Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

استخدام البطارية من الطرق الكيميائية والسمية الإيكولوجية لتقييم فاعلية عمليات معالجة مياه الصرف الصحي لإزالة استروجين الفعالية

Published: September 11, 2016 doi: 10.3791/54243
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute of Environment Health and Societies, Brunel University London, 2Department of Chemistry, Carnegie Mellon University

Summary

الغدد الصماء المركبات (EDC) تشكل خطرا كبيرا على البيئة المائية. محطات معالجة مياه الصرف الصحي البلدية المساهمين في قوة استروجين من المياه السطحية. منهجية المنصوص عليها في هذه الورقة يسمح لتقييم فعالية وملاءمة عمليات معالجة مياه الصرف الصحي، فيما يتعلق بسحب EDC.

Introduction

المخاوف بشأن الآثار الضارة للمركبات الغدد الصماء على الحياة البرية في مجال الصحة الإنجابية وأدى الاتحاد الأوروبي لوضع اثنين من المواد استروجين (استراديول وايثينيل استراديول) على "قائمة المراقبة" تحت الإطار التوجيهي للمياه (WFD). EDC تشمل مجموعة متنوعة من فئات الكيميائية، بما في ذلك الاستروجين الطبيعية والاصطناعية الستيرويد، والأدوية، والمبيدات الحشرية، والمواد الكيميائية الصناعية ومكونات المنتجات الاستهلاكية مع الآثار السلبية المعروفة على الحياة البرية. بعض هذه المركبات قد يحتمل أن تؤثر على الصحة البشرية 1.

وقد أظهرت الأبحاث أن مياه الصرف من محطة معالجة مياه الصرف هي استروجين لصيد السمك (2) ونتيجة لذلك العديد من المياه المستقبلة أيضا استروجين لصيد السمك 3. وقد تجلى ذلك أولا من خلال المسوحات الوطنية في المملكة المتحدة والتي أظهرت زيادة تركيزات vitellogenin (أ الإناث محدد البروتين صفار السلائف 4) في الدم من الذكور الاسماك البرية وقبل ارتفاعالتكافؤ من ثنائيي (وضع البيض و / أو القنوات التناسلية للإناث في الخصية من الأسماك الذكور) في أنواع الأسماك كثير البيض عادة 5،6.

معالجة مياه الصرف الصحي التقليدية هي عملية من ثلاث مراحل تتكون من الفحص الأولي تليها المعالجة الأولية والثانوية التي يزيل المنحل والمواد العالقة العضوية على حد سواء. فعالية إزالة الفردية EDC تعتمد على الخصائص الفيزيائية للمواد وعلى فعالية عملية المعالجة المطبقة. بالنسبة لكثير من إزالة EDC عبر الامتزاز والتدهور البيولوجي يمكن أن تكون كبيرة ولكن غير مكتملة. المعالجة الثلاثية، مثل ترشيح الرمل، يمكن أن تكون فعالة في زيادة إزالة EDC 7 في حين معالجة متقدمة باستخدام الأكسدة المتقدمة (على سبيل المثال الأوزون) أو الكربون المنشط يمكن أن تكون فعالة في تحقيق الإزالة الكاملة بالقرب 7.

تقييم أي تكنولوجيا جديدة لمعالجة مياه الصرف الصحي نيس لتحديد مدى فعالية العملية المقترحة في إزالة EDC. بطارية من الاختبارات، بما في ذلك التحليل الكيميائي المستهدفة إلى جانب اختبار السمية الإيكولوجية، وذلك باستخدام المجراة في اختبارات بيولوجية المختبر، وتوفر بيانات شاملة لهذا الغرض. على الرغم من المفيد جدا لأغراض تنظيمية، أن التحليل الكيميائي المستهدفة فقط توفير بيانات عن المركبات (ونواتج محددة) رصدها. اختبارات بيولوجية تسمح بالإضافة إلى "الكشف" من الآثار السلبية لنواتج الأيض ولدت معالجة مياه الصرف الصحي التحول من المنتجات التي لولاها يمكن كشفها 8،9. وتصف هذه الورقة استخدام بطارية من فحوصات مختبر السمية الكيميائية وتقييم فعالية عدد من عمليات معالجة مياه الصرف الصحي المتقدمة والناشئة في إزالة قوة استروجين من النفط الخام ومياه الصرف الصحي المعالجة والمياه المستقبلة.

Protocol

بيان الأخلاق: وقد تمت الموافقة على بروتوكولات لتقييم الغدد الصماء النشاط من المواد الكيميائية / مخاليط في الأسماك رعاية الحيوان جامعة برونيل في لندن والأخلاقي مراجعة الجسم (AWERB) ومن قبل وزارة الداخلية في المملكة المتحدة تحت الحيوانات (الإجراءات العلمية) لسنة 1986.

جمع العينات 1. المياه والمحافظة واستخراج

  1. جمع العينات وحفظها
    1. قبل الاستخدام، وتنظيف الزجاجات مع سطح مناسب عامل تنظيف النشط. بعد التنظيف، وشطف زجاجات المياه، واستنزاف وجافة.
    2. جمع العينات في عبوات زجاجية من سعة 2-L تحتوي على المواد الحافظة التي تتكون من 0.5 غرام من النحاس (II) نترات و 6 مل من 3.6 M محلول حمض الهيدروكلوريك. تخزين العينات أقل من 10 درجة مئوية. استخراج وتحليل في أقرب وقت ممكن لجمع وحفظ التالية.
  2. استخراج عينة وتنظيف (لتحليل هرمون الاستروجين الستيرويد) 10
    1. الصلب المرحلة استخراج (SPE)
      1. قبل استخراج، للحد من المواد الصلبة العالقة، وعينات تصفية المياه باستخدام 1 ميكرون حجم المسام رقة الترشيح.
        1. مرة واحدة تصفيتها، وعينات ارتفاع مع معيار الداخلية بإضافة 100 ميكرولتر من ارتفاعه بالديوتيريوم المحلول القياسي الداخلي تحتوي على 2،4،16،16-د 4 -estrone: 2،4،16،16-د 4 -17β استراديول (E2) : و2،4،16،16-د 4--17α ايثينيل استراديول (EE2) (كل في 40 ميكروغرام / لتر في الميثانول) إلى 1000 مل النفايات السائلة (أو 100 مل مؤثر) مما أدى إلى ارتفاع الداخلي من 2 نانوغرام / لتر من مياه الصرف الصحي عينات النفايات السائلة، و 20 نانوغرام / لتر لعينات مؤثر مياه الصرف الصحي.
      2. إرفاق بطانات المتاح صمام، وخراطيش SPE الستايرين ثنائي الفاينيل البنزين، والخزانات خرطوشة لجهاز SPE. وختم كاف التبديل على مضخة فراغ لاختبار المعدات.
      3. ماصة 5 مل من خلات الإيثيل في كل خزان، إلى حالة من الخراطيش. التبديل على مضخة فراغ (إلى أقل من 10 بوصة زئبقية السماح لمعدل تدفق أقل من 10 مل في الدقيقة)ومن خلال سحب السائل. لا تدع خراطيش SPE تجف. كرر العملية مع 5 مل من الميثانول تليها 5 مل من الماء.
      4. ملأ كل خزان خرطوشة مع الماء والاتصال 1/8 "أنابيب PTFE بين الخزانات خرطوشة وزجاجات عينة الزجاج. التبديل على فراغ بمعدل تدفق أقل من 10 مل في الدقيقة الواحدة، والسماح للعينة كلها بالمرور عبر خرطوشة. تفريغ القارورة النفايات عند الضرورة.
      5. تجف تماما وخراطيش SPE تحت فراغ (أو باستخدام الهواء أو النيتروجين) وحتى محتويات خرطوشة تغيير اللون (على سبيل المثال، من البني الداكن إلى البني الفاتح).
      6. وضع نظيفة وجافة 10 مل قارورة جمع الزجاج في الرف ومكان داخل متعددة الاستخراج. تأكد من أن كل بطانة فوق قارورة. ماصة 8 مل من ثنائي كلورو ميثان في كل خزان عينة، والتبديل على مضخة فراغ (معدل تدفق أقل من 10 مل في الدقيقة) وسحب السائل من خلال في قارورة جمع.
      7. إزالة 10 مل قارورة من مشعب SPEواستخدام مكثف للحد من حجم 1 مل. نقل كل عينة في قارورة لصناعة السيارات في أخذ العينات ومزيد من التركيز إلى 100 ميكرولتر باستخدام النيتروجين تفجير أسفل المعدات.
    2. الههلامي (المؤتمر الشعبي العام) تنظيف
      1. ضخ 95 ميكرولتر من استخراج عينة مزال في HPLC المؤتمر الشعبي العام مجهزة باستخدام الشروط المبينة في الجدول 1. التركيز المؤتمر الشعبي العام استخراج وصولا الى 200 ميكرولتر باستخدام مكثف والنيتروجين ضربة أسفل الجهاز ثم جعل تصل إلى 2.0 مل مع الهكسان.
    3. SPE تنظيف
      1. إرفاق بطانات المتاح صمام، وخراطيش أمينو، والخزانات خرطوشة لمشعب SPE. وضع نظيفة وجافة 10 مل قارورة جمع الزجاج في الرف ومكان داخل متعددة الاستخراج. ماصة 2 مل من الهكسان في كل خزان، إلى حالة من الخراطيش. تسمح للسائل بالمرور الخراطيش.
      2. ماصة العينة استخراج المؤتمر الشعبي العام في الخزان، ومرة ​​أخرى تسمح للسائلتمر عبر خرطوشة. جمع شطافة عينة في القارورة وإزالة من مشعب. لا تجاهل شطافة.
      3. وضع نظيفة وجافة 10 مل جمع قارورة جديدة في رف وتضع داخل استخراج متعددة. لغسل خرطوشة، إضافة 2 مل من خلات الإيثيل في الهكسان (30٪ ت / ت) إلى الخزان وسحب السائل من خلال خرطوشة. كرر مع مزيد من 2 مل من خلات الإيثيل في الهكسان، ونبذ كل غسل.
      4. وضع الأصلي 10 قارورة مل جمع (الخطوة 1.2.3.2) مرة أخرى في رف داخل متعددة الاستخراج. ماصة 2 مل من خلات الإيثيل في الأسيتون (50٪ ت / ت) في الخزان، والتبديل على مضخة فراغ (إلى أقل من 2 بوصة زئبقية السماح لمعدل تدفق أقل من 2 مل في الدقيقة) وسحب السائل من خلال في قارورة . كرر هذه العملية مع 2 مل أخرى من خلات الإيثيل.
      5. إزالة قارورة العينة واستخدام مكثف للحد من حجم استخراج إلى 1 مل. نقل العينة إلى قارورة زجاجية صغيرة وتستخدم النيتروجين تفجير أسفل المعدات، لتتبخر ركان استخراج إلى جفاف بدايته.
      6. إضافة 100 ميكرولتر من الميثانول وتخلط جيدا. نقل استخراج لصناعة السيارات في العينات قارورة (مع 0.3 مل إدراج) ولحد القارورة. تحليل العينات باستخدام LCMS / MS (انظر القسم 2).
عمود: PL هلام، 50 أ، 300 × 7.5 مم، 5 ميكرون
العمود الحرس: PL هلام، 50 × 7.5 مم، 5 ميكرون
طور متحرك: ثنائي كلورو ميثان
معدل التدفق: 1 مل لكل دقيقة
درجة حرارة العمود: 25 ° C
الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن: 210 نانومتر
حجم الحقن: 95 ميكرولتر
وضع حقن: موقفارض
رسم السرعة: 500 مل لكل دقيقة
إخراج سرعة: 500 مل لكل دقيقة
رسم موقف: 3 مم
جزء جمع: 3 مل جزء (7-10 دقيقة) في 10 مل قارورة

الجدول 1. الشروط والمعايير لالههلامي (المؤتمر الشعبي العام) تنظيف عينات مياه الصرف الصحي المستخرج. تفاصيل الجدول العمود المؤتمر الشعبي العام، الطور المتحرك، ودرجة الحرارة، وحجم الحقن، وكشف عن الطول الموجي.

  1. استخراج عينة (للشاشة الخميرة الاستروجين)
    1. مرشح العينات ومفصلة في القسم 1.2.1.1. إرفاق بطانات المتاح صمام، وخراطيش C18 SPE، والخزانات خرطوشة لجهاز SPE. مختومة التبديل على مضخة فراغ لاختبار المعدات على نحو كاف.
    2. ماصة 5 مل الميثانول في كل خزان، إلى حالة من C18 خراطيش. بدوره على فراغ (إلى حوالي 5 بوصة زئبقية للسماح لتدفق حوالي 5 مل في الدقيقة الواحدة) والسماح للتشغيل السائل، من خلال التوقف لمدة 1 دقيقة في منتصف الطريق من خلال. لا تدع خراطيش تجف. كرر العملية مع أي HPLC الصف أو الماء المقطر مزدوجة ([ده 2 O). مرة أخرى لا تجف.
    3. استخراج عينات من المياه كما هو موضح في القسم 1.2.1.4. مواصلة فراغ لا يقل عن 30 دقيقة حتى يجف تماما الخراطيش.
    4. وضع نظيفة وجافة قارورة جمع 10 مل إلى رف في مشعب الاستخراج. تأكد من أن كل بطانة فوق قارورة. إضافة 5 مل من الميثانول لكل خزان. بدوره على فراغ (التدفق الأقصى من 5 مل / دقيقة) وتسمح للسائل بالمرور خرطوشة في قارورة، والتوقف لمدة 2 دقيقة في منتصف الطريق من خلال.
    5. قبل التحليل باستخدام شاشة نعم، والحد من استخراج للجفاف بدايته باستخدام النيتروجين وإعادة مع 500-1،000 الايثانول ميكرولتر. ختم الأغطية من قوارير عينة لتجنب التبخر والحفاظ على 4 درجات مئوية (في خالية من شرارةثلاجة).

2. التحليل الكيميائي عن طريق LCMS / MS

  1. تحسين ظروف تشغيل النظام LCMS / MS باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.
  2. تحليل حلول المعايرة القياسية، مقتطفات عينة، فارغة والتحليلية لمراقبة الجودة عينات (AQC) باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة والظروف مطياف الكتلة، ورصد التحولات أيون كما هو موضح في الجدول رقم (2). تحديد تركيز هرمون الاستروجين الستيرويد في استخراج عينة باستخدام داخلي المعايير 10.
يمكننا تعريف
اللوني السائل
عمود: C18 (2)، 150 × 4.6 مم، 5 ميكرون.
حجم الحقن: 20 ميكرولتر
تدفق: 0.5 مل في الدقيقة الواحدة.
Mالمرحلة obile: والمذيبات: الماء الذي يحتوي على 0.1٪ الأمونيا.
المذيبات ب: الأسيتونتريل.
برنامج التدرج:
الوقت (دقيقة) 0 10 18 24 28
A: B نسبة المذيبات 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00
قياس الطيف الكتلي
مصدر: Electrospray (الأيونات السالبة)
الغاز ومصدر: الوغد: 20 رطل، GS1: 70 رطل، GS2: 30 رطل
تيم: 600 درجة مئوية والغاز CAD 5 و IonSpray الجهد -900
التحولات MRM:
E1: 269/145 و 269/143
E2: 271/145 و 271/143
EE2: 295/145 و 295/143
E1-D4: 273/147
E2-D4: 275/147
EE2-D4: 299/145

الجدول 2. تفاصيل المعلمات والشروط اللازمة لتحليل محتوي التعليم / MS من هرمون الاستروجين الستيرويد في مقتطفات مياه الصرف الصحي. ويبين الجدول حجم حقن عينة ومعدل التدفق، وظروف المرحلة النقالةالثانية التدرج.

3. استروجين آخر عن طريق في المختبر شاشة الخميرة الاستروجين (YES) الفحص 8

  1. إعداد وتخزين مكونات المتوسطة والمتوسطة الحد الأدنى حسب الجدول 3 (أ) إلى (ز).
(أ) متوسط ​​الحد الأدنى (درجة الحموضة 7.1):
إعداد الحديد 2 (SO 4) 3 الحل بإضافة 40 ملغ من الحديد 2 (SO 4) 3 إلى 50 مل من الماء المقطر المزدوج ([ده 2 O)
إضافة 1 L ده 2 O إلى دورق زجاجي 2 L
إضافة المكونات التالية لالدورق:
13.61 ز KH 2 PO 4
1.98 ز (NH 4) 2 SO 4
4.2 ز KOH
0.2 ز MgSO 4
1 مل من الحديد 2 (SO 4)
50 ملغ L-ليسين
50 ملغ L-الحامض الاميني
50 الأدينين ملغ
20 ملغ L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك
20 ملغ L-ميثيونين
30 ملغ L-التيروزين
30 ملغ L-يسوليوكيني
30 ملغ L-ليسين، حمض الهيدروكلوريك
25 ملغ L-الفنيل الأنين
حمض 100 ملغ L-الجلوتاميك
150 ملغ L-حمض أميني أساسي
375 ملغ L-سيرين
ضع الكأس على النمام ساخنة مع برغوث المغناطيسي ويحرك حتى يذوب كل شيء
تأكد من أن الرقم الهيدروجيني 7.1 وضبط إذا لزم الأمر
استخدام 50 مل محقنة معقمة الاستغناء عن 45 مل قسامات في قناني زجاجية مع أعلى الجفن المسمار المعدني
تعقيم متوسط ​​الحد الأدنى في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 10 دقيقة في الأوتوكلاف
تخزين في درجة حرارة الغرفة
(ب) د - (+) - الجلوكوز:
إعداد 20٪ ث / الحل الخامس في [ده 2 O
الاستغناء عن 20 مل قسامات في لقوارير الزجاج مع أعلى الجفن المسمار المعدني
تعقيم الحل الجلوكوز في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 10 دقيقة في الأوتوكلاف
تخزين في درجة حرارة الغرفة
(ج) L-الأسبارتيك حمض:
جعل حل الأسهم من 4 ملغ / مل في ده 2 O
الاستغناء عن 20 مل قسامات في لقوارير الزجاج مع أعلى الجفن المسمار المعدني
تعقيم الحل L-الأسبارتيك حمض في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 10 دقيقة في الأوتوكلاف
تخزين في درجة حرارة الغرفة
(د) فيتامين الحل:
يعد حل البيوتين بإضافة 2 ملغ من البيوتين إلى 100 ​​مل من ده 2 O
تزن من 8 الثيامين ملغ، 8 البيريدوكسين ملغ و 8 ملغ حامض البانتوثنيك، 40 ملغ إينوزيتول. إضافة جميع المكونات الجافة و 20 مل من محلول البيوتين إلى 180 مل ده 2 O
جعل 10 مل قسامات معقمة من خلال تصفية من خلال 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية المتاح في زجاجات زجاجية معقمة، في خزانة تدفق الهواء الصفحي
تخزينها في 4 درجة مئوية
(ه) L-ثريونين:
إعداد 100 مل من 24 ملغ / مل L-ثريونين في ده 2 O
الاستغناء عن 10 مل قسامات في لقوارير الزجاج مع أعلى الجفن المسمار المعدني
تعقيم الحل L-ثريونين على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 10 دقيقة في الأوتوكلاف
تخزين في درجة حرارة الغرفة
إعداد 25 مل من 20 ملي النحاس (II) محلول كبريتات في [ده 2 O
جعل 5 مل قسامات معقمة من خلال تصفية من خلال 0.2 ميكرومتر حجم المسام مرشح في زجاجات زجاجية معقمة، في مجلس الوزراء تدفق الصفحي
تخزين في درجة حرارة الغرفة
(ز) الكلورية الأحمر β-D-galactopyranoside (CPRG):
إعداد 25 مل من حل 10 ملغ / مل من CPRG في ده 2 O
جعل 5 مل قسامات معقمة من خلال تصفية من خلال 0.2 ميكرومتر حجم المسام مرشح في زجاجات زجاجية معقمة، في مجلس الوزراء تدفق الصفحي
تخزينها في 4 درجة مئوية

الجدول 3. الخميرة الاستروجين شاشة الفحص. إعداد وتخزين مكونات المتوسطة والمتوسطة الحد الأدنى.

  1. إعداد وتخزين المنتجاتجنرال الكتريك من 10X الثقافة الخميرة المركزة
    1. في يوم 1، وإعداد متوسط ​​النمو (كما هو مفصل في 3.4.1) وتصب في قارورة المخروطية العقيمة. إضافة 125 ميكرولتر من 10X الخميرة يتركز من قارورة المبردة المخزنة في -20 درجة مئوية. احتضان وسائل الإعلام تلقيح عند 28 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 24 ساعة على شاكر المداري.
    2. في يوم 2، وجعل زجاجتين من متوسط ​​النمو (~ 50 مل)، وتصب في قوارير معقمة المخروطية منفصلة. إضافة 1 مل من 24 ساعة الخميرة مثقف في كل قارورة من وسائط النمو. احتضان وسائل الإعلام تلقيح عند 28 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 24 ساعة على شاكر المداري.
    3. في يوم 3، وتصب كل ثقافة على مدار 24 ساعة في أنبوب العقيمة الطرد المركزي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 50 مل أنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 2000 ز س. تخلصي من طاف وإعادة تعليق كل بيليه في 5 مل من الحد الأدنى من المتوسط ​​مع 15٪ الجلسرين. جعل 0.5 مل aliquots من ثقافة الخميرة المركزة 10X في cryovials معقمة وتخزين 1.2 مل في -20 درجة مئوية لمدة أقصاها 4 أشهر.
  2. استعداداتالتموينية وتخزين مخزون المواد الكيميائية لمنحنيات القياسية
    1. شطف جميع الأواني الزجاجية وملاعق مرتين مع الإيثانول المطلق وتترك لتجف قبل الاستخدام لإزالة أي آثار الملوثات.
    2. تزن E2 مباشرة في قارورة زجاجية في مجلس الوزراء وزنها مسحوق وضبط تركيز من حيث الحجم في الايثانول المطلق. تمييع إلى تركيز 2x10 -7 م (54.48 ميكروغرام / لتر). ختم غطاء وتخزينها في 4 درجات مئوية (في الثلاجة خالية من شرارة).
  3. منتج الفحص
    1. في اليوم 0، وإعداد المتوسطة النمو. لزجاجة 45 مل من الحد الأدنى من المتوسط ​​إضافة 5 مل من محلول الجلوكوز، 1.25 مل من محلول حمض الأسبارتيك L، و 0.5 مل من محلول فيتامين، 0.4 مل L-ثريونين حل، و 125 النحاس ميكرولتر (II) محلول كبريتات. صب متوسط ​​النمو في قارورة المخروطية العقيمة.
      1. إضافة 125 ميكرولتر من 10X الأسهم المركزة (يذوب الثلج من -20 ° C تخزين) إلى القارورة واحتضان وسائل الإعلام الملقحة عند 28 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 24 ساعة على شاكر المداري.
    2. في يوم 1، تسمية العقيمة 96-جيدا 'لوحة التخفيف "وجعل التخفيفات التسلسلية (100 مجلدا ميكرولتر في الإيثانول) من E2 المنحنى القياسي والكيميائية اختبار (ق) / استخراج النفايات السائلة (ق) (على سبيل المثال، EE2).
    3. تسمية العقيمة 96-جيدا مسطحة بصريا أسفل "لوحة فحص (ق)" عيار مكروي. على كل لوحة تشمل الفراغات (زائد / ناقص مذيب) ومنحنى القياسية E2، بالإضافة إلى صفوف الكيميائية اختبار (ق) / استخراج النفايات السائلة (ق).
    4. ماصة 10 ميكرولتر من كل تركيز (E2 أو كيميائية أو استخراج) في البئر المناسب لوحة الفحص. ماصة 10 ميكرولتر من الايثانول في كل بئر "المذيبات فارغ" من لوحة الفحص. ترك لوحة الفحص مع الغطاء لتتبخر للجفاف.
    5. جعل زجاجة من متوسط ​​النمو (~ 50 مل)، وإضافة 0.5 مل من الكلورية الأحمر β-D-galactopyranoside (CPRG) حل في زجاجة. تحديد كثافة خلايا الخميرة في الثقافة على مدار 24 ساعة من خلال قياس العكارة للثقافة في 620 نانومتر في قارئ لوحة. تحصين لمتوسطة ssay مع 4x10 خلايا الخميرة 7 من الثقافة 24 ساعة.
    6. صب المتوسطة فحص تلقيح في الحوض الصغير العقيمة. باستخدام ماصة متعدد القنوات إضافة 200 ميكرولتر من المتوسطة فحص تلقيح إلى كل بئر من لوحة فحص 96-جيدا.
    7. وضع غطاء على لوحة فحص 96-جيدا وختم حواف مع الشريط. يهز لوحة فحص (ق) بقوة لمدة 2 دقيقة على شاكر لوحة عيار واحتضان عند 32 درجة مئوية في مجلس الوزراء التدفئة بشكل طبيعي التهوية.
    8. في يوم 2، يهز لوحة فحص (ق) بقوة على شاكر لوحة عيار لمدة 2 دقيقة. العودة إلى 32 درجة مئوية الحاضنة.
    9. في يوم 4، يهز لوحة فحص (ق) بقوة لمدة 2 دقيقة على شاكر لوحة عيار. ترك لوحة (ق) على الوقوف لحوالي 1 ساعة ثم قراءة لوحة فحص (ق) في أحد الامتصاصية من 540 نانومتر (الامتصاصية الأمثل لCPRG ~ 575 نانومتر) و 620 نانومتر (التعكر) باستخدام قارئ لوحة. ترك لوحة (ق) في درجة حرارة الغرفة، وقراءة في وقت لاحق إذا لزم الأمر.
  4. حسابات النشاط استروجين <رأ>
  5. القراءات الصحيحة فحص لتعكر باستخدام المعادلة التالية: تصحيح قيمة = عينة أو معيار (E2) الامتصاصية في 540 نانومتر - [نموذج أو معيار (E2) الامتصاصية في 620 نانومتر - الامتصاصية فارغة في 620 نانومتر]. مؤامرة E2 منحنى القياسية مع الفراغات المناسبة (للتحقق من التلوث) 8.
  6. استخدام نموذج تصحيح (مقتطف أو كيميائية) لحساب "المعادل استراديول. استخدام تآمر E2 القيم المنحنى القياسي ومعادلة الانحدار (3-المعلمة متعدد الحدود أو الخطية اعتمادا على صالح) أن أقحم العينة / استخراج القيم الامتصاصية للقيم تعادل E2. استخدام عامل التركيز (أي المياه المستخرجة وحجم الإيثانول وإعادة علقت استخراج في) لحساب النشاط استروجين في العينة المستخرجة مسبقا.

4. تقييم وبناء مختبر آخر استروجين عن طريق في فيفو Vitellogenin التعريفي في ذكر المنوة البلم

  1. استخدام البلم المنوة الذكور (Pimephalespromelas)> 4 أشهر من العمر، والتي تعرض الخصائص الجنسية الثانوية (أي وضع الدرنات الزواج وfatpad ظهري) يدل على تقرير الجنسي لدى الذكور.
    1. لمنع النشاط التفريخ، منفصل ناضجة الذكور ثلاثة أسابيع (± 3 أيام) قبل بدء الاختبار. إنشاء شركتين على الأقل 45 L أحواض زجاجية مع تحميل الحد الأقصى من 3 جرام / لتر. لضمان أعداد كافية من الأسماك الصحية للاختبار، استخدام ما لا يقل عن 100 من الذكور.
    2. الحفاظ على الأسماك الذكور تحت ظروف بيئية مماثلة كما سوف يكون من ذوي الخبرة في اختبار (أي درجة حرارة الماء من 25 ± 1 درجة مئوية و 16: ضوء 8 ساعة: الضوئية المعتمة). الحفاظ على معدل تدفق المياه التخفيف إلى كل خزان لضمان 95٪ استبدال الوقت على الأقل كل 6-8 ساعة، أي 330 مل / دقيقة لخزان 45 لتر.
  2. جهاز الاختبار والتصميم التجريبي
    1. استخدام الدبابات زجاجية كبيرة لاستيعاب تحميل تصل إلى 3 غرام من الأسماك لكل لتر من واتإيه. لمدة 8 الذكور البالغين (اسميا 4.5 غرام لكل منهما)، واستخدام خزان 10-20 L.
      1. استخدام دبابتين تكرار لكل معاملة وحماية كل خزان من أي اضطرابات بصرية لا داعي لها (أي استخدام شاشات بطاقة مغلفة بين الدبابات). تحديد كل دبابة مع عدد الدراسة، تركيز التعرض وعدد هوية السفينة.
    2. لدراسات المياه العادمة
      1. لدى وصوله، ونقل على الفور النفايات السائلة في خزان التخزين في 10 ± 1 درجة مئوية. بدء الجرعات النفايات السائلة في غضون سنتين ساعة من استلام النفايات السائلة.
      2. تغذية مياه الصرف الصحي، عن طريق مضخة تحوي، من 10 ° C خزان التخزين لسفينة التأقلم. حرارة النفايات السائلة في وعاء التأقلم إلى 18 ± 2 درجة مئوية. ضخ مياه الصرف الصحي بمياه دافئة من السفينة التأقلم مع الجرعات / سفن خلط ومن ثم إلى أحواض اختبار (التي تتولى الأسماك). تسخين أحواض إلى درجة حرارة 25 ± 1 درجة مئوية.
    3. للدراسات الجرعات الكيميائية
      1. وزن المواد الكيميائية اختبار في خزانة مسحوق وزنها. إعداد مخزون المواد الكيميائية المركزة في ده 2 O ويفضل دون استخدام المذيبات.
        ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة المذيبات لإذابة مركبات الاختبار، واستخدام عناصر التحكم المذيبات بالإضافة إلى التحكم في المياه التخفيف.
      2. تغذية الجاذبية أو مضخة المياه التخفيف من درجة الحرارة التي تسيطر خزان رأس عن طريق جهاز التحكم في التدفق (ق) إلى الجرعات / خلط السفينة. تتركز مضخة الأسهم الكيميائية (ق) باستخدام نظام ضخ تحوي على الجرعات / خلط السفن. السيطرة على معدل ضخ (الكيميائية الأسهم) ومعدل تدفق المياه (المياه تمييع) لتحقيق تركيز التعرض المطلوب.
        ملاحظة: استخدام أنابيب السيليكون لتغذية الكيميائية للمياه / اختبار لكل سفينة اختبار من الجرعات / خلط السفينة. استخدام معدل تدفق غير كافية لتوفير بديل السفينة 75٪ في لا يقل عن 24 ساعة، أي 20 مل / دقيقة لخزان 20 لتر. الحفاظ على معدل التدفق في ± 10٪ من القيمة الاسمية المحددة.
      الحفاظ تعرض درجة حرارة مياه الصهاريج في 25 ± 1 درجة مئوية، الأوكسجين المذاب فوق 70٪ من قيمة تشبع الهواء (5.8 ملغم لتر -1 عند 25 درجة مئوية) و± حدات 0.5 درجة الحموضة (ابتداء من درجة الحموضة ما بين 6.5 و 8.5) طوال الدراسة. تعيين ظروف الإضاءة لالضوئية للضوء 16 ساعة: 8 ساعات الظلام، مع الفجر / الغسق الفترات الانتقالية من 20 دقيقة.
    4. تغذية غ لكل خزان في تغذية الأسماك مرتين في اليوم مع إذابة حديثا الكبار المجمدة الأرتيميا (الأرتيميا) في 2.5 (± 0.1). أيضا إطعام الأسماك مرة واحدة في اليوم مع كمية صغيرة (اثنان إصبع قرصة) لالاستوائية الأسماك تقشر. ترك ما لا يقل عن 3 ساعات بين كل رضعة.
      1. الاحتفاظ بسجل التغذية اليومي لمراقبة استجابة للتغذية / السلوك (جيد أو متوسط ​​أو ضعيف، مقارنة مع الضوابط). سيفون الدبابات على الأقل مرتين في الأسبوع (ويفضل أن يكون يوميا) لإزالة أي طعام غير مأكول والبراز. تنظيف الجانبين وقيعان من أوعية الاختبار مرة واحدة في الأسبوع على الأقل.
    5. أخذ عينة المياه الأسبوعيةالصورة من كل خزان لتأكيد النشاط استروجين (عبر شاشة الخميرة) والتركيب الكيميائي (عن طريق الكيمياء التحليلية). انظر الأقسام 1-3 للاطلاع على تفاصيل لجمع عينات المياه، واستخراج وتحليل.
      ملاحظة: للحصول على كل تجربة، استخدام وسائل منع تخفيف المياه (المراقبة السلبية)، مراقبة إيجابية (E2 أو EE2)، بالإضافة إلى ثلاثة على الأقل التخفيفات من النفايات السائلة (100، 50 و 25٪) أو الكيميائية اختبار لمراقبة الاستجابة للجرعة. إذا تم اختبار تقنيات جديدة، واستخدام مركب / مياه الصرف الصحي مع أو بدون العلاج (على سبيل المثال، EE2 دون علاج، EE2 مع TAML / بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) معالجة 12؛ الشكل 1).

شكل 1
الشكل 1. رسم بياني يمثل التصميم التجريبي لالأحيائي في الجسم الحي المنوة vitellogenin لتحديد إزالة السمية من 17α-ايثينيل استراديول باستخدام TAML / بيروكسيد معالجة المياه. وإكسبerimental انشاء يتكون من ثمانية أحواض زجاجية 11 L كل بنك الاحتياطي الفيدرالي مع استمرار تدفق المياه. يتم تسليم الحلول الأسهم الكيميائية الفردية والمياه (التي تمت تصفيتها دي بالكلور) لغرف الخلط. تركيزات الاسمية (بدون رد فعل) في الأوعية خلط هي 2 نانوغرام / لتر EE2، 80 نانومتر TAML و 0.16 ميكروغرام / LH 2 O 2. يتم إعداد الحلول الأسهم الكيميائية (EE2، H 2 O 2 و TAML) وأعطيت جرعات بشكل منفصل بحيث ردود الفعل تبدأ في الأوعية خلط. تتعرض الأسماك (8 البلم المنوة الذكور في الخزان) إلى الخليط (ق) بعد فترة رد الفعل الاتصال ما يقرب من 45 دقيقة. يتم أخذ عينات من المياه من خزانات تعرض أسبوعيا. يتم أخذ عينات البلازما من البلم المنوة لقياس العلامات البيولوجية vitellogenin استروجين (VTG) من مجموعة خط الأساس، في بداية الدراسة، وجميع الأسماك الأخرى بعد 21 يوما من التعرض. علاجات محددة هي: 'C'. السيطرة السلبية (الماء التخفيف فقط)، '+'؛ مراقبة إيجابية من EE2،'+ H'؛ EE2 بالإضافة إلى H 2 O 2، '+ T'؛ EE2 بالإضافة إلى H 2 O 2 زائد TAML. تم تعديل هذا الرقم من ميلز وآخرون. 2015 12. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إجراء الاختبار
    1. فترة تأقلم
      1. قياس الوزن الرطب (ز) من كل الأسماك الذكور الناضجة جنسيا، وتخصيص عشوائيا على كل خزان (8 ذكور في الخزان).
      2. حفاظ على الأسماك غير المخصصة من نفس الدفعة والمحافظة عليها في ظل ظروف الاختبار نفسها. استخدام هذه الأسماك ليحل محل أي الأفراد الذين تظهر علامات ضرر مادي أو عدم وجود حالة خلال فترة تأقلم لمدة 7 أيام. ضمان في نهاية فترة تأقلم كل خزان العلاج يحتوي على 8 ذكور التي تأقلم تماما لظروف الاختبار.
      3. تأخذ "خط الأساس" عينات البلازما من 8 ذكور إضافية من نفس باتك للذكور السمك. اتبع طريقة اخذ عينات من الدم في القسم 4.4 وطريقة Vitellogenin (VTG) تحليل في 4.5.
    2. بعد فترة التأقلم، وتقديم الأسهم الجرعات النفايات السائلة أو الكيميائية للدبابات التعرض لمدة 21 يوما كما هو موضح في 4.2.2 أو 4.2.3. وفيات رصد والسلوك والمظهر الخارجي من الأسماك في كل تكرار خزان مسبق يوميا لتغذية الأولى من اليوم. تسجيل أي سلوك غير طبيعي أو الحوادث.
      ملاحظة: تأكد من الظروف البيئية ومعدلات التغذية الحفاظ على صحة الأسماك (الأقسام 4.2.4 و 4.2.5).
  2. أخذ عينات الأسماك بعد فترة التعرض لمدة 21 يوما
    1. 12 ساعة قبل أخذ العينات، والتوقف عن تغذية الأسماك.
    2. تسمية أنابيب الطرد المركزي الصغيرة لجمع عينات الدم، إضافة ~ 5 ميكرولتر من أبروتينين (مثبط البروتياز) ووضعها على الجليد.
    3. جعل حل 500 ملغ / لتر من MS222 (مخدر) عن طريق إذابة 500 ملغ من MS222 لكل 1 لتر من الماء بالكلور دي (تأقلم سابقا25 ± 1 درجة مئوية). تحييد MS222 لدرجة الحموضة 7.4 ± 0.4 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    4. نقل كل الأسماك من خزان في MS222 مخزنة. نضع في الحل حتى وقف جميع حركة الغطاء الخيشومي (عادة 5 ± 1 دقيقة).
    5. قياس وتسجيل طول شوكة (مم) تحت التخدير الطرفي. استخدام مشرط المتاح لبتر ذيل، واستخدام أنبوب hemocrit heparinized لجمع الدم من الشريان الذيلية (الشكل 2). بعناية الاستغناء عن الدم في أنبوب microcentrifuge قبل المسمى والحفاظ على الجليد.
    6. قتل الأسماك مباشرة بعد تعادله الدم. تأكيد الموت وقف دائم للتداول و / أو تدمير الدماغ. قياس وتسجيل الوزن الإجمالي الأسماك (لأقرب 0.01 غ)، وتشريح الأنسجة كما هو مطلوب.
    7. أجهزة الطرد المركزي الدم (7000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية) في غضون 2 ساعة من جمعها. نقل طاف البلازما باستخدام ماصة في حوض microcentrifuge ل0.4 مل المسمى الجديدوفاق ومتجر على الجليد. تجميد أنابيب تحتوي البلازما على الثلج الجاف في غضون 30 دقيقة من الطرد المركزي ومخزن في -80 درجة مئوية قبل تحليل البلازما تركيزات VTG.

الشكل 2
الشكل 2. صور تصور الذكور أسماك المنوة (المنوة)، جمع البلازما ومكان الخصية. وفي نهاية التعرض لمدة 21 يوما كل السمك يجب ان يقتل لجمع عينات الدم. مرة واحدة في إطار هذا طول المحطة مخدر الأسماك (طول شوكة، مم) يجب أن تقاس بسرعة تليها جمع الدم من الشريان الذيلية صور-A: خط منقط باللون الأحمر إلى الموقع لبتر ذيل (يجب استخدام مشرط المتاح لبتر ذيل يظهر). صور-B أنبوب hemocrit heparinized تستخدم لجمع الدم. وينبغي بعد ذلك قتل كل سمكة على الفور بعد أن تم أخذ عينة من الدم لها، في هذه الحالة الرأس كلهوقد قطعت من الجسم (صور-C). مرة واحدة وقد تم قتل الأسماك تجويف الجسم يمكن فتحت لكشف الأعضاء الداخلية. صور-C يدل على مكان وجود الخصية (الغدد التناسلية) فيما يتعلق المثانة السباحة (SB) في الأسماك المبروك، على سبيل المثال، أسماك المنوة، روش، الكارب، الخ الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قياس تركيزات بلازما VTG مع الفحص المناعي (ELISA) مجموعة انزيم مرتبط VTG المتجانسة التي صممت خصيصا لالبلم المنوة.
    1. إعداد معايير VTG والمخازن على النحو المبين في بروتوكول الشركة المصنعة. تمييع عينة البلازما 01:50، 1: 5000، و 1: 500000 ومقايسة لهم في نسختين للحصول على قراءات ضمن نطاق المنحنى القياسي VTG حسب تعليمات الشركة الصانعة. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لحساب تركيزات vitellogenin.

    5. تقييم مجال المتقدم / رواية معالجة مياه الصرف الصحي تقنيات للتخفيف استروجين آخر عن طريق في فيفو Vitellogenin وثنائيي التعريفي في روش (Rutilus rutilus)

    1. القبض على روتش البرية تعيش أسفل تيار من مصبات مياه الصرف الصحي محطة معالجة
      ملاحظة: استخدام روتش (Rutilus rutilus) أو غيرها من المياه العذبة الوفيرة أو الأسماك المالحة الأنواع، والتي هي كثير البيض والمعروف أن حساسية لاختلال الغدد الصماء استروجين.
      1. صيد الأسماك باستخدام electrofishing، المعاوضة، محاصرة أو غيرها من وسائل الصيد المعترف بها تبعا للحالة (13). نقل الأسماك في الدبابات الغازية إلى مختبر لأخذ العينات.
      2. إعداد أنابيب microcentrifuge كما هو مفصل في 4.4.2. استعد مخزنة MS222 كما هو موضح في 4.4.3. تخدير الأسماك على النحو المفصل في 4.4.4.
      3. قياس طول السمك والوزن تحت التخدير الطرفي.
      4. جمع الدم من الشريان الذيلية باستخدام dispoحقنة heparinized السمور. قتل كل الأسماك مباشرة بعد جمع عينة الدم. بعناية الاستغناء عن الدم في أنابيب microcentrifuge قبل المسمى والحفاظ على الجليد. تحضير البلازما كما هو موضح في الخطوة 4.4.7 وقياس VTG بواسطة ELISA (4.5).
      5. باستخدام ملقط إزالة 2-3 قشور السمك من كل الأسماك وتضع في المسمى بشكل فردي المظاريف ورقة صغيرة. متجر المغلفات في درجة حرارة الغرفة في الظروف الجافة لاحقة الأسماك تحديد العمر وتحليل النمو.
      6. فتح تجويف الجسم مع مشرط لكشف الأعضاء الداخلية. إخراج الأمعاء للكشف عن المثانة السباحة مع الغدد التناسلية تقع على جانبي (الشكل 2). إزالة بعناية الغدد التناسلية يقترن ملقط الانف الجميلة ومكان في قارورة زجاجية. تغطية الغدد التناسلية مع تثبيتي بوان في نسبة 01:10 الأنسجة: تثبيتي.
      7. ترك الأنسجة والتي بوين عن 6-24 ساعة تبعا لحجم الأنسجة (تثبيتي تخترق في 1 مم لكل ساعة). مرة واحدة ثابتة، صب قبالة تثبيتي في بواند استبدال 70٪ الأرواح مميثل الصناعية (IMS). تخزين الأنسجة الثابتة في درجة حرارة الغرفة حتى تتم معالجة الأنسجة لأمراض الأنسجة (القسم 5.3).
    2. تقييم ميدانية النشاط استروجين استخدام في الجسم الحي vitellogenin وثنائيي الاستقراء في روش
      1. التصميم التجريبي واقامة
        ملاحظة: إعداد الدبابات ومحطة تجريبية في وقت مبكر من الجسم الحي في العمل البداية. بدء الدبابات تتدفق 3-4 أسابيع قبل أي إضافة السمك إلى النظام. رصد معدلات تدفق المياه ونوعية المياه والظروف (درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، الأوكسجين المذاب، الخ) بانتظام للتأكد المعلمات المؤكد لا يمكن الحفاظ عليه.
        1. بناء خزانات كبيرة (على سبيل المثال، 300-1،000 L) في موقع المصنع التجريبي، التي يمكن أن تتلقى 'السيطرة' دي بالكلور مياه الصنبور، ومعيار مياه الصرف الصحي المعالجة (ق) والمياه المعالجة (ق) في موازاة متقدمة. نعلق مضخة الهواء / أجهزة التهوية للدبابات. تعيين معدلات تدفق المياه لتحقيق لا يقل عن 6 دبابات تتبادل olume يوميا.
          ملاحظة: تأكد من الدبابات هي معزولة جيدا ومظللة لمنع الإفراط في تقلبات درجات الحرارة اليومية. الدبابات تصميم للسماح للمراقبة الأسماك، لإجراء تعديلات سلوكية (نقص التغذية، وما إلى ذلك)، وعلامات المرض والوفيات.
      2. بدء التعرض عن طريق تعويم أكياس من روتش (من المزارع السمكية) في خزانات منهما لمدة 1 ساعة. يضاف الماء إلى خزان أكياس تدريجيا حتى درجة حرارة المياه والظروف المحيطة. الافراج عن الأسماك في دباباتهم.
      3. إطعام الصراصير الكبار يوميا على الأسماك مكعبات (حجم 0،5-0،8). تغذية روتش الأحداث اليومية على مكعبات صغيرة (أحجام بيليه 100-300) غير استروجين تغذية 14 الإرضاع بحسب الرغبة، معدلة على أساس من العلف غير مأكول. الاحتفاظ بسجل التغذية استجابة التغذية توثيق / السلوك اليومي (جيد أو متوسط ​​أو الفقراء، مقارنة مع الضوابط).
      4. أخذ عينات المياه أسبوعية من كل خزان لتأكيد النشاط استروجين والتركيب الكيميائي. سيأقسام البريد 1-3 للاطلاع على تفاصيل طرق أخذ العينات المائية وتحليلها.
    3. التشريح المرضي من الأسماك الغدد التناسلية 15
      1. إزالة بعناية الغدد التناسلية تشريح والثابتة (هو موضح في الخطوات 5.1.6 و5.1.7) من الحاوية مع ملاقط ومكان على لوح التقطيع.
      2. استخدام شفرة مشراح إلى قطع كل الغدد التناسلية إلى 3 أجزاء (الأمامي، المتوسط ​​والخلفي) ومن قطع كل جزء شريحة سميكة 3-5 ملم. وضع بعناية كل قطعة ستة إلى خزعة كاسيت البلاستيك المسمى، ومكان في معالج الأنسجة باستخدام توقيت المدرجة في الجدول (4).
      3. الشمع الأنسجة تضمين والقسم على مشراح دوار (3-5 ميكرون). نقل المقاطع إلى المسمى شرائح الزجاج المطلي الحيوية لاصقة والشرائح مكان على طبق ساخن (وضعت في 45 درجة مئوية) لتجف لمدة 24 ساعة.
      4. وصمة عار على الشرائح، إما يدويا أو باستخدام الملطخ الآلي، وذلك باستخدام توقيت المفصلة في الجدول 5 ضع قطرة من وكيل متزايدة على النسيج الملون، ولعبد المنعم يوسف كوب ساترة على وكيل متزايدة لحماية الأنسجة.
      5. أولا، فحص كل شريحة في تضخم منخفضة (20X، أي الهدف 2X، مع خطوط 10X العين التكبير) لتحديد الجنس، وعدد من النقاط من المرفقات إلى تجويف الجسم 15. ملاحظة أي شذوذ عن كل سمكة.
      6. في أعلى التكبير (100X أو 400X)، فحص الأنسجة لتقييم مراحل تكوين الأمشاج، تشوهات وجود البويضات في أنسجة الخصية. تسجيل شدة ثنائيي باستخدام نظام الدرجات التالية تتراوح بين 0 (الأنسجة الذكور العادية) إلى (نسيج المبيض 100٪) 7 6 (انظر الجدول رقم 6).
    عدد خطوة علاج غرض الوقت (ساعة)
    1 70٪ IMS جفاف 3
    2 90٪ IMS جفاف 2.5
    3 95٪ IMS جفاف 1.5
    4 100٪ IMS جفاف 1.5
    5 100٪ IMS جفاف 1.5
    6 100٪ IMS جفاف 1.5
    7 100٪ IMS جفاف 1.5
    8 علم الأنسجة وكيل المقاصة المقاصة 1.5
    9 علم الأنسجة وكيل المقاصة المقاصة 1.5
    10 علم الأنسجة وكيل المقاصة المقاصة 1.5
    11 شمع الشمع تسلل 1.25
    12 شمع الشمع تسلل 1.25
    20 ساعة المجموع

    وينبغي معالجة الجدول 4. نظام معالجة للشمع تشريب الأنسجة لأمراض الأنسجة. الأنسجة في معالج الأنسجة التلقائي. يجب أن تكون مغمورة الأنسجة في الحلول المفصلة للفترة الزمنية المحددة.

    وصمة عار لا. وصمة غرض الوقت (دقيقة)
    1 وكيل الأنسجة المقاصة يذوب الشمع 15
    2 إضافة الماء 2
    3 90٪ IMS إضافة الماء 2
    4 70٪ IMS إضافة الماء 2
    5 ماء الصنبور (تشغيل) شطف 2
    6 HAEMOTOXYLIN نواة الخلية البقع الزرقاء 10
    7 ماء الصنبور (تشغيل) إزالة الزائدة 10
    8 المحمضة IMS إزالة الكلور 20 ثانية
    9 ماء الصنبور (تشغيل) شطف 20 ثانية
    10 ليكو 3 ملح 20 ثانية
    11 ماء الصنبور (تشغيل) شطف 20 ثانية
    12 1٪ يوزين (مائية) البقع السيتوبلازم الوردي 20 ثانية
    13 ماء الصنبور (تشغيل) إزالة الزائدة 5
    14 70٪ IMS جفاف 2
    15 90٪ IMS جفاف 2
    16 100٪ IMS جفاف 5
    17 وكيل الأنسجة المقاصة إزالة IMS، وكيل ملزم 5

    الجدول 5. حلول والأوقات الغمر لHaematoxylin ويوزين (H & E) تلطيخ الأنسجة الغدد التناسلية الأسماك. ينبغي أن توضع الشرائح في كل حمام لالوكATED الوقت في تسلسل. مطلوب H & E تلطيخ من الأنسجة لتحديد الآثار التنموية أو التنظيمية للمياه العادمة ذات استروجين على الغدد التناسلية السمك.

    أحرز هدفاً قسم الوصف
    0 الخصية الذكور العادية
    1 متعدد البؤر خصمبيض مع 1-5 البويضات (عادة منفردة) منتشرة بين أنسجة الخصية
    2 خصمبيض متعددة البؤر، 6-20 البويضات في كثير من الأحيان في مجموعات صغيرة متناثرة بين أنسجة الخصية
    3 خصمبيض متعددة البؤر، 21-50 البويضات في مجموعات
    4 > 50 و <100 البويضات. القسم هو عادة متعددة البؤر ولديه مظهر من فسيفساء من اختبارالأنسجة icular والمبيض.
    5 > 100 البويضات، متعدد البؤر عادة ولكن يمكن أيضا أن يكون الوصل مع مناطق يمكن تحديدها بوضوح من أنسجة المبيض والخصية فصلها عن أنسجة الخصية.
    6 > 50 في المائة من أنسجة الغدد التناسلية في قسم غير المبيض ويتم فصل بوضوح من أنسجة الخصية من خلايا طلائية والأنسجة أكلة.
    7 100 في المائة من أنسجة الغدد التناسلية في القسم هو المبيض.

    الجدول 6. نظام تسجيل النقاط لتقييم شدة حالة ثنائيي في روتش. تشريحيا شرائح محضرة من نسيج الغدد التناسلية يجب فحصها تحت المجهر الضوئي، في 20X، 100X و 400X التكبير، لتقييم أي شذوذ وجود البويضات في أنسجة الخصية. تم تعديل هذا الجدول من Jobling <م> وآخرون. 2006 6.

Representative Results

محاولات لفهم تأثير إدخال تحسينات على عمليات معالجة مياه الصرف الصحي أو لتحديد التكنولوجيا الأنسب لالتحديثية المعدات بالمعالجة الثلاثية في محطات معالجة مياه الصرف الحالية فيما يتعلق فعالية إزالة النشاط الغدد الصماء من النفايات السائلة فارغة، لا يتطلب سوى قياس الكيميائية الرئيسية المكونات التي تدخل في أعمال ولكن يتطلب تحليل المنتجات انهيار والتي قد يكون لها أيضا نشاط الغدد الصماء. في نفايات مياه المجارير المحلية، وأكثر المواد استروجين الحالية هي هرمونات الستيرويد، إيسترون (E1)، 17β استراديول (E2) و17α-ايثينيل استراديول (EE2) 5،8. تفرز هرمون الاستروجين الستيرويد في المقام الأول من الجسم على شكل مزيج من تقارن الخاملة 16،17. وdeconjugated هذه الاستروجين مترافق بشكل كبير في نظام الصرف الصحي حسب النشاط البكتيري ويحدث مزيد من التدهور في محطات معالجة مياه الصرف. المنشطات deconjugated عالبريد إزالتها من مجرى مياه الصرف الصحي عن طريق الامتزاز إلى حمأة أو biodegraded خلال المعالجة الثانوية مما أدى إلى تشكيل، أولا من تركات تحول في نهاية المطاف تمعدن الكامل يمكن أن يحدث من العنصر النشط الأولي. ان التحليل الكيميائي للمركبات مفردة في مجرى مياه الصرف يكون من الصعب، تستغرق وقتا طويلا ومكلفا ولن تغطي المكونات النشطة غير معروفة موجودة في عينة. وعلاوة على ذلك، فإن مجموع مساهمة استروجين كل مكون توفر سوى مؤشرا على قوة استروجين التراكمية لعينة من المركبات تحليلها. هذا هو الخطر حيث تولد عمليات التحول المواد استروجين غير معروفة أو حيث مؤثر من أصل الصناعي. الجمع بين التحليل الكيميائي مع المجراة في اختبارات بيولوجية السمية الإيكولوجية المختبر يوفر حلا لوجود مكونات استروجين غير معروفة في خليط مثل مياه الصرف الصحي المعالجة. وفي فحوصات المختبر مثل الخميرة الاستروجين قرار مجلس الأمنالتابعين (YES) وقد استخدمت على نطاق واسع لتحديد النشاط استروجين من النفايات السائلة مياه الصرف الصحي ومساعدة في التعرف على مكونات نشطة في المعالجة عينات 8،18،19. ومع ذلك، يمكن المقارنة بين المجراة في التجارب المختبرية أن تكون كبيرة 11 وإجراء تقييم شامل لعمليات جديدة فيما يتعلق علاج الغدد الصماء قوة يتطلب مجموعة من الاختبارات الكيميائية والسمية الإيكولوجية.

وتحديد ما إذا كانت محطات معالجة فردية أو عمليات إزالة المركبات النشطة من مجرى مياه الصرف الصحي يمكن تحقيقه باستخدام التحليل الكيميائي الذي يتبع استخراج عينة والتركيز وتنظيف للاستخراج قبل التحليل، وغالبا ما يتم باستخدام يمكننا تعريف (/ MS) أو GCMS (/ MS) الأساليب. البيانات التي تم الحصول عليها من التحليل الكيميائي يمكن أن تستخدم لتحديد مدى مطابقتها مع شخص توقع أي تركيز تأثير (التركيز البيئي المتوقع) 20 أو معايير الجودة البيئيةالصورة (EQS) 21 من مركبات فردية معينة، وبالتالي هذه الأساليب هي حيوية لبيانات الجهات الرقابية. وعلاوة على ذلك، مستهدفة أو أساليب غير المستهدفة للتحليل الكيميائي تسمح بتحديد والكميات من المركبات الفردية أو أيزومرات بالمقارنة مع الطرق البيولوجية، التي توفر استجابة الإجمالية. وبالتالي تسمح طرق التحليل الكيميائي أن يتم هذا التقييم من مركبات منفصلة لتلبية ومعالجة هذه التحديات معالجة مياه الصرف الصحي على أساس محطة المعالجة الفردية. وقد أظهرت الدراسات أن معالجة مياه الصرف الصحي التقليدية (على سبيل المثال، محطات الحمأة المنشطة) يمكن أن تكون فعالة جدا في إزالة هرمونات الستيرويد الطبيعية على الرغم من إزالة هرمون اصطناعي EE2 تميل إلى أن تكون أقل فعالية. دراسات ميدانية باستخدام معالجة متقدمة باستخدام تقنيات مثل الأوزون، وقد أظهرت حبيبات الكربون المنشط (GAC) والأغشية، وإن كان بتكلفة عالية، وأنها يمكن أن تستخدم كحل نهاية الأنابيب لإزالة EE2 إلى أقل من بردicted مستويات التأثير ودون حدود الكشف الشكل 3 يبين إزالة EE2 باستخدام GAC في محطة لمعالجة مياه الصرف الصحي البلدية نطاق تجريبي. تظهر الدراسات التي أجريت على نطاق تجريبي في محطات معالجة مياه الصرف الصحي البلدية باستخدام نهاية الأنابيب العلاج GAC أيضا انخفاض في القدرة استروجين يلي GAC قياسها باستخدام شاشة الخميرة الاستروجين (YES) كما هو مبين في الشكل (4).

الشكل (3)
الشكل 3. البيانات الميدانية مثال يوضح إزالة ايثينيل استراديول بعد المعالجة الثلاثية المتقدمة. يتم جمع (A) عينات من محطات معالجة مياه الصرف التالية (محطة الحمأة المنشطة) وسائل العلاج التقليدية وفقا للإجراءات وصفها لحفظ العينات. يتم استخراج (ب) عينات باستخدام الصلبة مرحلة الاستخراج، تنظيف الهاتفي لإزالة المواد التدخل باستخدام العادي مرحلة SPE والههلامي. ويتركز (C) واستخراج مركزة نظيفة إلى انخفاض حجم وتحليلها باستخدام سلبي أيون electrospray LCMS / ماجستير في وضع MRM. وتحسب النتائج باستخدام توحيد الداخلية باستخدام المعايير الداخلية المسمى isotopically. في المثال المبين، EE2 موجود في النفايات السائلة ASP النهائي بتركيز أعلى من توقع أي مستوى تأثير (التركيز البيئي المتوقع) من 0.1 نانوغرام / لتر وإزالتها باستخدام GAC والأوزون (O 3) إلى تركيز آمنة بيئيا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. صور من الخميرة الاستروجين الشاشة (YES) لوحة فحص (A) التي تبين تغير لونها من الأصفر إلى الأحمر، تتعلق النشاط استروجين من العينات. المؤامرات التي تم إنشاؤها من الاداء لوحة نعم فحص تصحيح الامتصاصية (540نانومتر) من مستوى الإستراديول (B)، تنشيط عملية الحمأة السائلة (ASP) والحبيبية الكربون المنشط (GAC) معاملة عينات المياه العادمة (C). وتم اختبار كل عينة في مكررة. انتزعت آسيا والمحيط الهادئ وGAC النفايات السائلة وتتركز باستخدام أساليب SPE المبينة في القسم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المعالجة بالأوزون هو أيضا فعالة في إزالة هرمون الاستروجين الستيرويد والنشاط استروجين من محطات معالجة مياه الصرف الصحي المعالجة التقليدية. الأوزون هو قادرة على أكسدة مجموعة واسعة من الملوثات العضوية والمواد العضوية الذائبة في عينات مياه الصرف الصحي ويوفر خصائص التعقيم. فعالية المعالجة بالأوزون تعتمد على خصائص المياه مثل الرقم الهيدروجيني، وكمية من المواد العضوية والجرعة تطبيق الأوزون. هرمون الاستروجين التي يتم إزالتها سيئة من قبل وسائل العلاج التقليدية يمكن أن يكونإزالة من مياه الصرف الصحي مع تناول جرعات تتراوح بين 0.8 و 2 ملغ يا 3 / ملغ DOC. الأوزون هو عامل مؤكسد الانتقائي، الذي يتفاعل مع المواقع الإلكترونية الغنية (السندات غير المشبعة بين الكربون والمركبات العطرية بما في ذلك الكحول العطرية)، الأمر الذي يجعل الأوزون ينطبق على انهيار عدد من EDC. ومع ذلك، والقضاء على المركبات الفردية لا تؤدي بالضرورة إلى تمعدن الكامل للمركب الأصلي. المواد العضوية بعد المعالجة بالأوزون يمكن تحويل وسيطة توليد أو الأكسدة تحول من المنتجات التي تشمل عددا من الوزن الجزيئي المنخفض، والطبقات القطبية من المركبات مثل الألدهيدات والكيتونات، الأحماض الكربوكسيلية، كيتو الأحماض، ومركبات البروم. ومن الأمثلة على ذلك، برومات، والفورمالديهايد، الأسيتالديهيد والأحماض الكربوكسيلية. استخدام في الجسم الحي وفي اختبارات بيولوجية المختبر فقد تبين أنه على الرغم من الأوزون يكسد جزئيا فقط بعض المواد الكيميائية، مما أدى المنتجات التحول الكبرى لديها estrog أقلشبكة naric قوة، وبالتالي تطبيق الأوزون في أحد النتائج الجرعة المناسبة في إزالة عالية من النشاط استروجين.

واحدة من الفوائد الرئيسية لمعالجة إضافية مياه الصرف الصحي هو الحد من تأنيث ذكور السمك في المياه المستقبلة. على الأثر السلبي الذي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الخصوبة 3. وفي الدراسات المجراة باستخدام الأسماك (مثل الصراصير أو أسماك المنوة) تتعرض لإظهار مياه الصرف الصحي خلايا الإناث الجرثومية أو البويضات في الخصية من الأسماك الذكور (على سبيل المثال، كما رأينا في الشكل 5). ثنائيي الجنس أو الذكور VTG غائب أو انخفاض كبير في الأسماك بعد العلاج المتقدمة مثل GAC 7 أو الأوزون 22. وتشير هذه الدراسات إلى أن منتجات التحول التي تنتج أثناء المعالجة بالأوزون ليست استروجين، ولكن هذا لا يعالج سمية النفايات السائلة المنتجة. وقد تم تناول هذه المشكلة في دراسات أخرى، على سبيل المثال دراسة أجرتها ماغديبرغ وآخرون. تصل> 23 مما يدل على ان الأكسدة الأوزون والمنتجات السامة إلى تراوت قوس قزح ولكن يمكن إزالة هذه السمية عن طريق الترشيح الرمال المصب التالية المعالجة بالأوزون.

الرقم 5
الرقم 5. Photomicrographs من ذكر العادي (A) وثنائيي الجنس (B، C) الغدد التناسلية من روتش الكبار (Rutilus rutilus) تتعرض لمياه الصرف الصحي في حقل أساس التقييم. صورة مجهرية-A، يصور القسم النسيجي للخصية الذكور العادية. صورة مجهرية-B و-C، يصور المقاطع النسيجية للذكور السمك ثنائيي الجنس، بعد أن تعرضت لتنشيط عملية الحمأة المياه العادمة لمدة ستة أشهر. تشير الأسهم البويضات الموجودة في أنسجة الخصية. يمثل شريط مقياس 100 ميكرون في كل صورة مجهرية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

together.within الصفحات = "1"> ارتفاع تكلفة نهاية العلاج الأنابيب باستخدام الأوزون، GAC أو تكنولوجيا الأغشية تستدعي تطوير تكلفة بديلة أقل، وأساليب مستدامة لالغدد الصماء الكيميائية (EDC) الإزالة. وعلاوة على ذلك، والامتزاز والفصل أساليب ببساطة منفصلة EDC من مرحلة إلى أخرى بدلا من القضاء عليها عن طريق التدهور. وقد وضعت تفعيل TAML لتحفيز الهيدروجين بيروكسيد أكسدة الملوثات المجهرية العضوية في مياه الصرف الصحي 12،24 - 26. TAML المنشطات مع H 2 O 2 تتحلل بشكل فعال EE2 وغيرها من هرمون الاستروجين الستيرويد في الماء مختبر النقي وكذلك في النفايات السائلة من محطات معالجة مياه الصرف الصحي البلدية وفي عينات البول ارتفعت 12. الدراسات المختبرية، ويظهر TAML / H 2 O 2 العلاج يوفر إزالة هرمون الاستروجين الستيرويد عالية بما في ذلك إزالة EE2 وإلى حد كبير يقلل النشاط استروجين قياسها في المختبر باستخدام الأحيائي نعم وsubstantiaLLY يقلل تأنيث الأسماك في الجسم الحي قياسها باستخدام الأحيائي VTG (الشكل 1) والشكل (6).

الشكل (6)
الشكل 6. متوسط ​​تركيز EE2 والنشاط استروجين في المعالجة وتم قياس المياه غير المعالجة خزان (A) وvitellogenin البلازما في الأساس، وتتعرض الأسماك الذكور (B). أ) تركيز EE2 (نانوغرام / لتر، أشرطة زرقاء داكنة) التي يمكننا تعريف / MS ، وقد تم قياس النشاط استروجين (EE2 يعادل نانوغرام / لتر، وأشرطة خضراء داكنة) عبر في المختبر شاشة الخميرة الاستروجين (YES). ب) vitellogenin البلازما (نانوغرام / مل، وأشرطة زرقاء خفيفة) التركيز في البلم المنوة الذكور تم قياس عن طريق انزيم الكمي -linked المناعي فحص (ELISA). EE2 نتائج التحليل الكيميائي كما ذكرت <0.03 نانوغرام / لتر EE2 (أي أقل من حد الكشف (اللد)) وعولج وجود نصف اللد (أي، 2 O 2 + TAML، EE2 + H 2 O 2، وEE2 فقط. أشرطة الخطأ في الرسم البياني-A تمثل الخطأ المعياري للمتوسط، أشرطة الخطأ في الرسم البياني-B تمثل الانحراف المعياري. خطابات فوق القضبان في الرسم البياني-B تمثل تشابه الإحصائي. تم تعديل هذا الرقم من ميلز وآخرون. 12 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

محطات معالجة مياه الصرف الصحي هي الطريق الرئيسي لتلوث المياه السطحية مع EDC. تقييم فعالية إزالة النشاط الغدد الصماء من عمليات المعالجة التقليدية والمتقدمة أو الناشئة يتطلب استخدام مجموعة متنوعة من فحوصات الكيميائية والبيولوجية. التحليل الكيميائي باستخدام التحليل غير المستهدفة واستهدفت يوفر البيانات النوعية أو الكمية على فعالية إزالة المكونات الفردية، وبالتالي يتيح إجراء تقييم ليتم وفقا لمعايير الجودة البيئية أو توقع أي تركيز تأثير للمركبات أو مخاليط من مركبات تحليلها.

جيل من منتجات التحول الناتجة من تمعدن غير الكامل للمواد التالية العلاج ووجود مكونات النشطة بيولوجيا غير معروفة في مياه الصرف الصحي يحد من جدوى الاختبارات الكيميائية وحدها. مزيج من المجراة في اختبارات بيولوجية المختبر في تركيبة مع كيمياء تحليليةيوفر فحص راي مجموعة أدوات مفيدة لتحديد مدى فعالية إزالة EDC من خلال عمليات معالجة مياه الصرف الصحي الناشئة. هذه الاختبارات، عندما أجرت جنبا إلى جنب مع معايير الجودة المائية التقليدية وغيرها من النقاط النهائية السمية والميكروبيولوجية تسمح لتقييم نقدي لتقنيات معالجة مياه الصرف الصحي الحالية والناشئة.

من المهم أن نلاحظ أن الخميرة شاشات هرمون الاستروجين على أساس (على سبيل المثال، YES) ليست فقط فحوصات في المختبر لتحديد قوة استروجين من المواد الكيميائية ومياه الصرف الصحي. وقد تم تطوير عدد من المقايسات ستابلي مقرها خلايا الثدييات أيضا، على سبيل المثال، ER-CALUX 27 و hERα-هيلا-9903 28 مع خلايا سرطان الثدي البشرية أو الخلايا السرطانية في عنق الرحم على التوالي. وقد قارن نعم لفحوصات خلية مقرها الثدييات مماثلة، وقد وجدت لديهم مستوى عال مماثل من التكاثر، والحقيقية السلبية الأسعار تعريفا استروجين الإيجابية والحقيقية 29، althoلاف يعتبر في بعض الأحيان إلى أن تكون أقل قليلا حساسة 27. واحد يستفيد من الخميرة مقرها المقايسات مراسل هي أنه في مختبرات بدون خبرة كبيرة مع ثقافة خلايا الثدييات ونعم يمكن اعتمادها بشكل أكثر سهولة، كما أنه يتطلب تدابير المكافحة الحيوية أقل صرامة وتقنيات معقمة (نعم يمكن القيام بها على أعلى مقاعد البدلاء إذا لزم الأمر) . تتطلب فحوصات الخلية البشرية يستند أيضا CO 2 الحاضنات وluminometers مقارنة مع الحاضنة وصفيحة القراء القياسية المستخدمة في نعم. المقايسات مراسل هرمون الاستروجين على أساس اثنين من الخميرة (نعم، خميرة الخباز وA-نعم، adeninivorans Arxula) يجري حاليا مسارات بين المختبرات للتحقق من صحة ISO 19040 "جودة الماء - تقدير للإمكانات استروجين من المياه والصرف الصحي" تسليط الضوء على الصناعات الفائدة في هذه التقنيات.

وهناك عدد من أوجه القصور في الأساليب المذكورة والتي تشمل تلوث محتملللعينات أثناء أخذ العينات، وتخزين العينات وتحليلها مع المواد استروجين النابعة من البيئة الحقل أو المختبر أو عن طريق التلوث البشري (على سبيل المثال، المواد البلاستيكية، السطحي، ومنتجات العناية الشخصية). وهذا النوع من التلوث في مقايسة نعم (أو غيرها من الخلية المقايسات مراسل أساس) رفع الخلفية وتؤثر على استخدام الفحص. عينات الماء أو المذيبات المخزنة في زجاجات البلاستيك يمكن أن يؤدي بسهولة ايجابيات كاذبة. السلبيات كاذبة هي أيضا مثيرة للقلق كما تتطلب كلا LCMS / MS وفحص نعم SPE للتركيز هرمون الاستروجين إلى مستويات يمكن اكتشافها. مصفوفة، واختيار SPE الماصة وشطف المذيبات يمكن أن تؤثر على كفاءة الاستخراج وأنواع المركبات مزال. استخدام خراطيش C18 SPE لاستخراج باستخدام الشروط المبينة في هذا البروتوكول قد تولد التحيز السلبي، والمركبات القطبية العالية والأساسية وسيتم الاحتفاظ سيئة من قبل الماصة. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول يتطلب إعادة تشكيل شاطف نعم مزال من methanرأ إلى الايثانول عن طريق التبخر إلى جفاف النيتروجين ممول مما أدى إلى فقدان المتطايرة. ونتيجة لذلك البروتوكول يمكن أن توفر التقليل من النشاط استروجين من العينات التي تم فحصها. هذه القيود هي أهمية خاصة عند النظر في فحص نعم كمركبات غير معروفة أو غير متوقعة قد غاب، لأنهم لم يتم استخراجها أو ضائعون بسبب التبخر. وعلاوة على ذلك، فإن تقنية LCMS / MS يجعل استخدام المعايير الداخلية وصفت لتصحيح الإنعاش؛ هذا النهج لا يمكن استخدامها مع مقايسة نعم.

وتشمل قيودا كبيرة في الجسم الحي اختبار النفايات السائلة عالية التكلفة والوقت اللازم لتقييم بالمقارنة مع الطرق في المختبر. حاليا استخدام اختبارات الجنين الأسماك للكشف عن النشاط استروجين محدودة. ومع ذلك، كان هناك بعض النجاح في إنتاج هرمون الاستروجين المعدلة وراثيا استجابة متوهجة أجنة الأسماك 30، والتي يمكن أن تكون لها تطبيقات في المستقبل. البلم المنوة (المستخدمة في هذا protocرأ) هي الأنواع مختبر المشتركة وVTG الاستقراء في ذكور السمك هو موثقة جيدا، علامة الحيوي من التعرض للاستروجين ومقياس كمي من المياه العادمة إيداق 22 أو غيرها من المركبات استروجين أو مخاليط 31. تم التحقق من صحة المبادئ التوجيهية للاختبار منظمة التعاون والتنمية للمواد الكيميائية الغدد الصماء باستخدام الكبار المنوة، الميداكا اليابانية والزرد 32،33، مع VTG كونه العلامات البيولوجية الحساسة من التعرض هرمون الاستروجين في جميع الأنواع الثلاثة. ومع ذلك، VTG تحريض لا ترتبط مباشرة إلى انخفاض الإنجاب وذلك من عواقب بيئية التعرض مياه الصرف الصحي، كما رأينا في المبرح روتش ثنائيي 3. من ناحية أخرى، الصرصار ليست كلاسيكية "الأنواع المختبر للبحث السمية الإيكولوجية بسبب الحجم الكبير، والوقت جيل طويل (2-3 سنوات لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي)، على غرار الإنجاب. وضع البيض مجموعة (تربية) يحدث مرة واحدة في السنة، وصعوبة تحديد الذكور من الإناث (بخلاف خلالموسم وضع البيض). ومع ذلك، فقد هذا النوع كثير البيض عادة يتم دراستها بشكل جيد جدا في المملكة المتحدة، ويرجع ذلك إلى اكتشاف أن المصب من المياه المستعملة استروجين، أظهرت ذكور السمك اضطرابات في الغدد الصماء الخاصة بهم (على سبيل المثال، وجود vitellogenin أنثى محددة في دمائهم) والتشريح المرضي (ovotestes - وضع البيض في الخصية و / أو القنوات التناسلية للإناث) 5،6. ولذلك، وتطبيقها في المستقبل من هذه البروتوكولات، روتش (أو الأنواع المماثلة) يمكن أن تكون مفيدة الأنواع الحارس البرية لإظهار إذا شهدت تحسينات حقيقية إلى نوعية مياه الصرف الصحي (وانخفاض إيداق) في الأنهار تلقي نفايات السائلة المعالجة المتقدمة. أنها يمكن أيضا أن تستخدم في نهاية أنظمة الأنابيب لمراقبة وتحسين تكنولوجيا النفايات السائلة من المصانع نطاق تجريبي 7. وعند النظر في أي الأنواع لاستخدامها في عمليات التقييم في مياه الصرف الصحي الجسم الحي هناك علاقة تبادلية بين اختبار باستخدام الأنواع مختبر سريعة نسبيا والتي تسيطر عليها مقارنةيعد ميداني قائم، ولكن أكثر أهمية للبيئة، اختبار باستخدام الأنواع المحلية. ومع ذلك، مثل في التقييمات المجراة ذات تكلفة مرتفعة وينبغي أن ينظر فقط كما وتقام المباراة النهائية للاختبارات التقييم باستخدام التحليل الكيميائي التالية وفي فحوصات المختبر.

وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكولات المذكورة إعداد والتعامل مع العينات والأواني الزجاجية (أي والزجاجات ومعدات أخذ العينات يجب أن تكون مرحلة ما قبل المعالجة مع سطح مناسب نشط عامل تنظيف) لتجنب تلوث عينات من الملوثات البيئية بما في ذلك الحد من الاتصال من العينات مع البلاستيك و غيرها من المواد التي يمكن أن تنتج ايجابيات كاذبة. وهذا هو نفس القدر من الأهمية عند تصميم وبناء نظم تعرض الأحواض المائية والأسماك. من الناحية المثالية أحواض (أسهم الاسكان وأثناء التعرض) يجب أن تبنى من مواد مع انخفاض امتصاص 32 مع خطر التلوث الحد الأدنى. الفولاذ المقاوم للصدأ يمكن استخدامها لخزانات النفايات السائلة أو الماء.في حين يفضل دبابات من الزجاج والبناء للدبابات الأسماك (لأن هذا يوفر أيضا مراقبة سهلة من الأسماك). وينبغي تجنب استخدام أنابيب من البلاستيك درجة منخفضة أو أنابيب 32، بولي كلوريد الفينيل 34 و ABS يمكن استخدامها إذا "محنك بشكل صحيح"، أي، من اليسار إلى يتسرب أي ملوثات في المياه الجارية تخفيف لا يقل عن 12 ساعة قبل استخدامها. وقد استخدمت الطبية الصف سيليكون أنابيب بنجاح في منشأتنا لتسليم مضخة تحوي المواد الكيميائية والمياه العادمة / التخفيف من الدبابات. فضلا عن النظر في تلوث استروجين في بناء وتشغيل النظام المائية، فمن المهم أيضا أن نفكر في النظام الغذائي من الأسماك. تم العثور على العديد من الأطعمة الأسماك ملاءمة لتكون استروجين لصيد السمك. ولذلك فمن المهم لاختبار أي الأطعمة للنشاط (على سبيل المثال، في شاشة الاستروجين الخميرة، انظر بيريسفورد وآخرون. 14) قبل استخدامها في هذه الأنواع من الدراسات.

استكشاف الأخطاء وإصلاحهاالتحليل الكيميائي أو نعم بروتوكولات الفحص يتم تبسيط إذا عينات ضمان الجودة بما في ذلك السفر متعددة، والمختبرات ويتم تحليل الفراغات المذيبات جنبا إلى جنب مع الضوابط الإيجابية وعينات حقيقية للقضاء على النتائج السلبية الإيجابية الكاذبة والزائفة وصفها. إيجابي (على سبيل المثال، EE2) والسلبية وينبغي أيضا دائما أن تستخدم (الماء فقط تمييع) التحكم في المجراة فحوصات للتأكد من حساسية من العلامات البيولوجية البيولوجية المتوقعة أو نقطة النهاية (أي VTG أو التشريح المرضي)، والسماح لأي تلوث غير متوقع ليتم الكشف عن ( على سبيل المثال، من مجموعة تجريبية تصل، والنظام الغذائي، أو المياه تمييع). يجب التحقق من صحة أي تعديلات في البروتوكول قبل إجراء أي دراسة.

مع تنظيم أكثر صرامة للمركبات استروجين تدخل إلى البيئة من خلال نفايات محطات معالجة مياه الصرف فمن يتصور أن تقنيات معالجة مياه الصرف الصحي أكثر فعالية وسوف تحتاج إلى تطوير. بطارية من الاختبارات وصفها في هذه المخطوطة مجاملة للاختبارات تقييم السمية البيئية والكيميائية تطبق عادة لمعالجة مياه الصرف الصحي تصريف مياه الصرف. لذلك، تطبيقها في المستقبل من هذا النوع من البطاريات شاملة للاختبار يجب تمكين مطوري التكنولوجيا مياه الصرف الصحي، ومشغلي المصانع، لتنفيذ التصاميم الأكثر آمنة بيئيا النظر في أفضل الطرق لإزالة كل من المواد الكيميائية استروجين ينظم محددة والنشاط البيولوجي بشكل عام.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wellwash Versa plate washer Thermo Scientific 5165010
Plate reader Molecular Devices SpectraMax 340PC
Incubator Memmert INB 400 37 °C incubation required for carp assay
Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
Icemaker Scotsman AF80
12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
ELISA kits Biosense Laboratories V01018401-096 (Fathead minnow)
V01003402-096 (Carp)
Microfuge tubes, 0.5 ml Alpha labs LW2372
Microfuge tubes, 1.5 ml Alpha labs LW2375
Sulphuric acid, 95-98% Sigma-Aldrich 258105
Histology
Tissue processor Leica Biosystems TP1020
Wax dispenser Thermo Scientific Raymond Lamb E66HC
Metal embedding mold Leica Biosystems Various
Hot plate Thermo Scientific Shandon 3120063
Cold plate (EG1150 C) Leica Biosystems 14038838037
Heated forceps (EG F) Leica Biosystems 14038835824
Microtome Leica Biosystems RM2235
Paraffin section floatation  bath Electrothermal MH8517
Slide drying bench Electrothermal MH6616
Stainmate automated stainer Thermo Scientific Shandon E103/S10L
Cassettes, Histosette II, biopsy Simport M493
Paraffin wax Thermo Scientific Raymond Lamb W1
Histo-Clear II National Diagnostics HS-202
IMS (ethanol mix), IDA99 Tennants ID440
Polysine adhesion slides Thermo Scientific Gerhard Menzel J2800AMNZ
Cover slips, 22x50 mm VWR 631-0137
Histomount National Diagnostics HS-103
Haematoxylin Harris GURR VWR 351945S
Eosin, 1%, aqueous Pyramid Inovation S20007-E
Fisherbrand slide boxes Fisher Scientific 11701486
Microtome blades, MB35 Thermo Scientific Shandon 3050835
Bouin’s solution Sigma Aldrich HT10132-1L
Yeast screen
Flow cabinet Labcaire Systems Ltd SC12R
Cooled incubator LMS Cooled Incubator 303
Incubator Memmert INB 400
Shaker Grant PSU-10i
Fisherbrand whirlimixer Fisher Scientific 13214789
Plate shaker Heidolph Titramax 100 544-11200-00
12-Channel F1 digital multichannel pipette Thermo Scientific Finnpipette 4661070
12-channel pipette, electronic Sartorius 735441
96-well flat-bottom microplates MP Biomedicals
Thermo Scientific Nunc
Sarstedt		 76-232-05
260860
82.1581.001		 We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds
HPLC grade water Rathburn RH1020
Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
Potassium phosphate monobasic anhydrous Sigma-Aldrich P-5655
Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A-2939
Potassium hydroxide, pellets Sigma-Aldrich P-1767
Magnesium sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich M-2643
Iron(III) sulfate Sigma-Aldrich 307718
L-Leucine Sigma-Aldrich L-8912
L-Histidine Sigma-Aldrich H-6034
Adenine Sigma-Aldrich A-2786
L-Argenine, hydrochloride Sigma-Aldrich A-6969
L-Methionine Sigma-Aldrich M-5308
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T-8566
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I-7403
L-Lysine, hydrochloride Sigma-Aldrich L-8662
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P-5482
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G-8415
L-Valine Sigma-Aldrich V-0513
L-Serine Sigma-Aldrich S-4311
Thiamine, hydrochloride Sigma-Aldrich T-1270
Pyridoxine Sigma-Aldrich P-5669
D-Pantothenic acid, hemicalcium salt Sigma-Aldrich P-5155
Inositol Sigma-Aldrich I-5125
D-Biotin Sigma-Aldrich B-4639
D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers Sigma-Aldrich G-7021
L-Aspartic acid Sigma-Aldrich A-4534
L-Threonine Sigma-Aldrich T-8441
Copper(II) sulfate, anhydrous Sigma-Aldrich C-1297
Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 10884308001
Glycerol Sigma-Aldrich G-2025
17 β-Estradiol Sigma-Aldrich E-8875
Steroids
Acetone Rathburn
Acetonitrile Rathburn
Ammonia solution Rathburn
Ethylacetate Rathburn
Copper(II) nitrate Sigma-Aldrich
Acetone Rathburn
Dichloromethane Rathburn
2,4,16,16-d4-17β-estradiol CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-estrone CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol CDN Isotopes
17β-estradiol Sigma-Aldrich
Estrone Sigma-Aldrich
17α-ethynyl oestradiol Sigma-Aldrich
Hexane Rathburn
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich
Methanol Sigma-Aldrich
Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich
Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) Biotage
Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) Biotage
Fish study
orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 Watson Marlow 982.0063.000
straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 Watson Marlow 999.2008.000
pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m Watson Marlow 913.A008.016
200 series multi-channel persitaltic pump Watson Marlow 205CA
Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) VWR SFM1-3250
silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) VWR SFM1-5450
2.5 L glass winchester pk 4 Fisher Scienctific BTF-505-050B
magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 Fisher Scienctific FB55595 
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) Sigma Aldrich E10521-10G
17α-Ethynylestradiol Sigma Aldrich E4876-100MG
Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
SPE
1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 Sigma Aldrich 57276
disposable liners for manifold Sigma Aldrich 57059
filtration tubes without frits 6 ml pk 30 Sigma Aldrich 57242
reservior adaptors pk 12 Sigma Aldrich 57020-U
stainless steel weight for manifold pk 4 Sigma Aldrich 57278
male Luer plug for manifold pk 12 Sigma Aldrich 504351
SPE Vacuum Manifold Sigma Aldrich 57265
stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 Waters WAT054806
Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50  Waters WAT020515
Methanol HPLC grade 2.5 L Fisher Scientific M/4056/17
7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 Fisher Scientific TUL-520-031K
Absolute ethanol Hayman Kimia F200238
vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump Camlab 1136915

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T. State-of-the-science of endocrine disrupting chemicals. Toxicol. Lett. 211, (2012).
  2. Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).
  3. Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).
  4. Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).
  5. Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).
  6. Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
  7. Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).
  8. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
  9. Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).
  10. The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
  11. Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).
  12. Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511 (2015).
  13. EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. , British Standards Institute. London, UK. (2006).
  14. Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).
  15. Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).
  16. Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).
  17. Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).
  18. Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).
  19. Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).
  20. Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).
  21. Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
  22. Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).
  23. Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).
  24. Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).
  25. Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).
  26. Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).
  27. Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).
  28. Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  29. Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).
  30. Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32 (2012).
  31. Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).
  32. Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  33. Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).

Tags

العلوم البيئية، العدد 115، السمية الإيكولوجية، نعم الشاشة، يمكننا تعريف / MS، SPE، المؤتمر الشعبي العام، استروجين، الغدد الصماء مجمع، الكيمياء الخضراء، معالجة مياه الصرف الصحي، المنوة، Vitellogenin
استخدام البطارية من الطرق الكيميائية والسمية الإيكولوجية لتقييم فاعلية عمليات معالجة مياه الصرف الصحي لإزالة استروجين الفعالية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beresford, N., Baynes, A., Kanda,… More

Beresford, N., Baynes, A., Kanda, R., Mills, M. R., Arias-Salazar, K., Collins, T. J., Jobling, S. Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency. J. Vis. Exp. (115), e54243, doi:10.3791/54243 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter