Summary
Hormonforstyrrende forbindelser (EDC) utgjør en betydelig risiko for vannmiljøet. Kommunale renseanlegg er store bidragsytere til østrogen potens av overflatevann. Metodikken gitt i denne artikkelen gir en vurdering av effekt og egnethet av renseprosesser med hensyn til EDC fjerning.
Introduction
Bekymringer om de negative virkningene av hormonforstyrrende forbindelser på dyreliv reproduktiv helse har ført til at EU til å plassere to østrogen stoffer (østradiol og etinyløstradiol) på en "watch list" under vannrammedirektiv (WFD). EDC omfatter en rekke kjemiske klasser, inkludert naturlig og syntetisk steroid østrogen, narkotika, plantevernmidler og industrielle kjemikalier og bestanddeler av forbrukerprodukter med kjente skadevirkninger på dyreliv. Noen av disse forbindelsene potensielt kan påvirke menneskers helse 1.
Forskning har vist at utslipp fra renseanlegg er østrogen å fiske 2 og som en konsekvens mange resipienten er også østrogen for fisk tre. Dette ble første gang påvist gjennom nasjonale undersøkelser i Storbritannia som viste økt vitellogenin konsentrasjoner (en kvinnelig bestemt eggeplomme protein forløper 4) i blodet hos vill mannlige fisk og en høy prevalens intersex (utvikle egg og / eller kvinnelige kjønns kanaler i testiklene av hannfisk) i normalt gonochoristic fiskearter 5,6.
Konvensjonell kloakk behandling er vanligvis en tre trinns prosess som består av en innledende screening etterfulgt av primær og sekundær behandling som fjerner både oppløst og suspendert organisk materiale. Effekten av fjernelse av individuelle EDC er avhengig av de fysisk-kjemiske egenskaper av stoffene og på effektiviteten av behandlingsprosessen anvendt. For mange EDC fjerning via adsorpsjon og biologisk nedbrytning kan være betydelig, men ufullstendig. Tertiær behandling, for eksempel sand filtrering, kan være effektiv ved å øke EDC fjernelse 7, mens avansert behandling ved hjelp av avansert oksidering (for eksempel ozon) eller aktivert karbon kan være effektive for å oppnå nær fullstendig fjerning 7.
Vurderingen av ny teknologi for rensing av avløpsvann needs for å bestemme effekten av den foreslåtte fremgangsmåten i EDC fjerning. Et batteri av tester, inkludert målrettet kjemisk analyse sammen økotoksikologi testing, ved å bruke in vivo og in vitro bioanalyser, gir omfattende data for dette formålet. Selv om svært nyttig for regulatoriske formål, kan målrettede kjemiske analysen bare gi opplysninger om forbindelser (og spesifikke metabolitter) overvåket. Bioassays i tillegg la den "deteksjon" av negative effekter av metabolitter og behandling genererte avløpsvann transformasjon biprodukter som ellers ville være ubemerket 8,9. Dette notatet beskriver bruken av et batteri av kjemisk og vannmiljø laboratorieanalyser for å vurdere effekten av en rekke avanserte og nye renseprosesser i å fjerne østrogen potens av råolje og renset kloakk og motta farvann.
Protocol
Etikk uttalelse: Protokoller for å vurdere hormonforstyrrende aktivitet av kjemikalier / blandinger i fisk har blitt godkjent av Brunel University Animal Welfare og etisk Brødtekst (AWERB) og av den britiske Home Office under Dyr (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Vann Prøvetaking, Bevaring og Extraction
- Prøvetaking og bevaring
- Før bruk, rengjøre flaskene med en egnet overflateaktivt rengjøringsmiddel. Etter rengjøring, skyll flaskene med vann, avløp og tørr.
- Samle inn prøver i glassflasker av 2-l kapasitet inneholdende et konserveringsmiddel bestående av 0,5 g kobber (II) nitrat og 6 ml av 3,6 M saltsyreløsning. Oppbevar prøver under 10 ° C. Trekke ut og analysere så snart som mulig etter innsamling og bevaring.
- Eksempel utvinning og rydde opp (for steroid østrogen analyse) 10
- Solid Phase Extraction (SPE)
- Før ekstraksjon, for å redusere suspenderte faste stoffer, filtervannprøver ved hjelp av en mikrometer porestørrelse filterpapir.
- Når filtrert, pigg prøver med indre standard ved å tilsette 100 ul av spiking deuterert indre standard lageroppløsning inneholdende 2,4,16,16-d4 -estrone: 2,4,16,16-d4 -17β-østradiol (E2) og 2,4,16,16-d4 -17α-etinyløstradiol (EE2) (alle på 40 ug / L i metanol) til 1000 ml avløps (eller 100 ml innstrømmende) som resulterer i interne spike av 2 ng / L for kloakk utslippsprøver, og 20 ng / L for kloakk innstrømmende prøver.
- Fest engangs ventil liners, styren divinylbenzen SPE-kassetter og kassett reservoarer til SPE apparat. Slå på vakuumpumpen for å teste utstyret er tilstrekkelig forseglet.
- Pipetter 5 ml etylacetat i hvert reservoar, for å kondisjonere patronene. Slå på vakuumpumpen (til under 10 hPa for å tillate en strømningshastighet på mindre enn 10 ml per minutt)og trekk gjennom væsken. Ikke la SPE patronene tørke ut. Gjenta fremgangsmåten med 5 ml metanol, fulgt av 5 ml vann.
- Topp opp hver patron reservoar med vann og koble 1/8 "PTFE-rør mellom patronmagasiner og glassprøveflasker. Slå på vakuum ved en strømningshastighet på mindre enn 10 ml per minutt og la hele prøven til å passere gjennom patronen. tømme avfall kolben etter behov.
- Tørke SPE patroner under vakuum (eller ved hjelp av luft eller nitrogen) til kassetten innholdet endrer farge (for eksempel fra mørk brun til lys brun).
- Sett ren tørr 10 ml glass samling hetteglass i stativet og plass inne i utvinning manifold. Sjekk at alle liner er over en hetteglass. Pipetter 8 ml diklormetan i hver prøve reservoaret, slå på vakuumpumpen (flow rate på mindre enn 10 ml per minutt) og trekk væsken gjennom i samlingen hetteglassene.
- Fjern 10 ml hetteglass fra SPE manifoldog bruke en konsentrator for å redusere volumet til 1 ml. Overfør hver prøve til auto-sampler hetteglass og videre konsentrere seg til 100 pl bruker nitrogen blåse ned utstyr.
- Før ekstraksjon, for å redusere suspenderte faste stoffer, filtervannprøver ved hjelp av en mikrometer porestørrelse filterpapir.
- Gelpermeasjonskromatografi (GPC) opprydding
- Injiser 95 ul av den eluerte prøve ekstrakt i GPC-utstyrt HPLC ved anvendelse av betingelsene beskrevet i tabell 1. Konsentrer GPC trekke ned til 200 ul ved bruk av en konsentrator og nitrogen blåse ned apparat og deretter fyll opp til 2,0 ml med heksan.
- SPE opprydding
- Fest engangs ventil liners, aminopropyl kassetter og kassett reservoarer til SPE manifold. Sett ren tørr 10 ml glass samling hetteglass i stativet og plass inne i utvinning manifold. Pipetter 2 ml heksan i hvert reservoar, til tilstanden patronene. La væsken passere gjennom patronene.
- Pipetter GPC prøven ekstraktet inn i reservoaret, og igjen la væskenpassere gjennom patronen. Samle prøven eluatet i hetteglasset og fjern fra manifolden. Ikke kast eluatet.
- Sett en ny ren tørr 10 ml oppsamlingsbeger i stativet og plasser inne utvinning manifold. Å vaske patronen, tilsett 2 ml etylacetat i heksan (30% v / v) til reservoaret og trekke væsken gjennom patronen. Gjenta med ytterligere 2 ml etylacetat i heksan, forkaster alle vasker.
- Plasser original ml oppsamlingsbeger 10 (trinn 1.2.3.2) tilbake i stativet inne utvinning manifold. Pipetter 2 ml etylacetat i aceton (50% v / v) i reservoaret, innkobling av vakuumpumpen (til under 2 hPa for å tillate en strømningshastighet på mindre enn 2 ml per minutt) og trekke væsken gjennom inn i flasken . Gjenta fremgangsmåten med en annen 2 ml etylacetat.
- Fjern det prøveglass og bruke en konsentrator for å redusere ekstraktet volum til 1 ml. Overføre prøven til en mindre glassampulle og bruke nitrogen blåse ned utstyr, for å fordampe than trekke til begynnende tørrhet.
- Tilsett 100 ul metanol og bland godt. Overfør ekstrakt til en auto-sampler hetteglass (med 0,3 ml innsats) og cap hetteglasset. Analysere prøvene ved hjelp av LCMS / MS (se punkt 2).
- Solid Phase Extraction (SPE)
| Søyle: | PL gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 pm |
| Guard Kolonne: | PL gel, 50 x 7,5 mm, 5 pm |
| Mobil fase: | diklormetan |
| Strømningshastighet: | 1 ml per minutt |
| Kolonnetemperatur: | 25 ° C |
| UV-detektor: | 210 nm |
| Injeksjonsvolum: | 95 mL |
| Injeksjon modus: | Ståard |
| Tegn hastighet: | 500 ml per minutt |
| Eject hastighet: | 500 ml per minutt |
| Tegn stilling: | 3 mm |
| Fraksjon samlet: | 3 ml fraksjon (7 - 10 min) i 10 ml hetteglass |
Tabell 1. betingelser og parametere for gelpermeasjonskromatografi (GPC) opprydding utklippede avløpsprøver. Tabell detaljer GPC kolonne, mobil fase, temperatur, injeksjonsvolum, og detektoren bølgelengde.
- Eksempel utvinning (for gjær Østrogen Screen)
- Filtrer prøvene som beskrevet i kapittel 1.2.1.1. Fest engangs ventil liners, C18 SPE-kassetter og kassett reservoarer til SPE apparat. Slå på vakuumpumpen for å teste utstyret blir tilstrekkelig forseglet.
- Pipetter 5 ml metanol i hvert reservoar, til tilstanden C18 patroner. Slå på vakuum (til ca. 5 hPa for å tillate en strøm av ca. 5 ml per minutt), og la væsken løpe gjennom, pause i 1 minutt halvveis. Ikke la patronene gå tørr. Gjenta prosessen med enten HPLC-kvalitet eller dobbelt destillert vann (DDH 2 O). Igjen ikke gå tørr.
- Pakk vannprøver som beskrevet i punkt 1.2.1.4. Fortsett vakuum i minst 30 minutter for å tørke patronene.
- Plasser ren tørr 10 ml oppsamlingshetteglass i et rack i utvinning manifold. Sjekk at alle liner er over en hetteglass. Tilsett 5 ml metanol for hvert reservoar. Slå på vakuum (maks flyt av 5 ml / min) og la væsken passere gjennom patronen inn i hetteglasset, pause i 2 min halvveis gjennom.
- Før analyse med JA-skjermen, redusere ekstrakt til begynnende tørrhet ved hjelp av nitrogen og rekonstituere med 500-1000 mL etanol. Tett lokkene av prøverør for å unngå fordampning og holde ved 4 ° C (i en gnistfrittkjøleskap).
2. Kjemisk analyse ved hjelp av LCMS / MS
- Optimalisere driftsbetingelsene for LCMS / MS-systemet ved hjelp av produsentens instruksjoner.
- Analyser kalibreringsstandardløsninger, eksempel ekstrakter, blank og analytisk kvalitetskontroll (AQC) prøver ved bruk av væske-kromatografi og massespektrometri forhold, og overvåke ion overganger som beskrevet i tabell 2. Bestem konsentrasjonen av steroid østrogener i prøven ekstraktet ved hjelp av indre standarder 10.
| LCMS | |||||
| væskekromatografi | |||||
| Søyle: | C18 (2) 150 x 4,6 mm, 5 um. | ||||
| Injeksjonsvolum: | 20 mL | ||||
| Strømme: | 0,5 ml per minutt. | ||||
| Mobile fase: | Løsningsmiddel A: vann inneholdende 0,1% ammoniakk. | ||||
| Oppløsningsmiddel B: acetonitril. | |||||
| Gradient program: | |||||
| Tid (min) | 0 | 10 | 18 | 24 | 28 |
| A: B løsemiddel ratio | 90:10:00 | 50:50:00 | 0.479167 | 0.479167 | 90:10:00 |
| Massespektrometri | |||||
| Kilde: | Elektro (negativ ion) | ||||
| Gass og kilde: | CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi | ||||
| TEM: 600 ° C, CAD gass 5 og IonSpray spenning -900 | |||||
| MRM overganger: | |||||
| E1: | 269/145 og 269/143 | ||||
| E2: | 271/145 og 271/143 | ||||
| EE2: | 295/145 og 295/143 | ||||
| E1-D4: | 273/147 | ||||
| E2-D4: | 275/147 | ||||
| EE2-D4: | 299/145 | ||||
Tabell 2. Detaljer parametere og betingelser for LCMS / MS analyse av steroid østrogen i avløpsvann ekstrakter. Tabell gir prøveinjeksjonsvolum og strømningshastighet, løpeforhold ennd gradient.
3. østrogen aktivitet ved hjelp av In Vitro Gjær Østrogen Screen (JA) Assay 8
- Forbered og lagre minimal mellomstore og mellomstore komponenter som per tabell 3 (a) til (g).
| (a) Minimal Medium (pH 7,1): |
| Fremstille en Fe 2 (SO 4) 3-løsning ved å tilsette 40 mg av Fe 2 (SO 4) 3 til 50 ml dobbeltdestillert vann (DDH 2 O) |
| Tilsett 1 L DDH 2 O i en 2 liters glassbeger |
| Legg følgende komponenter til begeret: |
| 13.61 g KH 2 PO 4 |
| 1,98 g (NH 4) 2 SO 4 |
| 4,2 g KOH |
| 0,2 g MgSO4 |
| 1 ml av Fe 2 (SO 4) |
| 50 mg L-leucin |
| 50 mg L-histidin |
| 50 mg adenin |
| 20 mg L-arginin-HCl |
| 20 mg L-metionin |
| 30 mg L-tyrosin |
| 30 mg L-isoleucin |
| 30 mg L-lysin-HCl |
| 25 mg L-fenylalanin |
| 100 mg L-glutaminsyre |
| 150 mg L-valin |
| 375 mg L-serin |
| Sett begeret på oppvarmede rører med en magnetisk loppe og rør til alt er oppløst |
| Sjekk at pH er 7.1 og juster om nødvendig |
| Ved hjelp av en 50 ml steril sprøyte dispensere 45 ml porsjoner i glassflasker med metallskrukork lokk |
| Steriliser minimalmedium ved 121 ° C i 10 minutter i en autoklav |
| Oppbevares i romtemperatur |
| (b) D - (+) - Glukose: |
| Forbered en 20% w / v løsning i DDH 2 O |
| Tilsett 20 ml deler på glassflasker med metallskrukork lokk |
| Steriliser Glukose oppløsningen ved 121 ° C i 10 minutter i en autoklav |
| Oppbevares i romtemperatur |
| (c) L-Aspartic Acid: |
| Lag en stamløsning av 4 mg / ml i DDH 2 O |
| Tilsett 20 ml deler på glassflasker med metallskrukork lokk |
| Steriliser L-asparaginsyre-løsning ved 121 ° C i 10 minutter i en autoklav |
| Oppbevares i romtemperatur |
| (d) Vitamin Løsning: |
| Fremstille en biotin-løsning ved å tilsette 2 mg biotin 100 ml DDH 2 O |
| Vei opp 8 mg tiamin, 8 mg pyridoksin, 8 mg pantotensyre, 40 mg inositol. Legg alle de tørre komponenter og 20 ml av den biotin oppløsningen til 180 ml DDH 2 O |
| Gjøre 10 ml sterile aliquoter ved filtrering gjennom et 0,2 um porestørrelse engangs filter inn i sterile glassflasker, i en laminær luftstrøm kabinett |
| Oppbevar ved 4 ° C |
| (e) L-treonin: |
| Forbered 100 ml av 24 mg / ml L-treonin i DDH 2 O |
| Tilsett 10 ml deler på glassflasker med metallskrukork lokk |
| Steriliser L-treonin-løsning ved 121 ° C i 10 minutter i en autoklav |
| Oppbevares i romtemperatur |
| Fremstille 25 ml av en 20 mM kobber (II) sulfat oppløsning i DDH 2 O |
| Gjør 5 ml sterile delmengder ved filtrering gjennom en 0,2-mikrometer porestørrelse filter i sterile glassflasker, i en laminær kabinett |
| Oppbevares i romtemperatur |
| (g) klorfenol rød-β-D-galaktopyranosid (CPRG): |
| Fremstille 25 ml av en 10 mg / ml oppløsning av CPRG i DDH 2 O |
| Gjør 5 ml sterile delmengder ved filtrering gjennom en 0,2-mikrometer porestørrelse filter i sterile glassflasker, i en laminær kabinett |
| Oppbevar ved 4 ° C |
Tabell 3. Gjær Østrogen Screen analysen; tilberedning og oppbevaring av minimale mellomstore og mellom komponenter.
- Forberedelse og storage av 10x konsentrert gjærkultur
- På dag 1, forberede vekstmedium (som beskrevet i 3.4.1) og hell i en steril erlenmeyerkolbe. Legg 125 mL av 10x konsentrert gjær fra kryogene hetteglass oppbevares ved -20 ° C. Inkuber den inokulerte mediet ved 28 ° C i ca. 24 timer på en orbital-rystemaskin.
- På dag to, lage to flasker med vekstmedium (~ 50 ml) og hell i separate sterile koniske kolber. Tilsett 1 ml av 24-timers dyrkede gjær i hver kolbe av vekstmedier. Inkuber den inokulerte mediet ved 28 ° C i ca. 24 timer på en orbital-rystemaskin.
- På dag 3, hell hver 24-timers kultur i et sterilt 50 ml sentrifugerør. Sentrifuger 50 ml rør ved 4 ° C i 10 min ved 2000 x g. Hell av supernatanten, og re-suspen hver pellet i 5 ml minimalmedium med 15% glycerol. Gjør 0,5 ml prøver av 10x konsentrert gjærkultur i 1,2 ml sterile cryovials og oppbevar ved -20 ° C i inntil 4 måneder.
- behandling anleggrasjon og lagring av kjemiske aksjer for standardkurver
- Skyll alle glass og spatler to ganger med absolutt etanol og la tørke før bruk for å fjerne alle spor av forurensninger.
- Veie E2 direkte inn i et hetteglass i et pulver som veier skap og justere konsentrasjonen av volum i absolutt etanol. Fortynn til en konsentrasjon på 2x10 -7 M (54,48 ug / l). Seal lokk og oppbevar ved 4 ° C (i en gnistfritt kjøleskap).
- analyse~~POS=TRUNC produsent
- På dag 0, forberede vekstmedium. Til 45 ml flaske med minimalt medium tilsett 5 ml glukoseoppløsning, 1,25 ml L-asparaginsyre løsning, 0,5 ml vitaminløsning, 0,4 ml L-treonin-løsning, og 125 ul kobber (II) sulfatløsning. Hell vekstmedium inn i en steril Erlenmeyerkolbe.
- Legg 125 mL av 10x konsentrert lager (tint fra -20 ° C lagring) til kolben og inkuber inokulerte mediet ved 28 ° C i ca 24 timer på en orbital shaker.
- På dag 1, merke en steril 96-brønns 'fortynning plate' og lage serielle fortynninger (100 ul volum i etanol) av E2 standardkurve og forsøksstoff (er) / utstrømning ekstrakt (er) (f.eks, EE2).
- Etikett steril 96-brønns flatbunnet mikrotiterplate optisk 'analyseplate (r) ". På hver plate består av emnene (pluss / minus oppløsningsmiddel) og en E2 standardkurve, i tillegg til rader av forsøksstoff (er) / utstrømning ekstrakt (e).
- Pipetter 10 mL av hver konsentrasjon (E2, kjemiske eller trekke ut) i den aktuelle brønn av analyseplaten. Pipetter 10 ul etanol i hver 'oppløsningsmiddel blank "brønn av analyseplaten. La analyseplate med lokket ved å fordampe til tørrhet.
- Foreta en flaske med vekstmedium (~ 50 ml) og tilsett 0,5 ml av klorfenol rød-β-D-galaktopyranosid (CPRG) oppløsning per flaske. Bestemme tettheten av gjærceller i den 24-timers kultur ved å måle turbiditeten av kulturen ved 620 nm på en plateleser. Dyrk enssay medium med 4x10 7 gjærceller fra den 24-timers kultur.
- Hell inokulerte analysemedium inn i en steril trau. Ved hjelp av en flerkanals pipette Tilsett 200 ul av inokulerte analysemedium til hver brønn på 96-brønners analyseplate.
- Sett lokket på 96-brønners analyseplate og forsegle kantene med tape. Rist analyseplaten (e) kraftig i 2 min på en platerister titer og inkuber ved 32 ° C i et naturlig ventilert varmeskap.
- På dag 2, riste analyseplaten (e) kraftig på en titer platerister i 2 min. Gå tilbake til 32 ° C inkubator.
- På dag 4, riste analyseplaten (e) kraftig i 2 min på en titer plateryster. La platen (e) for å stå i omtrent 1 time og deretter lese analyseplaten (e) ved en absorbans på 540 nm (optimal absorbans for CPRG ~ 575 nm) og 620 nm (for turbiditet) ved anvendelse av en plateleser. La platen (e) ved værelsestemperatur og lese senere om nødvendig.
- På dag 0, forberede vekstmedium. Til 45 ml flaske med minimalt medium tilsett 5 ml glukoseoppløsning, 1,25 ml L-asparaginsyre løsning, 0,5 ml vitaminløsning, 0,4 ml L-treonin-løsning, og 125 ul kobber (II) sulfatløsning. Hell vekstmedium inn i en steril Erlenmeyerkolbe.
- Østrogen aktivitet beregninger <ol>
- Riktig analyseavlesninger for turbiditet ved hjelp av følgende ligning: Korrigert verdi = prøve eller standard (E2) absorbans ved 540 nm - [prøve eller standard (E2) absorbans ved 620 nm - blank absorbans ved 620 nm]. Plot E2 standardkurve med passende mellomrom (for å sjekke for forurensning) 8.
- Bruk den korrigerte prøven (ekstrakt eller kjemisk) for å beregne 'Estradiol ekvivalenter'. Bruk plottede E2 standard kurveverdier og regresjonsligningen (3-parameter polynom eller lineært avhengig av tilpasning) for å interpolere prøven / ekstrakt absorbansverdier for å E2 ekvivalente verdier. Bruk konsentrasjonsfaktoren (det vil si vann som trekkes ut og volum etanol ekstrakten resuspendert i) å beregne østrogen aktivitet i pre-ekstraherte prøven.
4. Laboratory basert vurdering av østrogen aktivitet ved hjelp av In Vivo Vitellogenin Induksjon i Male Fathead Minnows
- Bruk mannlige Fathead ørekyt (Pimephalespromelas)> 4 måneder gamle, som viser sekundære kjønnskarakteristika (dvs. utvikling av bryllups tubercles og en dorsal fatpad) indikerer mannlig seksuell besluttsomhet.
- For å hindre gyting aktivitet, menn separat moden tre uker (± 3 dager) før oppstart av testen. Satt opp i det minste to 45 liters glass akvarier med en maksimal mengde av 3 g / l. For å sikre et tilstrekkelig antall sunn fisk for testen, bruker et minimum av 100 menn.
- Hold hannfisken under identiske miljøforhold som vil oppleves i testen (dvs. vanntemperatur på 25 ± 1 ° C og 16: 8 timers lys: mørk daglengde). Opprett fortynningsvannet strømningshastigheten til hver tank for å sikre en 95% erstatning tid av minst hver 6 til 8 timer, dvs. 330 ml / min for en 45 l tank.
- Test apparater og eksperimentell design
- Bruk store glasstanker for å få plass til en lasting av opptil 3 g fisk per liter water. For 8 voksne menn (nominelt 4,5 g hver), kan du bruke en 10-20 L tank.
- Bruk to duplikate tankene for hver behandling og skjerme hver tank fra unødvendige synsforstyrrelser (dvs. bruke laminert kort skjermer mellom tankene). Identifiserer hver tank med en studie nummer, en eksponeringskonsentrasjon og et fartøy identifikasjonsnummer.
- For avløpsvannet studier
- Ved ankomst, overføres umiddelbart avløpet inn i en lagringstank ved 10 ± 1 ° C. Begynn dosering avløpsvann i løpet av to timer etter mottak av avløpsvannet.
- Strøm avløpet, via peristaltisk pumpe, fra 10 ° C lagringstanken til en akklimatisering fartøyet. Varm avløpsstrømmen i akklimatiserings fartøyet til 18 ± 2 ° C. Pump den oppvarmede utstrømning fra akklimatiseringsbeholderen til doserings / blandekarene og deretter til test akvarier (som holder fisken). Varm akvarier til en temperatur på 25 ± 1 ° C.
- For kjemiske doseringsstudier
- Veie test kjemikalier i et pulver som veier kabinett. Forbered konsentrerte kjemiske aksjer i DDH 2 O fortrinnsvis uten bruk av løsemidler.
Merk: Hvis løsningsmidler er nødvendig for å oppløse testforbindelser ved å bruke løsningsmiddelkontroller i tillegg til fortynningsvannet kontroll. - Tyngdekraften eller pumpe fortynningsvann fra en temperaturstyrt hodetank via strømningsstyringsinnretningen (e) til dosering / blandebeholder. Pumpen konsentrert kjemisk lager (e) ved hjelp av en peristaltisk pumpesystem til doserings / blandekar. Styre pumperaten (fra lager kjemisk) og vannstrømningshastighet (fortynning vann) for å oppnå den ønskede eksponering konsentrasjon.
Merk: Bruk silikonslanger for å mate vann / test kjemisk hver test fartøy fra doserings / blandekaret. Bruke en strømningshastighet som er tilstrekkelig til å gi en 75% fartøy erstatning i det minste i 24 timer, det vil si, 20 ml / min for en 20 l tank. Opprettholde strømningshastigheten ved ± 10% av den angitte nominelle verdi.
- Veie test kjemikalier i et pulver som veier kabinett. Forbered konsentrerte kjemiske aksjer i DDH 2 O fortrinnsvis uten bruk av løsemidler.
- Mate fisken to ganger om dagen med fersk tint frossen voksen artemia (Artemia) på 2,5 (± 0,1) g per tank per feed. Også mate fiskene en gang om dagen med en liten mengde (to finger klype) av en tropisk flake fisk mat. Legg igjen en minimum 3 timer mellom hver feed.
- Hold en daglig fôring posten for å overvåke fôring svar / oppførsel (god, moderat eller dårlig, sammenlignet med kontrollene). Sug tankene minst to ganger i uken (helst daglig) for å fjerne uspist mat og avføring. Rengjøre sidene og bunnen av forsøkskarene minst en gang per uke.
- Ta ukentlig vannprøves fra hver tank for å bekrefte østrogen aktivitet (via Yeast skjerm) og kjemisk sammensetning (via analytisk kjemi). Se pkt 1-3 for detaljer om vannprøver, ekstraksjon og analyse.
Merk: For hvert forsøk bruker fortynningsvann kontroll (negativ kontroll), positiv kontroll (E2 eller EE2) pluss minst tre fortynninger av eluatet (100, 50 og 25%) eller forsøksstoff for å overvåke responsen dose. Dersom nye teknologier er testet ved å bruke forbindelsen / avløpsvannet, med eller uten behandling (f.eks EE2 uten behandling, EE2 med TAML / hydrogenperoksid (H 2 O 2) behandling 12, figur 1).
- Bruk store glasstanker for å få plass til en lasting av opptil 3 g fisk per liter water. For 8 voksne menn (nominelt 4,5 g hver), kan du bruke en 10-20 L tank.
Figur 1. Diagram som representerer eksperimentell design av en in vivo Hodet ørekyte vitellogenin bioassay å bestemme fjerning av økotoksisitet 17α-etinyløstradiol hjelp TAML / peroxide vannbehandling. Den experimental satt opp består av åtte 11 L glass akvarier hver matet med kontinuerlig strøm av vann. Individuelle kjemisk stamløsninger og vann (filtrert de-klor) leveres til blandekamrene. Nominelle konsentrasjoner (uten reaksjon) i blande fartøyene er 2 ng / L EE2, 80 nM TAML og 0,16 mikrogram / LH 2 O 2. Kjemisk stamløsninger (EE2, H 2 O 2 og TAML) fremstilles og doseres separat, slik at reaksjonene starte i blandekarene. Fisk (8 hann Hodet ørekyte per tank) er utsatt for blandingen (e) etter en reaksjonstid kontakttid på ca 45 minutter. Vannprøver er tatt fra eksponerings tanker ukentlige. Plasmaprøver ble tatt fra Hodet ørekyte for å måle den østrogene biomarkør vitellogenin (vtg) fra en utgangsgruppe, ved starten av studien, og alle andre fisk etter 21 dagers eksponering. De spesifikke behandlinger er: 'C'; negativ kontroll (fortynning vann), '+'; positiv kontroll av EE2,'+ H'; EE2 pluss H 2 O 2, '+ T'; EE2 pluss H 2 O 2 pluss TAML. Dette tallet har blitt forandret fra Mills et al. 2015 12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Test prosedyre
- akklimatiseringsperiode
- Mål våtvekt (g) for hver kjønnsmoden hannfisk, og fordele på måfå til hver tank (8 hanner per tank).
- Holdes allokerte fisk fra samme parti og opprettholde dem under de samme testforhold. Bruk disse fiskene til å erstatte eventuelle personer som viser tegn på fysisk skade eller mangel på tilstand i løpet av 7 dager akklimatiseringsperiode. Sikre at ved slutten av den akklimatiseringsperiode hver behandlingstank har 8 menn som har fullt akklimatisert til forsøksbetingelsene.
- Ta 'baseline' plasmaprøver fra en ekstra 8 hanner fra samme BAtch av hannfisk. Følg blodprøvetakingsmetoden i punkt 4.4 og vitellogenin (VTG) analysemetode i 4,5.
- Etter akklimatiseringsperiode, levere avløpsvann eller kjemisk dosering aksjer til eksponeringstanker i 21 dager som beskrevet i 4.2.2 eller 4.2.3. Monitor dødelighet, oppførsel og fysisk utseende av fisken i hver tank replikere daglig før den første innmatingen av dagen. Spill unormal atferd eller hendelser.
Merk: Sørg for miljøforhold og fôring priser opprettholde helsen til fisken (§§ 4.2.4 og 4.2.5).
- akklimatiseringsperiode
- Sampling fisk etter 21 dagers eksponeringsperiode
- 12 timer før prøvetaking, slutte å mate fiskene.
- Merk mikro-sentrifugerør for innsamling av blodprøver, legger ~ 5 mL av aprotinin (en proteasehemmer) og plassere dem på is.
- Lag en 500 mg / L løsning av MS222 (bedøvelse) ved oppløsning av 500 mg MS222 per 1 L av de-klorvann (tidligere aklimatiserttil 25 ± 1 ° C). Nøytralisere MS222 til pH 7,4 ± 0,4 ved anvendelse av 1 M NaOH.
- Flytte hver fisk fra tanken inn i bufret MS222. Hold i oppløsningen inntil opphør av alle operculum bevegelse (typisk 5 ± 1 min).
- Mål og registrere gaffellengde (mm) under terminalen bedøvelse. Bruk en engangs skalpell amputere halen, og bruke en heparinisert hemocrit rør for å samle opp blod fra halearterien (figur 2). dispensere omhyggelig blod inn i den ferdigmerkede mikrosentrifugerør og hold på is.
- Drepe fisken umiddelbart etter trekking av blod. Bekrefte død ved permanent opphør av sirkulasjon og / eller ødeleggelse av hjernen. Måle og registrere total fiskevekt (til nærmeste 0,01 g), og dissekere vev etter behov.
- Sentrifuger blodet (7000 xg i 5 min ved 4 ° C) i løpet av 2 timer fra samlingen. Overfør plasmasupernatant ved hjelp av en pipette til ny merket 0,4 ml mikro badekares og butikken på is. Fryse rør inneholdende plasma på tørris i 30 min sentrifugering og oppbevar ved -80 ° C før analyse av plasmakonsentrasjoner VTG.
Figur 2. Bilder som viser mannlige Hodet ørekyte (Pimephales promelas), plasma innsamling og plasseringen av testikkel. På slutten av 21-dagers eksponering all fisk vil bli drept for å samle inn blodprøver. Når under denne terminalen bedøvelse fisken lengde (gaffellengde, mm) skal måles, raskt etterfulgt av blodprøvetaking fra halearterien Photo-A. Rød stiplet linje angir plassering for haleamputasjon (en engangs skalpell bør brukes til å amputere halen ). Foto-B viser et heparinisert hemocrit rør som brukes til å samle opp blodet. Hver fisk bør da drepes umiddelbart etter blodprøven er tatt, i dette tilfelle hele hodethar blitt skilt fra kroppen (Foto-C). Når fisken er blitt drept i kroppens hulrom kan åpnes opp for å avdekke de indre organer. Bilde-C viser plasseringen av testiklene (gonade) i forhold til svømmeblæren (SB) i cyprinid fisk, f.eks Hodet ørekyte, mort, karpe, etc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Mål plasmakonsentrasjoner med en homolog VTG enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) kit designet spesielt for Storhodet ørekyte VTG.
- Forbered VTG standarder og buffere som beskrevet i produsentens protokoll. Fortynn plasmaprøve 1:50, 1: 5000, og 1: 500 000 og analysere dem i to eksemplarer for å få målinger innenfor VTG standardkurven utvalg i henhold til produsentens anvisninger. Følg produsentens retningslinjer for å beregne vitellogenin konsentrasjoner.
5. Felt Vurderinger av Advanced / Novel avløpsvann teknologi for å motvirke østrogen aktivitet ved hjelp av In Vivo Vitellogenin og Intersex Induksjon i Roach (Rutilus rutilus)
- Fangst av vill mort levende ned strømmen av renseanlegget utløp
Merk: Bruk mort (Rutilus rutilus) eller andre rike ferskvanns eller brakkvann fiskearter, som er gonochoristic og kjent for å være følsomme for østrogen hormonforstyrrende.- Fange fisk ved hjelp electrofishing, netting, fangst eller andre anerkjente fiskemetoder, avhengig av situasjonen 13. Frakte fisken i karbonisert tanker tilbake til laboratoriet for prøvetaking.
- Forbered mikrosentrifugerør som beskrevet i 4.4.2. Forbered bufret MS222 som beskrevet i 4.4.3. Bedøve fisk som beskrevet i 4.4.4.
- Mål fisk lengde og vekten under terminal bedøvelse.
- Samle blod fra halearterien ved hjelp disposobel heparinisert sprøyte. Drep hver fisk umiddelbart etter blodprøvetakning. dispensere nøye blodet inn pre-merket mikrosentrifugerør og holde på is. Fremstille plasma som beskrevet i trinn 4.4.7 og måle VTG ved hjelp av ELISA (4,5).
- Bruk pinsett fjerne 2-3 skjell fra hver fisk og plassere i individuelt merket små papirkonvolutter. Oppbevar konvolutter ved romtemperatur under tørre forhold for senere fisk aldersbestemmelse og vekstanalyse.
- Åpen kroppens hulrom med en skalpell for å vise de indre organer. Ta ut tarmen for å avsløre svømmeblæren med en gonade ligger på hver side (figur 2). Fjern forsiktig de sammenkoblede gonadene med fin nosed tang og sted inn i et hetteglass. Dekk gonadene med Bouin er fiksativ i forholdet 1:10 vev: fiksativ.
- La vevet i Bouins til 6-24 timer, avhengig av størrelsen av vevet (fiksativ penetrerer ved 1 mm per time). Når fast, hell av Bouin er fiksativ end erstatte med 70% denaturert sprit (IMS). Oppbevar fast vev i romtemperatur til vev behandles for histopatologi (punkt 5.3).
- Feltet basert vurdering av østrogen aktivitet ved hjelp av in vivo vitellogenin og intersex induksjon i mort
- Eksperimentell design og sette opp
Merk: Sett opp tankene og pilotanlegg i god tid før in vivo arbeidet starter. Start av tankene som strømmer 3-4 uker før noen tilsetning av fisk til systemet. Overvåk vann strømningsrater, vannkvalitet og forhold (pH, temperatur, oppløst oksygen, etc.) regelmessig for å forsikre parametre kan opprettholdes.- Konstruer store tanker (f.eks 300-1000 L) på stedet ved pilotanlegget, som kan motta "kontroll" de-klorvann fra springen, standard behandlet avløpsvann (e) og avansert behandlet avløpsvann (e) i parallell. Fest luftpumpe / ventilasjonsanleggene til tankene. Sett vannmengder for å oppnå minst seks tank vKanonvolumet børser per dag.
Merk: Sørg for at stridsvogner er godt isolert og skyggelagt for å hindre overdreven daglige temperatursvingninger. Designtanker for å tillate observasjon av fisken, for atferdsmessige endringer (manglende foring, etc.), tegn til sykdom og dødelighet.
- Konstruer store tanker (f.eks 300-1000 L) på stedet ved pilotanlegget, som kan motta "kontroll" de-klorvann fra springen, standard behandlet avløpsvann (e) og avansert behandlet avløpsvann (e) i parallell. Fest luftpumpe / ventilasjonsanleggene til tankene. Sett vannmengder for å oppnå minst seks tank vKanonvolumet børser per dag.
- Start eksponering av flytende poser med mort (fra oppdrettsanlegg) i de respektive tanker for en time. Legg tank vann til poser gradvis til vanntemperatur og forholdene er ambient. Slipp fisken inn i deres tanker.
- Mate voksen mort daglig på pelletert fiskefôr (størrelse 0,5-0,8). Strøm juvenile mort daglig på liten pelletert (granulstørrelser 100-300) ikke-østrogen mate 14 ad libitum, justert på basis av uspist strømmen. Hold en daglig dokumentere fôring svar / oppførsel fôring record (god, moderat eller dårlig, sammenlignet med kontrollene).
- Ta ukentlige vannprøver fra hver tank for å bekrefte østrogen aktivitet og kjemisk sammensetning. See seksjoner 1-3 Nærmere informasjon om vannprøve og analysemetoder.
- Eksperimentell design og sette opp
- Histopatologi av fisk gonadene 15
- Fjern forsiktig dissekert og faste gonader (beskrevet i trinn 5.1.6 og 5.1.7) fra beholderen med pinsett og legg dem på et skjærebrett.
- Bruk en mikrotom kniv for å skjære hver gonade inn i 3 deler (anterior, midten og bakre) og fra hver del kuttet en 3-5 mm tykk tverrsnitt. Plasser forsiktig alle seks stykker i en merket plast biopsi kassett, og plasser i vev prosessor ved hjelp av timings er oppført i tabell 4.
- Voks legge ned vev og avsnittet om rotasjonsmikrotom (3-5 mm). Overfør deler til merket bio-lim belagt glassplater og plassere lysbilder på en oppvarmet plate (satt til 45 ° C) for å tørke i 24 timer.
- Flekk lysbildene, enten manuelt eller ved hjelp av en automatisert Stainer, ved hjelp av timings beskrevet i tabell 5. Plasser en dråpe monteringsmiddel på farget vev, og lay et glass dekkglass over festemiddel for å beskytte vevet.
- Først undersøke hvert lysbilde ved lav forstørrelse (20x, dvs. 2X objektiv, med 10X øye linjer forstørrelse) for å bestemme kjønn og antall poeng av vedlegg til kroppens hulrom 15. Merk noe unormalt for hver fisk.
- På et høyere forstørrelse (100X eller 400X), undersøke vev å vurdere gametogenesis etapper, misdannelser og tilstedeværelsen av ubefruktede egg i testikkelvevet. Registrere graden av intersex anvendelse av følgende karaktersystem varierer fra 0 (normal hann vev) til 7 (100% ovarievev) 6 (se tabell 6).
Trinn nummer Behandling Hensikt Tid (t) 1 70% IMS dehydrering 3 2 90% IMS dehydrering 2,5 3 95% IMS dehydrering 1.5 4 100% IMS dehydrering 1.5 5 100% IMS dehydrering 1.5 6 100% IMS dehydrering 1.5 7 100% IMS dehydrering 1.5 8 Histologi clearingmiddel Lysning 1.5 9 Histologi clearingmiddel Lysning 1.5 10 Histologi clearingmiddel Lysning 1.5 11 VOKS Wax infiltrasjon 1,25 12 VOKS Wax infiltrasjon 1,25 20 hr TOTAL Tabell 4. Processing regime for voks impregnering vev for histopatologi. Vev skal behandles i et automatisk vev prosessor. Vev bør være midt i løsningene som er beskrevet for den tid som er angitt.
Flekk nei. Flekk Hensikt Tid (min) 1 Histologi Clearing middel Løser voks 15 2 hydration 2 3 90% IMS hydration 2 4 70% IMS hydration 2 5 TAP VANN (kjører) Skylle 2 6 HAEMOTOXYLIN Flekker cellekjerner blå 10 7 TAP VANN (kjører) Fjern overflødig 10 8 forsurede IMS dechlorination 20 sek 9 TAP VANN (kjører) Skylle 20 sek 10 Lico 3 Salt 20 sek 11 TAP VANN (kjører) Skylle 20 sek 12 1% eosin (AQUEOUS) Flekker cytoplasma rosa 20 sek 1. 3 TAP VANN (kjører) Fjern overflødig 5 14 70% IMS dehydrering 2 15 90% IMS dehydrering 2 16 100% IMS dehydrering 5 17 Histologi Clearing middel Fjern IMS, bindemiddel 5 Tabell 5. Solutions og redningstider for haematoxylin og eosin (H & E) farging av fisk gonadale vev. Slides bør plasseres i hvert bad for Allocrerte tid i rekkefølge. H & E farging av vev er nødvendig for å fastslå utviklings eller organisatoriske konsekvenser av østrogen avløpsvann utslipp på fiske gonader.
Score Del Beskrivelse 0 Normal mannlig testikkel 1 Multifokal ovotestis med 1-5 ubefruktede egg (vanligvis enkeltvis) spredt blant testikkelvev 2 Multifokal ovotestis, 6-20 oocytter ofte i små klynger spredt blant testikkelvev 3 Multifokal ovotestis, 21-50 ubefruktede egg i klynger 4 > 50 og <100 oocytter. Seksjon er multifokal vanligvis og har utseendet av en mosaikk av testicular og eggstokkvev. 5 > 100 ubefruktede egg, vanligvis multifokal men kan også være samlings med klart identifiserbare soner av eggstokkreft og testikkelvev skilt fra testikkelvevet. 6 > 50 prosent av gonadal vev på seksjonen er ovarian og er klart adskilt fra den testikkelvev av epitel-celler og fagocyttiske vev. 7 100 prosent av gonadal vev på seksjonen er eggstokkene. Tabell 6. scoring system for å vurdere alvorlighetsgraden av intersex tilstand mort. Histologisk preparerte lysbilder av gonadal vev bør undersøkes under lysmikroskop, på 20X, 100X og 400X forstørrelse, for å vurdere eventuelle avvik og tilstedeværelsen av ubefruktede egg i testikkelvevet. Denne tabellen er endret fra Jobling <em> et al. 2006 6.
Representative Results
Forsøk på å forstå virkningen av forbedringene til avløpsvann behandlingsprosesser eller for å bestemme den mest aktuelle teknologien for å ettermontere utstyr som tertiær behandling ved eksisterende renseanlegg med hensyn til effekten av fjerning av hormonforstyrrende aktivitet utskrevne avløpsvann, krever ikke bare målingen av nøkkelen kjemisk komponenter som inngår verk, men krever analyse av nedbrytningsprodukter som også kan ha hormonforstyrrende aktivitet. I innenlandske kloakkutslipp, de østrogene stoffer er steroidhormoner, østron (E1), 17β-østradiol (E2) og 17α-etinyløstradiol (EE2) 5,8. Steroid østrogener er primært utskilles fra kroppen som en blanding av inaktive konjugater 16,17. Disse konjugerte østrogener er vesentlig deconjugated i avløpssystemet ved bakteriell aktivitet og videre nedbrytning skjer i renseanlegg. De deconjugated steroider are fjernes fra avløpsvannet strømmen ved adsorpsjon til slam eller brytes ned i løpet av sekundær behandling som resulterer i dannelsen, for det første omdannings biprodukter og til slutt fullstendig mineralisering kan forekomme for den første aktive komponenten. Den kjemiske analyse av alle de enkelte forbindelser i avløpsstrømmen ville være vanskelig, tidkrevende og kostbar og vil ikke dekke ukjente aktive komponenter er tilstede i en prøve. Videre vil en sum av østrogen bidraget av hver komponent bare gi en indikasjon på den kumulative østrogene potens av en prøve av forbindelsene analysert. Dette er en risiko der transformasjonsprosesser generere ukjente østrogen stoffer eller hvor innløpet er av industriell opprinnelse. Ved å kombinere kjemisk analyse med in vivo og in vitro bioanalyser økotoksikologi gir en løsning på nærværet av ukjente østrogene komponenter i blandinger slik som behandlet kloakk. In vitro assays slik som gjær Østrogen Screen (JA) har blitt brukt mye til å bestemme østrogen aktivitet av kloakkutslipp og bidra til å identifisere de aktive komponentene i behandlede prøver 8,18,19. Imidlertid kan sammenligninger mellom in vivo og in vitro testing være betydelig 11 og en omfattende evaluering av nye prosesser med hensyn til behandling av hormonforstyrrende potens krever et batteri av kjemiske og økotoksikologi tester.
En bestemmelse av hvorvidt individuelle renseanlegg eller prosesser fjerne aktive forbindelser fra avløpsvann strømmen kan oppnås ved hjelp av kjemisk analyse som følger prøven ekstraksjon, konsentrering og rensing av ekstraktet før analysen, som oftest utføres ved hjelp av LCMS (/ MS) eller GCMS (/ MS) metoder. Resultatene fra kjemisk analyse av data kan brukes til å fastslå samsvar med individuell Forutsatt ingen effekt konsentrasjon (PNEC) 20 eller miljø kvalitetsstandards (EQS) 21 av spesifikke individuelle forbindelser og derfor slike metoder er avgjørende for overholdelse av regelverk data. Videre er rettet eller ikke-målrettede kjemiske analysemetoder tillate identifikasjon og kvantifisering av de enkelte forbindelser eller isomerer, sammenlignet med biologiske metoder, som gir en total respons. Kjemiske analysemetoder derfor tillate vurdering av diskrete forbindelser som skal gjøres for å møte og å løse disse renseanlegg utfordringer på en individuell behandling plante basis. Studier har vist at konvensjonelle avløpsrensing (f.eks aktiverte slamanlegg) kan være svært effektive i fjerning av naturlige steroidhormoner selv om fjernelse av det syntetiske hormon EE2 tendens til å være mindre effektive. Feltstudier ved hjelp av avansert behandling under anvendelse av teknikker som for eksempel ozon, har granulert aktivert karbon (GAC) og membraner viste, dog på høy pris, at de kan brukes som en end-of-pipe-løsning for å fjerne EE2 til under predicted effektnivåer og til under deteksjonsgrensen. Figur 3 viser fjerning av EE2 hjelp GAC på pilotskala kommunalt renseanlegg. Studier gjennomført i pilotskala ved kommunale renseanlegg ved hjelp enden av røret GAC behandling viser også reduksjon i østrogen potens følgende GAC målt ved hjelp av gjær Østrogen Screen (JA) som vist i Figur 4.
Figur 3. Eksempel feltdata som viser fjerningen av etinyløstradiol følgende avansert tertiær behandling. (A) Prøver samles fra renseanlegg følgende konvensjonelle (aktivert slam) behandling ifølge fremgangsmåtene beskrevet for prøve bevaring. (B) Prøvene er hentet ved hjelp av fast fase ekstraksjon, renset opp for å fjerne forstyrrende stoffer ved hjelp av normal fase SPE oggelpermeasjonskromatografi. (C) Det rene konsentrerte ekstrakt konsentreres til et lite volum og analysert ved bruk av elektrospray negativ ion LCMS / MS i MRM-modus. Resultatene er beregnet ved hjelp av interne standardisering hjelp isotopisk merkede interne standarder. I det viste eksempel er EE2 til stede i den endelige ASP avløpet ved en konsentrasjon over den forutsagte Det beregnede nivå (PNEC) på 0,1 ng / l og er fjernet ved hjelp GAC og ozon (O 3) til en miljømessig sikker konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Bilde av en gjær Estrogen skjerm (YES) analyseplate (A) som viser fargeendring fra gult til rødt, knyttet til østrogen aktivitet av prøvene. Tomter er opprettet fra JA analyseplaten viser korrigert absorbans (540nm) av østradiol standard (B), aktivert slamprosess avløpet (ASP) og Granulært aktivert karbon (GAC) behandlet avløpsvann prøver (C). Hver prøve ble testet i duplikat. ASP og GAC avløp ble trukket ut og konsentrert ved hjelp av SPE metoder beskrevet i seksjon 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ozonering er også effektiv i å fjerne steroid østrogen og østrogen aktivitet fra konvensjonelt behandlede renseanlegg. Ozon er i stand til å oksidere et bredt spekter av organiske forurensninger og oppløst organisk materiale i kloakkprøver og gir desinfeksjonsegenskaper. Effektiviteten av ozonbehandling er avhengig av vann egenskaper som pH, mengden av organisk materiale og den anvendte dose av ozon. Østrogener som er dårlig fjernes ved konvensjonell behandling kan blifjernes fra avløpsvannet med doser mellom 0,8 og 2 mg O 3 / mg DOC. Ozon er et selektivt oksidasjonsmiddel, som reagerer med elektronrike steder (umettet karbon-karbon-bindinger, aromatiske forbindelser innbefattende aromatiske alkoholer), som gjør ozon anvendelig for nedbryting av et antall av EDC. Imidlertid ikke eliminering av de enkelte forbindelser ikke nødvendigvis føre til den fullstendige mineraliseringen av den opprinnelige forbindelse. Organiske stoffer etter ozonering kan transformeres genererende mellomprodukter eller transformasjon oksydasjon biprodukter som omfatter et antall av lav molekylvekt, polare klasser av forbindelser, så som aldehyder, ketoner, karboksylsyrer, keto syrer, og bromerte forbindelser. Eksempler omfatter, bromat, formaldehyd, acetaldehyd og karboksylsyrer. Ved hjelp av in vivo og in vitro bioanalyser har det vist seg at selv om ozon bare delvis oksyderer noen kjemiske stoffer, de resulterende store omdanningsprodukter har en lavere estrogENIC potens og følgelig anvendelse av ozon ved en passende dose resulterer i en høy fjerning av østrogenaktivitet.
En av de store fordelene med ytterligere behandling av avløpsvann er reduksjonen i feminisering av hannfisk i resipientvann; en uheldig virkning som kan føre til redusert fertilitet 3. In vivo-undersøkelser med fisk (f.eks mort eller Hodet ørekyte) som utsettes for avløpsvann vis hunnkjønnsceller eller oocytter i testis av hannfisk (for eksempel, som vist i figur 5). Intersex eller mannlig VTG er fraværende eller betydelig redusert i fisk etter avansert behandling som GAC 7 eller ozon 22. Disse studiene viser at omdanningsprodukter produsert under ozonering er ikke østrogen, men dette løser ikke giftigheten av avløpsvannet som produseres. Dette problemet er løst i andre studier, for eksempel en studie av Magdeburg et al. 12,24 - 26. TAML aktivatorer med H 2 O 2 effektivt fornedre EE2 og andre steroid østrogener i ren laboratorium vann, samt i utslipp fra kommunale renseanlegg og i piggete urinprøver 12. Laboratoriestudier viser TAML / H 2 O 2 behandling gir høy steroid østrogen fjerning inkludert EE2 fjerning og vesentlig reduserer østrogen aktivitet målt in vitro ved bruk av JA bioassay og substantially avtar fisk feminisering in vivo målt ved hjelp vtg bioanalysen (figur 1 og figur 6). 
Figur 5. Mikrofotografier av en normal mann (A) og intersex (B, C) gonader fra voksen mort (Rutilus rutilus) utsatt for avløpsvann i et felt basert vurdering. Mikroskopbilde-A, viser et histologisk del av normal mannlig testikkel. Mikroskopbilde-B og C, viser histologiske snitt av en intersex hannfisk, etter å ha blitt utsatt for aktivert slam prosess avløpsvannet i seks måneder. Pilene viser oocytter stede i testikkelvevet. Scale bar representerer 100 mikrometer i hver mikrofotografiet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 6. Gjennomsnittlig EE2 konsentrasjon og østrogenisk aktivitet i behandlede og ubehandlede tank vann (A) og plasma vitellogenin i referanse og eksponert hannfisk (B). A) EE2 konsentrasjon (ng / L, mørk blå søyler) ble målt ved LCMS / MS , østrogen aktivitet (EE2 tilsvar ng / L, mørke grønne søyler) ble målt via in vitro Gjær Østrogen Screen (JA). B) Plasma vitellogenin (ng / ml, lyseblå søyler) konsentrasjon hos hannStorHodet ørekyte ble målt via en kvantitativ enzym -bundne immunosorbent-assay (ELISA). EE2 kjemiske analyseresultatene rapporteres som <0,03 ng / L EE2 (dvs. lavere enn deteksjonsgrense (LOD)) ble behandlet som å ha en halv LOD (dvs. 2 O 2 + TAML, EE2 + H 2 O 2, og EE2 beskyttet. Feilfelt i graf-A representerer standardfeil av gjennomsnittet, feilfelt i graf-B representerer standardavvik. Bokstaver over stolpene i diagrammet-B representerer statistisk likhet. Dette tallet har blitt forandret fra Mills et al. 12 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Renseanlegg er den viktigste ruten for overvann forurensning med EDC. En evaluering av effektiviteten av fjerning av endokrin aktivitet av konvensjonelle, avanserte eller nye behandlingsprosesser krever bruk av en rekke kjemiske og biologiske analyser. Kjemisk analyse ved hjelp av ikke-målrettede og målrettet analyse gir kvalitative eller kvantitative data om effekten av fjerning av enkeltkomponenter og derfor gjør en vurdering som skal gjøres mot miljøkvalitetsstandarder eller spådd ingen effektkonsentrasjoner for forbindelser eller blandinger av forbindelser analysert.
Genereringen av omdanningsprodukter som følge av ufullstendig mineralisering av stoffer etter behandling og nærværet av ukjente biologisk aktive komponenter i spillvannet begrenser nytten av kjemiske tester alene. En kombinasjon av in vivo og in vitro bioassay i kombinasjon med analytisk kjemiry screening gir en nyttig verktøykasse for å fastslå effekten av EDC fjerning av nye renseprosesser. Disse testene, når utført sammen med tradisjonelle vannkvalitetsparametre og andre toksikologiske og mikrobiologiske endepunkter tillate en kritisk vurdering av nåværende og kommende renseteknologier.
Det er viktig å merke seg at gjær basert østrogen skjermer (f.eks, YES) er ikke den eneste in vitro assays for å bestemme østrogene potens av kjemikalier og avløpsvann. En rekke av stabilt transfekterte pattedyrcellebaserte analyser er blitt utviklet for, for eksempel, henholdsvis ER-CALUX 27 og hERα-HeLa-9903 28 med humane brystcancerceller eller cervikale tumorceller. Den JA har blitt sammenlignet med tilsvarende pattedyrcellebaserte analyser og har blitt funnet å ha et tilsvarende høyt nivå av reproduserbarhet, sanne positive og sanne negative østrogen identifikasjons priser 29, selv omugh det er noen ganger vurdert å være litt mindre følsom 27. En fordel med gjær basert reporter analyser er at i laboratorier uten betydelig erfaring med pattedyrcellekultur JA kan lettere vedtatt, da det krever mindre strenge tiltak bio-kontroll og sterile teknikker (YES kan utføres på benken toppen om nødvendig) . De menneskecelle baserte analyser krever også CO 2 inkubatorer og luminometers sammenlignet med standard inkubator og mikro lesere som brukes i JA. To gjær basert østrogen reporter analyser (JA, Saccharomyces cerevisiae og A-JA, Arxula adeninivorans) er for tiden gjennomgår interlaboratorie løyper for validering av ISO 19040 "Vannundersøkelse - Bestemmelse av østrogen potensialet for vann og avløp" fremhever de næringer interessen for disse teknikkene.
Det finnes en rekke begrensninger i de metoder som er beskrevet som omfatter den potensielle forurensningav prøvene under prøvetaking, prøveoppbevaring og analyse med østrogen stoffer som kommer fra felt eller laboratorium miljøet eller menneskelig forurensning (f.eks myknere, tensider, personlig pleie produkter). Denne type av forurensning i YES-analysen (eller andre cellebaserte analyser rapportør) vil heve bakgrunnen og påvirke bruken av analysen. Vannprøver eller løsemidler som er lagret i plastflasker kan lett føre til falske positiver. Falske negative er også av interesse både LCMS / MS og JA analysen krever SPE å konsentrere østrogener til påvisbare nivåer. Matrisen, valg av SPE sorbent og elueringsløsningsmiddel kan påvirke ekstraksjonseffektiviteten og de typer av forbindelser eluert. Ved hjelp av C18 SPE-patron for ekstraksjon ved anvendelse av betingelsene beskrevet i denne protokollen kan danne en negativ forspenning, som sterkt polare og basiske forbindelser ville bli dårlig beholdes av sorbenten. Videre krever denne protokollen tilberedning av elueres JA elueringsmiddel fra metanol til etanol via fordampning til tørrhet funder nitrogen som resulterer i tap av flyktige forbindelser. Som et resultat av protokollen kunne gi underestimert østrogenisk aktivitet av testede prøver. Disse begrensningene er spesielt viktig når de vurderer JA analysen som ukjente eller uventede forbindelser kan være savnet, fordi de ikke har blitt trukket ut, eller de går tapt på grunn av fordampning. Videre gjør LCMS / MS teknikk bruken av merkede interne standarder for å korrigere for utvinning; denne fremgangsmåten kan ikke brukes med YES-analysen.
Betydelige begrensninger av in vivo-testing av avløpsvann omfatter høye kostnadene og tiden som kreves for vurdering sammenlignet med in vitro metoder. For tiden bruken av fiskeembryo tester for å påvise østrogen aktivitet er begrenset. Imidlertid har det vært en viss suksess med å produsere østrogen responsive transgen glødende fiskeembryoer 30, som kan ha fremtidige søknader. Fathead ørekyt (brukt i denne protocol) er en vanlig laboratorie art og vtg induksjon i hannfisk er et godt dokumentert bio-markør på østrogeneksponering og en målbar grad av avløpsvannet østrogenisitet 22 eller andre østrogen-forbindelser eller blandinger 31. OECD test retningslinjer for hormonforstyrrende kjemikalier er godkjent for bruk voksen Hodet ørekyte, japansk medaka og sebrafisk 32,33, med VTG være en sensitiv biomarkør av østrogen eksponering i alle tre arter. Men VTG induksjon ikke direkte relateres til forplantningsskader og derfor de økologiske konsekvensene av avløpsvann eksponering, sett i alvorlig intersex mort tre. På den annen side, mort er ikke en klassisk 'laboratorium artens for økotoksikologi forskning på grunn av sin store størrelse, lang generasjonstid (2-3 år å nå seksuell modenhet), reproduktiv stil; gruppe gyting (avl) finner sted en gang i året, og det er vanskelig å identifisere menn fra kvinner (andre enn undergytesesongen). Imidlertid har dette normalt gonochoristic arter blitt svært godt studert i Storbritannia, på grunn av oppdagelsen av at nedstrøms av østrogen avløpsvann utslipp, mannlige fisk utstilt forstyrrelsene til sin endokrinologi (f.eks tilstedeværelse av kvinnelige spesifikke vitellogenin i blodet) og histopatologi (ovotestes - utvikle egg i testiklene og / eller kvinnelige kjønns kanaler) 5,6. Derfor, som en fremtidig anvendelse av disse protokollene, mort (eller lignende arter) kan være et nyttig vill Sentinel arter å vise om reelle forbedringer i avløpsvann kvalitet (og redusert østrogenisiteten) er sett i elver som får avansert behandlet avløpsvann. De kan også være ansatt i slutten av rørsystemer til å overvåke teknologisk forbedret utslipp fra pilotskala planter 7. Når du vurderer hvilke arter som skal brukes i in vivo avløpsvann vurderingene er det en avveining mellom relativt rask og kontrollert testing med laboratorie arter i forhold tillengre feltbasert, men mer miljø relevant, testing ved hjelp av stedegne arter. Men slik in vivo vurderingene er høye kostnader og bør bare betraktes som det siste settet med tester følgende vurderinger ved hjelp av kjemisk analyse og in vitro-analyser.
Kritiske trinnene i protokollen beskrevet omfatter fremstillingen og håndteringen av prøver og glass (dvs. flasker og prøvetakingsutstyret skal forbehandles med passende overflateaktivt rengjøringsmiddel) for å unngå forurensning av prøver fra miljøforurensninger inkludert begrensende prøvene kommer i kontakt med plast og andre materialer som kan produsere falske positiver. Dette er like viktig når designe og bygge akvarier og fisk eksponeringssystemer. Ideelt akvarier (bolig aksjer og under eksponeringer) bør bygget av materialer med lav adsorpsjon 32 med minimal forurensning risiko. Rustfritt stål kan brukes til avløp eller vannholdetanker.Mens tanker av en glasskonstruksjon er foretrukket for fisketanker (da dette gir også enkel observasjon av fisken). Bruken av lav karakter plastrør eller slangen bør unngås 32, kan PVC 34 og ABS brukes hvis 'riktig krydret ", dvs igjen å lekke ut eventuelle forurensninger i rennende fortynning vann i minst 12 timer før bruk. Medisinsk silisium slangen har vært ansatt hell i våre anlegg for slangepumpe levering av kjemikalier og avløpsvann / fortynning vann til tanker. Samt vurderer østrogen forurensning i bygging og drift av aquatics system, er det også viktig å tenke på kosthold på fisk; mange anstendighet fiskefor har vist seg å være østrogene til fisk. Derfor er det viktig å teste noen matvarer for aktivitet (for eksempel i gjær Østrogen Screen, Se Beresford et al. 14) før du bruker dem i disse typer studier.
Feilsøkingav kjemisk analyse eller JA analyseprotokoller beskrevet forenkles hvis kvalitetssikringsprøver inkludert flere reiser, laboratorium og løsemiddel blanks analyseres sammen med positive kontroller og reelle prøver å eliminere falske positive og falske negative resultater. Positiv (f.eks EE2) og negative (fortynning bare vann) kontroll bør også alltid brukes i in vivo-tester for å bekrefte følsomheten forventet biologisk biomarkør eller endepunkt (dvs. VTG eller histopatologi), og la noen uventet forurensning skal oppdages ( for eksempel fra eksperimentelle oppsett, kosthold, eller fortynning farvann). Eventuelle endringer i protokollen skal valideres før gjennomføre enhver undersøkelse.
Med strengere regulering av østrogen forbindelser inn i miljøet via renseanlegg utslipp er det for seg at mer effektive renseteknologier må utvikles. Batteriet av testene som er beskrevet i dette manuskriptet komplimentøkotoksikologiske og kjemiske evalueringstester normalt til grunn for renseanlegg utslipp av lukt. Derfor, for å fremtidig bruk av denne type helhetlig batteri av testen bør sette avløpsvann teknologiutviklere og driftsoperatører, iverksette de mest økologisk trygg design vurderer de beste metodene for å fjerne både spesifikke regulert østrogen kjemikalier og generell biologisk aktivitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | 37 °C incubation required for carp assay |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Icemaker | Scotsman | AF80 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
| Microfuge tubes, 0.5 ml | Alpha labs | LW2372 | |
| Microfuge tubes, 1.5 ml | Alpha labs | LW2375 | |
| Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Histology | |||
| Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
| Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
| Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
| Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
| Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
| Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
| Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
| Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
| Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
| Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
| IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
| Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
| Cover slips, 22x50 mm | VWR | 631-0137 | |
| Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
| Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
| Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
| Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
| Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
| Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Yeast screen | |||
| Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
| Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | |
| Shaker | Grant | PSU-10i | |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| 12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
| 96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
| HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
| Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Iron(III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
| L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
| L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
| D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
| D-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
| D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
| Steroids | |||
| Acetone | Rathburn | ||
| Acetonitrile | Rathburn | ||
| Ammonia solution | Rathburn | ||
| Ethylacetate | Rathburn | ||
| Copper(II) nitrate | Sigma-Aldrich | ||
| Acetone | Rathburn | ||
| Dichloromethane | Rathburn | ||
| 2,4,16,16-d4-17β-estradiol | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol | CDN Isotopes | ||
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Estrone | Sigma-Aldrich | ||
| 17α-ethynyl oestradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Hexane | Rathburn | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
| Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Fish study | |||
| orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | Watson Marlow | 982.0063.000 | |
| straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | Watson Marlow | 999.2008.000 | |
| pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m | Watson Marlow | 913.A008.016 | |
| 200 series multi-channel persitaltic pump | Watson Marlow | 205CA | |
| Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) | VWR | SFM1-3250 | |
| silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) | VWR | SFM1-5450 | |
| 2.5 L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
| magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| 17α-Ethynylestradiol | Sigma Aldrich | E4876-100MG | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| SPE | |||
| 1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 | Sigma Aldrich | 57276 | |
| disposable liners for manifold | Sigma Aldrich | 57059 | |
| filtration tubes without frits 6 ml pk 30 | Sigma Aldrich | 57242 | |
| reservior adaptors pk 12 | Sigma Aldrich | 57020-U | |
| stainless steel weight for manifold pk 4 | Sigma Aldrich | 57278 | |
| male Luer plug for manifold pk 12 | Sigma Aldrich | 504351 | |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57265 | |
| stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | Waters | WAT054806 | |
| Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | Waters | WAT020515 | |
| Methanol HPLC grade 2.5 L | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| 7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 | Fisher Scientific | TUL-520-031K | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |
References
- Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T.
- Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).
- Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).
- Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).
- Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).
- Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
- Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).
- The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
- Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).
- Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511 (2015).
- EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. , British Standards Institute. London, UK. (2006).
- Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).
- Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).
- Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).
- Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).
- Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).
- Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).
- Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).
- Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
- Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).
- Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).
- Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).
- Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).
- Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).
- Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).
- Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).
- Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32 (2012).
- Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).
- Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
