Summary
Intravital fluorescens mikroskopi (IVFM) av calvarium brukes i kombinasjon med genetisk dyremodeller å studere drap og engraftment av blodkreft cellene i benmargen (BM) nisjer.
Abstract
Økende bevis viser at vanlige hematopoiesis er regulert av forskjellige microenvironmental bunker i BM, inkluderer spesialisert mobilnettet nisjer modulerende kritiske blodkreft stem cell (HSC) funksjoner1,2. Faktisk fremstår et mer detaljert bilde av blodkreft microenvironment nå, der den endosteal og den endothelial nisjer form funksjonelle enheter for regulering av normal HSC og deres avkom3,4,5 . Nye studier har vist betydningen av perivascular cellene, adipocytter og neuronal vedlikeholde og regulere HSC funksjon6,7,8. Videre er det bevis for at celler fra ulike linjene, dvs lymfoide og myeloide celler, hjem og bor i spesifikke nisjer i BM-microenvironment. En fullstendig kartlegging av BM-microenvironment og beboerne er imidlertid fortsatt pågår.
Transgene musen stammer uttrykke lineage bestemt fluorescerende markører eller mus genmodifiserte for å mangler utvalgte molekyler i bestemte celler i BM nisje er nå tilgjengelig. Knock-out og avstamning sporing modeller, sammen med transplantasjon tilnærminger, gi salgsmuligheten for å fornye kunnskap om rollen av "nisje" celler for definerte blodkreft bestander, som HSC B-celler, T-celler, myeloide celler og erythroid celler. Denne strategien kan være ytterligere potentiated ved å flette bruk av to-fotonet mikroskopi av calvarium. Ved å gi i vivo høy oppløsning bilder og 3D-gjengivelse av BM-calvarium, kan vi nå bestemme nøyaktig plassering der bestemte blodkreft delsett hjemme i BM og evaluere the kinetics av deres ekspansjon over tid. Her, brukes Lys-GFP transgene mus (markering myeloide celler)9 og RBPJ bank-out mus (mangler kanoniske hakk signalisering)10 i kombinasjon med IVFM til å bestemme engraftment av myeloide celler til et hakk defekt BM microenvironment.
Introduction
Intravital multiphoton fluorescens mikroskopi (IVFM) er en kraftig tenkelig teknikk som gir det høy oppløsning, sanntid imaging av vev med dybde opp til 1mm, avhengig av vev. Når brukt på mus-calvarium, tillater det observere atferden til blodkreft cellene i BM på en ikke-invasiv måte opp til 60-100 μm11. Denne fremgangsmåten brukes her til å bestemme the kinetics av engraftment av normal myelogen progenitors i BM av RBPJ bank-out mus mangler kanoniske hakk signalering.
Siste arbeid fra vår gruppe vist at defekt kanoniske hakk signalering i BM microenvironment fører til en myeloproliferative-lignende sykdom12. Tap hakk signalnettverk ble anskaffet av betinget sletting av DNA bindende domenet RBPJ, kritisk transkripsjon faktoren nedstrøms for kanoniske hakk signalnettverk, bruker Mx1-grobunn indusert rekombinasjon10. I denne studien ble Mx1-grobunn/RBPJlox/lox mus modell brukt. Betinget sletting av DNA-bindende motivet av RBPJ resulterer i tap av signal fra alle hakk reseptorer. I Mx1-grobunn modellen, grobunn uttrykk er drevet av Mx1 selskapet aktiveres ved administrasjon av polyI:C som resulterer i induksjon av målrettet genet sletting i blod celler så vel som stromal komponenter av flere organer, inkludert BM, milt og lever.
Mx1-grobunn+/RBPJlox/lox og Mx1-grobunn-/RBPJlox/lox mus indusert med polyI:C (heretter angitt som RBPJKO og RBPJWT, henholdsvis) var drepende bestrålt og transplantert normalt, vill type blodkreft cellene. Fra uke 4 etter transplantasjon, utviklet RBPJKO mottakere betydelige leukocytose etterfulgt av splenomegali. Selv om RBPJKO mus presentert økt andel av myelogen progenitors i BM på uke 8 etter transplantasjon og senere tidspunkt, avsløre analyse av BM uker 4 og 6 ikke slående forskjeller i deres myelogen celleinnholdet i forhold til kontrollen RBPJWT mottakere. Denne observasjon, sammen med det faktum at Mx1-grobunn uttrykkes i ulike blodkreft organer, reist spørsmålet om BM microenvironment hadde direkte innvirkning på initiering av myeloproliferative fenotypen.
For å fastslå om BM var en kritisk første side av sykdom utvikling, ble IVFM av mus-calvarium brukt i kombinasjon med BM transplantasjon (BMT), RBPJ bank-out modellen og en slektslinje sporingssystem. Transgene mus uttrykke EGFP under kontroll av bestemte lysozyme promoter (Lys-GFP)9 ble brukt til å få giver celler som kan visualiseres under BM imaging etter BMT. Lysozyme uttrykk gjelder myeloide celler og Lys-GFP markerer celler fra vanlige myelogen stamfar (CMP) til eldre granulocytt13.
IVFM med BM på ulike tidspunkt vist at Lys-GFP celler homed tilsvarende til BM av RBPJWT og RBPJKO mottakere, men utvidet og engrafted raskere i BM av RBPJKO mottakere. Denne forskjellen var dramatisk på det tidligere tidspunktet (uke 2) og gått ned over tid (uker 4 og 6). Men på disse senere tidspunkt, evaluering av blodkreft kupé i samme mottaker viste en jevn økning i antall myeloide celler i PB og lokalisert i milten av RBPJKO mus, som indikerer en økt produksjon av celler fra BM i sirkulasjonen. Analyse av Lys-GFP celler lokalisering i BM transplantert mus for 6 ukens avdekket at myeloide celler ble bosatt videre fra er blodkar i RBPJKO microenvironment enn i kontrollen.
Kollektivt, gitt kombinasjonen av IVFM med disse bestemte dyremodeller innsikt i engraftment dynamics av myeloide celler i RBPJKO BM-microenvironment. Eksperimentell design og kvantitativ tilnærming er beskrevet her er foreslått som et paradigme som kan brukes for å løse lignende spørsmål. For eksempel bruk av andre celle bestemt avstamning sporing modeller, for eksempel RAG1-GFP14 eller Gata1-GFP15 mus, kan følgende virkemåte lymfoide eller erythroid progenitors, i BM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr ble utført med godkjenning av Animal Care og bruke komiteen av Indiana University School of Medicine. Sørg for å følge lovgivningen på dyr eksperimentering i landet der arbeidet utføres.
1. forberedelse av Mx1CreRBPJ- / - mottaker mus
- Krysse Mx1-grobunn+ mus med RBPJlox/lox mus10 hente Mx1-grobunnpositive RBPJlox/lox mus12 og Mx1-grobunn negative RBPJlox/lox littermates bruke kontroller. Kontrollere genotype ved PCR10.
- Bruker 6-8-uke-gamle Mx1Cre+/RBPJlox/lox og Mx1Cre-/RBPJlox/lox mus til å utføre polyI:C induksjon.
-
Injiser polyI:C 200 µg IP grobunn+ og grobunn- mus. Gi en polyI:C injeksjon annenhver dag 3 dager den første uken. Gi en polyI:C injeksjon andre uke, 7 dager etter forrige injeksjon (fire injeksjoner totalt).
- Bruk RBPJKO (indusert Mx1Cre+/RBPJlox/lox) og RBPJWT (indusert Mx1Cre-/RBPJlox/lox) mus som mottakere 3 uker etter siste polyI:C injeksjon.
Merk: Det anbefales å bruke mus indusert av pI: pC 3 uker etter injeksjon. IFNα respons utløst av polyI:C medfører betydelige endringer i BM, noe som resulterer i immunophenotypic utvidelse av HSC og redusert produksjon av modne progenitors i perifert blod16,17. Blodkreft delsettene er normalisert 3 uker etter injeksjon og mus kan benyttes uten forvirrende effekten av betennelse. Denne induksjon protokollen er optimalisert for RBPJ. Hvis sletter en annen genet, induksjon protokollen kan variere avhengig av Konstruer og sletting må valideres. Vi validert ~ 100% sletting av regionen RBPJ mellom loxP områder av RT PCR etter totalt fire polyI:C injeksjoner.
- Bruk RBPJKO (indusert Mx1Cre+/RBPJlox/lox) og RBPJWT (indusert Mx1Cre-/RBPJlox/lox) mus som mottakere 3 uker etter siste polyI:C injeksjon.
2. forberedelse Lys-EGFP Donor beinmargen celleområde for transplantasjon
- Euthanize en Lys-EGFP mus (karbondioksid etterfulgt av cervical forvridning) 1 eller 2 h før transplantasjon.
- Spray dyr kroppen overflaten med 70% etanol.
- Bruk kirurgisk saks å gjøre en huden snitt på begge beina rundt ankelen og med kirurgisk tang trekke bort hud og pels sammen å avsløre ren muskelvev.
- Bruk kirurgisk saks for å fjerne så mye muskel fra bena som mulig. Bruke en saks, kuttet bein (på kne og ankel felles) og rense eventuelle gjenværende muskelvev fra femurs og tibias med gasbind svamper. Plasser bein (to femurs og to tibias) i en 6-vel plate inneholder DMEM 10% FBS.
- Knuse bein i en morter med 10 mL kaldt 2mM EDTA PBS og Pipetter benmarg cellene å bringe cellene til én celle suspensjon. Alternativt, skyll bein med 2 mM EDTA PBS 3 ganger fra hver side med en 1 mL sprøyte.
- Filtrere bein margtransplantasjon celler ved hjelp av en 70-µm filter i et 15 mL sentrifuge rør. Skyll filter med 2-3 mL PBS. Spinne cellene ned 10 min 460 x g, resuspend cellene i 10 mL av fersk DMEM 10% FBS.
- Telle bein margtransplantasjon celler i en hemocytometer og justere til konsentrasjonen til 1,5 x 107 celler/mL i IMDM uten serum. Bruk 3 x 106 celler per dyr med et volum på 200 µL. Ca 1/3 celler med totalt BM er myelogen GFP + celler. La cellene på is inntil klar for injeksjon. Bruk 0.5 x 105 cellene for å fastslå GFP uttrykk av FACS9.
3. benmarg transplantasjon av Lys-GFP celler i RBPJKO mus
- Holde mottakeren mus i pai bur. Irradiate mus med en dødelig dose gammastråling (1200 Rad) på en Cs 137 irradiator. Bruke en delt dose protokoll: 900 rads om kvelden etterfulgt av 300 rads neste morgen (16 h fra hverandre).
- Transplantasjon drepende bestrålt RBPJWT og RBPJKO mottakere musene 5-6 h etter andre dose stråling. Injisere BM celler høstet fra Lys-EGFP mus i en konsentrasjon av 3 x 106 celler per dyr via hale blodåre injeksjon (se detaljer for høsting celler i § 2).
- Bilde uavhengig kohorter av transplantert mus ved IVFM på ulike tidspunkt: 24 h, og på uker 2, 4 og 6, som beskrevet nedenfor (se avsnitt 4 og 5 for i vivo imaging prosedyre).
4. kirurgisk forberedelse til Intravital Imaging
- Sterilisere Kirurgiske instrumenter. To fine tang (en rett, en vinklet), et par fine saks og ett par nål holdere. Klargjør operative området med alle rekvisita som trengs for prosedyren.
- Gi musen IP injeksjon ketamin cocktail bedøvelse (Xylazine 2.5-5 mg/kg + acepromazine 1.0-2.5 mg/kg + ketamin 90-100 mg/kg) bruker en 26-28 G nål sprøyte. Dyr vil bli overvåket hvert 15 min under prosedyren og bedøvelse supplementeres nødvendig på lag ¼ av originalen dose.
- Plasser musen på en riktig varmekilde (37 ° C oppvarming pad, dyr beskyttet mot direkte kontakt med varmeputen) og visuelt overvåke respirasjonsfrekvens.
- Sjekk reflekser med tåen knip svar. Kontroller at dyret er helt under anestesi før du starter noen kirurgiske prosedyrer.
- Bruk en 26-28 måle pinne sprøyte gi mus en hale blodåre injeksjon av en fluorescerende vaskulær markør (dekstran, 100 μL 20 mg/mL løsning).
- Veterinæren øye ointment gjelde begge øynene. Klipp dorsal overflaten av at dyret med liten elektrisk avklipt. Bruke en hårfjerning krem for 5 min. Bruk gasbind svamper fjerne kremen og skyll med saltvann. Prep ren hodebunnen med 70% alkohol med en bomullspinne.
- Bruke fine tang og saks for å gjøre en liten midtlinjen huden snitt (10-20 mm) på hodebunnen å utsette underliggende dorsal skallen overflaten. Bruk 5-0 kirurgisk silke for å plassere to opphold suturene i huden på hver side av snitt, opprette en klaff for å avsløre calvarium for bildebehandling.
- Plasser musene på ryggen og dukke eksponert hodebunnen i et glass bunn rett fylt med mikroskopet olje. Transportere dyr å mutiphoton imaging rom.
- Dyret på mikroskopet scenen med calvarium plassert på glass rett over målsettingen og da dekke med en 37° C varmeputen (dyr må beskyttes mot direkte kontakt med varme).
5. i Vivo høy oppløsning avbilding av mus-Calvarium
- Bruke en invertert AC confocal system endret for multiphoton imaging (se materialer tabell). Følgende produsentens instruksjoner tune en 2-fotonet laseren 830 nm, setter du en 20 X W, NA 0,95 linsen i mikroskopet snuten og sjekk laser strålen justeringen.
Merk: Oppreist mikroskop systemer brukes vanligvis for disse studiene, men et omvendt multiphoton system kan også benyttes. En tilpasset designet atraumatiske stereotaxic enhet ble brukt i denne studien. Men det er flere tilgjengelige stereotaxic enheter for oppreist mikroskop systemer, er ingen kommersielt tilgjengelig stereotaxic enheter for en invertert mikroskop system rettet mot sikrer musa skallen. Som alternativ til en egendefinert stereotaxic enhet, kan skallen sikres i posisjon over målsettingen utnytte ulike bånd eller lim metoder for stabilitet. - Åpne en image oppkjøpet programvare. "Acquisition innstillinger" Kontroller panelet hvis en retningsbestemt skannemodus er valgt. Zoom til 1,5 definert hastighet skanning til 4 μs/piksel, bildefrekvens til 512 x 512 bildepunkter. Velg 20 X W Na 0,95 mål fra listen over tilgjengelige mål objektiver tilsvarer linsen i revolveren.
- Åpne "Fargestoff List" fra "Image Vinningen" kontrollpanelet og velg "To Foton". Åpne vinduet "Lys banen & fargestoffer" og velg DM690-980 eksitasjon DM. åpne 2P laser lukkeren ved å merke avmerkingsboksen i Laser enhet 2. Velg RDM690 speil i vinduet "Mikroskop Controller".
- Velg "EPI lampe", Velg B/G epi-filter kuben og fokusere målet til å visualisere vaskulær flyt og calvarium benmarg nisje, bruke som referanse bifurkasjonen av sentrale venen (a) og av koronar Sutur (b) (figur 2A).
-
Samle bilder ved hjelp av ikke-descanned-modus. Velg tre eksterne detektorer: avdrag detector1 samle SHG signalet av kollagen (utslipp filter - 430/100 nm), Amstel detector2 samle GFP signalet (utslipp filter - 525/50) og Mövenpick detector3 samle signal av TRITC-dekstran (utslipp filter - 605/90 nm).
- Utføre imaging frekvensen skanning av 4μs/bildepunkt med ingen snitt for å minimere Phototoksisitet. Samle bilder med konstant laser makt og detektor vinning justert for å bruke hele det dynamiske spekteret av detektor med minimal metning.
- Samle rekke deler gjennom dybden av vev (60 x 1 μm Z-stabler) fra 6 områder av calvarium benmarg. Bruk innstillingene for trinn på 1 μm, zoome 1.5 og 512 x 512 bildepunkter rammestørrelse (423 µm x 423 µm).
Merk: Total totaltiden krevde å bilde en mus er 1-1,5 h.
6. kvantitativ analyse
- Utføre bilde kvantifisering og 3D rekonstruksjoner bruker en dedikert 3D / 4D kvantifisering og visualisering programvare som produsentens instruksjoner (se Materialer tabell). Visualisere interaktivt Z-stabler i 3D utnytte maksimalt intensitet projeksjon (MIP), alpha-blanding eller skygge projeksjon volum gjengivelse algoritmer.
- Segmentere GFP celler ved hjelp av den "sted objektmodulen segmentering". Bruke stabelen aritmetiske behandling (kanal subtraksjon) for å eliminere falske positive antall GFP celler (dette eliminerer signal på beinet cellene viser sterk fluorescens i grønne og røde kanaler).
- Utføre segmentering av blodkar og bein overflate ved hjelp av modulen overflaten segmentering. Om nødvendig kan du beregne avstander celleområdet til noen av de ovennevnte flatene ved å bruke X-spenning algoritmer kalt "avstand på stedet til overflaten".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kohorter av 2 RBPJKO og 2 RBPJWT mottakere ble avbildet i en tenkelig økt på ulike tidspunkt: 24 h og 2, 4 og 6 uker etter transplantasjon av BM Lys-GFP celler (arbeidsflyt er illustrert i figur 1A).
I hver mouse, ble bildene anskaffet fra 6 standard regioner i BM calvarium, identifisert av deres posisjon i forhold til bifurkasjonen av sentrale venen (figur 2A, en) og det koronar suture (figur 2A, b). Injeksjon av dekstran Texas-rød før imaging tillater identifisering av disse landemerkene og valg av 6 regioner (figur 2A): venstre, Medium og høyre (UL, UM, UR), og nederst til venstre, Medium og høyre (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-stabler er samlet fra hver region og gjengis som 3D maksimal intensitet projeksjon (MIP), (figur 2B); 3D Shadow projeksjon, som inkluderer bein komponenten (grå) generert av den andre harmonisk generasjon (SHG) mikroskopi sondering kollagen organisasjon (figur 2C); og til slutt en 3D segmentert bilde, som lar kvantifisering av celler og måling av deres avstander fra benet og fartøy (figur 2D).
På grunn av potensielle forskjeller i homing preferanser blodkreft cellene i forskjellige regioner i BM-calvarium etter transplantasjon er det viktig å prøve flere områder i calvarium av hver musen. Figur 3 viser et eksempel på cellen distribusjon i 6 områder analysert i en RBPJWT og en RBPJKO mottaker to uker etter BMT (grønn - myeloide celler, grå-ben) med skygge projeksjon 3D-rendring algoritme. Antall celler per region varierte fra 64 til 258 RBPJWT musen og 265 til 573 RBPJKO musen. Sluttresultatet er deretter uttrykt som gjennomsnittlig antall 6 regionene analysert: antall celler regionen / pr mus (gjennomsnitt 135 i RBPJWT vs 469 i RBPJKO). Dette representant eksperimentet angir at det er en større variasjon i cellen fordeling regionen i RBPJWT enn i RBPJKO mottakeren. Videre, i tillegg til variasjon i calvarium områdene i en mus, som er vanlig, det er variasjoner blant enkelte mus innen samme gruppe. Derfor er det viktig at for hvert tidspunkt minst 4 mus evalueres per forsøk å få minst en totalt 24 30 regioner til å analysere per betingelse.
Figur 4 viser dynamikken i myeloid progenitor ekspansjon i et hakk defekt BM microenvironment forhold til kontroll over 6 uker etter transplantasjon. I denne representant eksperimentet, 8 RBPJWT og 8 RBPJKO mus transplantert og avbildet på de angitte tidspunkt (2 RBPJWT mus og 2 RBPJKO mus på hvert tidspunkt). Figur 4A viser en representant 3D rekonstruksjon av 1 til 6 regioner ervervet. Celler i hver av 6 regioner ble regnet og gjennomsnittlig antall celler/område om to mus på hvert punkt (totalt 12 regioner) ble beregnet for RBPJWT og RBPJKO mottakere (figur 4C). Denne analysen viser at: (i) donor Lys-GFP celler i RBPJWT og RBPJKO mottakere har en lignende homing effektivitet; II) celler i RBPJKO mottakerne utvide raskere og er dobbelt så mange celler i RBPJWT mottakerne i uke 2 etter BMT; III) celler i RBPJWT mottakere utvide senere og er 2-fold høyere enn celler i RBPJKO mottakere på uke 4 etter BMT; og iv) celle nummer i både RBPJWT og RBPJKO mottakere blir ligner på uke 6 etter BMT. Analyse av donor myeloide celler i PB angir en høyere produksjon av myeloide celler fra BM av RBPJKO mottakerne enn fra BM av RBPJWT mottakerne i uke 4, på tiden da BM av RBPJKO mus viste en lavere innhold av Lys-GFP celler. Kombinert analyse av myeloide celler bosatt i BM og myeloide celler i PB, viser at i RBPJKO BM microenvironment Lys-GFP celler utvide og er klar til å mobilisere raskere. Parallell FACS analyse av Lys-GFP celler i lange ben BM fra samme mus var lik den observert av IVFM; men var forskjellene mellom forholdene mindre uttalt (figur 4B).
Måling av avstand på enkelte Lys-GFP cellene fra bein eller er blodkar er vist i figur 5. I denne representant studien 3D segmentering analyse av LM regionen RBPJWT og RBPJKO calvarium på 6 uker fra BMT ble brukt (figur 5A). Avstand fra bein og fartøyene ble beregnet for hver celle i regionen: 200 celler i RBPJWT og 255 celler i RBPJKO, og dermed uttrykt som et gjennomsnitt. Analysen viser at Lys-GFP celler lokalisere på en tilsvarende avstand fra benet i RBPJWT og RBPJKO mus (11 μm), men at de bor mer fjernt fra er blodkar i RBPJKO mus enn i RBPJWT mus (15 μm vs 5 μm, henholdsvis). Dette resultatet er spennende, som i RBPJKO mus Lys-GFP celler mobilisert i sirkulasjonen mer enn i RBJWT mus, og vil derfor forventes å lokalisere nærmere til fartøyene. Det er imidlertid mulig at forskjellen i lokalisering gjenspeiler en annen scene av disse to bestandene (i RBPJWT og RBPJKO), et poeng som ikke løses av denne analysen. Betydningen av dette resultatet vil bli fulgt opp med et større celleområde i alle 6 regioner og ved å kombinere FACS analyse.
Samlet, suboptimal resultater er oppnådd når et lite antall områder er analysert per musen. Imaging er spesielt utfordrende på de tidlige tidspunkt etter BMT, som dødelige bestråling skader på blodkar og lekkasje av dekstran fra kapillærene reduserer bildedefinisjon. Dermed er det viktig å ha et stort antall gjentakelser, spesielt i de tidligste tidspunkt.
SHG er et nyttig verktøy for å undersøke kollagen fiber organisasjon i 3D. Det er en andre-ordens lineære optisk prosess som stammer fra strukturer som kollagen fibrene har ikke-centrosymmetry og en høy andre-ordens lineære koeffisient. Når intens innfallende lyset samhandler med slike strukturer, genereres lys på to ganger hendelsesfrekvens eller halv hendelsen bølgelengde. Derfor er ingen merking nødvendig for å fange SHG signal under 2-fotonet mikroskopi. Med 830 nm eksitasjon bølgelengde fange vi SHG signalet i den blå kanalen med utslipp filter 430/100 nm.
Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyten. (A) induksjon av Mx1-grobunn/RBPJlox/lox mus til å generere RBPJKO og RBPJWT mus ~ 4 uker før bildebehandling; (B) forberedelse av BM celler fra Lys-GFP transgene mus; (C) transplantasjon av BM Lys-GFP celler i drepende bestrålt RBPJKO eller RBPJWT mottakere; (D) IVFM av musen calvarium på 24 h, 2, 4 og 6 uker etter BMT, etterfulgt av euthanasia og BM analyse av FACS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: IVFM av BM vaskulær nisje. (A) Mosaic multi Foton bilde av Lys-EGFP mus calvarium viser 6 standard regionene imaging (UL: øvre venstre, UM: øvre midten, UR: øvre høyre, LL: nedre venstre LM: lavere midten, LR: nede t.h.) (grønn, myeloide celler, rød, blodkar, grå, bein) 10 X forstørrelse; (B-D) BM nisje detalj gjengitt som: (B) MIP, (C) 3D Shadow projeksjon, (D) 3-D segmentering bilde. Bildene ble behandlet - ved hjelp av en dedikert 3D / 4D kvantifisering og visualisering programvare (tabell 1). Skalere barer = 50 μm i B, C, D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Myeloide celler Engraftment på uke 2. Bilder av Lys-GFP celler (grønn) og bein overflaten (grå) i 6 BM områder fra calvarium beinet av en RBPJWT og en RBPJKO mus (U: øvre, L: venstre, M: midten, R: høyre). Skalere barer = 50 μm. Søylediagrammer (høyre) angir antall celle telles i hver region (RBPJWT range 64-258; RBPJKO range 265-573) og deres gjennomsnitt 135 STD +/-73 og 469 STD +/-121. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kinetics av myeloide celler Engraftment og utgang følgende BMT. (A) bilder av Lys-GFP celler (grønn) og bein overflaten (grå) i en representant region fra calvarium av en RBPJWT og RBPJKO musen på hver gang poeng. Skalere barer = 50 μm; (B) Dot blotter viser prosentandelen av Lys-GFP positive celler av flowcytometri i BM av lange-ben høstet fra samme musen fotografert i vivo (over). (C) søylediagrammer angir gjennomsnittlig antall celler/område i 2 mus (totalt 12 regioner) på hvert punkt, +/-STD. (D) linje grafen viser fold økning i antall nøytrofile (nummerert av cellen teller) i PB av samme mus enn i (A) på de angitte tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Lokalisering av myeloide celler i den BM Relative benet og er blodkar. (A) representant 3D segmentert bilder av Lys-GFP celler og blodkar, og Lys-GFP celler og bein i den samme regionen i calvarium bein i RBPJWT og RBPJKO mottakere på uke 6 fra BMT. Skalere barer = 50 μm. (B) stolpediagram oppsummerer den gjennomsnittlige avstanden i μm +/-SEM av Lys-GFP celler fra bein overflaten eller er blodkar. Antall celler målt i: RBPJWT n = 200 celler og RBPJKO n = 255 celler. Lys-GFP celler fra er blodkar er større RBPJKO enn RBPJWT mus, p < 0,001 (Student t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en eksperimentell design optimalisert for å studere the kinetics av blodkreft cellene engraftment av Intravital fluorescerende mikroskopi. I denne studien ble utvidelse av myeloid progenitor celler i en WT BM eller et hakk signalering defekt BM sporet i bein calvarium av følgende Lys-GFP positive myeloide celler etter BMT i RBPJWT eller RBPJKO mottakere. Denne tilnærmingen er foreslått som en modell som kan brukes på adressen lignende spørsmål, for eksempel: jeg) å finne ekspansjon og lokalisering i BM nisjene celler av andre linjene, som lymfoide, erythroid eller megakaryocytic celler, ved å bruke som giver celler blodkreft cellene bærer avstamning bestemte arrangørene GFP eller tomater-rød; II) å vurdere ulike micro-miljøbestemt determinanter ved hjelp av andre spesifikke KO eller transgene mus som mottakere.
Styrken i denne tenkelig protokollen i calvarium bein, er at anatomiske landemerkene å velge BM regionene, bifurkasjonen av sentrale venen og det koronar suture, er rimelig bevart i alle mus, tillater konsistens mellom enkelte eksperimenter mens avkall kravet til en automatisert scenen. I tillegg bruken av GFP modellen spore blodkreft cellene viste seg for å være svært effektive, som GFP gitt et stabilt signal i suboptimal forhold, som etter bestråling. Til slutt, tenkelig opplegget beskrevet, med en invertert mikroskop og en tilpasset stereotaxic enhet der musen er i supine posisjon, sterkt minimere puste gjenstander.
To aspekter ved denne eksperimentell design, kan hvis implementert, føre til en bredere og mer effektiv bruk av IVFM for calvarium. Først vil det være viktig å optimalisere og standardisere protokoller langsgående tenkelig at observasjon av samme musen på forskjellige tidspunkt (fra dag 2 til flere uker) etter intervensjon (i.e. BMT eller terapi) i stedet for uavhengige kohorter av mus. Som dette krever riktig forhold for etter operasjonen utvinning og bruk av tiltak for å motvirke betennelse, infeksjon, og arr formasjon på stedet av imaging, er anvendelsen for øyeblikket begrenset. Andre, vil det være verdifullt å utvikle en rekke avstamning sporing musen modeller med fluorescerende proteiner i bestemte celler i BM nisje (vaskulær, endosteal, perivascular og neuronal) å kombinere blodkreft celle funksjoner med spesifikke kjennetegner BM nisjene.
Avbildning av bein fortsatt har noen utfordringer og begrensninger i forhold til andre vev. Selv om to-fotonet mikroskopet kan trenge 100-1000 mikron dypt i vev, er det fortsatt utfordrende å image gjennom hele tykkelsen på calvarium bein. Bilder miste kvalitet med økende dybde slik protokollen her beskriver pålitelig analyse av BM regioner fra 60 mikron tykk stabler. En annen faktor som kan føre til inkonsekvens eller suboptimal imaging er buede formen på calvarium bein, som kan bringe bildet uskarpt. Det er avgjørende å ha skallen plassert perfekt på glass rett over målsettingen, muligens med en stereotaxic enhet. Faktisk skallen størrelsen er viktig: skallen mus for ung eller for lite kan ikke passer perfekt i en gitt stereotaxic enhet. Som et eksempel passer ikke enheten brukes her mus yngre enn 6 uker og mindre enn 20 g.
En ekstra begrensning er at tenkelig systemet benyttes i denne studien er begrenset til 3 kanaler. Som den blå kanalen tilordnes automatisk samle inn ikke-merking basert SHG signalet av kollagen som bein, er bare 2 kanaler tilgjengelig for bestemte fluorescens merking. Videre har dette systemet en fart begrensning av 1 rammen/s på 2 μs/bildepunkt bor tid og 512 x 512 bildepunkter rammestørrelse, som ikke er ideelt for rask dynamisk prosesser (for eksempel mål av blodstrøm og vurdering av cellen Mobilisering i blodet).
En viktig utfordring er at irradiation utført BMT kompromiss integriteten i blodkar. Vaskulær lekkasje i BM etter bestråling forårsaker problemer med segmentering/kvantifisering av individuelle strukturer, som kan utgjøre problemer med kvantitativ analyse.
Endelig er det viktig å vurdere at avbilding av ett museklikk tar ca 1 h, og mus som kan avbildes i en gitt dag er begrenset (~ 4-6 mus). Dermed kan økningen i utvalgsstørrelsen du tak power analyse kreve flere uavhengige eksperimenter, som kan øke variasjon.
Etter denne protokollen er antall blodkreft cellene Lys-GFP+ celler oppdaget av IVFM i BM etter 24 timer fra BMT er ~ 30 celler/område og det ganske lite antall sammenlignet med første input av celler (3 x 106). Selv om en del av problemet er grunn celle overlapping i lunge og lever før homing å BM etter IV injeksjon, det gjenstår å bli utforsket om det er områder i calvarium enn de valgte der transplantert cellene hjemme om høyere effektivitet.
Homing og engraftment celler i BM etter BMT er vanligvis etterfulgt av flowcytometri ved måling av CD45.1/CD45.2 markører, GFP, Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eller kombinasjon av avstamning og stamcelleforskningen markører. Bruk av IVFM, spesielt på tidlig tidspunkt, gjør tilgjengelig unik og ekstra informasjon som ikke kan gis av flowcytometri. For eksempel ofte det er ikke lett å skille av FACS hendelser som "celler" av hendelser som er "gjenstander", spesielt når et lavt antall positive hendelser samles (dvs. på 24 h fra BMT). IVFM gir informasjon om morfologi og lokalisering av cellene som dette skillet. Tilsvarende inkluderer FACS analyse av BM blodkreft cellene høstet av rødme eller krasje bein celler som var bosatt i nisje og celler som allerede var i omløp i vaskulære systemet. Faktisk tillater IVFM skillet og evaluering av celler hviler i BM nisje og celler som mobiliserer i blodet. Denne forskjellen er av stor verdi når studere the kinetics av homing, lokalisering, differensiering og Mobilisering i en gitt modell. Viktigst, kan IVFM gir unike informasjon om plasseringen av blodkreft cellene i forhold til de microenvironment cellene utgjør en bestemt nisje.
Andre metoder brukes til å håndtere sammensetningen av BM nisje, så histologiske analyse brukes. Sammenligning mellom intravital mikroskopi med BM og histologiske analyse av AC confocal mikroskopi er grundig og elegant diskutert av Lo Celso et al. 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Bildebehandling ble gjennomført i Indiana Center for biologisk mikroskopi ved Indiana University, ledet av Dr. Ken Dunn. Stereotaxic enheten er en prototype designet og utviklet av Mark Soonpaa, Wells senter for Pediatric forskning. Dette arbeidet ble støttet av NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN forskning Foundation (NC) og CTSI samarbeid prosjektet IUSM/Notre Dame (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
