Summary
Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.
Abstract
Erhöhung der Beweis zeigt an, dass die normale Blutbildung durch ausgeprägte microenvironmental Hinweise in der BM reguliert wird, darunter spezialisierte zelluläre Nischen modulierende kritische hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Funktionen1,2. In der Tat zeichnet sich ein genaueres Bild von der hämatopoetische Mikroumgebung jetzt bei dem bilden der endosteal und die endothelialen Nischen Funktionseinheiten für die Regulierung des normalen HSC und ihre Nachkommen3,4,5, . Neue Studien haben die Bedeutung der perivaskuläre, Adipozyten und neuronalen Zellen bei der Erhaltung und Regulierung der HSC Funktion6,7,8gezeigt. Darüber hinaus gibt es Beweise, dass Zellen aus verschiedenen Linien, d.h. myeloischen und lymphatischen Zellen, Haus und wohnen in speziellen Nischen innerhalb der BM Mikroumgebung. Allerdings ist eine vollständige Zuordnung der BM Mikroumgebung und seine Bewohner noch im Gange.
Transgenen Mausstämme Linie bestimmte fluoreszierende Markierungen oder Mäuse, die genetisch ausgeführt, um ausgewählte Moleküle in bestimmten Zellen der BM Nische fehlt auszudrücken sind jetzt verfügbar. Knock Out und Abstammung tracking-Modelle in Kombination mit Transplantation Ansätze bieten die Möglichkeit, das Wissen über die Rolle der spezifischen "Nische" zu verfeinern Zellen für definierte hämatopoetischen Bevölkerungen, wie HSC, B-Zellen, T-Zellen, myeloische Zellen und erythroiden Zellen. Diese Strategie kann weiter durch die Zusammenlegung des Einsatz von zwei-Photonen-Mikroskopie von den Calvarium verstärkt werden. Indem in Vivo hochauflösende Bildgebung und 3-d-Rendering von BM Calvarium, können wir jetzt genau die Position bestimmen, wo bestimmte hämatopoetische Teilmengen in BM zu Hause und die Kinetik der ihre Expansion im Laufe der Zeit zu bewerten. Hier werden Lys-GFP transgene Mäuse (Markierung myeloische Zellen)9 und RBPJ Knock-out-Mäusen (fehlender kanonische Notch signaling)10 in Kombination mit IVFM zur Engraftment myeloische Zellen eine Kerbe defekt BM Mikroumgebung zu bestimmen.
Introduction
Intravitalen multiphoton Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das ermöglicht die hochauflösende, Echtzeit-Bildgebung von Geweben mit Tiefe bis zu 1mm, je nach Gewebe. Bei der Anwendung auf die Maus Calvarium ermöglicht es, beobachtet das Verhalten der hämatopoetischen Zellen innerhalb der BM in eine nicht-invasive Weise bis zu 60-100 μm11. Dieser Ansatz dient hier die Kinetik des Engraftment des normalen myeloische Vorfahren in den BM RBPJ Knock-out-Mäusen fehlt kanonische Kerbe Signalisierung zu bestimmen.
Neuere Arbeiten aus unserer Gruppe zeigten, dass Defekte kanonische Kerbe Signalisierung BM Mikroumgebung, führe zu einer myeloproliferative-ähnliche Erkrankung12. Verlust der Notch signaling erhielten bedingte Löschung der DNA-bindende Domäne der RBPJ, der kritischen Transkriptionsfaktor flussabwärts der kanonischen Kerbe Signalisierung mit Mx1-Cre Rekombination10induziert. In dieser Studie wurde die Mx1-Cre/RBPJLox/Lox Mäusen Modell verwendet. Bedingte Löschung des Motivs DNA-Bindung des RBPJ führt zum Verlust der Signalisierung von allen Notch Rezeptoren. In der Mx1-Cre-Modell, Cre Ausdruck durch den Mx1-Projektträger bei der Verabreichung von PolyI:C, wodurch die Induktion der gezielte gen Löschung in den Blutkörperchen sowie Stromazellen Komponenten mehrerer Organe aktiviert angetrieben wird einschließlich BM, Milz und Leber.
Mx1-Cre+/RBPJLox/Lox und Mx1-Cre–/RBPJLox/Lox Mäusen mit PolyI:C (hereon gekennzeichnet als RBPJKO und RBPJWT, beziehungsweise) induziert wurden tödlich bestrahlt und mit normalen, Wildtyp hämatopoetischen Zellen transplantiert. Ab 4. Woche nach der Transplantation, entwickelt RBPJKO Empfänger deutliche Leukozytose gefolgt von Splenomegalie. Obwohl RBPJKO Mäuse zunehmenden Anteils myeloischer Vorläuferzellen in der BM 8. Woche nach Transplantation und zu späteren Zeitpunkten vorgestellt, offenbart Analyse des BM 4 und 6 Wochen nicht auffällige Unterschiede inhaltlich myeloische Zellen im Vergleich zur Kontrolle RBPJWT Empfänger. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass Mx1-Cre in verschiedenen blutbildenden Organe exprimiert wird die Frage aufgeworfen, ob die BM Mikroumgebung direkten Einfluss auf die Einleitung der myeloproliferative Phänotyp hatten.
Um festzustellen, ob der BM eine kritische erste Website der Krankheitsentwicklung war, wurde IVFM von der Maus Calvarium in Kombination mit BM-Transplantation (BMT), RBPJ-Knock-Out-Modell und eine Linie tracking-System verwendet. Transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck EGFP unter der Kontrolle der spezifischen Lysozym Promotor (Lys-GFP)9 wurden verwendet, um die Spenderzellen zu erhalten, die bei BM imaging nach BMT visualisiert werden können. Lysozym Ausdruck ist spezifisch für myeloische Zellen und Lys-GFP markiert Zellen aus der gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMP) zur Reife Granulozyten13.
IVFM des BM zu unterschiedlichen Zeitpunkten gezeigt, dass Lys-GFP Zellen ebenso an die BM der RBPJWT und RBPJKO Empfänger vernetzten, aber erweitert und schneller in der BM RBPJKO Empfänger aufgeprägt. Dieser Unterschied war dramatisch zum früheren Zeitpunkt (Woche 2) und verringerte sich im Laufe der Zeit (Wochen 4 und 6). Jedoch zu dieser späteren Zeitpunkten, Bewertung von hämatopoetischen Fach in den gleichen Empfänger zeigte eine stetige Zunahme der Zahl der myeloischen Zellen zirkulieren in der PB und lokalisiert in der Milz von Mäusen, RBPJKO, zeigt eine erhöhte Leistung von Zellen aus dem BM in den Blutkreislauf. Lys-GFP Zellen Lokalisierung in der BM von transplantierten Mäusen bei 6 Wochen ergab, dass myeloische Zellen weiter das Gefäßsystem in der Mikroumgebung RBPJKO als im Steuerelement wohnen würden.
Kollektiv, Einblicke die Kombination von IVFM mit dieser bestimmten Tiermodellen in der Engraftment Dynamik der myeloischen Zellen in die RBPJKO BM Mikroumgebung. Die Versuchsplanung und quantitative der hier beschriebene Ansatz wird vorgeschlagen, als ein Paradigma, die angewendet werden kann, um ähnliche Fragen beantworten. Beispielsweise gestatten die Verwendung der anderen Zelle spezifische Linie tracking-Modelle, wie RAG1-GFP14 oder Gata1-GFP15 Mäuse, im Anschluss an das Verhalten des lymphatischen oder erythroiden Vorläuferzellen, bzw. in dem BM.
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Protocol
Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Verwendung von Tieren wurden mit Genehmigung der Animal Care und verwenden Ausschuss der Indiana University School of Medicine durchgeführt. Sicherstellen Sie, dass die Einhaltung der Rechtsvorschriften über Tierversuche des Landes wo die Arbeit ausgeführt wird.
1. Vorbereitung des Mx1CreRBPJ- / - Empfänger Mäuse
- Mx1-Cre+ Mäuse mit RBPJLox/Lox Mäusen10 Mx1-Cre zu überquerenpositive RBPJLox/Lox Mäusen12 und Mx1-Cre negative RBPJLox/Lox Wurfgeschwistern als Steuerelemente verwenden. Überprüfen Sie den Genotyp durch PCR-10.
- Verwenden Sie 6-8 Wochen-alte Mx1Cre+/RBPJLox/Lox und Mx1Cre–/RBPJLox/Lox Mäusen, die PolyI:C Induktion durchzuführen.
-
PolyI:C 200 µg i.p Cre+ und Cre– Mäuse zu injizieren. Geben Sie eine PolyI:C Injektion jeden zweiten Tag für 3 Tage in der ersten Woche. Geben Sie eine PolyI:C Injektion der zweiten Woche, 7 Tage nach der letzten Injektion (insgesamt vier Injektionen).
- Verwenden Sie RBPJKO (induzierte Mx1Cre+/RBPJLox/Lox) und RBPJWT (induzierte Mx1Cre–/RBPJLox/Lox) Mäuse als Empfänger 3 Wochen nach der letzten Injektion von PolyI:C.
Hinweis: Es wird empfohlen, Mäuse induziert durch pI: pC 3 Wochen nach der Injektion zu verwenden. Die IFNα Reaktion ausgelöst durch PolyI:C erhebliche Veränderungen in der BM, was die Immunophenotypic-Erweiterung des HSC und verringerte Leistung von Reifen Stammväter in das periphere Blut16,17. Darstellung der hämatopoetischen Teilmengen ist normalisierte 3 Wochen nach der Injektion und die Mäuse ohne verwirrende Entzündungen genutzt werden können. Diese Induktion-Protokoll ist für RBPJ optimiert worden. Wenn ein anderes gen zu löschen, die Induktion Protokoll variieren das Konstrukt und Löschung muss überprüft werden. Wir validiert ~ 100 % Streichung der RBPJ Region zwischen LoxP-Standorten durch RT-PCR nach insgesamt vier PolyI:C Injektionen.
- Verwenden Sie RBPJKO (induzierte Mx1Cre+/RBPJLox/Lox) und RBPJWT (induzierte Mx1Cre–/RBPJLox/Lox) Mäuse als Empfänger 3 Wochen nach der letzten Injektion von PolyI:C.
2. Vorbereitung des Lys-EGFP Spenderzellen Knochenmark zur Transplantation
- Einschläfern eine Lys-EGFP-Maus (Kohlendioxid gefolgt von zervikale Dislokation) 1 oder 2 h vor der Transplantation.
- Besprühen Sie die tierischen Körper-Oberfläche mit 70 % Ethanol.
- Können Sie chirurgische Scheren einen Hautschnitt an beiden Beinen um den Knöchel zu machen und mit chirurgischen Zangen wegziehen Haut und Fell zusammen, um saubere Muskelgewebe verfügbar zu machen.
- Verwenden Sie chirurgische Scheren, um so viel Muskelmasse wie möglich aus den Beinen zu entfernen. Mit einer Schere schneiden die Knochen (an Knie und Sprunggelenk) und alle übrigen Muskelgewebe aus dem Oberschenkelknochen und Schienbeine mit Gaze Schwämme reinigen. Legen Sie die Knochen (zwei Oberschenkelknochen und zwei Tibien) in einer 6-Well-Platte mit DMEM 10 % FBS.
- Zerdrücken Sie den Knochen in einem Mörser mit 10 mL kalten 2mM EDTA PBS und Pipettieren Knochenmarkzellen um die Zellen in einzellige Aussetzung zu bringen. Alternativ spülen Sie die Knochen mit 2 mM EDTA PBS 3 Mal von jeder Seite mit einer 1 mL Spritze.
- Filtern Sie die Knochenmarkzellen mit einem 70 µm-Filter in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Spülen Sie die Filter mit ca. 2-3 mL PBS. Drehen Sie die Zellen nach unten 10 min bei 460 X g, Aufschwemmen der Zellen in 10 mL frisches DMEM 10 % FBS.
- Zählen Sie Knochenmarkzellen auf ein Hemocytometer und passen Sie die Konzentration auf 1,5 x 107 Zellen/mL in IMDM ohne Serum. Verwenden Sie 3 x 106 Zellen pro Tier mit einem Volumen von 200 µL. Ca. 1/3 des gesamten BM myeloische GFP + Zellen sind. Lassen Sie die Zellen auf Eis, bis bereit zur Injektion. Verwenden Sie 0,5 x 105 Zellen GFP Ausdruck durch FACS9zu ermitteln.
(3) Knochenmark-Transplantation von Lys-GFP Zellen in RBPJKO Mäuse
- Empfängers Mäuse in einem Kreisdiagramm Käfig zurückhalten. Mäuse mit einer letalen Dosis von Gamma-Strahlung zu bestrahlen (1.200 Rad) auf eine Cs-137-Brutapparat. Verwenden Sie eine geteilte Dosis Protokoll: 900 rads am Abend gefolgt von 300 rads am nächsten Morgen (16 h auseinander).
- Transplant letal bestrahlten RBPJWT und RBPJKO Empfänger Mäuse 5-6 h nach der zweiten Dosis der Strahlung. BM injizieren Zellen geerntet von Lys-EGFP-Mäusen in einer Konzentration von 3 x 106 Zellen pro Tier über Heck Vene Injektion (siehe Details zum Ernten von Zellen in Abschnitt 2).
- Bild unabhängige Kohorten von transplantierten Mäusen durch IVFM zu verschiedenen Zeitpunkten: 24 h, und in der Woche 2, 4 und 6, wie beschrieben unten (siehe Abschnitt 4 & 5 für in-Vivo imaging-Verfahren).
4. chirurgische Vorbereitung intravitalen Imaging
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente. Zwei feine Pinzette (eine gerade, eine abgewinkelt), ein paar feine Schere und ein paar Nadelhalter. Bereiten Sie operativen Bereich mit allen Lieferungen für Verfahren benötigt.
- Geben Sie der Maus eine IP-Injektion von Ketamin cocktail Betäubung (Xylazin 2,5-5 mg/kg + Acepromazine 1,0-2,5 mg/kg + Ketamin 90-100 mg/kg) mit einer 26-28 G Nadel Spritze. Tier wird alle 15 Minuten während des Eingriffs überwacht werden und Narkose wird nach Bedarf auf ¼ der ursprünglichen Dosis ergänzt werden.
- Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer richtigen Wärmequelle (37 ° C Heizkissen, Tier geschützt vor direktem Kontakt mit Heiz-Pads) und überwachen Sie die Atemfrequenz visuell zu.
- Überprüfen Sie Reflexe mit dem Zeh Response kneifen. Sicherstellen Sie, dass das Tier vollständig unter Narkose ist, vor Beginn jeder chirurgischen Eingriffen.
- Verwendung eines 26-28 gauge Nadel Spritze Mäuse eine Rute Vene Injektion eines fluoreszierenden vaskuläre Marker (Dextran, 100 μL 20 mg/mL Lösung) geben.
- Tierarzt Augensalbe auf beiden Augen anwenden. Clip der dorsalen Oberfläche des Tierkopfes mit kleinen elektrischen Haarschneider. Wenden Sie eine Haarentfernung Creme für 5 min. Einsatz Gaze Schwämme, die Creme zu entfernen und dann mit Kochsalzlösung abspülen. Vorbereitung der sauberen Kopfhaut mit 70 % Alkohol mit einem Wattestäbchen.
- Verwenden Sie feine Pinzetten und Scheren zu einem kleinen Mittellinie Hautschnitt (10-20 mm) auf der Kopfhaut, die zugrunde liegenden dorsalen Schädel Oberfläche verfügbar zu machen. Verwenden Sie 5-0 chirurgische Seide um zwei Aufenthalt Nähte in der Haut auf jeder Seite des Schnittes, erstellen eine Klappe, die Calvarium für die Bildgebung aussetzen zu platzieren.
- Positionieren Sie die Mäuse auf den Rücken und Tauchen Sie die exponierten Kopfhaut in eine Glasschale unten mit Mikroskop Öl gefüllt. Das Tier der Mutiphoton imaging Raum zu transportieren.
- Legen Sie das Tier auf den Mikroskoptisch mit dem Calvarium positioniert auf die Glasschale über das Ziel und dann bedecken Sie mit einem 37° C Heizkissen (Tier muss vor direktem Kontakt mit Hitze geschützt werden).
5. in Vivo hochauflösende Bildgebung der Maus Calvarium
- Verwenden Sie ein umgekehrte konfokale System für multiphoton Bildgebung modifiziert (siehe Materialien Tabelle). Folgende Angaben des Herstellers tune einen 2-Photonen-Laser mit 830 nm, eine 20 X W, NA 0.95 Objektiv in das Mikroskop Nasenstück und überprüfen Sie den Laser-Strahl-Ausrichtung.
Hinweis: Aufrechte Mikroskopsysteme werden am häufigsten für diese Studien verwendet, aber eine umgekehrte multiphoton-System kann auch genutzt werden. In dieser Studie wurde eine benutzerdefinierte gestaltete atraumatische stereotaktischen Gerät verwendet. Obwohl mehrere handelsübliche stereotaktischen Geräte für aufrechte Mikroskopsysteme vorhanden sind, gibt es keine handelsübliches stereotaktischen Gerät für ein umgekehrtes Mikroskopsystem zur Sicherung des Maus-Schädels. Als alternative zu einem benutzerdefinierten stereotaktischen Gerät kann der Schädel in Position über das Ziel, die Verwendung von Klebeband oder Klebstoff Methoden zur Stabilität gesichert werden. - Öffnen Sie eine Bild-Datenerfassungs-Software. In den "Erwerb"Settings Panel überprüfen, ob eine direktionale Scan-Modus ausgewählt ist. Richten Sie die Geschwindigkeit des Scannens 4 µs/Pixel, Bildrate auf 512 x 512 Pixel und Zoomen Sie auf 1,5. Wählen Sie 20 X W Na 0,95 Ziel aus der Liste der verfügbaren objektiven entsprechend das Objektiv in der Nasensteg positioniert.
- Zugriff auf die "Dye-Liste" aus der "Image Acquisition Systemsteuerung" und wählen Sie "Zwei-Photon". Öffnen Sie das Fenster "Licht Weg & Farbstoffe" und wählen Sie DM690-980 Erregung DM Open der 2P-Laser-Verschluss durch Aktivierung des Kontrollkästchens in der Laser-Unit 2. Wählen Sie im Fenster "Mikroskop Controller" RDM690 Spiegel.
- Wählen Sie "EPI-Lampe", wählen Sie B/G-Epi-Filter-Cube und konzentrieren Sie das Ziel auf die Probe, Kreislauf fließen und die Calvarium Knochenmark Nische, mit als Referenz der Bifurkation der Zentralvene (a) und die koronare Naht (b) (Abb. 2A) zu visualisieren.
-
Sammeln Sie Bilder mit nicht descanned Modus. Wählen Sie drei externen Detektoren: PMT detector1 SHG Signal von Kollagen zu sammeln (Emission Filter - 430/100 nm), GaAsP detector2 sammeln GFP-Signal (Emission Filter - 525/50) und GaAsP detector3 Signal des TRITC-Dextran sammeln (Emission Filter - 605/90 nm).
- Durchführen Sie Bildgebung mit einer Scanrate von 4μs/Pixel mit keine Mittelung zur Minimierung von Phototoxizität. Sammeln Sie Bilder einen konstanten Laser Power und Detektor Gewinn so angepasst, dass um den volle Dynamikumfang des Detektors mit minimalen Sättigung zu nutzen.
- Sammeln Sie Serie Abschnitte durch die Tiefe des Gewebes (60 x 1 μm Z-Stapel) aus 6 Regionen Calvarium Knochenmark. Verwenden Sie Schritt Größeneinstellungen von 1 μm, zoom, 1,5 und 512 x 512 Pixel Rahmengröße (423 µm X 423 µm).
Hinweis: Insgesamt ist total Zeitaufwand für eine Maus Bild 1-1,5 h.
(6) Quantitative Analyse
- Die Bild-Quantifizierung und 3D Rekonstruktionen mit einer dedizierten 3D/4D Bild Quantifizierung und Visualisierung Software gemäß Herstellervorschrift auszuführen (siehe Materialtabelle). Z-Stacks in 3D mit maximaler Intensität Projection (MIP), Alpha-Mischung oder Schatten Projektion Volume Rendering Algorithmen interaktiv zu visualisieren.
- Segment GFP Zellen unter Verwendung der "Ort Objektmodul Segmentierung". Gelten Sie Stack arithmetischen Verarbeitung (Kanal Subtraktion) um falsche positive Zählung der GFP Zellen zu beseitigen (dadurch Signal von Knochenzellen, die starke Fluoreszenz im grünen und roten Kanäle anzeigen).
- Durchzuführen Sie Segmentierung der Gefäße und Knochen Oberfläche mit Hilfe des Moduls Oberfläche Segmentierung. Bei Bedarf berechnen Sie Entfernungen von Zellen zu einem der oben genannten Oberflächen durch X-Tension Algorithmen "Abstand von spot zu Oberfläche" genannt.
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Representative Results
Kohorten von 2 RBPJKO und 2 RBPJWT Empfängern wurden in eine bildgebende Einzelsitzung zu unterschiedlichen Zeitpunkten abgebildet: 24 h und 2, 4 und 6 Wochen nach der Transplantation der BM Lys-GFP Zellen (Workflow abgebildet in Figur 1A).
In jeder Maus wurden Bilder aus 6 standard Regionen der BM Calvarium, gekennzeichnet durch ihre Position in Bezug auf die Zweiteilung der Zentralvene (Abb. 2A, a) und die koronare Naht (Abbildung 2A, b) erworben. Injektion von Dextran Texas-rot vor der Bildgebung ermöglicht die Identifizierung dieser Wahrzeichen und die Auswahl der 6 Regionen (Abbildung 2A): oben links, Medium und Recht (UL, ähm, UR), und unten links, Medium und Recht (LL, LM, LR). 60 x 1 μm Z-Stacks werden aus jeder Region gesammelt und ausgeschmolzen als 3-d-maximale Intensität Projection (MIP), (Abb. 2 b); 3-d-Schatten Projektion, umfasst die Knochen Komponente (grau) erzeugt durch die zweite harmonische Erzeugung (SHG) Mikroskopie sondieren Kollagen Organisation (Abbildung 2); und zu guter Letzt eine segmentierte 3D-Bild, die Quantifizierung der Zellen und Messung ihrer Abstände von den Knochen und der Gefäße (Abb. 2D) ermöglicht.
Aufgrund möglicher Unterschiede in homing Präferenzen der hämatopoetischen Zellen in den verschiedenen Regionen des BM Calvarium nach Transplantation ist es wichtig, mehrere Regionen in den Calvarium jede Maus probieren. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel der Zelle Verteilung in 6 Regionen analysiert in einem RBPJWT und einem RBPJKO-Empfänger 2 Wochen nach BMT (grün - myeloische Zellen, grau-Knochen) mit Schatten Projektion 3D Rendering-Algorithmus. Anzahl der Zellen pro Region reichten von 64 bis 258 in der RBPJWT-Maus und von 265 bis 573 in der RBPJKO Maus. Endgültige Ergebnisse werden dann als durchschnittliche Zahl der 6 Regionen analysiert ausgedrückt: Anzahl der Zellen pro Region / Maus (Durchschnitt 135 in RBPJWT Vs 469 im RBPJKO). Dieses repräsentative Experiment zeigt, dass es eine größere Variation in der Zelle Verteilung pro Region in der RBPJWT als in der RBPJKO-Empfänger. Darüber hinaus zusätzlich die Variante gefunden in den Calvarium Regionen eine Maus, die wie üblich, gibt es Unterschiede zwischen den einzelnen Mäusen innerhalb der gleichen Gruppe. Daher ist es wichtig, dass für jeden Zeitpunkt mindestens 4 Mäuse pro Experiment zu ein Minimum von einem insgesamt 24 bis 30 Regionen pro Zustand analysiert werden ausgewertet werden.
Abbildung 4 zeigt die Dynamik der myeloischen Vorläuferzellen Expansion in eine Kerbe defekt BM Mikroumgebung im Vergleich zur Kontrolle über 6 Wochen nach der Transplantation. In diesem repräsentativen Experiment wurden 8 RBPJWT und 8 RBPJKO Mäuse transplantiert und zu den angegebenen Zeitpunkten (2 RBPJWT Mäuse und 2 RBPJKO Mäuse zu jedem Zeitpunkt) abgebildet. Abbildung 4A zeigt eine repräsentative 3-d-Rekonstruktion der 1 von 6 Regionen erworben. Zellen in jeder der 6 Regionen wurden gezählt und die durchschnittliche Anzahl der Zellen/Region von zwei Mäusen zu jedem Zeitpunkt (insgesamt 12 Regionen) errechnete sich für RBPJWT und RBPJKO Empfänger (Abbildung 4). Diese Analyse zeigt, dass: (i) Lys-GFP Spenderzellen in RBPJWT und RBPJKO Empfänger haben eine ähnliche homing Effizienz; (II) Zellen in der RBPJKO-Empfänger schneller erweitern und Woche 2 nach BMT zweimal die Anzahl der Zellen in der RBPJWT-Empfänger stehen; (III) Zellen in RBPJWT Empfänger später erweitern und sind in Woche 4 nach BMT 2-fach höher als Zellen in RBPJKO Empfänger; und iv) Anzahl von Zellen in RBPJWT und RBPJKO Empfänger in Woche 6 nach BMT ähnlich geworden. Analyse der myeloischen Spenderzellen in der PB zeigt eine höhere Leistung der myeloischen Zellen aus den BM RBPJKO Empfängern als von den BM RBPJWT Begünstigten in Woche 4, zum Zeitpunkt als die BM RBPJKO Mäuse einen niedrigeren Gehalt an Lys-GFP Zellen zeigte. Die kombinierte Analyse von myeloische Zellen in BM ansässig und myeloische Zellen zirkulieren in der PB zeigen, dass in der RBPJKO-BM Mikroumgebung Lys-GFP Zellen erweitern und sind bereit, schneller zu mobilisieren. Parallele FACS Analyse von Lys-GFP Zellen in langen Röhrenknochen BM von den gleichen Mäusen zeigte eine Tendenz ähnlich dem von IVFM beobachtet; Unterschiede zwischen Bedingungen waren jedoch weniger ausgeprägt (Abbildung 4 b).
Maß für die Entfernung von Lys-GFP Einzelzellen aus den Knochen oder das Gefäßsystem ist in Abbildung 5dargestellt. In dieser repräsentativen Studie 3-d-Segmentierung Analyse der LM-Region von RBPJWT und RBPJKO Calvarium mit 6 Wochen von BMT verwendet wurde (Abb. 5A). Entfernung von Knochen und Gefäße wurden berechnet für jede Zelle in der Region: 200 Zellen in RBPJWT und 255 Zellen in RBPJKO und somit als durchschnittlich ausgedrückt. Die Analyse zeigt, dass Lys-GFP Zellen in derselben Entfernung vom Knochen in den RBPJWT und RBPJKO-Mäusen (11 μm) zu lokalisieren, sondern sie wohnen weiter entfernt von das Gefäßsystem bei RBPJKO Mäusen als bei RBPJWT Mäusen (15 μm Vs 5 μm, beziehungsweise). Dieses Ergebnis ist faszinierend, wie in der RBPJKO Mäuse Lys-GFP-Zellen in den Blutkreislauf mehr als bei RBJWT Mäusen mobilisiert, und würde somit erwartet werden, um näher auf die Schiffe zu lokalisieren. Es ist jedoch möglich, dass der Unterschied in der Lokalisierung eine andere Phase der Differenzierung dieser beiden Populationen (in RBPJWT und RBPJKO), entspricht ein Punkt, der bei dieser Analyse nicht bewältigt werden kann. Die Bedeutung dieses Ergebnisses wird mit einem größeren Pool an Zellen in allen 6 Regionen und durch die Kombination von FACS Analyse weiterverfolgt werden.
Insgesamt, suboptimale Ergebnisse werden erzielt, wenn eine kleine Anzahl von Regionen per Mausklick analysiert werden. Bildgebung ist eine besondere Herausforderung zu den frühen Zeitpunkten nach BMT, tödliche Bestrahlung schädigt das Gefäßsystem und Austreten von Dextran von Kapillaren reduziert Bildschärfe. Daher ist es wichtig, eine große Anzahl von Wiederholungen, vor allem an die frühesten Zeitpunkte.
SHG ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Kollagen Fasern Organisation in 3D. Es ist ein zweiter Ordnung nichtlineare optische Prozess stammt von Strukturen wie Kollagenfasern besitzen, nicht-Centrosymmetry und einem hohen zweiter Ordnung nicht-linearen Koeffizienten. Wenn intensive einfallendes Licht mit solchen Strukturen interagiert, erzeugt es Licht zweimal die einfallenden Frequenz oder die Hälfte der einfallenden Wellenlänge. Daher ist keine Kennzeichnung erforderlich, um die SHG Signal während der 2-Photonen-Mikroskopie zu erfassen. Mit 830 nm Anregung Wellenlänge erfassen wir SHG Signal in den blauen Kanal mit Emission Filter 430/100 nm.
Abbildung 1: Experimentelle Workflow. (A) Induktion der Mx1-Cre/RBPJLox/Lox Mäusen, RBPJKO und RBPJWT Mäuse ~ 4 Wochen vorher Imaging; zu generieren (B) Vorbereitung der BM Zellen von Lys-GFP transgene Mäuse; (C) Transplantation von BM Lys-GFP Zellen in letal bestrahlten RBPJKO oder RBPJWT Empfänger; (D) IVFM der Maus Calvarium mit 24 h, 2, 4 und 6 Wochen nach BMT, gefolgt von Euthanasie und BM-Analyse durch FACS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: IVFM der BM vaskuläre Nische. (A) Mosaik Multi-Photonen-Bild von Lys-EGFP Maus Calvarium zeigt die 6 standard Regionen der Bildgebung (UL: oben links, UM: oben Mitte, UR: oben rechts, LL: unten links, LM: Mitte, LR unten: rechts unten) (grün, myeloische Zellen, rot, Gefäßsystem, grau, Knochen) 10-fache Vergrößerung; (B-D) BM Nische Detail wiedergegeben als: MIP (B), (C) 3-d-Schatten Projektion, Segmentierung 3D-Bild (D). Bilder wurden verarbeitet - mit einer speziellen 3D/4D Bild Quantifizierung und Visualisierung Software (Tabelle 1). Skalieren Sie Bars 50 μm in B, C, d = Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Myeloische Zellen Engraftment in Woche 2. Bilder von Lys-GFP-Zellen (grün) und Knochen Oberfläche (grau) in den 6 BM Regionen vom Calvarium Knochen von einem RBPJWT und einem RBPJKO Maus (o: obere, L: links, M: Mitte, R: rechts). Skalieren von Balken = 50 μm. Balkendiagramme (rechts) geben die Anzahl der Zelle gezählt in den einzelnen Regionen (RBPJWT Bereich 64-258; RBPJKO Bereich: 265-573) und ihre durchschnittliche Anzahl 135 STD + / 73 und 469 STD + / 121. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Kinetik der myeloischen Zellen Engraftment und Ausgabe im folgenden BMT. (A) Bilder von Lys-GFP-Zellen (grün) und Knochenoberfläche (grau) in einer repräsentativen Region vom Calvarium von RBPJWT und RBPJKO Mausklick an den Zeitpunkten jeweils angegeben. Skalieren von Balken = 50 μm; (B) Dot blots zeigen Prozentsatz der Lys-GFP-positiven Zellen durch Durchflusszytometrie innerhalb der BM von Röhrenknochen geerntet von der gleichen Maus in-vivo (siehe oben) abgebildet. (C) Balkendiagramme zeigen durchschnittliche Anzahl von Zellen/Region in 2 Mäuse (insgesamt 12 Regionen) zu jedem Zeitpunkt, + / STD. (D) Line Graph zeigt fachen Anstieg in der Gesamtzahl der Neutrophilen (von Zelle Zähler aufgezählt) präsentiert in der PB der gleichen Mäuse als in (A) zu den angegebenen Zeitpunkten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Lokalisierung von Myeloid Zellen in der BM-relativen bis auf die Knochen und das Gefäßsystem. (A) repräsentative segmentierten 3D-Bilder von Lys-GFP Zellen und Gefäßsystem, und Lys-GFP Zellen und Knochen in der gleichen Region von Calvarium Knochen in RBPJWT und RBPJKO Empfänger in Woche 6 von BMT. Skalieren von Balken = 50 μm. (B) Balkendiagramm fasst die durchschnittliche Entfernung in μm + / SEM von Lys-GFP Zellen von der Knochenoberfläche oder das Gefäßsystem. Anzahl der Zellen in gemessen: RBPJWT n = 200 Zellen und RBPJKO n = 255 Zellen. Entfernung von Lys-GFP Zellen aus dem Gefäßsystem ist größer in RBPJKO als RBPJWT Mäuse, p < 0,001 (Studenten t-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Design so optimiert, dass die Kinetik der blutbildenden Zellen Engraftment studieren von fluoreszierendem intravitalen Mikroskopie. In dieser Studie wurde der Ausbau der myeloischen Vorläuferzellen in einer WT-BM oder in eine Kerbe, die Signalisierung defekt BM in den Knochen Calvarium von folgenden Lys-GFP positive myeloische Zellen nach BMT in RBPJWT oder RBPJKO Empfänger verfolgt. Dieser Ansatz wird vorgeschlagen, als ein Modell, das auf ähnliche Fragen, zum Beispiel angewendet werden kann: ich) zu bestimmen, den Ausbau und die Lokalisierung in den BM-Nischen der Zellen von anderen Linien, wie z. B. lymphatischen, erythroiden oder Megakaryopoese Zellen, durch die Verwendung als Spenderzellen hämatopoetischen Zellen tragen Linie spezifische Promotoren fahren GFP oder Tomatenrot; (II) zu unterschiedlichen Mikro-ökologische Determinanten bewerten, indem Sie mit anderen spezifischen KO oder transgene Mäuse als Empfänger.
Stärke dieses bildgebenden Protokoll im Calvarium Knochen, ist, dass die anatomischen Wahrzeichen verwendet, um den BM Regionen, Gabelung der Zentralvene und die koronare Naht wählen vernünftigerweise in alle Mäuse, schönem Kohärenz zwischen den einzelnen geschont werden Experimente bei Verzicht auf das Erfordernis einer automatisierten Bühne. Darüber hinaus die Verwendung von GFP-Modell hämatopoetische Zellen verfolgen erwies sich als sehr effektiv, wie GFP ein stabiles Signal unter suboptimalen Bedingungen, wie z. B. nach Bestrahlung zur Verfügung gestellt. Zu guter Letzt die bildgebende Einrichtung beschrieben, mit einem inversen Mikroskop und eine angepasste stereotaktischen Gerät, in dem die Maus in Rückenlage, ist, stark Atmung Artefakte zu minimieren.
Zwei Aspekte dieser experimentellen Design könnte wenn implementiert, um eine breitere und effektivere Nutzung der IVFM der Calvarium führen. Erstens wird es wichtig sein, zu optimieren und standardisieren Protokolle der längs-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung der gleichen Maus zu verschiedenen Zeitpunkten (vom 2. Tag bis zu mehreren Wochen) nach Intervention (d.h. BMT oder Therapie) anstelle von unabhängige Kohorten von Mäusen. Da dieser Ansatz geeignete Bedingungen für postoperative Erholung und den Einsatz von Maßnahmen erfordert, Entzündung, Infektion, entgegenzuwirken und Narbenbildung an der Stelle der Bildgebung, ist seine Anwendung derzeit begrenzt. Zweitens wird es wertvoll, um ein Array von tracking-Maus-Modellen mit fluoreszierenden Proteinen in bestimmten Zellen der BM Nische Abstammung zu entwickeln sein (vaskuläre, endosteal, perivaskuläre und neuronale) hämatopoetischen Zellfunktionen mit spezifischen kombinieren Merkmale der BM Nischen.
Bildgebung von Knochen hat noch einige Herausforderungen und Einschränkungen im Vergleich zu anderen Geweben. Obwohl die zwei-Photonen-Mikroskop 100-1.000 µm tief in Gewebe eindringen kann, ist es immer noch schwierig, durch die gesamte Dicke des Knochens Calvarium Bild. Bilder verlieren Qualität mit zunehmender Tiefe, so dass das Protokoll hier zuverlässige Analyse von BM Regionen von 60 µm dicken Stapel beschreibt. Ein weiterer Faktor, der Inkonsistenz oder suboptimale Bildgebung führen kann ist die gebogene Form des Calvarium Knochens, die das Bild unscharf bringen kann. Es ist wichtig, den Schädel positioniert perfekt auf die Glasschale über das Ziel, eventuell mit einem stereotaktischen Gerät haben. In der Tat, die Schädel-Größe ist wichtig: Schädel von Mäusen zu jung oder zu klein, kann nicht passen perfekt in ein bestimmtes stereotaktischen Gerät. Als Beispiel passt das hier verwendete Gerät nicht Mäuse, die jünger als 6 Wochen und weniger als 20 g.
Eine weitere Einschränkung ist, dass in dieser Studie verwendeten Bildgebungssystem auf 3 Kanäle beschränkt. Wie der blaue Kanal automatisch zugewiesen wird,-Beschriftung auf der Grundlage SHG Signal des Kollagens Knochen zu sammeln, gibt es nur 2 Kanäle für bestimmte Fluoreszenz zu beschriften. Darüber hinaus verfügt das System über eine Geschwindigkeitsbegrenzung von 1 Frame/s 2 μs/Pixel wohnen, Zeit und 512 x 512 Pixel Rahmengröße, die nicht ideal für schnelle dynamische Prozesse (z. B. Maß für die Durchblutung und Bewertung der Zelle Mobilisierung in der Blutbahn).
Eine große Herausforderung ist, dass die Bestrahlung für BMT Kompromisse die Integrität des Gefäßsystems durchgeführt. Die vaskuläre Leckage im BM nach der Bestrahlung verursacht Schwierigkeiten mit Segmentierung/Quantifizierung der einzelnen Strukturen, die Schwierigkeit in der quantitativen Analyse darstellen können.
Schließlich ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die Darstellung der Mausklick dauert ca. 1 h und beschränkt sich die Anzahl der Mäuse, die an einem bestimmten Tag abgebildet werden können (~ 4 bis 6 Mäuse). Erhöhung der Stichprobenumfang macht der Analyse erhalten erfordern daher, mehrere unabhängige Experimente, die Variabilität erhöhen können.
Nach diesem Protokoll ist die Zahl der blutbildenden Zellen Lys-GFP+ von IVFM in BM erkannt, nach 24 h von BMT ~ 30 Zellen/Region und es ist durchaus eine kleine Anzahl im Vergleich zu der ursprünglichen Eingabe von Zellen (3 x 106). Obwohl Teil dieses Problems soll Zelle Überfüllung in Lunge und Leber vor Referenzfahrt mit dem BM nach i.v. Injektion, es bleibt untersucht werden, ob es Regionen in der Calvarium außer den ausgewählten gibt Hause wo die transplantierten Zellen höher Effizienz.
Homing und Engraftment Zellen in die BM nach BMT häufig Durchflusszytometrie durch Messung der CD45.1/CD45.2 Marker, GLP, Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-) oder eine Kombination aus Linie und Stammzell-Marker folgen. Die Verwendung von IVFM, vor allem zu frühen Zeitpunkten macht verfügbaren einzigartig und zusätzliche Informationen, die nicht durch Durchflusszytometrie erbracht werden. Zum Beispiel, oft ist es nicht leicht durch FACS Ereignisse zu unterscheiden, die "Zellen" Ereignisse "Artefakte", insbesondere wenn eine geringe Anzahl positiver Ereignisse gesammelt werden (d. h. bei 24 h von BMT). IVFM bietet Informationen über Morphologie und Lokalisation der Zellen, die diese Unterscheidung Hilfsmittel. Ebenso gehören FACS Analyse der BM hämatopoetischen Zellen geerntet, indem man Spülung oder Absturz der Knochen Zellen, die in der Nische aufhielten und Zellen, die bereits im Umlauf im Gefäßsystem. In der Tat ermöglicht IVFM die Unterscheidung und Bewertung der Zellen ruht in der BM-Nische und Zellen, die in den Blutstrom mobilisiert werden. Diese Unterscheidung ist von großem Wert, wenn die Kinetik der Referenzfahrt, Lokalisierung, Differenzierung und Mobilisierung in ein bestimmtes Modell zu studieren. Wichtig ist, bieten IVFM einzigartige Informationen über die Position der blutbildenden Zellen im Verhältnis zu der Mikroumgebung Zellen einer bestimmten Nische.
Andere Methoden verwendet, um die Zusammensetzung der BM Nische, solche histologische Analyse Adresse wurden verwendet. Vergleich zwischen intravitalen Mikroskopie des BM und histologische Analyse von konfokalen Mikroskopie ist gründlich und elegant von Lo Celso Et Al. diskutiert worden 18.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Bildgebung erfolgte im Indiana-Zentrum für biologische Mikroskopie an der Indiana University, unter der Regie von Dr. Ken Dunn. Das stereotaxischen Gerät ist ein Prototyp entworfen und hergestellt von Mark Soonpaa, Brunnen-Zentrum für pädiatrische Forschung. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN Research Foundation (NC) und die CTSI kollaborative Projekt IUSM/Notre Dame (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
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