Tillat Sprague-Dawley-rotter en uke til å tilpasse seg det nye miljøet før start av eksperimentet.
- Innånding anestesi for induksjon
- Indusere og opprettholde anestesi med 5% og 2% av isofluran oppløst i 40% / 60% og 25% / 75% oksygen / nitrogen via et kammer og nesekjeglen, respektivt. Juster anestesi dybde til nivået avskaffe pedalen tilbaketrekking refleks til tå klype for å bekrefte riktig anesthetization.
MERK: Bruk våknet dyr kan være et bedre valg i translasjonsforskning vilkår, men det er store problemer med å holde under rTMS og thei er utsatt for mye stress. - Overvåke kroppstemperatur med en rektal probe og opprettholde det ved 37 ° C ved hjelp av en homeothermic teppe. Overvåke anestesidybden ved hjelp pedal tilbaketrekking refleks, temperatur, lufthastighet og hjertefrekvens.
- Indusere og opprettholde anestesi med 5% og 2% av isofluran oppløst i 40% / 60% og 25% / 75% oksygen / nitrogen via et kammer og nesekjeglen, respektivt. Juster anestesi dybde til nivået avskaffe pedalen tilbaketrekking refleks til tå klype for å bekrefte riktig anesthetization.
- Omkobling til intravenøs anestesi for vedlikehold
- Forbered halen med en spritserviett. Kateterisere en lateral halevenen med en 24-gauge venekateter for overgang til IV anestesi (figur 1A). Belastning propofol intravenøst (1 mg / kg x min [] i løpet av 10 min, ved bruk av 10 mg / ml emulsjon) til dyrene. Avslutt isofluran 5 min etter start propofol lasting.
- Oppretthold propofol sedasjon med en hastighet på 500 - 700 mikrogram / (kg · min) gjennom hele forsøket, som i en tidligere studie 16. Supplement oksygen på 0,8 l / min via en nesekonus.
MERK: Anestesi med propofol er å redusere potensiell undertrykkelse av kortikal eksitabilitet ved inhalasjon agenten 17-19. Imidlertid er anestesi ikke obligatorisk i rTMS eksperimenter, og våknet dyr kan også anvendes. Anestesimetoder skal avgjøres i betraktning av forskningshypoteser. - Bruk veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Påfør magnetisk stimulering (se section2) 10 min etter fullstendig overgang til iv anestesi.
- Deknings forhold
- Overvåke vitale tegn under restitusjonsfasen. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Hvis et dyr har gjennomgått kirurgi, ikke returnere den til selskap med andre dyr før fullt restituert.
MERK: Hvis kirurgi for en sykdomsmodell er utført, er det nødvendig postoperativ smertebehandling. Imidlertid er smertebehandling ikke er nødvendig for denne rTMS eksperimentet.
- Overvåke vitale tegn under restitusjonsfasen. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Hvis et dyr har gjennomgått kirurgi, ikke returnere den til selskap med andre dyr før fullt restituert.
2. Gjentatte Transkraniell magnetisk stimulering
- Stimulator og spole
- Påfør stimulering ved hjelp av en repeterende stimulator som leverer bifasisk stimuli via en 25 mm figur-åtte coil. Finn midten av spolen 0,5 cm lateralt til topp-punktet på den biauricular linje, og angulate spolen 45 ° til bakken.
MERK: maksimal magnetisk feltstyrke av spolen er 4,0 T. Den magnetiske spole er montert fast på en innebygd i holderen.
- Påfør stimulering ved hjelp av en repeterende stimulator som leverer bifasisk stimuli via en 25 mm figur-åtte coil. Finn midten av spolen 0,5 cm lateralt til topp-punktet på den biauricular linje, og angulate spolen 45 ° til bakken.
- Motor terskel
- Bestem motor terskel (MT) ved hot spot, med sentrum av spolen plassert 0,5 cm lateralt til topp-punktet på den biauricular linje og med den flate flate på calvaria. Dette er den samme metoden som er benyttet i en tidligere studie 20.
MERK: Definer MT som minimum stimulus intensitet fremkaller 5 eller mer håndgripelig sammentrekninger på kontralateral forpoten av 10 påfølgende stimuli. Kontroller om stimulering er primært forårsaker kontralateral muskelkontraksjon å sikre ensidig stimulering. - Bruk av rTMS
- Anvende rTMS 10 min etter stabilisering av dyp anestesi. Plasser midten av spolen på målet rTMS området, valgt fra cerebral cortex avhengig av forskningsspørsmål. Deretter vipper spolen for å sikre direkte kontakt mellom spolen midten og overflaten av kraniet ved stimulering punkt.
MERK: For eksempel vil angulate spolen 45 ° til bakken minimere en potensiell direkte effekt av rTMS på kontralateral cortex (figur 1B og 1C). - Emne dyrene til en økt med 20-min rTMS av den ensidige halvkule. Ved hjelp av programvaren konsollen, levere rTMS med en lav frekvens (1 Hz), høy frekvens (20 Hz), eller sham stimulering protokollen, og sett stimulering intensitet på 100-110% av MT.
- Utfør en Hz stimulering uten hvile. Ved hjelp av programvaren konsollen input "1200" skudd på "20" min). For 20 Hz stimulering, gjennomføre 2 sek av stimulering etterfulgt av 28sek hvile. Ved hjelp av programvaren konsollen input "1600" skudd på "20" min.
- For humbug stimulering, vipp spiral vinkelrett (90 ° rotasjon) til calvaria og plassere spolen kant 2 cm bortsett fra hodeoverflaten (figur 1D). Fest spolen holder fast til hovedapparatet; Det er ikke nødvendig å holde spolen for hånd under forsøket.
MERK: For å kompensere for akustiske og andre ikke-spesifikke effekter, bør distinkte humbug protokoller brukes til forskjellige stimuleringsregimer. For eksempel kan 1-Hz sham stimulering benyttes for 1-Hz-rTMS eksperimenter.
- Anvende rTMS 10 min etter stabilisering av dyp anestesi. Plasser midten av spolen på målet rTMS området, valgt fra cerebral cortex avhengig av forskningsspørsmål. Deretter vipper spolen for å sikre direkte kontakt mellom spolen midten og overflaten av kraniet ved stimulering punkt.
- Kjøle spolen
- Bruk et vannkjølingssystem for å muliggjøre repeterende magnetisk stimulering for mer enn 20 min ved 1- og 20-Hz stimulering frekvenser (figur 2). Sirkulere isete vann som omgir hele lengden av spolen i løpet av forsøket for å hindre overoppheting, selv om temperaturen av spolen eller stimulatoren ikke overvåkes.
MERK: Kommersielt tilgjengelige avkjølte rotte spoler kan også brukes. - Hvis mulig, overvåke spiral temperaturen ved å se på oppvarming måleren av rTMS maskinen. MERK: Det var ingen negative konsekvenser knyttet til rTMS stimulering. Det er imidlertid en potensiell brannskade risiko hvis metall øret identifikasjon koder brukes nær den stimulerende coil.
- Bruk et vannkjølingssystem for å muliggjøre repeterende magnetisk stimulering for mer enn 20 min ved 1- og 20-Hz stimulering frekvenser (figur 2). Sirkulere isete vann som omgir hele lengden av spolen i løpet av forsøket for å hindre overoppheting, selv om temperaturen av spolen eller stimulatoren ikke overvåkes.
3. Micro Positron Emission Tomography
- Animal forberedelse
- Gjennomføre inhalasjonsanastesi for induksjon og iv anestesi for vedlikehold (se trinn 1.2.1 og 1.3.1). Anvende 1-Hz rTMS til et dyr i 10 minutter ved en stimulering intensitet på 100-110% av MT.
- Fem minutter etter endt rTMS stimulering, injiserer en mCi av 2- [18F] fluoro-deoksyglukose (18 FDG) oppløst i 0,5 ml av vanlig saltoppløsning intravenøst ved hjelp av en halevenekateter. Tillat 30 minutter for 18 FDG opptak. MERK: Plasser rotte under bedøvelse under hele mikro-PET eksperiment.
- bilde~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
- Bruk en PET skanner for avbildning av hjernen for å bekrefte den unilaterality av stimulering. Rekonstruere bilder med en 3-D iterativ algoritme. For å vurdere endringer i stoffskiftet indusert av rTMS, identifisere områder av interesse (Rois) i bildene av de tverrgående hjerne §§ 21.
- Aktiv dødshjelp
- Etter å ha utført mikro-PET billeddiagnostikk, avlive rottene i et kammer fylt inn med karbondioksid mens rottene er i dyp anestesi.
4. mRNA Microarray
- Aktiv dødshjelp
- Indusere og opprettholde anestesi med 5% og 2% av isofluran oppløst i 40% / 60% og 25% / 75% oksygen / nitrogen via et kammer og nesekjeglen, respektivt. Bedøve dypt til nivået av avskaffe pedalen tilbaketrekking refleks til tå klype før de blir halshugget.
- Halshogge rottene for eutanasi 5 min etter en økt med 1-Hz rTMS.
- tissue innhøsting
- Legg ut materialer og kirurgiske instrumenter i størrelsesorden bruk, herunder brettet papirhåndklær, et bein rongeur, microscissors, større kirurgiske saks, en microforcep, en nr 10 eller 11 skalpell blad, et lokk 10 cm glass petriskål fylt med is og 1,5 ml rør. Forbered en plastpose for deponering av kadaver.
- Lag en midtlinjen snitt i huden på skallen anterioposteriorly. Rett ut dissekere bløtvev og omkringliggende muskler med kirurgiske sakser, og fjern skallebenet stykke ved hjelp av et bein rongeur. Raskt dissekere den friske hjernen nøye fra skallen. Deretter legge den på is ved hjelp av microforceps og microscissors. Skyll hjernevevet i iskald normal saltløsning.
- Overfør hjernen til tørris umiddelbart, og deretter lagre det ved -80 ° C i et rør inntil videre behandling.
- Tine hjernevevet før innhøsting.
- Plasser hjernen dorsal side opp, og høste hjernevev fra stimulated cerebral cortex (rundt hot spot i den primære motor cortex) på isen ved hjelp av microforceps og microscissors. Sett høstet vev i 1,5 ml tube.
- RNA forberedelse
- Utdrag total RNA fra vevshomogenater bruker lysereagensen 22. Prosessen med DNase fordøyelsen og opprydding prosedyrer. Kvantifisere RNA prøver og aliquoter og lagres ved -80 ° C inntil bruk.
- For kvalitetskontroll, evaluere RNA renhet og integritet ved denaturerende gelelektroforese, ved en OD-forhold på 260: 280, og analysere dem på en kommersielt tilgjengelig analysator.
- Merking og rensing
- Forsterke og rense total RNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig RNA forsterkning kit for å gi biotinylert cRNA. I korthet, revers-transkribere 550 ng total-RNA til cDNA ved hjelp av en T7 oligo (dT) primer. Syntetisere og in vitro transkribere den nest cDNA og merk den med biotin-NTP.
- etter purreduser fuktighet, kvantifisere cDNA ved hjelp av et spektrofotometer.
- Hybridisering og data eksport 23
- Bruke uttrykket beadchip for mRNA-ekspresjon analyse. Hybridiserer de merkede 750-ng cDNA prøvene til hver rotte-12 uttrykk perle array for 16 - 18 timer ved 58 ° C. Gjennomføre deteksjon av matrise signal ved hjelp av streptavidin-Cy3.
- Scan matriser med konfokal skanner. Utfør rekke data eksport prosessering og analyse ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig programvare.
- Bestem motor terskel (MT) ved hot spot, med sentrum av spolen plassert 0,5 cm lateralt til topp-punktet på den biauricular linje og med den flate flate på calvaria. Dette er den samme metoden som er benyttet i en tidligere studie 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Femten 8-ukers gamle Sprague-Dawley hannrotter ble anvendt for en separat inter-rater pålitelighet analyse av MT bestemmelse. Ved hjelp av palpasjon av muskelrykninger, MTS var tilgjengelig i alle rotter og målt som 33,00 ± 4,21% maksimal stimulator utgang (% MSO) og 33,93 ± 0,88% MSO, henholdsvis av to uavhengige forskere. Bland-Altman skjevhet var -0,93, og 95% grensene for avtalen var -9,13 til 7,26%.
I mikro-PET eksperiment på seks 8-ukers gamle rotter (n = 4 i 1-Hz rTMS, og n = 2 i humbug rTMS gruppe), ble opptaket av 18 F-FDG i ROIs beregnes som gjennomsnitt nCi / cc etter kalibrering av både ipsilaterale og kontralaterale cerebral cortex i de samme bildene. Radioaktiviteten i den kontralaterale området ble brukt som en referanse for å normalisere data oppnådd i den ipsilaterale område, og den differensielle opptak forholdet (DUR) ble beregnet.De gjennomsnittlige DURs hentet fra tre påfølgende tverr bilder ble i gjennomsnitt å oppnå DURs for rottene. Dette er den samme metoden som er benyttet i en tidligere studie 21. 18 FDG-PET-bilder viste et samlings økning i glukosemetabolismen i stimulert venstre kortikale området i en-Hz gruppe, støtter unilaterality av rTMS (figur 3).
I mRNA microarray studien ble kvaliteten på hybridisering og generell chip ytelse overvåkes ved visuell inspeksjon av både de interne kvalitetskontroller og rå skannede data. Array-data ble filtrert i henhold til et deteksjons p-verdi på <0,05 (tilsvarende signal-til-støy-forhold) på minst 50% av eksemplene (en høyere signalverdi som var nødvendig for å oppnå et deteksjons p-verdi på <0,05). Den valgte genet signalverdi ble forvandlet av logaritme og normalisert ved hjelp av en quantile metode. Den statistiske betydningen av uttrykket daTA ble bestemt ved hjelp av Mann-Whitney U-test og fold endring, der nullhypotesen var at ingen forskjell mellom en-Hz rTMS (n = 4) og humbug grupper (n = 4). Den falske oppdagelse hastigheten ble kontrollert ved å justere p-verdien ved hjelp av Benjamini-Hochberg algoritme. Etter normalisering og filtrering, mRNAer som viser signifikante differensialuttrykk (| gangers endring | 1,2, p <0,05) ble valgt. Som et resultat av dette uttrykket nivåer av de umiddelbare tidlige gener var signifikant høyere i rTMS gruppen enn i narre gruppe, med uttrykk av Arc, Junb og Egr2 gener oppregulert (Figur 4A).
I tillegg målte vi BDNF mRNA uttrykk i den stimulerte og kontralaterale cortex etter 5 påfølgende dager med 20-min rTMS (n = 5 hver i 1 Hz og 20 Hz-grupper). Etter en-Hz stimulering, BDNF mRNA uttrykk var betydelig higher i den stimulerte cortex enn i den kontralaterale en (figur 4B). Dette avslørte differensial rTMS-induserte endringer i stimulert og kontralaterale cerebral cortex.
Figur 1. Eksperimentelle innstillinger. (A) Et intravenøst kateter blir satt inn i en lateral halevene (pil), og en neseseksjon anvendes for anestesi med isofluran, så vel som for oksygen supplement etter en omkobling til intravenøs propofol. (B ) Dorsal anterolaterale utsikten under rTMS. (C) Dorsal bakre visning. Overflaten av et tall-av-åtte spole er Velvinklete 45 ° i forhold til bakken for å minimalisere den potensielle direkte stimulering av den kontralaterale cortex. (D) En skjematisk illustrasjon av narre rTMS. Spolen er plassert 2 cm vekk fra og vippet vinkelrette (90 ° dreining)til calvaria. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. kjølesystemet benytter en Water-sirkulasjonspumpe med Motor. Ice pakking på kobbertråder av spolen er ikke nødvendig, da kjølesystemet innhylling kabelen av spolen er tilstrekkelig til å kjøle ned varmen som produseres på kobbertråder. Overflaten av spolen er ikke i direkte kontakt med avkjølt vann. Kjølesystemet er aktiv under stimulering økter.
Figur 3. Positron Emission Tomography (PET) Bilde. (A) koronale deler av mikro-PET-bilder aven rotte erholdt ved å anvende 2- [18F] fluoro-deoksyglukose, som viser økt lokal glukosemetabolismen i den stimulerte cortex etter en-Hz rTMS i 10 min ved 100% av MT (piler). (B) Forholdet mellom FDG opptak i stimulert / kontralateral cortex i 1-Hz (n = 4) og sham rTMS gruppe (n = 2). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. mRNA microarray av den umiddelbare Tidlig Gener og BDNF. (A) Arc, Junb, og Egr2 ble uttrykt forskjellig, som ble identifisert på microarray fått 5 min etter en økt med 1-Hz rTMS, bestilt av ganger endring. Uttrykket nivåer av genene var signifikant høyere i rTMS gruppen (n = 4) than i humbug gruppen (n = 4) (p <0,05 med Mann-Whitney U-test), med uttrykk av Arc, Junb, og Egr2 gener oppregulert. (B) Etter 5 dager med 20-min 1-Hz rTMS, BDNF mRNA uttrykk var signifikant høyere i stimulert cortex enn i motsatt side (* p <0,05, Wilcoxon signed-rank test). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedformålet med denne studien var å innføre en dyremodell for ensidige rTMS. Selv om ensidig stimulering er en av de mest grunnleggende egenskapene til menneske rTMS forskning, har mange studier ikke vedtatt det i små dyr. Imidlertid Rotenberg et al., 15 registreres kontralaterale MEPs med stimuleringen av 100% MT ved hjelp av et tall-8 spole med en utvendig lobe diameter på 20 mm, mens stimulering med 112,5% og 133,3% MT produsert ipsilaterale og kontralaterale MEPs. Dette kan være fordi det store induserte elektriske feltet kan påvirke motsatt halvkule. Således er vårt studium en forlengelse av disse tidligere arbeider 15,24, ved å bevege spolen mer sideveis og vippe det å fremheve ensidig stimulering. Hovedmålet med denne studien ble oppnådd fordi vi bekreftet at mikro-PET avdekket en lokal økning i glukosemetabolismen i stimulert hjernebarken etter rTMS (figur 3).
jove_content "> Plassering og vinkling av spolen er viktige skritt i dette eksperimentet. Ensidig stimulering er mulig ved å plassere straffe rTMS Coil 1 cm lateralt for toppunktet på biauricular linje og angulating spolen 45 ° til bakken. Stimulering område kan være forskjellig fra den primære motor cortex (M1), avhengig av tilstanden som forskere ønske å målrette med rTMS. for eksempel, for å lindre depresjon, er dorsolateral prefrontale cortex (DLPFC) stimulert med rTMS, men motoren terskel, hvilken måles også i M1, bestemmer stimulering intensitet selv for DLPFC rTMS Likeledes hotspot -. 0,5 cm lateralt til topp-punktet på den biauricular line - ble anvendt for å bestemme motor terskel i den foreliggende studien flere laterale cortex -. 1 cm lateral til toppunktet - var med vilje valgt å sikre unilaterality stimulering og undersøke rTMS-indusert molekylære endringer. ve_content "> Som for den magnetiske feltstyrke i vevet, i en foregående elementmodellering studie på den induserte elektriske feltet i musehjerne, den induserte elektriske felt ved 70 mm figur 8 spiral ved 75% MSO nådd ca. 150 V / m på hjernens overflate og i cortex. den elektriske feltstyrken falt dramatisk etter hvert som avstanden øker, som viser den maksimale dybde med større enn 100 V / m styrken var bare 1,9 mm til 70 mm figur 8 spole 25. i en annen rotte studie, ved 10 mm dybde reduseres den induserte elektriske feltstyrken til 25% av det på hjernens overflate 26. det er interessant at halv effekt region (HPR) var like bred som ~ 7 x 7 mm (0,51 cm2), selv når en 25- mm figur 8 spiral ble anvendt 25. Selv om konkrete tall ikke ble gitt for 70 mm figur 8 spiral, Salvador og Miranda kommenterte at den HPR til 70 mm spolen var større enn den til 25 mm spolen. Siden vi ønsket å hindre HPR fra dekkerkontralaterale halvkule, valgte vi en plass 1 cm lateralt for midtlinjen. Tilting var uunngåelig for å sikre direkte kontakt mellom spolen midten og overflaten av hodeskallen ved stimulering punkt.Anestesi kan potensielt hemme nevronale eksitabilitet, glukose metabolisme, og genekspresjon. Haghighi et al. avdekket at isofluran ved konsentrasjon på 0,5% betydelig deprimert elektriske transcranial parlamentsmedlemmer er tatt opp fra rotter 17. På den annen side ble MEPs konservert i løpet av propofol infusjon så høyt som 40 mg / [kg · t], med amplituder gjenværende store i rotter 18. I en menneskelig studie ble ingen sammensatte muskelaksjonspotensialer (CMAP) oppdages under isoflurananestesi. Imidlertid, 333 Hz, fire-puls magnetisk stimulering fremkalt CMAP i hypothenar muskelen hos 75% av pasientene, og i den fremre tibiale muskel hos 65% av pasientene, i løpet av propofol anestesi 19. Bruke våknet dyr kan være et bedre valg i Physiological aspekter, men de er ikke lett å holde under rTMS og er utsatt for stressende forhold.
Som feilsøking, en enkel kjøler som brukte en vannsirkulasjonspumpe aktivert oss å forlenge stimulering varighet mer enn 20 min selv på en 20-Hz stimulering frekvens. Dette er viktig fordi det gjør det mulig for så mange stimuleringer som i rTMS protokoller for humane individer. Avkjøling av figur 8 spole med bare en håndholdt iskaldt vann pose var ikke tilstrekkelig til å sikre stimulering av mer enn 20 min. Long rTMS varighet i små dyr vil gi mulighet for grundig undersøkelse av de molekylære mekanismene for rTMS. Kommersielt tilgjengelige avkjølte rotte spoler vil være rimelige alternativer.
Det var flere begrensninger i dette eksperimentet. Først bare en bifasisk puls var tilgjengelig, som var en begrensning av rTMS maskinen vi brukte. Fremtidige studier som undersøker effekten av ulike impulser og kurver vil være nødvendig.For det andre har vi vedtatt en pragmatisk tilnærming til å bestemme motor terskelen ved palpasjon. Selv om denne metoden kan være dårligere enn EMG teknikker når det gjelder nøyaktighet, er det lett reproduserbar og anvendelig til mange forsknings hypoteser. Hvis for eksempel den primære hensikten med en forsker var å undersøke forskjeller mellom den primære motor cortex og tilstøtende subcortices i rTMS-indusert gen eller protein ekspresjon, vil mer nøyaktig bestemmelse av motor terskel være nødvendig. Hvis en forsker, imidlertid ønsket å analysere rTMS-indusert genekspresjonsprofiler i dorsolateral prefrontale kortikale vev, kan den foreliggende pragmatisk tilnærming tilstrekkelig, fordi avstanden og vinkelen mellom målvevet og spolen kan variere noe under bevegelse av spolen fra M1 til DLPFC området. For det tredje, selv om vi ble brukt rTMS på ensidig halvkule av rottehjerne, fortsatt stimulering er ikke så brenn som rTMS i menneskelig forskning. Den induserte sterkt elektrisk field av ~ 0,5 cm2 på mindre enn 10 cm2 av rottehjerneoverflaten synes relativt mer diffuse enn det i den menneskelige hemisfæriske overflate på ~ 2500 cm 2 27. Vi tror imidlertid at modellen presentert heri kan brukes til å belyse de molekylære mekanismer for rTMS ved å tillate analyse av det inter-hemisfærisk forskjell i dets virkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Homeothermic blanket with a rectal probe | Harvard apparatus | 507222F | |
| Isoflurane (Forane sol.) | Choongwae | ||
| Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml) | Claris Lifesciences | ||
| Repetitive magnetic stimulator (Magstim Rapid2) | Magstim Company Ltd | ||
| 25 mm figure-of-8 coil | Magstim Company Ltd | 1165-00 | |
| PET-CT | GE Healthcare | ||
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | (US Patent No. 5,346,994) | |
| RNeasy Lipid Tissue Mini Kit | Qiagen | 74804 | |
| RNeasy Mini Spin Columns | Qiagen | (Mat No. 1011708) | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Ambion Illumina RNA amplification kit | Ambion | ||
| Nanodrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| Illumina RatRef-12 Expression BeadChip | Illumina, Inc. | ||
| Amersham fluorolink streptavidin-Cy3 | GE Healthcare Bio-Sciences |
References
- Lefaucheur, J. P., et al. Neurogenic pain relief by repetitive transcranial magnetic cortical stimulation depends on the origin and the site of pain. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 75 (4), 612-616 (2004).
- Hirayama, A., et al. Reduction of intractable deafferentation pain by navigation-guided repetitive transcranial magnetic stimulation of the primary motor cortex. Pain. 122 (1-2), 22-27 (2006).
- O'Reardon, J. P., et al. Efficacy and safety of transcranial magnetic stimulation in the acute treatment of major depression: a multisite randomized controlled trial. Biol Psychiatry. 62 (11), 1208-1216 (2007).
- Brighina, F., et al. Facilitatory effects of 1 Hz rTMS in motor cortex of patients affected by migraine with aura. Exp Brain Res. 161 (1), 34-38 (2005).
- Lefaucheur, J. P. Stroke recovery can be enhanced by using repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS). Neurophysiol Clin. 36 (3), 105-115 (2006).
- Khedr, E. M., Ahmed, M. A., Fathy, N., Rothwell, J. C. Therapeutic trial of repetitive transcranial magnetic stimulation after acute ischemic stroke. Neurology. 65 (3), 466-468 (2005).
- Fregni, F., et al. A sham-controlled trial of a 5-day course of repetitive transcranial magnetic stimulation of the unaffected hemisphere in stroke patients. Stroke. 37 (8), 2115-2122 (2006).
- Pascual-Leone, A., Valls-Sole, J., Wassermann, E. M., Hallett, M. Responses to rapid-rate transcranial magnetic stimulation of the human motor cortex. Brain. 117 (4), 847-858 (1994).
- Ridding, M. C., Rothwell, J. C. Is there a future for therapeutic use of transcranial magnetic stimulation). Nat Rev Neurosci. 8 (7), 559-567 (2007).
- Valero-Cabre, A., Payne, B. R., Pascual-Leone, A. Opposite impact on 14C-2-deoxyglucose brain metabolism following patterns of high and low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation in the posterior parietal cortex. Exp Brain Res. 176 (4), 603-615 (2007).
- Di Lazzaro, V., et al. The physiological basis of the effects of intermittent theta burst stimulation of the human motor cortex. J Physiol. 586 (16), 3871-3879 (2008).
- Post, A., Keck, M. E. Transcranial magnetic stimulation as a therapeutic tool in psychiatry: what do we know about the neurobiological mechanisms. J Psychiatr Res. 35 (4), 193-215 (2001).
- Muller, P. A., Dhamne, S. C., Vahabzadeh-Hagh, A. M., Pascual-Leone, A., Jensen, F. E., Rotenberg, A. Suppression of motor cortical excitability in anesthetized rats by low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation. PLoS One. 9 (3), 91065 (2014).
- Funke, K., Benali, A. Modulation of cortical inhibition by rTMS - findings obtained from animal models. J Physiol. 589 (18), 4423-4435 (2011).
- Rotenberg, A., et al. Lateralization of forelimb motor evoked potentials by transcranial magnetic stimulation in rats. Clin Neurophysiol. 121 (1), 104-108 (2010).
- Beom, J., Kim, W., Han, T. R., Seo, K. S., Oh, B. M. Concurrent use of granulocyte-colony stimulating factor with repetitive transcranial magnetic stimulation did not enhance recovery of function in the early subacute stroke in rats. Neurol Sci. 36 (5), 771-777 (2015).
- Haghighi, S. S., Green, K. D., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26, 993-997 (1990).
- Fishback, A. S., Shields, C. B., Linden, R. D., Zhang, Y. P., Burke, D. The effects of propofol on rat transcranial magnetic motor evoked potentials. Neurosurgery. 37 (5), 969-974 (1995).
- Rohde, V., Krombach, G. A., Baumert, J. H., Kreitschmann-Andermahr, I., Weinzierl, M., Gilsbach, J. M. Measurement of motor evoked potentials following repetitive magnetic motor cortex stimulation during isoflurane or propofol anaesthesia. Br J Anaesth. 91 (4), 487-492 (2003).
- Lee, S. A., Oh, B. M., Kim, S. J., Paik, N. J. The molecular evidence of neural plasticity induced by cerebellar repetitive transcranial magnetic stimulation in the rat brain: a preliminary report. Neurosci Lett. 575, 47-52 (2014).
- Fu, Y. K., et al. Imaging of regional metabolic activity by (18)F-FDG/PET in rats with transient cerebral ischemia. Appl Radiat Isot. 67 (18), 1743-1747 (2009).
- Silveyra, P., Catalano, P. N., Lux-Lantos, V., Libertun, C. Impact of proestrous milieu on expression of orexin receptors and prepro-orexin in rat hypothalamus and hypophysis: actions of Cetrorelix and Nembutal. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292 (3), 820-828 (2007).
- Zidek, N., Hellmann, J., Kramer, P. J., Hewitt, P. G. Acute hepatotoxicity: a predictive model based on focused illumina microarrays. Toxicol Sci. 99 (1), 289-302 (2007).
- Hsieh, T. H., Dhamne, S. C., Chen, J. J., Pascual-Leone, A., Jensen, F. E., Rotenberg, A. A new measure of cortical inhibition by mechanomyography and paired-pulse transcranial magnetic stimulation in unanesthetized rats. J Neurophysiol. 107 (3), 966-972 (2012).
- Salvador, R., Miranda, P. C. Transcranial magnetic stimulation of small animals: a modeling study of the influence of coil geometry, size and orientation. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 674-677 (2009).
- Parthoens, J., Verhaeghe, J., Servaes, S., Miranda, A., Stroobants, S., Staelens, S. Performance Characterization of an Actively Cooled Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation Coil for the Rat. Neuromodulation. , (2016).
- Toro, R., et al. Brain size and folding of the human cerebral cortex. Cereb Cortex. 18 (10), 2352-2357 (2008).
