Summary
Hormonforstyrrende forbindelser (EDC) udgør en væsentlig risiko for vandmiljøet. Kommunale renseanlæg er vigtige bidragydere til den østrogene potens af overfladevand. Den metode forudsat i dette papir giver mulighed for en vurdering af effekten og egnethed spildevandsrensning processer med hensyn til EDC fjernelse.
Introduction
Bekymringer vedrørende de negative virkninger af hormonforstyrrende forbindelser på dyrelivet reproduktiv sundhed har ført EU til at placere to østrogene stoffer (østradiol og ethinylestradiol) på en "overvågningsliste" under vandrammedirektivet (VRD). EDC omfatte en række forskellige kemiske klasser, herunder naturlige og syntetiske steroid østrogener, narkotika, pesticider og industrikemikalier og bestanddele af forbrugerprodukter med kendte skadelige virkninger på dyrelivet. Nogle af disse forbindelser kan potentielt påvirke menneskers sundhed 1.
Forskning har vist, at spildevand fra renseanlæg er østrogene at fiske 2 og som en konsekvens mange recipienter er også østrogene at fiske 3. Dette blev først demonstreret gennem nationale undersøgelser i Det Forenede Kongerige, der viste en øget vitellogenin koncentrationer (en kvindelig specifik æggeblomme protein forstadie 4) i blodet hos vilde mandlige fisk og en høj prevalens af intersex (udvikle æg og / eller kvindelige reproduktive kanaler i testiklerne af mandlige fisk) i normalt gonochoristic fiskearter 5,6.
Konventionel spildevandsbehandling er typisk en tre-trins proces, der består af en indledende screening efterfulgt af primær og sekundær behandling, som fjerner både opløst og suspenderet organisk materiale. Effekten af fjerne individuelle EDC er afhængig af de fysisk-kemiske egenskaber af stofferne og om effektiviteten af behandlingsprocessen anvendt. For mange EDC fjernelse via adsorption og biologisk nedbrydning kan være betydelig, men ufuldstændig. Tertiær behandling, såsom sand filtrering, kan være effektive til at øge EDC fjernelse 7 mens avanceret behandling ved hjælp af avanceret oxidation (f.eks ozon) eller aktivt kul kan være effektive til at opnå nær fuldstændig fjernelse 7.
Vurderingen af en ny teknologi til spildevandsrensning needs at fastlægge effekten af den foreslåede proces i EDC fjernelse. Et batteri af tests, herunder målrettet kemisk analyse sammen økotoksikologi test med in vivo og in vitro bioassays, giver omfattende data til dette formål. Selvom meget nyttige i reguleringsøjemed, kan målrettet kemiske analyser kun give oplysninger om forbindelser (og specifikke metabolitter) overvåges. Bioassays desuden tillade "afsløring" af negative virkninger af metabolitter og behandling-genereret spildevand transformation biprodukter, der ellers ville blive uopdaget 8,9. Dette papir beskriver anvendelsen af et batteri af kemiske og økotoksicitet laboratorieanalyser til at vurdere effektiviteten af en række avancerede og nye spildevandsrensning processer til fjernelse østrogene styrke rå og behandlet spildevand og recipienter.
Protocol
Etik erklæring: Protokoller til vurdering hormonforstyrrende aktivitet af kemikalier / blandinger i fisk er blevet godkendt af Brunel University Animal Welfare og etisk organ (AWERB) og af det britiske indenrigsministerium under Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986.
1. Vand Prøvetagning, Bevarelse og Extraction
- Sample indsamling og bevaring
- Før brug, rense flaskerne med en egnet overflade aktivt rengøringsmiddel. Efter rengøring skylles flaskerne med vand, afløb og tør.
- Indsamle prøver i glasflasker af 2-L kapacitet indeholdende et konserveringsmiddel, der består af 0,5 g kobber (II) nitrat og 6 ml 3,6 M saltsyreopløsning. Opbevar prøver under 10 ° C. Uddrag og analysere så hurtigt som muligt efter indsamling og bevarelse.
- Prøve ekstraktion og oprensning (for steroid østrogen analyse) 10
- Solid Phase Extraction (SPE)
- Før ekstraktionen for at reducere suspenderede faste stoffer, filter vandprøver anvendelse af 1 um porestørrelse filtrerpapir.
- Når filtreret, spike prøver med intern standard ved tilsætning af 100 pi spiking deutereret intern standard stamopløsning indeholdende 2,4,16,16-d4 -estrone: 2,4,16,16-d4 -17β-estradiol (E2) : og 2,4,16,16-d4 -17α-ethinylestradiol (EE2) (alle ved 40 ug / l i methanol) til 1.000 ml afløbet (eller 100 ml indstrømmende) resulterer i intern spyd af 2 ng / L for spildevand spildevand prøver og 20 ng / l for spildevand tilløb prøver.
- Vedhæft engangs ventil liners, styren divinylbenzen SPE patroner og patron reservoirer til SPE apparatet. Tænd vakuumpumpen at teste udstyret er tilstrækkeligt forseglet.
- Pipette 5 ml ethylacetat i hvert reservoir, til konditionering af patronerne. Tænd vakuumpumpen (til under 10 inHg at tillade en strømningshastighed på mindre end 10 ml i minuttet)og træk gennem væsken. Lad ikke SPE tørre ud. Gentag proces med 5 ml methanol efterfulgt af 5 ml vand.
- Top op hver patron reservoir med vand og forbinde 1/8 "PTFE rør mellem patronindretningen reservoirer og glas prøveflasker. Tænd vakuum ved en strømningshastighed på mindre end 10 ml per minut og lade hele prøven at passere gennem patronen. Tøm kolben affaldet om nødvendigt.
- Tørre SPE patroner under vakuum (eller ved at bruge luft eller nitrogen), indtil patronen indholdet ændre farve (fx fra mørkebrun til lysebrun).
- Put rene tørre 10 ml indsamling glas hætteglas i rack og sted inde udvinding manifold. Kontrollerer, at alle liner er over et hætteglas. Pipette 8 ml dichlormethan i hver prøve reservoir, tænde vakuumpumpen (flow på mindre end 10 ml per minut) og træk væsken gennem ind i indsamling hætteglas.
- Fjern 10 ml hætteglas fra SPE manifoldog bruge en koncentrator at nedbringe mængden til 1 ml. Overfør hver prøve til autosampler hætteglas og yderligere at koncentrere til 100 pi under anvendelse af nitrogen blæse ned udstyr.
- Før ekstraktionen for at reducere suspenderede faste stoffer, filter vandprøver anvendelse af 1 um porestørrelse filtrerpapir.
- Gelpermeeringschromatografi (GPC) oprydning
- Injicer 95 pi af den eluerede prøveekstrakt i GPC udstyret HPLC ved betingelserne beskrevet i tabel 1. Koncentrer GPC ekstrakt ned til 200 pi bruger koncentrator og nitrogen blæse ned apparat og derefter fyldes op til 2,0 ml med hexan.
- SPE oprydning
- Vedhæft engangs ventil liners, aminopropyl patroner og patron reservoirer til SPE manifold. Put rene tørre 10 ml indsamling glas hætteglas i rack og sted inde udvinding manifold. Pipette 2 ml hexan i hvert reservoir, til konditionering af patronerne. Lad væsken passere gennem patronerne.
- Pipettere GPC prøveekstrakt ind i reservoiret og igen, således at væskenpassere gennem patronen. Prøven opsamles eluatet i hætteglasset og fjerne fra manifolden. Smid ikke eluat.
- Sæt en ny ren tør hætteglas 10 ml samling til rack og placere inde udvinding manifold. At vaske patronen, tilsættes 2 ml ethylacetat i hexan (30% v / v) til reservoiret og træk væsken gennem patronen. Gentag med yderligere 2 ml ethylacetat i hexan, kassere alle vaskene.
- Anbring originalen 10 ml samling hætteglas (trin 1.2.3.2) tilbage i rack inde udvinding manifold. Afpipetteres 2 ml ethylacetat i acetone (50% v / v) til reservoiret, tænd vakuumpumpen (til under 2 inHg at tillade en strømningshastighed på mindre end 2 ml per minut) og træk væsken gennem i hætteglasset . Gentag processen med en anden 2 ml ethylacetat.
- Fjern hætteglasset prøve og bruge en koncentrator for at reducere ekstrakten fortyndes til 1 ml. Overfør prøven i en mindre hætteglas og bruge kvælstof blæse ned udstyr, til at fordampe than ekstrakt til begyndende tørhed.
- Tilsæt 100 pi methanol og bland godt. Overfør ekstrakten til en autosampler hætteglas (med 0,3 ml insert) og Luk hætteglasset. Analyser af prøverne ved hjælp af LCMS / MS (se afsnit 2).
- Solid Phase Extraction (SPE)
| Kolonne: | PL-gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 um |
| Guard Kolonne: | PL-gel, 50 x 7,5 mm, 5 um |
| Mobil fase: | dichlormethan |
| Strømningshastighed: | 1 ml pr minut |
| Kolonne temperatur: | 25 ° C |
| UV-detektor: | 210 nm |
| Injektionsvolumen: | 95 pi |
| Injektion tilstand: | Ståard |
| Tegn hastighed: | 500 ml pr min |
| Skub hastighed: | 500 ml pr min |
| Tegn position: | 3 mm |
| Fraktion opsamlet: | 3 ml fraktion (7 - 10 min) i 10 ml hætteglas |
Tabel 1. Betingelser og parametre for gelpermeationskromatografi (GPC) oprensning af ekstraherede spildevandsprøver. Tabel detaljer GPC kolonne, mobil fase, temperatur, injektionsvolumen, og detektor bølgelængde.
- Prøve ekstraktion (for gær Østrogen Screen)
- Filter prøver som beskrevet i afsnit 1.2.1.1. Vedhæft engangs ventil liners, C18 SPE patroner og patron reservoirer til SPE apparatet. Tænd vakuumpumpen at teste udstyret er tilstrækkeligt forseglet.
- Afpipetteres 5 ml methanol i hvert reservoir, til regulering af C18 patroner. Slå vakuum (til ca. 5 inHg at tillade en strømning på ca. 5 ml pr minut) og lad væsken løbe igennem, pause i 1 minut halvvejs gennem. Lad ikke patronerne løber tør. Gentag processen med enten HPLC-kvalitet eller dobbelt destilleret vand (Hedeselskabet 2 O). Igen ikke løbe tør.
- Uddrag vandprøver, som beskrevet i afsnit 1.2.1.4. Fortsæt vakuum i mindst 30 min til tørre patronerne.
- Placer rene tørre 10 ml indsamling hætteglas i et rack i udvinding manifold. Kontrollerer, at alle liner er over et hætteglas. Der tilsættes 5 ml methanol til hvert reservoir. Tænd vakuum (maksimalt flow på 5 ml / min) og tillade væsken at passere gennem patronen til hætteglasset, pause i 2 min halvvejs gennem.
- Før analyse ved hjælp af JA skærmen, reducere ekstrakten til begyndende tørhed under anvendelse af nitrogen og rekonstituere med 500-1.000 pi ethanol. Seal lågene af prøven hætteglas at undgå fordampning og holde ved 4 ° C (i en gnist-frikøleskab).
2. Kemisk Analyse Brug LCMS / MS
- Optimer driftsbetingelserne for LCMS / MS-system ved hjælp af producentens anvisninger.
- Analyser kalibrering standardløsninger, prøveekstrakterne, blank og analytisk kvalitetskontrol (AQC) prøver ved hjælp af væskekromatografi og massespektrometri betingelser, og overvåge ion overgange som beskrevet i tabel 2. Bestem koncentrationen af steroid østrogener i prøveekstraktet anvendes intern standarder 10.
| LCMS | |||||
| Liquid Chromatography | |||||
| Kolonne: | C18 (2), 150 x 4,6 mm, 5 um. | ||||
| Injektionsvolumen: | 20 pi | ||||
| Flyde: | 0,5 ml per minut. | ||||
| Mobile fase: | Opløsningsmiddel A: vand indeholdende 0,1% ammoniak. | ||||
| Opløsningsmiddel B: acetonitril. | |||||
| Gradientprogram: | |||||
| Tid (min) | 0 | 10 | 18 | 24 | 28 |
| A: B-forholdet opløsningsmiddel | 90:10:00 | 50:50:00 | 0.479167 | 0.479167 | 90:10:00 |
| massespektrometri | |||||
| Kilde: | Elektrospray (negativ ion) | ||||
| Gas og kilde: | CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi | ||||
| TEM: 600 ° C, CAD gas 5 og IonSpray spænding -900 | |||||
| MRM overgange: | |||||
| E1: | 269/145 & 269/143 | ||||
| E2: | 271/145 & 271/143 | ||||
| EE2: | 295/145 & 295/143 | ||||
| E1-D4: | 273/147 | ||||
| E2-D4: | 275/147 | ||||
| EE2-D4: | 299/145 | ||||
Tabel 2. Detaljer parametre og betingelser for LCMS / MS-analyse af steroid østrogener i spildevand ekstrakter. Tabel giver prøve injektion volumen og flow, mobile betingelser fase ennd gradient.
3. østrogene aktivitet Brug In Vitro Gær Østrogen Screen (JA) Indhold 8
- Forberede og gemme minimal medium og medium komponenter som pr tabel 3 (a) til (g).
| (a) minimalmedium (pH 7,1): |
| Forbered en Fe 2 (SO 4) 3 ved tilsætning 40 mg Fe 2 (SO 4) 3 til 50 ml dobbelt-destilleret vand (Hedeselskabet 2 O) |
| Tilsæt 1 L Hedeselskabet 2 O til en 2 I bægerglas |
| Tilføj følgende komponenter til bægeret: |
| 13,61 g KH 2 PO 4 |
| 1,98 g (NH4) 2 SO4 |
| 4,2 g KOH |
| 0,2 g MgSO4 |
| 1 ml af Fe2 (SO4) |
| 50 mg L-leucin |
| 50 mg L-histidin |
| 50 mg adenin |
| 20 mg L-arginin-HCI |
| 20 mg L-methionin |
| 30 mg L-tyrosin |
| 30 mg L-isoleucin |
| 30 mg L-lysin-HCl |
| 25 mg L-phenylalanin |
| 100 mg L-glutaminsyre |
| 150 mg L-valin |
| 375 mg L-serin |
| Sæt bægerglasset på opvarmede omrører med en magnetisk loppe og rør, indtil det hele er opløst |
| Kontrolleres, at pH er 7,1, og om nødvendigt justere |
| Ved hjælp af en 50 ml steril sprøjte dispensere 45 ml portioner i glasflasker med metal skrue top låg |
| Steriliser minimalmedium ved 121 ° C i 10 minutter i en autoklave |
| Opbevares ved stuetemperatur |
| (b) D - (+) - Glucose: |
| Der fremstilles en 20% vægt / volumen opløsning i Hedeselskabet 2 O |
| Dispenser 20 ml portioner i til hætteglas med metal skrue top låg |
| Steriliser Glucose opløsning ved 121 ° C i 10 minutter i en autoklave |
| Opbevares ved stuetemperatur |
| (c) L-asparaginsyre: |
| Lav en stamopløsning på 4 mg / ml i Hedeselskabet 2 O |
| Dispenser 20 ml portioner i til hætteglas med metal skrue top låg |
| Steriliser L-asparaginsyre-opløsning ved 121 ° C i 10 minutter i en autoklave |
| Opbevares ved stuetemperatur |
| (d) Vitamin Løsning: |
| Forbered en biotin ved tilsætning af 2 mg biotin til 100 ml Hedeselskabet 2 O |
| Afvej 8 mg thiamin, 8 mg pyridoxin, 8 mg pantothensyre, 40 mg inositol. Tilføj alle de tørre komponenter og 20 ml af biotin løsning til 180 ml Hedeselskabet 2 O |
| Gør 10 ml sterile alikvoter ved filtrering gennem et 0,2 um porestørrelse engangsfilter til sterile glasflasker, i en laminar luftstrøm kabinet |
| Opbevares ved 4 ° C |
| (e) L-Threonin: |
| Fremstilling af 100 ml af 24 mg / ml L-threonin i Hedeselskabet 2 O |
| Dispensere 10 ml portioner ind på hætteglas med metal skruelåg låg |
| Steriliser L-threonin-opløsning ved 121 ° C i 10 minutter i en autoklave |
| Opbevares ved stuetemperatur |
| Forbered 25 ml af en 20 mM kobber (II) sulfat-opløsning i Hedeselskabet 2 O |
| Foretag 5 ml sterile alikvoter ved filtrering gennem et 0,2 um porestørrelse filter over i sterile glasflasker, i en laminar strømning |
| Opbevares ved stuetemperatur |
| (g) chlorphenol-rød-β-D-galactopyranosid (CPRG): |
| Forbered 25 ml af en 10 mg / ml opløsning af CPRG i Hedeselskabet 2 O |
| Foretag 5 ml sterile alikvoter ved filtrering gennem et 0,2 um porestørrelse filter over i sterile glasflasker, i en laminar strømning |
| Opbevares ved 4 ° C |
Tabel 3. Gær Østrogen Screen assay; tilberedning og opbevaring af minimale medium og mellemstore komponenter.
- Forberedelse og storage af 10x koncentreret gærkultur
- På dag 1, forberede vækstmedium (som beskrevet i 3.4.1) og hældes i en steril konisk kolbe. Tilføj 125 pi 10x koncentreret gær fra kryogene hætteglas opbevaret ved -20 ° C. Inkubér podede medier ved 28 ° C i ca. 24 timer på en orbitalryster.
- På dag 2, gør to flasker vækstmedium (~ 50 ml) og hældes i separate sterile koniske kolber. Der tilsættes 1 ml 24-timers dyrkede gær i hver kolbe vækstmedie. Inkubér podede medier ved 28 ° C i ca. 24 timer på en orbitalryster.
- På dag 3 hæld hver 24-timers kultur i et sterilt 50 ml centrifugerør. Centrifugeres 50 ml rør ved 4 ° C i 10 minutter ved 2.000 x g. Hæld supernatanten, og resuspender hver pellet i 5 ml minimalt medium med 15% glycerol. Lav 0,5 ml portioner af 10x koncentreret gær kultur i 1,2 ml sterile kryohætteglas og opbevares ved -20 ° C i højst 4 måneder.
- Preparation og opbevaring af kemiske lagre for standard kurver
- Skyl alle glasvarer og spartler to gange med absolut ethanol og lad det tørre før brug for at fjerne alle spor af forureninger.
- Afvej E2 direkte i et hætteglas i et pulver vejer kabinet og justere koncentrationen i volumen i absolut ethanol. Fortyndes til en koncentration på 2x10 -7 M (54,48 ug / L). Seal låg og opbevares ved 4 ° C (i en gnist-fri køleskab).
- Assay producent
- På dag 0 forberede vækstmedium. Til 45 ml flaske minimalmedium tilsættes 5 ml glucoseopløsning 1,25 ml L-asparaginsyre, 0,5 ml vitaminopløsning, 0,4 ml L-threonin-opløsning, og 125 pi kobber (II) sulfatopløsning. Hæld vækstmedium i en steril konisk kolbe.
- Tilføj 125 pi 10x koncentreret stamopløsning (optøet fra -20 ° C opbevaring) til kolben og inkuber inokulerede medier ved 28 ° C i ca. 24 timer på en orbitalryster.
- På dag 1, mærke et sterilt 96-brønd "fortynding tallerken 'og gør seriefortyndinger (100 pi volumener i ethanol) af E2 standardkurve og teststof (r) / spildevand ekstrakt (er) (f.eks EE2).
- Label steril 96 brønde optisk flad bund mikrotiter 'assay plade (s) ". På hver plade omfatter emner (plus / minus opløsningsmiddel) og en E2-standardkurve, ud over rækker af teststoffet (r) / spildevand ekstrakt (s).
- Afpipetteres 10 pi af hver koncentration (E2, kemiske eller ekstrakt) i den passende brønd i assaypladen. Afpipetteres 10 ul ethanol i hvert "opløsningsmiddel blank 'godt af assaypladen. Efterlad Assaypladen med låget til at fordampe til tørhed.
- Foretag en flaske vækstmedium (~ 50 ml) og tilsæt 0,5 ml chlorphenol-rød-β-D-galactopyranosid (CPRG) opløsning per flaske. Bestemme densiteten af gærceller i 24-timers kultur ved måling turbiditet af kulturen ved 620 nm i en pladelæser. Podes på enssay medium med 4x10 7 gærceller fra 24 timers kultur.
- Hæld podede assaymedium i en steril trug. Ved hjælp af en multi-kanal pipette tilsættes 200 pi podede assaymedium til hver brønd af 96-brønds assayplade.
- Lægge låg på den 96-brønds assayplade og forsegle kanterne med tape. Ryst assaypladen (er) kraftigt i 2 minutter på en titer pladeryster og inkuber ved 32 ° C i en naturligt ventilerede varmeskabet.
- På dag 2 ryste assaypladen (er) kraftigt på en titer pladeryster i 2 min. Vende tilbage til 32 ° C inkubator.
- På dag 4, ryste assaypladen (er) kraftigt i 2 minutter på en titer pladeryster. Lad skilt (e) at henstå i ca. 1 time derefter læse assaypladen (er) ved en absorbans på 540 nm (optimal absorbans for CPRG ~ 575 nm) og 620 nm (for turbiditet) ved anvendelse af en pladelæser. Efterlad plade (r) ved stuetemperatur, og læse senere om nødvendigt.
- På dag 0 forberede vækstmedium. Til 45 ml flaske minimalmedium tilsættes 5 ml glucoseopløsning 1,25 ml L-asparaginsyre, 0,5 ml vitaminopløsning, 0,4 ml L-threonin-opløsning, og 125 pi kobber (II) sulfatopløsning. Hæld vækstmedium i en steril konisk kolbe.
- Østrogenaktivitet beregninger <ol>
- Korrekte assay aflæsninger for turbiditet ved hjælp af følgende ligning: Korrigeret værdi = prøve eller standard (E2) absorbans ved 540 nm - [prøve eller standard (E2) absorbans ved 620 nm - blank absorbans ved 620 nm]. Plot E2 standardkurve med passende emner (for at kontrollere for kontamination) 8.
- Brug den korrigerede prøve (ekstrakt eller kemisk) til at beregne »Estradiol ækvivalenter". Brug de plottede E2 standard curve værdier og regressionsligningen (3-parameter polynomium eller lineære afhængigt af tilpasning) at interpolere prøven / udtrække absorbansværdier til E2 tilsvarende værdier. Brugskoncentration faktor (dvs. vand ekstraheres og volumen ethanol ekstrakten resuspenderes i) for at beregne østrogene aktivitet i præ-ekstraherede prøve.
4. Laboratory vurdering af østrogen aktivitet Brug in vivo vitellogenininduktion i Male Fathead Minnows
- Brug mandlige Fathead minnows (Pimephalespromelas)> 4 måneder gamle, som udviser sekundære seksuelle karakteristika (dvs. udvikling af nuptial Knolde og en dorsal fatpad) indikerer mandlig seksuel bestemmelse.
- For at undgå gydende aktivitet, separat modne hanner tre uger (± 3 dage) forud for indledningen af testen. Opsæt mindst to 45 L glas akvarier med en maksimal belastning på 3 g / l. For at sikre et tilstrækkeligt antal sunde fisk til testen, skal du bruge mindst 100 mænd.
- Hold den mandlige fisk under identiske miljømæssige betingelser som vil blive oplevet i testen (dvs. vand temperatur på 25 ± 1 ° C og en 16: 8 timers lys: mørke fotoperiode). Vedligehold fortynding vandmængden til hver tank for at sikre en 95% udskiftning på mindst hver 6 til 8 timer, dvs 330 ml / min for en 45 L tank.
- Test apparater og eksperimenterende design
- Brug store glas tanke til at rumme en belastning på op til 3 g fisk pr liter watis. For 8 voksne mænd (nominelt 4,5 g hver), bruge en 10-20 L tank.
- Brug to replikatbeholdere for hver behandling og skjold hver tank fra alle unødvendige synsforstyrrelser (dvs. bruger laminerede kort skærme mellem tankene). Identificer hver tank med en undersøgelse nummer, en koncentration eksponering og en fartøjsidentifikationsnummer.
- For spildevand spildevand undersøgelser
- Ved ankomsten, straks overføre spildevand til en lagertank ved 10 ± 1 ° C. Start dosering spildevand inden for to timer efter modtagelsen af spildevand.
- Feed spildevandet via peristaltisk pumpe, fra 10 ° C lagertank til en akklimatisering fartøj. Varm spildevandet i akklimatisering fartøj til 18 ± 2 ° C. Pump den opvarmede udløbet fra akklimatisering fartøj til doseringsmidlerne / blandebeholdere og derefter på prøve akvarier (der har fisken). Varm akvarierne til en temperatur på 25 ± 1 ° C.
- For kemiske dosering undersøgelser
- Afvejes test kemikalier i et pulver vejer kabinet. Forbered koncentrerede kemiske lagre i Hedeselskabet 2 O helst uden brug af opløsningsmidler.
Bemærk: Hvis opløsningsmidler skal opløseliggøre testforbindelser, betjeningsgreb opløsningsmiddel foruden fortyndingsvandet kontrol. - Faldtilførsel eller pumpe fortyndingsvand fra et temperaturstyret header tanken via flowkontrol anordning (er) til dosering / blandebeholderen. Pumpe koncentreret kemikalie lager (er) under anvendelse af en peristaltisk pumpesystem til dosering / blandekar. Styre pumpen sats (på lager kemiske) og vand flow (fortynding vand) for at opnå koncentrationen ønskede eksponering.
Bemærk: Brug silikoneslanger at fodre vand / test kemikalie til hver test fartøj fra dosering / blanding fartøj. Brug en strømningshastighed, der er tilstrækkelig til at tilvejebringe en erstatning 75% fartøj i mindst 24 timer, dvs. 20 ml / min for en 20 L tank. Opretholde strømningshastigheden på ± 10% af den angivne nominelle værdi.
- Afvejes test kemikalier i et pulver vejer kabinet. Forbered koncentrerede kemiske lagre i Hedeselskabet 2 O helst uden brug af opløsningsmidler.
- Foder fisk to gange om dagen med frisk optøet frossen voksne artemia (Artemia) på 2,5 (± 0,1) g pr tanken per foder. Også fodre fisk en gang om dagen med en lille mængde (to fingre knivspids) af en tropisk flage fiskefoder. Efterlad mindst 3 timer mellem hver feed.
- Hold en daglig fodring rekord at overvåge fodring respons / adfærd (god, moderat eller dårlig, sammenlignet med kontrollerne). Sifon tankene mindst to gange om ugen (helst dagligt) for at fjerne enhver uspist mad og afføring. Rens siderne og bunden af måleglasset mindst en gang om ugen.
- Tag ugentlig vandprøves fra hver tank for at bekræfte østrogen aktivitet (via Gær skærm) og kemisk sammensætning (via analytisk kemi). Se afsnit 1-3 til oplysninger om vand prøveudtagning, ekstraktion og analyse.
Bemærk: For hvert forsøg, bruge fortynding vand kontrol (negativ kontrol), positiv kontrol (E2 eller EE2) plus mindst tre fortyndinger af spildevand (100, 50 og 25%) eller test kemikalie til at overvåge dosis respons. Hvis nye teknologier testes, bruge sammensatte / spildevand med eller uden behandling (f.eks EE2 uden behandling, EE2 med TAML / hydrogenperoxid (H 2 O 2) behandling 12; figur 1).
- Brug store glas tanke til at rumme en belastning på op til 3 g fisk pr liter watis. For 8 voksne mænd (nominelt 4,5 g hver), bruge en 10-20 L tank.
Figur 1. Diagram repræsenterer eksperimentelt design af en in vivo elritse vitellogenin bioassay for at bestemme fjernelse af økotoksicitet 17α-ethinyløstradiol hjælp TAML / peroxid vandbehandling. Det experimental oprettet består af otte 11 L glas akvarier hver fodret med kontinuerlig strøm af vand. Individuelle kemiske stamopløsninger og vand (filtreret de-chlorerede) leveres til blandekamrene. Nominelle koncentrationer (uden reaktion) i blanding skibe er 2 ng / l EE2, 80 nM TAML og 0,16 pg / LH 2 O 2. Kemiske stamopløsninger (EE2, H 2 O 2 og TAML) fremstilles og doseres separat, således at reaktionerne påbegyndes i blandebeholdere. Fisk (8 mænd Fathead minnows pr tank) er udsat for blandingen (er) efter en reaktionstid kontakttid på ca. 45 minutter. Vandprøver er taget fra tankene eksponering ugentlige. Plasmaprøver er taget fra Fathead minnows til at måle den østrogene biomarkør vitellogenin (VTG) fra en baseline gruppe, ved starten af undersøgelsen, og alle andre fisk efter 21 dages eksponering. De specifikke behandlinger er: "-C"; negativ kontrol (fortynding vand kun), '+'; positiv kontrol med EE2,'+ H «; EE2 plus H 2 O 2, '+ T'; EE2 plus H2O 2 plus TAML. Dette tal er blevet ændret fra Mills et al. 2015 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Test Procedure
- akklimatiseringsperiode
- Mål våd vægt (g) for hver kønsmodne hanfisk, og tildeler tilfældigt til hver tank (8 hanner pr tank).
- Hold ikke-allokeret fisk fra samme parti og vedligeholde dem under samme prøvningsbetingelser. Brug disse fisk til at erstatte eventuelle personer, der viser tegn på fysiske skader eller manglende tilstand under den 7-dages akklimatisering periode. Sørg for enden af akklimatisering periode hver behandling tank har 8 mænd, der har fuldt akklimatiseret til testbetingelserne.
- Tag 'baseline' plasmaprøver fra yderligere 8 hanner fra samme baTCH af mandlige fisk. Følg blodprøvetagning metoden i afsnit 4.4 og Vitellogeninproduktion (VTG) analysemetode i 4,5.
- Efter akklimatisering periode, levere spildevand eller kemiske dosering lagre tankene eksponering i 21 dage, som beskrevet i 4.2.2 eller 4.2.3. Monitor dødelighed, adfærd og fysiske udseende fisk i hver replikere tanken dagligt før den første feed af dagen. Optag enhver unormal adfærd eller hændelser.
Bemærk: Sørg for miljømæssige forhold og fodring satser bevare sundheden af fisk (afsnit 4.2.4 og 4.2.5).
- akklimatiseringsperiode
- Fish Sampling efter periode på 21 dage eksponering
- 12 timer forud for prøveudtagning, stop fodre fiskene.
- Label mikro-centrifugerør til indsamling af blodprøver, tilføje ~ 5 pi Aprotinin (en proteasehæmmer) og placere dem på is.
- Lav en 500 mg / l opløsning af MS222 (bedøvelse) ved at opløse 500 mg MS222 pr 1 liter de-chlorerede vand (tidligere akklimatiserettil 25 ± 1 ° C). Neutralisere MS222 til pH 7,4 ± 0,4 ved anvendelse af 1 M NaOH.
- Flyt hver fisk fra tanken ind i buffer MS222. Holde i opløsningen, indtil ophør af al Laag bevægelse (typisk 5 ± 1 min).
- Mål og registrere gaffel længde (mm) under terminal bedøvelse. Brug en engangs skalpel til at amputere halen, og brug en hepariniseret hæmokrit rør til opsamling af blod fra caudale arterie (Figur 2). dispensere omhyggeligt blodet ind i præ-mærkede mikrocentrifugerør og holde på is.
- Dræb fisken straks efter at trække blodet. Bekræft døden ved endeligt ophør af cirkulationen og / eller ødelæggelse af hjernen. Mål og registrere alt fisk vægt (til nærmeste 0,01 g), og dissekere væv efter behov.
- Centrifuger blodet (7000 xg i 5 min ved 4 ° C) inden 2 timer for indsamlingen. Overfør plasma supernatanten med en pipette i ny mærkede 0,4 ml mikrocentrifuge karbades og butik på is. Frys rørene indeholdende plasma på tøris inden for 30 min af centrifugering og opbevares ved -80 ° C før analyse af plasma VTG koncentrationer.
Figur 2. Billeder skildrer mandlige elritse (Pimephales promelas), plasma indsamling og placering af testikler. Ved afslutningen af den 21-dages eksponering alle fisk bør aflives at indsamle blodprøver. Når under denne terminal bedøvelse fisk længde (gaffel længde, mm) bør måles, hurtigt efterfulgt af blodprøvetagning fra caudale arterie Foto-A:. Røde stiplede linje angiver placering til hale amputation (en engangs skalpel skal bruges til at amputere halen ). Foto-B viser en hepariniseret hæmokrit rør bruges til at indsamle blodet. Hver fisk bør derefter dræbt umiddelbart efter blodprøve er taget, i dette tilfælde hele hovedeter blevet skilt fra kroppen (Foto-C). Når fisken er blevet dræbt kan åbnes legemshulen op for at afsløre de indre organer. Foto-C viser placeringen af testiklerne (gonadedosis) i forhold til svømmeblære (SB) i karpefisk, f.eks elritse, skalle, karpe, etc. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Mål plasma VTG koncentrationer med en homolog VTG-enzymimmunanalyse (ELISA) kit designet specielt til Fathead minnows.
- Forbered VTG standarder og buffere som beskrevet i producentens protokol. Fortynd plasmaprøve 1:50, 1: 5000 og 1: 500.000 og analysere dem dobbelt for at få aflæsninger inden for VTG standardkurveområdet i henhold til producentens anvisninger. Følg producentens retningslinjer for at beregne vitellogenin koncentrationer.
5. Field vurderinger af Advanced / Novel Kloakservice Technologies at afbøde østrogen aktivitet Brug in vivo Vitellogeninproduktion og Intersex induktion i Roach (Rutilus rutilus)
- Opsamling af vilde skalle leve ned strøm af renseanlæg udløb
Bemærk: Brug skalle (Rutilus rutilus) eller andre rigelige ferskvand eller brakvand fiskearter, som er gonochoristic og kendt for at være følsomme over for østrogene hormonforstyrrelser.- Fang fisk ved hjælp elektrofiskeri, netting, fældefangst eller andre anerkendte fangstmetoder afhængig af situationen 13. Transporten af fisken i kulsyreholdige tanke tilbage til laboratoriet for prøveudtagning.
- Forbered mikrocentrifugerør som beskrevet i 4.4.2. Forbered bufferet MS222 som beskrevet i 4.4.3. Bedøver fisk som beskrevet i 4.4.4.
- Mål fisk længde og vægt under terminal bedøvelsesmiddel.
- Indsaml blod fra caudale arterie hjælp disposable hepariniseret sprøjte. Dræb hver fisk umiddelbart efter blodprøvetagning. dispensere omhyggeligt blodet ind pre-mærkede mikrocentrifugerør og holde på is. Forbered plasma som beskrevet i trin 4.4.7 og måle VTG ved ELISA (4.5).
- Brug pincet fjerne 2-3 fiskeskæl fra hver fisk og placere i individuelt mærkede små papirkonvolutter. Opbevar kuverter ved stuetemperatur under tørre forhold til senere fisk aldersbestemmelse og vækst analyse.
- Åben legemshulhed med en skalpel for at afsløre de indre organer. Tag tarmen at afsløre svømme blære med en gonad placeret på hver side (figur 2). Fjern forsigtigt de parrede kønskirtlerne med fine nosed pincet og sted i et glas hætteglas. Dæk kønskirtlerne med Bouins fiksativ i et forhold på 1:10 væv: fiksativ.
- Efterlad vævet i Bouins for 6-24 timer afhængigt af størrelsen af vævet (fiksativ trænger til 1 mm per time). Når faste, hæld Bouins fiksativ end erstatte med 70% industrielle sprit (IMS). Opbevar den faste væv ved stuetemperatur, indtil væv behandles for histopatologi (afsnit 5.3).
- Field vurdering af østrogen aktivitet ved hjælp in vivo vitellogenin og intersex induktion i skalle
- Eksperimentel design og opsætning
Bemærk: Opsætning af tanke og pilotanlæg godt forud for in vivo-arbejdet påbegyndes. Start tankene flyder 3-4 uger før nogen tilsætning af fisk til systemet. Overvåg vand flow, vandkvalitet og betingelser (pH, temperatur, opløst ilt, etc.) regelmæssigt for at sikre parametre kan opretholdes.- Construct store tanke (f.eks 300-1000 L) på stedet på pilotanlægget, som kan modtage "kontrol" de-chlorerede vand fra hanen, standard behandlede spildevand (r) og avancerede behandlede spildevand (r) i parallel. Vedhæft luftpumpe / beluftere til tankene. Set vand flow til at opnå mindst 6 tanken vlydstyrken udvekslinger per dag.
Bemærk: Sørg for, at tanke er velisoleret og skyggefulde undgå for store daglige temperatursvingninger. Design tanke at tillade observation af de fisk, for adfærdsændringer (manglende fodring, etc.), tegn på sygdom og dødelighed.
- Construct store tanke (f.eks 300-1000 L) på stedet på pilotanlægget, som kan modtage "kontrol" de-chlorerede vand fra hanen, standard behandlede spildevand (r) og avancerede behandlede spildevand (r) i parallel. Vedhæft luftpumpe / beluftere til tankene. Set vand flow til at opnå mindst 6 tanken vlydstyrken udvekslinger per dag.
- Start eksponeringen ved flydende poserne med skalle (fra dambrug) i de respektive tanke i 1 time. Tilføj akvarium vand til poserne gradvist, indtil vandets temperatur og betingelser er ambient. Slip fisken i deres tanke.
- Feed voksen skalle dagligt på pelleteret fiskefoder (størrelse 0,5-0,8). Foder juvenile skalle dagligt på små pelleteret (pillestørrelser 100-300) ikke-østrogene foder 14 ad libitum, justeret på grundlag af uspist foder. Hold en daglig fodring rekord dokumenterer fodring respons / adfærd (god, moderat eller dårlig, sammenlignet med kontrollerne).
- Tag ugentlige vandprøver fra hver tank for at bekræfte østrogene aktivitet og kemisk sammensætning. see §§ 1-3 til oplysninger om vand prøveudtagnings- og analysemetoder.
- Eksperimentel design og opsætning
- Histopatologi af fisk gonader 15
- Fjern forsigtigt dissekerede og faste gonader (beskrevet i trin 5.1.6 og 5.1.7) fra beholderen med pincet og sted på et skærebræt.
- Brug en mikrotom kniv til at skære hver gonadedosis i 3 dele (forreste, midten og bageste) og fra hver del skære en 3-5 mm tyk tværsnit. Placer forsigtigt alle seks stykker i en mærket plast biopsi kassette, og anbringes i væv processor hjælp de tider, der er anført i tabel 4.
- Voks integrere væv og afsnittet om rotationsmikrotom (3-5 um). Overleveringsstrækningerne til mærkede bio-klæbende coatede objektglas og placere glider på en opvarmet plade (indstillet ved 45 ° C) for at tørre i 24 timer.
- Farv dias, enten manuelt eller ved hjælp af en automatiseret farvningsværktøjet, hjælp de tider beskrevet i tabel 5. Placer en dråbe montering agent på farvede væv, og lay et dækglas over monterings middel til at beskytte vævet.
- Først undersøge hver dias ved lav forstørrelse (20X, dvs. 2X mål, med 10X øjet linjer forstørrelse) for at bestemme køn og antallet af punkter af vedhæftede filer til kroppens hulrum 15. Bemærk eventuelle afvigelser for hver fisk.
- Ved en højere forstørrelse (100X eller 400X), undersøge vævet til at vurdere gametogenese stadier, abnormiteter og tilstedeværelsen af oocytter i testikelvævet. Optag sværhedsgraden af intersex anvendelse af følgende klassificeringssystem i området fra 0 (normal mandlig væv) til 7 (100% ovarievæv) 6 (se tabel 6).
Trin nummer Behandling Formål Time (hr) 1 70% IMS Dehydrering 3 2 90% IMS Dehydrering 2.5 3 95% IMS Dehydrering 1.5 4 100% IMS Dehydrering 1.5 5 100% IMS Dehydrering 1.5 6 100% IMS Dehydrering 1.5 7 100% IMS Dehydrering 1.5 8 Histologi klaringsmiddel Clearing 1.5 9 Histologi klaringsmiddel Clearing 1.5 10 Histologi klaringsmiddel Clearing 1.5 11 VOKS Wax infiltration 1.25 12 VOKS Wax infiltration 1.25 20 timer TOTAL Tabel 4. Behandling ordning for voks imprægnering væv til histopatologi. Væv bør behandles i en automatisk væv processor. Væv skal være nedsænket i de løsninger, der er beskrevet i det tidsrum angivet.
Farv no. Plet Formål Tid (min) 1 Histologi Clearing agent opløser voks 15 2 Hydration 2 3 90% IMS Hydration 2 4 70% IMS Hydration 2 5 LEDNINGSVAND (KØRER) Skylle 2 6 HAEMOTOXYLIN Pletter cellekerner blå 10 7 LEDNINGSVAND (KØRER) Fjern overskydende 10 8 syrnet IMS deklorering 20 sek 9 LEDNINGSVAND (KØRER) Skylle 20 sek 10 Lico 3 Salt 20 sek 11 LEDNINGSVAND (KØRER) Skylle 20 sek 12 1% Eosin (vandig) Pletter cytoplasma pink 20 sek 13 LEDNINGSVAND (KØRER) Fjern overskydende 5 14 70% IMS Dehydrering 2 15 90% IMS Dehydrering 2 16 100% IMS Dehydrering 5 17 Histologi Clearing agent Fjern IMS, bindemiddel 5 Tabel 5. Løsninger og nedsænkning tider for Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning af fisk gonadale væv. Slides skal placeres i hvert bad for allocated tid i rækkefølge. H & E farvning af væv er nødvendig for at bestemme udviklingsmæssige eller organisatoriske konsekvenser af østrogene spildevand spildevand på fisk gonader.
score afsnit Beskrivelse 0 Normale mandlige testis 1 Multifocal ovotestis med 1-5 oocytter (normalt enkeltvis) spredt blandt testikel væv 2 Multifocal ovotestis, 6-20 oocytter ofte i små klynger spredt blandt testikel væv 3 Multifocal ovotestis, 21-50 oocytter i klynger 4 > 50 og <100 oocytter. Afsnit er normalt multifokal og giver indtryk af en mosaik af testicular og ovarievæv. 5 > 100 oocytter, som regel multifokal men kunne også være omdrejningspunkt med klart identificerbare zoner af æggestokkene og testikelkræft væv adskilt fra testikel væv. 6 > 50 procent af den gonadale væv på strækningen er ovarie- og er klart adskilt fra den testikelvæv af epitelceller og fagocytiske væv. 7 100 procent af gonadal væv på afsnittet er æggestokkene. Tabel 6. Scoring system til at vurdere sværhedsgraden af intersex tilstand skalle. Histologisk forberedte lysbilleder af gonadal væv bør undersøges under lysmikroskop ved 20X, 100X og 400X forstørrelse, for at vurdere eventuelle afvigelser og tilstedeværelsen af oocytter i testikelkræft væv. Denne tabel er modificeret fra Jobling <em> et al. 2006 6.
Representative Results
Forsøg på at forstå konsekvenserne af forbedringer af spildevandsrensning processer eller til at bestemme den mest hensigtsmæssige teknologi til at eftermontere udstyr som tertiær behandling på eksisterende renseanlæg i forhold til effekten af fjernelse af hormonforstyrrende effekt af udledte spildevand, ikke blot kræver måling af centrale kemiske komponenter, der indgår værkerne, men kræver en analyse af de nedbrydningsprodukter, der også kan have hormonforstyrrende effekt. I husspildevand spildevand, de mest østrogene stoffer er de steroidhormoner, østron (E1), 17β-østradiol (E2) og 17α-ethinylestradiol (EE2) 5,8. Steroid østrogener primært udskilles fra kroppen som en blanding af inaktive konjugater 16,17. Disse konjugerede østrogener væsentligt dekonjugeres i kloaksystemet ved bakteriel aktivitet og yderligere nedbrydning sker i renseanlægget. De dekonjugeres steroider are fjernet fra spildevandsstrøm ved adsorption til slam eller bionedbrudt under sekundær rensning resulterer i dannelsen, dels af omdannelsesprodukter biprodukter og i sidste ende fuldstændig mineralisering kan forekomme i den oprindelige aktive komponent. Den kemiske analyse af alle individuelle forbindelser i udløbsstrømmen ville være vanskeligt, tidskrævende og dyrt og ville ikke omfatte ukendte aktive bestanddele til stede i en prøve. Endvidere vil en sum af den østrogene bidrag af hver komponent kun give en indikation af den kumulative østrogene styrke af en prøve af de analyserede forbindelser. Dette er en risiko, hvis omdannelsesprocesser generere ukendte østrogene stoffer eller hvor indløbet er af industriel oprindelse. Kombinere kemisk analyse med in vivo og in vitro økotoksikologiske bioassays tilvejebringer en løsning til tilstedeværelsen af ukendte østrogene komponenter i blandinger, såsom renset spildevand. In vitro assays, såsom den Gær Østrogen Screen (YES) er blevet anvendt i udstrakt grad til at bestemme den østrogene aktivitet af spildevandsafløb og til at identificere de aktive komponenter i behandlede prøver 8,18,19. Sammenligninger mellem in vivo og in vitro test kan dog være betydelige 11 og en samlet vurdering af nye processer med hensyn til behandling af hormonforstyrrende potens kræver et batteri af kemiske og økotoksikologiske tests.
kan opnås en bestemmelse af, hvorvidt de enkelte rensningsanlæg eller processer fjerner aktive forbindelser fra spildevandsstrøm hjælp kemisk analyse, som følger prøve udtrækning, koncentrering og oprensning af ekstraktet før analyse, oftest foregå ved hjælp af LCMS (/ MS) eller GCMS (/ MS) metoder. De opnåede fra kemisk analyse af data kan bruges til at fastslå overensstemmelse med individuelle forudsagde ingen effekt koncentrationer (PNEC) 20 eller miljøkvalitetskravs (EQS) 21 af specifikke individuelle forbindelser og derfor sådanne metoder er afgørende for regulatoriske data compliance. Desuden målrettet eller ikke-målrettet kemiske analysemetoder muliggøre identifikation og kvantificering af de enkelte forbindelser eller isomerer sammenlignet med biologiske metoder, som giver et samlet svar. Kemiske analysemetoder tillader derfor vurderingen af diskrete forbindelser, der skal foretages for at møde og for at løse disse spildevandsrensning udfordringer på et individuelt rensningsanlæg basis. Undersøgelser har vist, at konventionel spildevandsbehandling (f.eks aktiverede slamanlæg) kan være yderst effektiv til fjernelse af naturlige steroidhormoner selvom fjernelse af det syntetiske hormon EE2 tendens til at være mindre effektive. Markforsøg ved hjælp af avanceret behandling anvendelse af teknikker såsom ozon, har granuleret aktivt kul (GAC) og membraner demonstreret, omend på høje omkostninger, at de kan anvendes som en end-of-pipe løsning til at fjerne EE2 til under predicted effektniveauer og til under detektionsgrænserne. Figur 3 viser fjernelsen af EE2 hjælp GAC på en pilot skala kommunalt renseanlæg. Undersøgelser foretaget i pilotanlæg på kommunale renseanlæg anvender ende af røret GAC behandling viser også reduktionen i østrogene potens efter GAC målt ved hjælp af Gær Østrogen Screen (YES), som det ses i figur 4.
Figur 3. Eksempel felt data, der viser fjernelsen af ethinylestradiol efter avancerede tertiær behandling. (A) Prøver indsamlet fra renseanlægget efter konventionelle (aktiveret slamanlæg) behandling efter procedurerne beskrevet for prøve konservering. (B) Prøverne ekstraheres under anvendelse af fastfaseekstraktion, rensede at fjerne interfererende stoffer ved hjælp normal fase SPE oggelpermeationschromatografi. (C) Den rene koncentrerede ekstrakt koncentreres til et lille volumen og analyseret under anvendelse negative ion elektrospray LCMS / MS i MRM mode. Resultaterne beregnes ved brug af interne standardisering ved hjælp isotopmærkede interne standarder. I det viste eksempel EE2 er til stede i den endelige ASP spildevandet i en koncentration over den forudsagte ingen effekt niveau (PNEC) på 0,1 ng / L og fjernes ved hjælp af GAC og ozon (O 3) til en miljømæssigt sikker koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Billede af en gær Estrogen Screen (YES) assayplade (A), der viser farveændring fra gul til rød, vedrørende østrogenaktivitet af prøverne. Plots oprettet fra JA assaypladen viser korrigerede absorbans (540nm) af estradiol standard (B), aktiveret slam proces afløbet (ASP) og granuleret aktivt kul (GAC) behandlet spildevand effluentprøver (C). Hver prøve blev testet in duplo. ASP og GAC spildevand blev udvundet og koncentreret ved hjælp af SPE metoderne i afsnit 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ozon er også effektiv til at fjerne steroid østrogener og østrogene aktivitet fra konventionelt behandlede renseanlæg. Ozon er i stand til at oxidere en bred vifte af organiske forureninger og opløst organisk stof i spildevandsprøver og giver desinfektionsegenskaber. Effektiviteten af ozonisering afhænger vandets egenskaber såsom pH, mængden af organisk stof og den anvendte dosis af ozon. Østrogener, der er dårligt fjernes ved konventionel behandling kan værefjernes fra spildevand med doser mellem 0,8 og 2 mg O 3 / mg DOC. Ozon er en selektiv oxidationsmiddel, som reagerer med elektron rige websteder (umættede carbon-carbon bindinger, aromatiske forbindelser, herunder aromatiske alkoholer), hvilket gør ozon gælder for fordelingen af en række EDC. Imidlertid fjernelse af individuelle forbindelser ikke nødvendigvis føre til den fuldstændige mineralisering af den oprindelige forbindelse. Organiske stoffer efter ozonisering kan omdannes genererer mellemprodukter eller transformation oxidation biprodukter, som omfatter en række lav molekylvægt, polære klasser af forbindelser såsom aldehyder, ketoner, carboxylsyrer, ketosyrer, og bromerede forbindelser. Eksempler omfatter, bromat, formaldehyd, acetaldehyd og carboxylsyrer. Brug af in vivo og in vitro bioassays er det blevet påvist, at selv om ozon kun delvis oxiderer nogle kemiske stoffer, de resulterende vigtige omdannelsesprodukter har en lavere estrogENIC potens og dermed anvendelsen af ozon ved en passende dosis resulterer i en høj fjernelse af østrogen aktivitet.
En af de store fordele ved yderligere behandling af spildevand er reduktionen i feminiseringen af mandlige fisk i at modtage farvande; en negativ virkning, der kan føre til nedsat fertilitet 3. In vivo undersøgelser under anvendelse af fisk (f.eks, skalle eller elritse) udsat for spildevand viser kvindelige kønsceller eller oocytter i testiklerne hos mandlige fisk (f.eks, som det ses i figur 5). Intersex eller mandlig VTG er fraværende eller væsentligt reduceret i fisk efter avanceret behandling såsom GAC 7 eller ozon 22. Disse undersøgelser viser, at omdannelsesprodukter produceret under ozonisering ikke østrogene, men dette behandler ikke toksiciteten af spildevand, der produceres. Dette spørgsmål er blevet behandlet i andre undersøgelser, for eksempel en undersøgelse fra Magdeburg et al. 12,24 - 26. TAML aktivatorer med H 2 O 2 effektivt nedbryder EE2 og andre steroid østrogener i rent laboratorium vand samt i spildevand fra kommunale renseanlæg og i spikede urinprøver 12. Laboratorieundersøgelser, viser TAML / H2O 2 behandling giver høj steroid østrogen fjernelse herunder EE2 fjernelse og væsentligt reducerer østrogen aktivitet målt in vitro under anvendelse af JA bioassay og substantially formindsker fisk feminisering in vivo målt ved anvendelse af VTG bioassay (figur 1 og figur 6). 
Figur 5. mikrofotografier af en normal mandlig (A) og intersex (B, C) gonader fra voksne skalle (Rutilus rutilus) udsat for spildevand i et felt vurdering. Photomicrograph-A, viser en histologisk snit af normal mandlig testikel. Mikrofotografi-B og C, viser histologiske snit af en intersex hanfisk, der er blevet udsat for aktiveret slam proces spildevand spildevand i seks måneder. Pile viser oocytter stede i testikelvæv. Scale søjle repræsenterer 100 um i hvert mikrofotografi. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 6. Gennemsnitlig EE2 koncentration og østrogene aktivitet i behandlede og ubehandlede tanken farvande (A) og plasma vitellogenin i baseline og udsatte mandlige fisk (B). A) EE2 koncentration (ng / L, mørkeblå søjler) blev målt ved LCMS / MS , østrogene aktivitet (EE2 tilsvarende ng / L, mørkegrønne søjler) blev målt via in vitro gær østrogen Screen (JA). B) Plasma vitellogenin (ng / ml, lyseblå søjler) koncentration i mandlige Fathead minnows blev målt via en kvantitativ enzym -bundet immunosorbent assay (ELISA). EE2 kemisk analyseresultater angives som <0,03 ng / L EE2 (dvs. lavere end detektionsgrænsen (LOD)) blev behandlet som havende halvdelen LOD (dvs. 2 O 2 + TAML, EE2 + H 2 O 2, og EE2-only. Fejl barer i graf-A repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien, fejl barer i graf-B repræsenterer standardafvigelsen. Bogstaver over barer i graf-B repræsenterer statistisk lighed. Dette tal er blevet ændret fra Mills et al. 12 Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Renseanlæg er den største rute for forurening af overfladevand med EDC. En evaluering af effekten af fjernelse af hormonforstyrrende aktivitet af konventionelle, avancerede eller nye behandlingsprocesser kræver brug af en række forskellige kemiske og biologiske assays. Kemisk analyse ved hjælp af ikke-målrettede og målrettet analyse giver kvalitative eller kvantitative data om effektiviteten af fjerne individuelle komponenter og giver derfor en vurdering, der skal foretages mod miljøkvalitetskrav eller forventet ingen effekt koncentrationer for de forbindelser eller blandinger af forbindelser analyseres.
Frembringelsen af omdannelsesprodukter som følge af ufuldstændig mineralisering af stoffer efter behandling og tilstedeværelsen af ukendte biologisk aktive bestanddele i spildevand begrænser nytten af kemiske test alene. En kombination af in vivo og in vitro bioassays i kombination med analytisk kemikerry screening giver en nyttig værktøjskasse at fastlægge effekten af EDC fjernelse ved nye spildevandsrensning processer. Disse test, når udført parallelt med de traditionelle vandkvalitetsparametre og andre toksikologiske og mikrobiologiske endepunkter tillade en kritisk vurdering af nuværende og kommende spildevandsrensning teknologier.
Det er vigtigt at bemærke, at gær baseret østrogen skærme (f.eks YES) er ikke den eneste in vitro assays til bestemmelse østrogene styrke af kemikalier og spildevand. Et antal stabilt transficerede mammale cellebaserede assays er blevet udviklet for eksempelvis ER-CALUX 27 og hERa-HeLa-9903 28 med humane brystcancerceller eller cervikale tumorceller hhv. JA er blevet sammenlignet med lignende mammale cellebaserede assays og har vist sig at have et sammenligneligt højt reproducerbarhed, sand positive og sande negative østrogene identifikation satser 29, althoUH det undertiden anses for at være lidt mindre følsom 27. En fordel ved gær baseret reporter analyser er, at i laboratorier uden betydelig erfaring med pattedyr cellekultur kan lettere vedtaget YES, da det kræver mindre strenge bio-kontrolforanstaltninger og sterile teknikker (JA kan udføres på den øverste bænk hvis nødvendigt) . De menneskelige celle assays kræver også CO 2 inkubatorer og luminometre forhold til standard inkubator og mikropladelæsere anvendes i JA. To gær baseret østrogen reporter assays (JA, Saccharomyces cerevisiae og A-YES, Arxula adeninivorans) er i øjeblikket undergår mellem laboratorier stier til validering af ISO 19040 "Vand kvalitet - Bestemmelse af østrogene potentiale af vand og spildevand" fremhæve de industrier interesse i disse teknikker.
Der er en række begrænsninger af fremgangsmåderne beskrevet som omfatter den potentielle kontamineringaf prøver under prøveudtagning, prøve opbevaring og analyse med østrogene stoffer med oprindelse fra marken eller laboratorium miljøet eller af menneskelig forurening (f.eks blødgørere, overfladeaktive stoffer, produkter til personlig pleje). Denne type af forurening i YES-assayet (eller andre cellebaserede reporterassays) vil hæve baggrunden og påvirke brugen af assayet. Vandprøver eller opløsningsmidler, der er lagret i plastflasker kan let forårsage falske positiver. Falske negativer er også bekymring, da både LCMS / MS og YES assay kræver SPE at koncentrere østrogener til påviselige niveauer. Matricen, valg af SPE sorbent og elueringsopløsningsmiddel kan påvirke udvinding effektivitet og de typer af forbindelser elueres. Brug C18 SPE patroner til ekstraktion med de betingelser, der er beskrevet i denne protokol, kan generere en negativ bias, som meget polære og basiske forbindelser ville være dårligt tilbageholdt af sorbenten. Desuden er denne protokol kræver rekonstituering af det eluerede YES eluenten fra methanol til ethanol via inddampning til tørhed bidragyder nitrogen resulterer i tab af flygtige forbindelser. Som følge protokollen kan give en undervurderet østrogene aktivitet af analyserede prøver. Disse begrænsninger er især vigtigt, når man overvejer YES assay som ukendte eller uventede forbindelser kan blive savnet, fordi de ikke er blevet udvundet eller de er tabt på grund af fordampning. Desuden LCMS / MS teknik gør brug af mærkede interne standarder til at korrigere til nyttiggørelse; denne fremgangsmåde kan ikke bruges med YES-assayet.
Væsentlige begrænsninger af in vivo testning af spildevand omfatter høje omkostninger og tid, der kræves til vurdering sammenlignet med in vitro-metoder. I øjeblikket brugen af fisk embryo tests til at afsløre østrogene aktivitet er begrænset. Imidlertid har der været en vis succes med at producere østrogen lydhør transgene glødende fisk embryoner 30, som kan have fremtidige applikationer. Fathead minnows (anvendes i denne protocol) er et fælles laboratorium arter og VTG induktion i mandlig fisk er en veldokumenteret bio-markør for østrogene eksponering og en kvantificerbar måling af spildevand spildevand østrogenicitet 22 eller andre østrogene stoffer eller blandinger 31. OECD test retningslinjer for hormonforstyrrende kemikalier er blevet valideret ved hjælp af voksne elritse, japanske Medaka og zebrafisk 32,33, med VTG være en følsom biomarkør for østrogen eksponering i alle tre arter. Men VTG-induktion ikke direkte korrelerer til reproduktiv svækkelse og dermed de økologiske konsekvenser af spildevand eksponering, som det ses i alvorligt intersex skalle 3. På den anden side, skalle er ikke en klassisk 'laboratorium arter "for økotoksikologi forskning på grund af deres store størrelse, lang generationstid (2-3 år at nå seksuel modenhed), reproduktive stil; gruppe gydningen (avl) finder sted en gang om året, og det er vanskeligt at identificere mænd fra kvinder (andre end undergydeperioden). Dette har imidlertid normalt gonochoristic arter blevet meget godt undersøgt i Storbritannien, på grund af den opdagelse, at nedstrøms for østrogene spildevandsudledningerne, mandlige fisk udviste forstyrrelser til deres endokrinologi (fx tilstedeværelsen af kvinde-specifik vitellogenin i blodet) og histopatologi (ovotestes - udvikling æg i testiklerne og / eller kvindelige reproduktive kanaler) 5,6. Derfor, som en fremtidig anvendelse af disse protokoller, kunne skalle (eller lignende arter) være et nyttigt vilde sentinel arter at vise, om reelle forbedringer af spildevand kvalitet (og reduceret østrogenicitet) ses i floder, der modtager avancerede behandlede spildevand. De kan også anvendes i slutningen af rørsystemer til overvågning teknologisk forbedrede spildevand fra pilot skala planter 7. Når man overvejer hvilke arter til brug i in vivo spildevand vurderinger der er en afvejning mellem relativt hurtige og kontrollerede test ved hjælp laboratorium arter i forhold til denlængere felt baseret, men mere miljømæssigt relevant, test hjælp naturligt hjemmehørende arter. En sådan in vivo vurderinger er høje omkostninger og bør kun betragtes som det endelige sæt test følgende vurderinger ved kemisk analyse og in vitro assays.
Kritiske trin i de protokoller, der er beskrevet omfatter forberedelse og håndtering af prøver og glasvarer (dvs. flasker og prøvetagning udstyr skal forbehandles med egnede overfladeaktive rengøringsmiddel) for at undgå forurening af prøver fra miljøbelastende stoffer, herunder at begrænse kontakt af prøver med plast og andre materialer, der kan producere falske positiver. Dette er lige så vigtigt, når designe og bygge akvarier og fisk eksponering systemer. Ideelt akvarier (boliger aktier og under eksponeringer) skal bygges af materialer med lav adsorption 32 med minimal forurening risiko. Rustfrit stål kan bruges til spildevand eller vand spildevandstanke.Ud fra følgende betragtninger tanke af et glas konstruktion foretrækkes til akvarier (da dette giver også nem observation af fisk). Bør undgås Brugen af lav kvalitet plast rør eller slange 32, kan PVC 34 og ABS anvendes, hvis "korrekt krydret", dvs., til venstre for at udvaskes eventuelle forureninger i rindende fortynding vand i mindst 12 timer før brug. Medicinsk kvalitet silicium slanger har været ansat med succes i vores anlæg til peristaltisk pumpe levering af kemikalier og spildevand / fortynding vand til tanke. Samt overvejer østrogene forurening i konstruktion og drift af den Aquatics system, er det også vigtigt at tænke på kost af fisk; mange sømmelighed fisk fødevarer har vist sig at være østrogene for fisk. Derfor er det vigtigt at teste alle fødevarer for aktivitet (fx i gær Østrogen Screen, Se Beresford et al. 14), før du bruger dem i disse typer af undersøgelser.
Fejlfindingaf den kemiske analyse eller YES assay protokoller, der er beskrevet er forenklet, hvis kvalitetssikring prøver, herunder flere rejser, laboratorium og blanke opløsningsmidler analyseres sideløbende positive kontroller og reelle prøver at eliminere falsk positive og falsk negative resultater. Positiv (f.eks EE2) og negative bør også altid anvendes (fortynding kun vand) kontrol i in vivo assays til at bekræfte følsomheden af forventet biologisk biomarkør eller endepunkt (dvs. VTG eller histopatologi), og tillade nogen uventet forurening skal registreres ( fx fra forsøgsopstilling op, kost, eller fortynding farvande). Eventuelle ændringer i protokollen skal valideres forud for enhver undersøgelse.
Med strengere regulering af østrogene forbindelser ind i miljøet via Renseanlæg spildevand er det forestille sig, at mere effektive spildevandsrensning teknologier skal udvikles. Batteriet tests er beskrevet i dette manuskript komplimentereøkotoksikologiske og kemiske evaluering test normalt anvendes på renseanlæg udslip. Derfor, at fremtidige anvendelse af denne form for holistisk batteri af test bør gøre det muligt spildevand teknologiudviklere, og plante operatører, gennemføre de mest økologisk sikker designs overvejer de bedste metoder til at fjerne både specifikke regulerede østrogene kemikalier og overordnet biologisk aktivitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | 37 °C incubation required for carp assay |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Icemaker | Scotsman | AF80 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
| Microfuge tubes, 0.5 ml | Alpha labs | LW2372 | |
| Microfuge tubes, 1.5 ml | Alpha labs | LW2375 | |
| Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Histology | |||
| Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
| Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
| Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
| Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
| Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
| Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
| Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
| Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
| Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
| Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
| IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
| Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
| Cover slips, 22x50 mm | VWR | 631-0137 | |
| Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
| Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
| Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
| Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
| Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
| Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Yeast screen | |||
| Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
| Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | |
| Shaker | Grant | PSU-10i | |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| 12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
| 96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
| HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
| Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Iron(III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
| L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
| L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
| D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
| D-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
| D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
| Steroids | |||
| Acetone | Rathburn | ||
| Acetonitrile | Rathburn | ||
| Ammonia solution | Rathburn | ||
| Ethylacetate | Rathburn | ||
| Copper(II) nitrate | Sigma-Aldrich | ||
| Acetone | Rathburn | ||
| Dichloromethane | Rathburn | ||
| 2,4,16,16-d4-17β-estradiol | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol | CDN Isotopes | ||
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Estrone | Sigma-Aldrich | ||
| 17α-ethynyl oestradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Hexane | Rathburn | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
| Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Fish study | |||
| orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | Watson Marlow | 982.0063.000 | |
| straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | Watson Marlow | 999.2008.000 | |
| pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m | Watson Marlow | 913.A008.016 | |
| 200 series multi-channel persitaltic pump | Watson Marlow | 205CA | |
| Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) | VWR | SFM1-3250 | |
| silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) | VWR | SFM1-5450 | |
| 2.5 L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
| magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| 17α-Ethynylestradiol | Sigma Aldrich | E4876-100MG | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| SPE | |||
| 1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 | Sigma Aldrich | 57276 | |
| disposable liners for manifold | Sigma Aldrich | 57059 | |
| filtration tubes without frits 6 ml pk 30 | Sigma Aldrich | 57242 | |
| reservior adaptors pk 12 | Sigma Aldrich | 57020-U | |
| stainless steel weight for manifold pk 4 | Sigma Aldrich | 57278 | |
| male Luer plug for manifold pk 12 | Sigma Aldrich | 504351 | |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57265 | |
| stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | Waters | WAT054806 | |
| Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | Waters | WAT020515 | |
| Methanol HPLC grade 2.5 L | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| 7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 | Fisher Scientific | TUL-520-031K | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |
References
- Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T.
- Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).
- Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).
- Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).
- Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).
- Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
- Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).
- The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
- Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).
- Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511 (2015).
- EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. , British Standards Institute. London, UK. (2006).
- Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).
- Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).
- Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).
- Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).
- Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).
- Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).
- Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).
- Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
- Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).
- Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).
- Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).
- Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).
- Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).
- Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).
- Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).
- Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32 (2012).
- Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).
- Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
