Summary
Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.
Abstract
Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat normale Haematopoiese wordt geregeld door verschillende microenvironmental signalen in de BM, waaronder gespecialiseerde cellulaire niches modulerende kritische hematopoietische stamcellen (HSC) functies1,2. Inderdaad, een meer gedetailleerd beeld van de hematopoietische communicatie nu ontstaat, waarin het endosteale en de endothelial nissen vormen functionele eenheden voor de regulering van normale HSC en hun nakomelingen3,4,5 . Nieuwe studies is gebleken dat het belang van gerelateerde cellen, adipocytes en neuronale cellen in het onderhouden en reguleren van HSC functie6,7,8. Bovendien zijn er aanwijzingen dat cellen van verschillende geslachten, d.w.z. myeloïde en lymfoïde cellen, huis en wonen in specifieke niches communicatie in het BM. Echter, een volledige toewijzing van de BM-communicatie en de inzittenden is nog in volle gang.
Transgene muis stammen uiting lineage specifieke fluorescerende markers of muizen genetisch gemanipuleerde om gebrek aan geselecteerde moleculen in bepaalde cellen van de BM-niche zijn nu beschikbaar. Knock-out en afstamming bijhouden van modellen, in combinatie met de benaderingen van de transplantatie, bieden de mogelijkheid om te verfijnen van de kennis over de rol van specifieke "niche" cellen voor gedefinieerde hematopoietische populaties, zoals HSC, B-cellen, T-cellen, myeloïde cellen en erythroid cellen. Deze strategie kan verder worden Potentiation door de samenvoeging van het gebruik van twee-foton microscopie van de calvarium. Door middel van in vivo de beeldvorming van de hoge resolutie en 3D-weergave van de BM-calvarium, kunnen we nu juist de locatie waar specifieke hematopoietische deelverzamelingen thuis in de BM en evalueren van de kinetiek van hun expansie na verloop van tijd bepalen. Hier, worden Lys-GFP transgene muizen (markering myeloïde cellen)9 en RBPJ knock-out muizen (ontbreekt canonieke Notch signalering)10 gebruikt in combinatie met IVFM om te bepalen van de engraftment van myeloïde cellen een inkeping defecte BM communicatie.
Introduction
Intravital multiphoton fluorescentie microscopie (IVFM) is een krachtige beeldvormende techniek waarmee de hoge resolutie, real-time imaging van weefsels met diepte tot 1mm, afhankelijk van het weefsel. Wanneer toegepast op de calvarium van de muis, laat het observeren van het gedrag van de hematopoietische cellen binnen de BM in een niet-invasieve manier omhoog tot en met 60-100 μm11. Deze benadering wordt hier gebruikt om te bepalen van de kinetiek van de engraftment van normale myeloïde voorlopercellen in de BM van RBPJ knock-out muizen ontbreekt canonieke Notch signalering.
Recente werk van onze fractie aangetoond dat defecte canonieke Notch signalering in de BM communicatie leidt tot een myeloproliferatieve-achtige ziekte12. Verlies van Inkeping signalering werd verkregen door voorwaardelijke schrapping van het DNA-bindende domein van RBPJ, de kritische transcriptiefactor stroomafwaarts van canonieke uitsparing signalering, met behulp van de Mx1-Cre geïnduceerde recombinatie10. In deze studie werd de Mx1-Cre/RBPJlox/lox muizen model gebruikt. Voorwaardelijke schrapping van het DNA-bindende motief van RBPJ leidt tot het verlies van signalering van alle Notch receptoren. In het model van de Mx1-Cre, Cre expressie wordt gedreven door de promotor van de Mx1 geactiveerd bij toediening van polyI:C, resulterend in de inductie van verwijdering van de gerichte gen in cellen van het bloed zo goed zoals in stromale onderdelen van meerdere organen, met inbegrip van BM, de milt en de lever.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox en Mx1-Cre-/RBPJlox/lox muizen geïnduceerde met polyI:C (visualisering aangegeven als RBPJKO en RBPJWT, respectievelijk) dodelijk waren bestraald en met normale, wild type hematopoietische cellen getransplanteerd. Vanaf week 4 na de transplantatie, ontwikkeld RBPJKO ontvangers belangrijke leukocytose gevolgd door splenomegalie. Hoewel RBPJKO muizen gepresenteerd verhoogd percentage van myeloïde voorlopercellen in de BM tijdens week 8 na de transplantatie en op latere tijdstippen, openbaarde analyse van BM op weken 4 en 6 niet opvallende verschillen in hun myeloïde celinhoud in vergelijking met controle RBPJWT ontvangers. Deze observatie, samen met het feit dat de Mx1-Cre wordt uitgedrukt in verschillende hematopoietische organen, de vraag gesteld of de BM communicatie directe invloed gehad op de opening van het myeloproliferatieve fenotype.
Om te bepalen of de BM een kritieke eerste site van ziekte ontwikkeling was, werd IVFM van de muis calvarium gebruikt in combinatie met BM transplantatie (BMT), het model van de knock-out RBPJ, en een tracking systeem afkomst. Transgene muizen EGFP uiten onder de controle van de specifieke lysozym promotor (Lys-GFP)9 werden gebruikt om het verkrijgen van de donor cellen die tijdens BM imaging na BMT kon worden gevisualiseerd. Lysozym expressie is specifiek voor myeloïde cellen en Lys-GFP markeert cellen van de gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP) voor de volwassen granulocyt-13.
IVFM van de BM op verschillende tijdstippen aangetoond dat Lys-GFP cellen homed op dezelfde manier naar de geadresseerden BM van RBPJWT en RBPJKO, maar uitgebreid en sneller geaccepteerd in de BM van RBPJKO ontvangers. Dit verschil was dramatisch op het eerdere tijdstip (week 2) en daalde na verloop van tijd (weken 4 en 6). Echter bij deze latere tijdstippen, evaluatie van het hematopoietische compartiment in de dezelfde ontvanger toonde een gestage toename in het aantal myeloïde cellen circuleren in de PB en gelokaliseerd in de milt van RBPJKO muizen, met vermelding van een verhoogde productie van cellen van de BM in de circulatie. Onderzoek van Lys-GFP cellen lokalisatie in het BM van getransplanteerde muizen op 6 weken bleek dat myeloïde cellen verder van de therapieën in de communicatie van de RBPJKO dan in het besturingselement woonden.
Collectief, de combinatie van IVFM met deze specifieke diermodellen geboden inzichten in de dynamiek van de engraftment van myeloïde cellen in de RBPJKO BM-communicatie. De proefopzet en kwantitatieve benadering hier beschreven wordt voorgesteld als een paradigma die kan worden toegepast om soortgelijke vragen. Bijvoorbeeld, kunnen het gebruik van andere cel specifieke afstamming bijhouden van modellen, zoals RAG1-GFP14 of Gata1-GFP15 muizen, naar aanleiding van het gedrag van lymfoïde of erythroid progenitorcellen, respectievelijk in de BM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij het gebruik van dieren werden uitgevoerd met toestemming van de Animal Care en gebruiken Comité van Indiana University School of Medicine. Zorgen om te voldoen aan de wetgeving inzake dierlijke proefneming van het land waar het werk wordt uitgevoerd.
1. bereiding van Mx1CreRBPJ- / - ontvanger muizen
- Kruis Mx1-Cre+ muizen met RBPJlox/lox muizen10 te verkrijgen van de Mx1-Crepositieve RBPJlox/lox muizen12 en Mx1-Cre negatieve RBPJlox/lox nestgenoten om te gebruiken als besturingselementen. Controleer of het genotype door PCR10.
- Gebruik van 6-8 week-oude Mx1Cre+/RBPJlox/lox en Mx1Cre-/RBPJlox/lox muizen voor het uitvoeren van de polyI:C-inductie.
-
Injecteren polyI:C 200 µg i.p. in Cre+ en Cre- muizen. Geef een polyI:C injectie elke andere dag gedurende 3 dagen de eerste week. Het geven van een injectie van de polyI:C de tweede week, 7 dagen na de vorige injectie (vier injecties in totaal).
- Gebruik RBPJKO (geïnduceerde Mx1Cre+/RBPJlox/lox) en RBPJWT (geïnduceerde Mx1Cre-/RBPJlox/lox) muizen als ontvangers 3 weken na de laatste injectie van de polyI:C.
Opmerking: Het is aanbevolen om het gebruik van muizen geïnduceerd door pI: pC 3 weken na de injectie. De reactie van de IFNα veroorzaakt door polyI:C induceert significante veranderingen in de BM, resulterend in de uitbreiding van de immunophenotypic van HSC en uitvoer van volwassen voorlopercellen daalde in het perifeer bloed16,17. Vertegenwoordiging van het hematopoietische deelverzamelingen is genormaliseerd 3 weken na de injectie en de muizen kunnen worden gebruikt zonder de storende effecten van ontsteking. Dit protocol inductie is geoptimaliseerd voor RBPJ. Als het verwijderen van een ander gen, het inductie-protocol kan variëren afhankelijk van de constructie en verwijdering moet worden gevalideerd. We gevalideerd ~ 100% verwijdering van de RBPJ-regio tussen loxP sites door RT-PCR na een totaal van vier polyI:C injecties.
- Gebruik RBPJKO (geïnduceerde Mx1Cre+/RBPJlox/lox) en RBPJWT (geïnduceerde Mx1Cre-/RBPJlox/lox) muizen als ontvangers 3 weken na de laatste injectie van de polyI:C.
2. voorbereiding van Lys-EGFP Donor beenmergcellen voor transplantatie
- Een Lys-EGFP muis (koolstofdioxide gevolgd door cervicale dislocatie) euthanaseren 1 of 2 h vóór de transplantatie.
- Spray de dierlijke lichaamsoppervlak met 70% ethanol.
- De chirurgische schaar gebruik te maken van een huid incisie op beide benen rond de enkel en met chirurgische pincet trek weg Pelsbereiderijen en bontwerkerijen samen om schone spierweefsel bloot te stellen.
- Heelkundige schaar verwijderen van zo veel spieren van de benen als mogelijk gebruiken. Met een schaar, knip de botten (bij de knie en de enkel gezamenlijk) en schoon elke resterende spierweefsel van het dijbeen en zijn verbeend met behulp van gaas sponzen. De beenderen (twee dijbeen en twee zijn verbeend) plaats in een 6-well plaat met DMEM 10% FBS.
- Plet de botten in een mortier met 10 mL koude 2mM EDTA PBS en Pipetteer de beenmergcellen te brengen van de cellen in één cel schorsing. Als alternatief, spoel de botten met 2 mM EDTA PBS 3 keer vanaf iedere kant met een spuit van 1 mL.
- Het beenmergcellen filteren met behulp van een 70-µm filter in een centrifugebuis 15 mL. Spoel filter met 2-3 mL PBS. Draai de cellen naar beneden 10 min op 460 x g, resuspendeer de cellen in 10 mL van de verse DMEM 10% FBS.
- Tellen van beenmergcellen op een hemocytometer en aanpassen van de concentratie aan 1.5 x 107 cellen/mL in IMDM zonder serum. 3 x 106 cellen per dier worden gebruikt met een volume van 200 µL. Ongeveer 1/3 cellen van totale BM zijn myeloïde GFP + cellen. Laat de cellen op ijs totdat u voor injectie. Gebruik 0,5 x 105 cellen om te bepalen van GFP expressie door FACS9.
3. het beenmerg transplantatie van Lys-GFP cellen in RBPJKO muizen
- Bedwingen ontvangende muizen in een kooi van de taart. Bestralen muizen met een dodelijke dosis gammastraling (1.200 Rad) op een Cs-137-irradiator. Een split dosis protocol gebruiken: 900 rads's avonds gevolgd door 300 rads de volgende ochtend (16 h uit elkaar).
- Verplant de dodelijk bestraalde RBPJWT en RBPJKO ontvangende muizen 5-6 uur na de tweede dosis straling. Injecteren van BM cellen geoogst van Lys-EGFP muizen bij een concentratie van 3 x 106 cellen per dier via staart veneuze injectie (zie details voor het oogsten van de cellen in de sectie 2).
- Afbeelding van onafhankelijke cohorten van getransplanteerde muizen door IVFM op verschillende tijdstippen: 24 h, en weken 2, 4 en 6, zoals beschreven hieronder (zie punt 4 & 5 voor in vivo imaging procedure).
4. chirurgische voorbereiding Intravital Imaging
- Steriliseren chirurgische instrumenten. Twee fijne pincet (één rechte, een hoek), een paar fijne schaar en een paar van de houders van de naald. Voorbereiding operatieve gebied met alle voorzieningen die nodig zijn voor de procedure.
- Geef de muis een IP-injectie van ketamine cocktail verdoving (Xylazine 2,5-5 mg/kg + acepromazine 1.0-2.5 mg/kg + ketamine 90-100 mg/kg) met behulp van een 26-28 G naald-spuit. Dier elke 15 min tijdens de procedure zal worden gecontroleerd en verdoving zal zo nodig op ¼ van de oorspronkelijke dosis worden aangevuld.
- Plaats de muis op een goede warmtebron (37 ° C verwarming pad, dier beschermd tegen direct contact met de verwarming pad) en visueel controleren de respiratoire tarief.
- Controleer met behulp van de teen reflexen knijpen reactie. Zorg ervoor dat het dier volledig onder verdoving voordat u begint met een chirurgische ingrepen.
- Gebruik een 26-28 gauge naald spuit geven muizen een staart veneuze injectie van een fluorescerende vasculaire marker (Dextran, 100 μl van 20 mg/mL oplossing).
- Dierenarts oog zalf toepassen op beide ogen. Clip het dorsale oppervlak van het hoofd van het dier met kleine elektrische tondeuse. Toepassing van een ontharing crème voor 5 min. gebruik gaas sponzen te verwijderen van de crème en daarna spoelen met zout. Prep de schone hoofdhuid met 70% alcohol, met behulp van een wattenstaafje.
- Gebruik fijne Tang en schaar om een kleine middellijn huid incisie (10-20 mm) op de hoofdhuid om het onderliggende oppervlak van de dorsale schedel bloot te stellen. Gebruik de chirurgische zijde 5-0 om twee verblijf hechtingen in de huid aan elke kant van de incisie, maken een klep om de calvarium voor imaging bloot te stellen.
- Plaats de muizen op hun rug en de blootgestelde hoofdhuid in een glazen bodem schotel gevuld met Microscoop olie dompelen. Vervoer van het dier aan de mutiphoton imaging kamer.
- Plaats van het dier in het werkgebied van de microscoop met de calvarium op de glazen schotel boven de doelstelling geplaatst en dan bedek met een 37° C verwarming pad (dier moet worden beschermd tegen direct contact met hitte).
5. in Vivo hoge resolutie beeldvorming van de muis Calvarium
- Een omgekeerde confocal systeem aangepast voor multiphoton imaging gebruiken (Zie materialen tabel). De instructies van de fabrikant volgende tune een laser 2-foton 830 nm, plaats een 20 X W, NB 0.95 objectief in de Microscoop neus stuk en controleer de laser beam uitlijning.
Opmerking: Rechtop Microscoop systemen worden meestal gebruikt voor deze studies, maar een omgekeerde multiphoton systeem kan ook worden gebruikt. In deze studie werd een aangepaste ontworpen atraumatische stereotaxic apparaat gebruikt. Hoewel er verschillende verkrijgbare stereotaxic apparaten voor rechtop Microscoop systemen, is er geen commercieel beschikbare stereotaxic apparaat voor een omgekeerde Microscoop systeem gericht op het beveiligen van de schedel van de muis. Als alternatief voor een aangepaste stereotaxic apparaat, kan de schedel worden beveiligd in positie boven de doelstelling met behulp van verschillende methoden van tape of lijm voor stabiliteit. - Open een afbeelding acquisitie software. In de "overname-instellingen" Controleer paneel als een directionele scanmodus is geselecteerd. De snelheid van het scannen naar 4 µs/pixel, framesnelheid op 512 x 512 pixels instellen en zoom om 1,5. 20 X W NB 0.95 doelstelling selecteren in de lijst met beschikbare lenzen van de doelstelling overeenkomen met de lens geplaatst in het neusstuk.
- Toegang tot de "kleurstof lijst" van de "Image Acquisition" Configuratiescherm en selecteer "Twee-foton". Open het venster "Licht pad & kleurstoffen" en selecteer DM690-980 excitatie DM. Open de sluiter van de laser 2P door het controleren van het selectievakje in de Laser-Unit 2. Selecteer in het venster "Microscoop Controller" RDM690 spiegel.
- Selecteer "EPI LAMP", kies B/G epi-filter kubus en richten de doelstelling op het model om te visualiseren vasculaire stroom en de calvarium het beenmerg niche, met als referentie de bifurcatie voor de centrale ader (a) en de coronaire hechtdraad (b) (figuur 2A).
-
Het verzamelen van beelden met behulp van niet-descanned modus. Selecteer drie externe detectoren: bet detector1 voor het verzamelen van de SHG signaal van collageen (emissie filter - 430/100 nm), GaAsP detector2 verzamelen GFP signaal (emissie filter - 525/50) en GaAsP detector3 voor het verzamelen van signaal van de TRITC-dextran (emissie filter - 605/90 nm).
- Uitvoeren van beeldvorming op een scanfrequentie van 4μs/pixel met geen gemiddeld om te minimaliseren van fototoxiciteit. Het verzamelen van beelden op een constante laser macht en detector winst aangepast voor het gebruik van het volledige dynamische bereik van de detector met minimale verzadiging.
- Aantal secties door de diepte van het weefsel (60 x 1 μm Z-stacks) ophalen in 6 regio's van de calvarium het beenmerg. Instellingen voor stap grootte van 1 μm gebruiken, zoom 1.5 en 512 x 512 pixels framegrootte (423 µm x 423 µm).
Opmerking: Over het geheel genomen totale tijd die nodig is om het imago van een muis is 1-1,5 h.
6. kwantitatieve analyse
- Uitvoeren van de afbeelding kwantificatie en 3D-reconstructies met behulp van een speciale 3D / 4D beeld kwantificatie en visualisatie software volgens de aanwijzingen van de fabrikant (Zie Materialen tabel). Visualiseer interactief Z-stacks in 3D met behulp van maximale intensiteit projectie (MIP), alpha-mix of schaduw projectie volume rendering algoritmen.
- Segment GFP cellen met behulp van de "Spot Object segmentatie module". Stapel rekenkundige verwerking (kanaal aftrekken) om valse positieve graaf van GFP cellen (dit elimineert signaal van bot cellen weergeven van sterke fluorescentie in groene en rode kanalen) toepassing.
- Segmentatie van therapieën en bot oppervlakte met behulp van de module oppervlakte segmentatie uitvoeren Indien nodig, berekenen van afstanden van cellen naar een van de bovenstaande oppervlakken door toepassing van X-spanning algoritmen "afstand van plek naar oppervlakte" genoemd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cohorten van 2 RBPJKO en 2 RBPJWT ontvangers waren beeld in een afzonderlijke imaging sessie op verschillende tijdstippen: 24 h en 2, 4 en 6 weken na de transplantatie van cellen van de BM Lys-GFP (werkstroom wordt geïllustreerd in figuur 1A).
In elke muis, werden de beelden verkregen uit 6 standaard regio's van de calvarium van BM, geïdentificeerd door hun positie ten opzichte van de bifurcatie voor de centrale ader (figuur 2A, a) en de coronaire hechtdraad (figuur 2A, b). Injectie van Dextran Texas-rood vóór imaging maakt de identificatie van deze monumenten en de selectie van de 6 regio's (figuur 2A): linksboven, Medium en recht (UL, UM, UR), linksonder, Medium en recht (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-stacks worden verzameld van elke regio en gesmolten als 3D-maximale intensiteit projectie (MIP), (figuur 2B); 3D-schaduw projectie, waaronder de bot component (grijs) gegenereerd door de tweede harmonische generatie (SHG) microscopie indringende collageen organisatie (figuur 2C); en tot slot een 3-D Segmented beeld, waardoor de kwantificatie van cellen en de meting van de afstanden van het bot en de schepen (figuur 2D).
Vanwege mogelijke verschillen in homing voorkeuren van hematopoietische cellen in de verschillende regio's van de BM-calvarium na de transplantatie is het belangrijk om te proeven van de verschillende regio's in de calvarium van elke muis. Figuur 3 toont een voorbeeld van de cel distributie in de 6 regio's geanalyseerd in één RBPJWT en één RBPJKO ontvanger op 2 weken na BMT (groen - myeloïde cellen, grijs-bot) met behulp van schaduw projectie 3D-rendering algoritme. Aantal cellen per regio varieerden van 64 tot 258 in de RBPJWT-muis en van 265 tot 573 in de RBPJKO-muis. Definitieve resultaten worden vervolgens uitgedrukt als gemiddelde aantal van de 6 regio's geanalyseerd: aantal cellen per regio / per muis (gemiddeld 135 in RBPJWT vs 469 in RBPJKO). Dit representatieve experiment geeft aan dat er een grotere variatie in cel verdeling per regio in de RBPJWT dan in de RBPJKO-ontvanger. Naast de variatie gevonden in de calvarium regio's binnen een muis, die gemeenschappelijk is, zijn er bovendien variaties onder individuele muizen binnen dezelfde groep. Het is dus belangrijk dat voor elk tijdstip ten minste 4 muizen per experiment te verkrijgen van een minimum van een totale 24 tot 30 regio's worden geanalyseerd per voorwaarde worden geëvalueerd.
Figuur 4 toont de dynamiek van myeloïde voorlopercellen expansie in een inkeping defecte BM communicatie t.o.v. controle meer dan 6 weken na de transplantatie. In dit representatieve experiment, waren 8 RBPJWT en 8 RBPJKO muizen getransplanteerde en beeld op de aangegeven tijd punten (2 RBPJWT muizen en 2 RBPJKO muizen op elk tijdstip). Figuur 4A toont een representatieve 3D-reconstructie van 1 van de 6 regio's verworven. Cellen in elk van de 6 regio's werden geteld en het gemiddelde aantal cellen/regio van twee muizen op elk tijdstip (totaal 12 regio's) werd berekend voor RBPJWT en RBPJKO ontvangers (figuur 4C). Deze analyse geeft aan dat: (i) donor Lys-GFP cellen in RBPJWT en RBPJKO ontvangers hebben een soortgelijke homing efficiëntie; II) cellen in de RBPJKO ontvangers vouw sneller en tweemaal het aantal cellen in de RBPJWT ontvangers staan 2 week na BMT; III) cellen in RBPJWT ontvangers later uit te breiden en zijn 2-fold hoger dan cellen in RBPJKO ontvangers bij week 4 na BMT; en iv) celaantal in zowel RBPJWT als RBPJKO ontvangers worden soortgelijke op week 6 na BMT. Analyse van donor myeloïde cellen in de PB geeft een hogere output van myeloïde cellen van de ontvangers van de BM van RBPJKO dan van de BM van RBPJWT ontvangers bij week 4, op het moment wanneer de muizen BM van RBPJKO een lagere gehalte aan Lys-GFP cellen toonde. De gecombineerde analyse van myeloïde cellen resident in het BM en myeloïde cellen circuleren in de PB, blijkt dat in de RBPJKO BM communicatie Lys-GFP cellen uit te breiden en zijn klaar om te mobiliseren sneller. Parallelle FACS analyse van Lys-GFP cellen in lange beenderen BM van de dezelfde muizen bleek een trend vergelijkbaar is met de waargenomen door IVFM; verschillen tussen de omstandigheden waren echter dat minder uitgesproken (figuur 4B).
Meting van de afstand van afzonderlijke Lys-GFP cellen van het bot of de therapieën is afgebeeld in Figuur 5. In dit representatieve studie, 3D-segmentatie analyse van de LM-regio van RBPJWT en RBPJKO calvarium op 6 weken van BMT werd gebruikt (figuur 5A). Afstand van bot en de schepen werden berekend voor elke cel in het gebied: 200 cellen in RBPJWT en 255 cellen in RBPJKO, en dus, uitgedrukt als een gemiddelde. Uit de analyse blijkt dat de Lys-GFP cellen lokaliseren op een soortgelijke afstand van het bot in de RBPJWT en RBPJKO muizen (11 μm), maar dat zij verder verwijderd van de therapieën wonen in RBPJKO muizen dan in RBPJWT muizen (15 μm vs 5 μm, respectievelijk). Dit resultaat is intrigerend, zoals in de RBPJKO muizen Lys-GFP cellen gemobiliseerd in de circulatie meer dan in RBJWT muizen, en dus zou worden verwacht om te lokaliseren dichter op de schepen. Het is echter mogelijk dat het verschil in lokalisatie weerspiegelt een verschillend stadium van differentiatie van deze twee populaties (in RBPJWT en RBPJKO), een punt dat niet kan worden opgelost door deze analyse. De betekenis van dit resultaat zal worden opgevolgd met een grotere pool van cellen in alle 6 regio's en door het combineren van FACS analyse.
Algehele suboptimaal resultaten worden verkregen wanneer een klein aantal regio's worden geanalyseerd per muis. Imaging vormt een bijzondere uitdaging op de vroege tijdstippen na BMT, zoals dodelijke bestraling de therapieën beschadigt en lekkage van dextran van haarvaten afbeelding definitie vermindert. Het is dus belangrijk dat een groot aantal herhalingen, vooral bij de vroegste tijd punten.
SHG is een nuttig instrument voor het onderzoeken van collageen vezels organisatie in 3D. Het is een tweede-orde niet-lineaire optische proces die afkomstig is van structuren zoals collageenvezels bezitten van niet-centrosymmetry en een hoge niet-lineaire coëfficiënt van de tweede orde. Wanneer intens invallende licht met dergelijke structuren communiceert, genereert het licht aan tweemaal de incident frequentie of de helft van de incident golflengte. Daarom is geen etikettering noodzakelijk om het vangen van de SHG signaal tijdens 2-foton microscopie. Met 830 nm excitatie golflengte vangen we SHG signaal in het blauwe kanaal met emissie filter 430/100 nm.
Figuur 1: Experimentele Workflow. (A) inductie van Mx1-Cre/RBPJlox/lox muizen voor het genereren van RBPJKO en RBPJWT muizen ~ 4 weken voorafgaande imaging; (B) voorbereiding van BM cellen van Lys-GFP transgene muizen; (C) transplantatie van BM Lys-GFP cellen in dodelijk bestraalde RBPJKO of RBPJWT ontvangers; (D) IVFM van muis calvarium op 24 h, 2, 4 en 6 weken na BMT, gevolgd door euthanasie en BM analyse door FACS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: IVFM van de BM vasculaire Niche. (A) Mosaic multi foton beeld van Lys-EGFP muis calvarium toont de 6 standaard regionen voor imaging (UL: linksboven, UM: Upper midden, UR: bovenste rechts, LL: lagere links, LM: lagere midden, LR: rechtsonder) (rood, therapieën groen, myeloïde cellen; gray, bot) 10 X vergroting; (B-D) BM niche detail weergegeven als: MIP (B), (C) 3D-schaduw projectie, (D) 3D-segmentatie afbeelding. Beelden werden verwerkt - met behulp van een speciale 3D / 4D beeld kwantificatie en visualisatie software (tabel 1). Schaal bars = 50 μm in B, C, D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Myeloïde cellen Engraftment op Week 2. Beelden van Lys-GFP cellen (groen) en bot oppervlakte (grijs) in de 6 BM-regio's van het bot van de calvarium van een RBPJWT en een RBPJKO muis (U: Upper, L: links, M: midden, R: recht). Schaal bars = 50 μm. Bar grafieken (rechts) geeft het aantal cel geteld in elke regio (RBPJWT bereik 64-258; RBPJKO variëren 265-573) en hun gemiddeld 135 STD +/-73 en 469 STD +/-121. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Kinetiek van myeloïde cellen Engraftment en Output volgende BMT. (A) beelden van Lys-GFP cellen (groen) en bot oppervlak (grijs) in één vertegenwoordiger regio uit de calvarium van een RBPJWT en RBPJKO muis op elk van de punten van de tijd aangegeven. Schaal bars = 50 μm; (B) Dot vlekken Toon percentage van Lys-GFP positieve cellen door stroom cytometry binnen de BM van lange-beenderen geoogst uit de dezelfde muis beeld in vivo (zie hierboven). (C) Bar grafieken geven gemiddeld aantal cellen/regio 2 muizen (totaal 12 regio's) op elk tijdstip, +/-STD. (D) lijn grafiek toont-voudige toename in het totale aantal neutrofielen (geïnventariseerd door cel teller) gepresenteerd in de PB van de dezelfde muizen dan in (A) op de aangegeven tijdstippen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Lokalisatie van myeloïde cellen in het BM-relatieve tot op het bot en de therapieën. (A) representatieve 3D-gesegmenteerde afbeeldingen van Lys-GFP cellen en therapieën, en Lys-GFP cellen en bot in dezelfde regio calvarium bot in RBPJWT en RBPJKO ontvangers aan week 6 van BMT. Schaal bars = 50 μm. (B) staafdiagram geeft een overzicht van de gemiddelde afstand in μm +/-SEM van Lys-GFP cellen uit het oppervlak van bot of de therapieën. Aantal cellen gemeten in: RBPJWT n = 200 cellen en RBPJKO n = 255 cellen. Afstand van Lys-GFP cellen uit de therapieën is groter in RBPJKO dan RBPJWT muizen, p < 0,001 (Student t-test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een experimenteel ontwerp geoptimaliseerd om te bestuderen van de kinetiek van hematopoietische cellen engraftment door Intravital TL microscopie. In deze studie, werd de uitbreiding van myeloïde voorlopercellen in een WT BM of in een inkeping signalering van defecte BM gevolgd in het bot calvarium door volgende Lys-GFP positieve myeloïde cellen na BMT in RBPJWT of RBPJKO ontvangers. Deze aanpak wordt voorgesteld als een model dat kan worden toegepast om soortgelijke vragen te stellen, bijvoorbeeld: ik) om de uitbreiding en de lokalisatie in de BM-nissen van cellen van andere geslachten, zoals lymfoïde, erythroid of megakaryocytic cellen, met behulp van als donor cellen hematopoietische cellen uitvoering van specifieke initiatiefnemers lineage rijden GFP of tomaatrode; II) te beoordelen van verschillende micro-milieu determinanten met behulp van andere specifieke KO of transgenic muizen als ontvangers.
Sterkte van dit imaging protocol in het calvarium bot, is dat de anatomische bezienswaardigheden gebruikt voor het selecteren van de BM-regio's, bifurcatie voor de centrale ader en de coronaire hechtdraad, zijn redelijk geconserveerd in alle muizen, samenhang tussen individu toe te staan experimenten tijdens het afzien van de eis van een geautomatiseerde stadium. Bovendien, het gebruik van het GFP-model voor het bijhouden van hematopoietische cellen bleek zeer effectief zijn, zoals GFP bepaald een stabiel signaal in suboptimaal voorwaarden, zoals na bestraling. Tot slot de imaging set-up beschreven, met behulp van een omgekeerde Microscoop en een aangepaste stereotaxic apparaat, waarin de muis in liggende positie is, sterk minimaliseren ademhaling artefacten.
Twee aspecten van deze proefopzet, kunnen indien uitgevoerd, leiden tot een breder en efficiënter gebruik van de IVFM van de calvarium. Ten eerste, het is belangrijk om te optimaliseren en standaardiseren van protocollen van longitudinale imaging zodat de waarneming van de dezelfde muis op verschillende tijdstippen (vanaf dag 2 tot enkele weken) na interventie (d.w.z. BMT of therapie) in plaats van met behulp van onafhankelijke cohorten van muizen. Als deze aanpak passende voorwaarden voor herstel na operatie en het gebruik van maatregelen vereist voor het tegengaan van ontsteking, infectie, en litteken vorming op de site van beeldvorming, is de toepassing ervan momenteel beperkt. Ten tweede, het zal waardevol zijn voor het ontwikkelen van een matrix van afstamming bijhouden Muismodellen uitvoering van fluorescente proteïnen in bepaalde cellen van de BM-niche (vasculaire, endosteale, gerelateerde en neuronale) hematopoietische cel functies combineren met specifieke kenmerken van de BM-nissen.
Beeldvorming van bot heeft nog steeds enkele uitdagingen en beperkingen in vergelijking met andere weefsels. Hoewel de twee-foton microscoop 100-1000 micron diep in weefsels doordringen kan, is het nog steeds wel uitdagend om het beeld door de gehele dikte van de calvarium bot. Beelden verliezen kwaliteit met toenemende diepte, zodat het protocol hier betrouwbare analyse van BM regio's uit 60 micron dikke stapels beschrijft. Een andere factor die leiden inconsistentie of suboptimaal imaging tot kan is de gebogen vorm van de calvarium bot, dat het beeld onscherp kan brengen. Het is cruciaal dat de schedel geplaatst perfect op de glazen schotel boven de doelstelling, eventueel met een stereotaxic apparaat. Inderdaad, de grootte van de schedel is belangrijk: schedel van muizen te jong of te klein mag niet perfect passen in een bepaald stereotaxic apparaat. Als voorbeeld past muizen jonger dan 6 weken en minder dan 20 g niet het apparaat hier gebruikt.
Een extra beperking is dat de imaging systeem gebruikt in deze studie beperkt tot 3 kanalen. Als het blauwe kanaal automatisch toegewezen wordt aan het verzamelen van niet-labeling gebaseerde SHG-signaal van het collageen voor bot, zijn slechts 2 kanalen beschikbaar voor het labelen van specifieke fluorescentie. Bovendien heeft dit systeem een beperking van de snelheid van 1 frame/s op 2 µs/pixel wonen tijd en de framegrootte van 512 x 512 pixels, die niet ideaal voor snel dynamische processen (zoals de mate van doorbloeding en evaluatie van de mobilisatie van de cel in de bloedbaan is).
Een belangrijke uitdaging is dat de bestraling uitgevoerd voor BMT compromissen de integriteit van therapieën. De vasculaire lekkage aanwezig in de BM na bestraling veroorzaakt problemen met segmentatie/kwantificatie van individuele structuren, die moeilijk de kwantitatieve analyse kunnen opleveren.
Tenslotte is het belangrijk om te overwegen dat beeldvorming van één muisklik ongeveer 1 uur duurt, en het aantal muizen die image kan worden gemaakt op een bepaalde dag beperkt is (~ 4 tot en met 6 muizen). Dus verhoging van de grootte van de steekproef te verkrijgen kracht van analyse mogelijk meerdere onafhankelijke experimenten, die variabiliteit toenemen kunnen.
Naar aanleiding van dit protocol is het aantal hematopoietische cellen Lys-GFP+ cellen opgespoord door IVFM in de BM na 24 h van BMT ~ 30 cellen/regio en het is vrij een klein aantal in vergelijking met de eerste ingang van cellen (3 x 106). Hoewel, deel van dit probleem moet cel overlapping in longen en lever voordat homing bij de BM i.v. injectie na, het valt nog te worden onderzocht of er gebieden in de calvarium dan degene die geselecteerd zijn waar de getransplanteerde cellen home op hoger efficiëntie.
Homing en engraftment van cellen in de BM na BMT worden vaak gevolgd door stroom cytometry door meting van CD45.1/CD45.2 markers, GFP, Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) of een combinatie van afkomst en markeringen van de cel van de stam. Het gebruik van IVFM, vooral in de vroege tijd punten, maakt beschikbaar unieke en aanvullende informatie die door stroom cytometry kan niet worden geleverd. Bijvoorbeeld, is het vaak niet gemakkelijk te onderscheiden door FACS gebeurtenissen die "cellen" van gebeurtenissen die "artefacten", in het bijzonder zijn wanneer een laag aantal positieve gebeurtenissen worden verzameld (dat wil zeggen op 24u van BMT). IVFM biedt informatie over morfologie en lokalisatie van de cellen die dit onderscheid helpt. FACS analyse van BM hematopoietische cellen geoogst door spoelen of crashen van de beenderen omvatten ook cellen die woonden in de niche en cellen die al in omloop in het vaatstelsel waren. Inderdaad, IVFM maakt het onderscheid en de evaluatie van cellen rust binnen de BM niche en cellen die in de bloedbaan zijn mobiliseren. Dit onderscheid is van grote waarde bij de studie van de kinetiek van homing, lokalisatie, differentiatie en mobilisatie in een bepaald model. Nog belangrijker is, kunnen IVFM unieke informatie verschaffen over de positie van het hematopoietische cellen ten opzichte van de communicatie-cellen vormen een specifieke niche.
Inspelen op de samenstelling van de BM-niche, dergelijke histologische analyse gebruikte andere methoden zijn gebruikt. Vergelijking tussen intravital microscopie van de BM en histologische analyse door confocale microscopie is elegant en grondig besproken door Lo Celso et al. 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Imaging werd uitgevoerd in het midden van de Indiana voor biologische microscopie aan de Indiana University, geregisseerd door Dr. Ken Dunn. Het stereotaxic apparaat is een prototype ontworpen en gemaakt door Mark Soonpaa, Wells centrum voor pediatrisch onderzoek. Dit werk werd ondersteund door NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), het onderzoek van MPN Stichting (NC) en de CTSI gezamenlijke project IUSM/Notre Dame (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
