Summary
Intravital Fluorescens mikroskopi (IVFM) af calvarium anvendes i kombination med genetisk dyremodeller for at studere målsøgende og engraftment hæmatopoietisk celler i knoglemarven (BM) nicher.
Abstract
Stadig flere beviser viser, at normal bloddannelsen er reguleret af særskilte microenvironmental stikord i BM, som omfatter specialiserede cellulære nicher modulerende kritiske hæmatopoietisk stamcelle (HSC) funktioner1,2. Faktisk, et mere detaljeret billede af den hæmatopoietisk mikromiljø nu fremstår, hvori den knoglens endosteale og i endothelial nicher danne funktionelle enheder til regulering af normale HSC og deres afkom3,4,5 . Nye undersøgelser har afsløret betydningen af perivascular celler, adipocytter og neuronale celler i vedligeholdelse og regulering af HSC funktion6,7,8. Desuden er der bevis for, at celler fra forskellige slægter, dvs myeloid og lymfoide celler, hjem og opholde sig i særlige nicher inden for BM mikromiljø. En fuldstændig kortlægning af BM mikromiljø og ombordværende er imidlertid stadig i gang.
Transgene mus stammer udtryk for lineage specifikke fluorescerende markører eller musene genetisk manipuleret til at mangle valgte molekyler i bestemte celler i BM niche er nu tilgængelige. Knock-out og afstamning tracking modeller i kombination med transplantation tilgange, giver mulighed for at forfine viden om specifikke "niche" rolle celler for definerede hæmatopoietisk populationer, som HSC, B-celler, T-celler, myeloide celler og erythroid celler. Denne strategi kan yderligere forstærkede ved at kombinere brugen af to-foton mikroskopi af calvarium. Ved at give i vivo høj opløsning imaging og 3D-rendering af BM calvarium, kan vi nu fastslå netop det sted, hvor specifikke hæmatopoietisk delmængder hjem i BM og evaluere kinetik af deres ekspansion over tid. Her, er Lys-normal god landbrugspraksis Transgene mus (mærkning myeloide celler)9 og RBPJ knock-out mus (mangler kanoniske Notch signalering)10 brugt i kombination med IVFM til at bestemme engraftment af myeloide celler til et hak defekte BM mikromiljø.
Introduction
Intravital multiphoton Fluorescens mikroskopi (IVFM) er en kraftfuld billedbehandling teknik, der giver mulighed for en høj opløsning, real-time imaging af væv med dybde op til 1mm, afhængigt af væv. Når de påføres mus calvarium, tillader det, observere adfærd af den hæmatopoietisk celler i BM i en ikke-invasiv måde op til 60-100 μm11. Denne fremgangsmåde bruges her til at bestemme kinetik af engraftment af normale myeloide ophav i BM af RBPJ knock-out mus mangler kanoniske Notch signalering.
Seneste arbejde fra vores gruppe viste, at defekte kanoniske Notch signalering i BM mikromiljø fører til en myeloproliferative-lignende sygdom12. Tab af Notch signalering blev opnået ved betinget sletning af DNA bindende domæne af RBPJ, kritisk transkriptionsfaktor nedstrøms af canonical Notch signalering, ved hjælp af Mx1-Cre induceret rekombination10. I denne undersøgelse, blev Mx1-Cre/RBPJlox/lox mus model brugt. Betinget sletning af DNA-bindende motiv af RBPJ resulterer i tab af signaler fra alle Notch receptorer. I modellen Mx1-Cre, Cre udtryk er drevet af Mx1 initiativtageren aktiveret ved administration af polyI:C resulterer i induktion af målrettede gen sletning i blod celler samt som stromale komponenter af flere organer, herunder BM, milten og leveren.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox og Mx1-Cre-/RBPJlox/lox mus induceret med polyI:C (hereon angivet som RBPJKO og RBPJWT, henholdsvis) var lethally bestrålet og transplanteret med normale, vildtype hæmatopoietisk celler. Starter fra uge 4 efter transplantation, udviklet RBPJKO modtagere betydeligt leukocytose efterfulgt af splenomegali. Selvom RBPJKO mus præsenteret øget procentdel af myeloide stamceller i BM i uge 8 efter transplantation og på senere tidspunkter, afsløre analyse af BM uger 4 og 6 ikke slående forskelle i deres myeloide celleindholdet i forhold til kontrol RBPJWT modtagere. Denne observation, sammen med det faktum, at Mx1-Cre kommer til udtryk i forskellige hæmatopoietisk organer, rejste spørgsmålet om, hvorvidt BM mikromiljø havde direkte indflydelse på iværksættelsen af myeloproliferative fænotype.
For at afgøre, hvorvidt BM er et kritisk første stedet for udvikling af sygdom, var IVFM af musen calvarium bruges i kombination med BM transplantation (BMT), den RBPJ knock-out model, og en slægt tracking system. Transgene mus at udtrykke EGFP under kontrol af specifikke lysozym promoter (Lys-NGL)9 blev brugt til at opnå donor celler, der kunne visualiseres under BM imaging efter BMT. Lysozym udtryk er specifikke for myeloide celler og Lys-normal god landbrugspraksis markerer celler fra den fælles myeloide stamceller (CMP) til modne granulocyt13.
IVFM af BM på forskellige tidspunkter viste, at Lys-NGL celler homed ligeledes til BM af RBPJWT og RBPJKO modtagere, men udvidet og aflægger hurtigere i BM af RBPJKO modtagere. Denne forskel var dramatisk for den tidligere tidspunkt (uge 2) og faldt over tid (uger 4 og 6). Men disse senere tidspunkt punkter, evaluering af hæmatopoietisk rum i den samme modtager viste en støt stigning i antallet af myeloide celler cirkulerer i PB og lokaliseret i milten af RBPJKO mus, der angiver en øget produktion af celler fra BM i omløb. Analyse af Lys-NGL celler lokalisering i BM af transplanterede mus på 6 uger, viste, at myeloide celler var bosat længere fra Vaskulaturen RBPJKO mikromiljø end i kontrolelementet.
Kollektivt, givet kombinationen af IVFM med disse specifikke dyremodeller indsigt i engraftment dynamikken af myeloide celler i RBPJKO BM mikromiljø. Eksperimentelle design og kvantitativ metode beskrevet her er foreslået som et paradigme, der kan anvendes for at løse lignende spørgsmål. For eksempel, brugen af andre celle specifikke lineage tracking modeller, såsom RAG1-NGL14 eller Gata1-NGL15 mus, kan tillade efter opførsel af lymfoide eller erythroid progenitorceller, henholdsvis i BM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer brugen af dyr blev udført med tilladelse af Animal Care og bruge Udvalget af Indiana University School of Medicine. Sikre, at du overholder lovgivningen om dyreforsøg i det land, hvor arbejdet udføres.
1. forberedelse af Mx1CreRBPJ- / - Recipient mus
- Cross Mx1-Cre+ mus med RBPJlox/lox mus10 at opnå Mx1-Crepositive RBPJlox/lox mus12 og Mx1-Cre negative RBPJlox/lox littermates bruge som kontrol. Kontrollere genotype ved PCR10.
- Brug 6-8 ugers-gamle Mx1Cre+/RBPJlox/lox og Mx1Cre-/RBPJlox/lox mus til at udføre polyI:C induktion.
-
Injicere polyI:C 200 µg i.p. i Cre+ , og Cre- mus. Give en polyI:C injektion hver anden dag for 3 dage den første uge. Give en polyI:C indsprøjtning den anden uge, 7 dage efter den tidligere injektion (fire injektioner i alt).
- Brug RBPJKO (induceret Mx1Cre+/RBPJlox/lox) og RBPJWT (induceret Mx1Cre-/RBPJlox/lox) mus som modtagere 3 uger efter den sidste polyI:C injektion.
Bemærk: Det anbefales at bruge mus induceret af pI: pC 3 uger efter injektion. Den IFNα reaktion udløst af polyI:C inducerer betydelige ændringer i BM, hvilket resulterer i en immunophenotypic udvidelse af HSC og faldt produktionen af modne stamceller i perifert blod16,17. Repræsentation af de hæmatopoietisk delmængder er normaliseret 3 uger efter injektion og musene kan udnyttes uden de forstyrrende effekter af betændelse. Denne induktion protokol er blevet optimeret til RBPJ. Hvis du sletter et andet gen, induktion-protokollen kan variere afhængigt af konstruktionen, og sletning skal valideres. Vi valideret ~ 100% sletning af regionen RBPJ mellem loxP steder af RT-PCR efter ialt fire polyI:C injektioner.
- Brug RBPJKO (induceret Mx1Cre+/RBPJlox/lox) og RBPJWT (induceret Mx1Cre-/RBPJlox/lox) mus som modtagere 3 uger efter den sidste polyI:C injektion.
2. fremstilling af Lys-EGFP Donor knoglemarv celler til Transplantation
- Aflive en Lys-EGFP mus (kuldioxid efterfulgt af cervikal dislokation) 1 eller 2 h før transplantation.
- Spray animalske kroppens overflade med 70% ethanol.
- Brug kirurgisk saks til at gøre en hud indsnit på begge ben omkring anklen og med kirurgisk pincet trække væk hud og pels sammen at eksponere ren muskelvæv.
- Brug kirurgisk saks til at fjerne så meget muskel fra benene som muligt. Ved hjælp af en saks, skåret knogler (i knæ og ankel fælles) og rense enhver resterende muskelvæv fra lårben og skinneben ved hjælp af gaze svampe. Placere knogler (to lårben og to forbenede) i en 6-godt plade indeholdende DMEM 10% FBS.
- Knuse knogler i en morter med 10 mL koldt 2mM EDTA PBS og afpipetteres knoglemarv celler for at bringe cellerne i én celle suspension. Alternativt, skylle ben med 2 mM EDTA PBS 3 gange fra hver side med en 1 mL sprøjte.
- Filtrere knoglemarv celler ved hjælp af en 70 µm filter i en 15 mL-centrifugerør. Skyl filteret med 2-3 mL PBS. Spin celler ned 10 min på 460 x g, resuspend celler i 10 mL frisk DMEM 10% FBS.
- Tælle knoglemarv celler på en hemocytometer og justere koncentrationen til 1.5 x 107 celler/mL i IMDM uden serum. Brug 3 x 106 celler pr. dyr med et rumfang på 200 µL. Omkring 1/3 celler af samlede BM er myeloide normal god landbrugspraksis + celler. Forlade cellerne på is indtil klar til injektion. Brug 0,5 x 105 celler til at bestemme normal god landbrugspraksis udtryk af FACS9.
3. knoglemarv Transplantation af Lys-NGL celler til RBPJKO mus
- Dy recipient mus i en pie bur. Bestråle mus med en dødelig dosis af gammastråling (1.200 Rad) på en Cs 137 irradiator. Bruge en split dosis protokol: 900 rads aftenen efterfulgt af 300 rads næste morgen (16 h fra hinanden).
- Transplantation lethally bestrålede RBPJWT og RBPJKO recipient mus 5-6 h efter den anden dosis af stråling. Injicere BM celler høstet fra Lys-EGFP mus i en koncentration på 3 x 106 celler pr. dyr via hale vene injektion (Se detaljer for høst celler i afsnit 2).
- Billede uafhængige kohorter af transplanterede mus af IVFM på forskellige tidspunkter: 24 h, og i uge 2, 4 og 6, som beskrevet nedenfor (Se afsnit 4 & 5 for i vivo billeddannelse procedure).
4. kirurgisk forberedelse til Intravital Imaging
- Sterilisere kirurgiske instrumenter. To fine pincet (en straight, en vinklet), et par fine saks og et par nål indehavere. Forberede operative område med alle leverancer nødvendige for proceduren.
- Give musen en IP indsprøjtning af ketamin cocktail bedøvelsesmiddel (xylazin 2,5-5 mg/kg + Acepromazin 1,0-2,5 mg/kg + ketamin 90-100 mg/kg) ved hjælp af en 26-28 G kanyle sprøjte. Dyret vil blive overvåget hver 15 min under proceduren og anæstesi vil blive suppleret efter behov på ¼ af den oprindelige dosis.
- Placer musen på en ordentlig varmekilde (37 ° C varme pad, animal beskyttet mod direkte kontakt med varme pad) og visuelt overvåge den respirationsfrekvens.
- Kontrollere reflekser ved hjælp af tå knivspids svar. Sikre, at dyret er helt under anæstesi før begyndelsen nogen kirurgiske procedurer.
- Brug en 26-28 gauge kanyle sprøjte til at give mus en hale vene injektion af en fluorescerende vaskulære markør (Dextran, 100 μL af 20 mg/mL opløsning).
- Anvende vet øjet salve på begge øjne. Klip den dorsale overflade af dyrets hoved med små elektriske klippere. Anvende en Hårfjerningscreme til 5 min. Brug gaze svampe til at fjerne cremen og derefter skylles med saltvand. Prep ren hovedbunden med 70% alkohol ved hjælp af en vatpind.
- Brug fine pincet og saks til at gøre en lille midterlinjen hud indsnit (10-20 mm) på hovedbunden for at afsløre de underliggende dorsale kraniet flade. Bruge 5-0 kirurgisk silke for at placere to ophold sutur i huden på hver side af den indsnit, skaber en klap for at udsætte calvarium til billedbehandling.
- Placer mus på ryggen og nedsænkes udsatte hovedbunden i en glas bund fad fyldt med mikroskop olie. Transport af dyr til mutiphoton imaging værelse.
- Placere dyret på stadiet mikroskop med calvarium placeret på glasfad over målet og derefter dække med en 37° C varme pad (dyr skal beskyttes mod direkte kontakt med varme).
5. in Vivo høj opløsning billeddannelse af musen Calvarium
- Bruge en inverteret Konfokal system modificeret for multiphoton billeddannelse (Se materialer tabel). Følgende producentens anvisninger tune en 2-foton laser til 830 nm, sted en 20 X W, NA 0,95 mål linse i mikroskop næse stykke og check den laser stråle justering.
Bemærk: Opretstående mikroskop systemer er mest almindeligt anvendt til disse undersøgelser, men en inverteret multiphoton system kan også udnyttes. I denne undersøgelse, blev en brugerdefineret designet atraumatisk stereotaxisk enhed brugt. Selv om der er flere kommercielt tilgængelige stereotaxisk enheder til opretstående mikroskop systemer, er der ikke kommercielt tilgængelige stereotaxisk enhed i en inverteret mikroskop system med henblik på at sikre mus kraniet. Som alternativ til en brugerdefineret stereotaxisk enhed, kan kraniet være sikret i position over målet udnytter forskellige tape eller lim metoder for stabilitet. - Åbn et billede erhvervelse software. I indstillingerne"tilegnelse" Kontrollér panel, en retningsbestemt scanningstilstand er valgt. Nedsat hastighed scanning til 4 μs/pixel, billedfrekvensen til 512 x 512 pixel og zoom til 1,5. Vælg 20 X W Na 0,95 mål fra listen over tilgængelige målet linser til at matche linsen placeret i næsestykket.
- Få adgang til listen"farvestof" fra "Image erhvervelse Kontrolpanel" og vælg "To Photon". Åbn vinduet "Lys sti & farvestoffer" og vælg DM690-980 excitation DM. åben 2P laser lukkeren ved at kontrollere afkrydsningsfeltet i Laser enhed 2. Vælg RDM690 spejl i vinduet "Mikroskop Controller".
- Vælg "EPI lampe", vælge B/G epi-filter terning og fokusere mål på modellen til at visualisere vaskulære flow og calvarium knoglemarv niche, bruge som reference tvedeling af den centrale vene (en) og koronar sutur (b) (figur 2A).
-
Indsamle billeder ved hjælp af ikke-descanned tilstand. Vælg tre eksterne detektorer: ydelse detector1 at indsamle SHG signal af kollagen (emission filter - 430/100 nm), GaAsP detector2 at indsamle normal god landbrugspraksis signal (emission filter - 525/50) og GaAsP detector3 at indsamle signal af TRITC-dextran (emission filter - 605/90 nm).
- Udføre imaging med en scanning hastighed på 4μs/pixel med ingen gennemsnit for at minimere fototoksicitet. Indsamle billeder ved en konstant laser power og detektor forstærkning justeret for at udnytte den fulde dynamiske rækkevidde af detektor med minimal mætning.
- Indsamle serie af dele gennem dybden af væv (60 x 1 μm Z-stakke) fra 6 regioner i calvarium knoglemarv. Brug trin størrelsesindstillinger 1 μm, zoom 1,5 og 512 x 512 pixel rammestørrelse (423 µm x 423 µm).
Bemærk: Samlet totaltid krævede hen til billed en mus er 1-1,5 h.
6. kvantitativ analyse
- Udføre image kvantitering 3D rekonstruktioner og ved hjælp af en dedikeret 3D / 4D billede kvantificering og visualisering software ifølge producentens anvisninger (Se Materialer tabel). Visualisere interaktivt Z-stakke i 3D udnytte maksimal intensitet projektion (MIP), alpha-blanding eller shadow projektion volume rendering algoritmer.
- Segmentere NGL celler ved hjælp af den "stedet objekt segmentering modul". Anvende stak aritmetiske behandling (kanal subtraktion) for at fjerne falske positive antal NGL celler (Dette fjerner signal af knogleceller viser stærk fluorescens i grøn og rød kanaler).
- Udføre segmentering af vaskulatur og knoglen overfladen ved hjælp af modulet overflade segmentering. Hvis det kræves, skal du beregne afstande af celler til nogen af de ovenstående overflader ved at anvende X-spænding algoritmer kaldes "afstand af spot til overfladen".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kohorter af 2 RBPJKO og 2 RBPJWT modtagere blev afbildet i en individuel imaging session på forskellige tidspunkter: 24 og 2, 4 og 6 uger efter transplantation af BM Lys-NGL celler (workflow er illustreret i figur 1A).
I hvert mus blev billeder erhvervet fra 6 standard regioner i BM calvarium, identificeret ved deres holdning til tvedeling af den centrale vene (figur 2A, en) og koronar sutur (figur 2A, b). Injektion af Dextran Texas-rød før imaging giver mulighed for identifikation af disse vartegn og udvælgelse af 6 regioner (figur 2A): øverst til venstre, Medium og højre (UL, UM, UR), og nederst til venstre, Medium og højre (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-stakke er indsamlet fra hver region og gengives som 3D-maksimal intensitet projektion (MIP), (figur 2B); 3D-skygge projektion, der omfatter knogle-komponent (grå) genereret af den anden harmoniske generation (SHG) mikroskopi sondering kollagen organisation (figur 2 c); og endelig en 3-D segmenterede billede, som giver mulighed for kvantificering af celler og måling af deres afstande fra knoglen og fartøjer (figur 2D).
På grund af målsøgende præferencer hæmatopoietisk celler i de forskellige regioner af BM calvarium potentielle forskelle efter transplantation er det vigtigt at prøve flere regioner i calvarium af hver mus. Figur 3 viser et eksempel på celle distribution i 6 regioner analyseres i én RBPJWT og én RBPJKO modtager 2 uger efter BMT (grøn - myeloide celler, grå-knogle) ved hjælp af shadow projektion 3D rendering algoritme. Antallet af celler pr. region varierede fra 64 til 258 i RBPJWT mus og 265 til 573 i RBPJKO musen. Endelige resultater er derefter udtrykt i gennemsnitligt antal 6 regioner analyseret: antallet af celler pr. region / mus (gennemsnit 135 i RBPJWT vs 469 i RBPJKO). Denne repræsentant eksperiment viser, at der er en større variation i celle fordeling pr. region i RBPJWT end i RBPJKO modtageren. Endvidere ud over variationen i calvarium regionerne inden for en mus, som er fælles, findes variationer blandt individuelle mus i samme koncern. Det er således vigtigt, at mindst 4 mus er vurderet pr. eksperiment for at opnå et minimum af en total 24 til 30 regioner skal analyseres pr. betingelse til hvert tidspunkt.
Figur 4 viser dynamics myeloide stamceller ekspansion i en hak defekte BM mikromiljø i forhold til kontrol over 6 uger efter transplantation. I denne repræsentative eksperiment, blev 8 RBPJWT og 8 RBPJKO mus transplanteret og afbildet på de angivne tidspunkter (2 RBPJWT mus og 2 RBPJKO mus på hvert tidspunkt). Figur 4A viser en repræsentativ 3D rekonstruktion af 1 ud af 6 regioner erhvervet. Celler i hver af de 6 regioner var talt op og det gennemsnitlige antal celler/region af to mus for hvert tidspunkt (samlede 12 regioner) blev beregnet for RBPJWT og RBPJKO modtagere (figur 4 c). Denne analyse viser, at: (i) donor Lys-NGL celler i RBPJWT og RBPJKO modtagere har en lignende homing effektivitet; II) celler i RBPJKO modtagere udvide hurtigere og er to gange antallet celler i RBPJWT modtagere på uge 2 efter BMT; III) celler i RBPJWT modtagere udvide senere og er 2-fold højere end celler i RBPJKO modtagere på uge 4 efter BMT; og iv) celle nummer i både RBPJWT og RBPJKO modtagere blevet lignende på uge 6 efter BMT. Analyse af donor myeloide celler i PB angiver en højere output af myeloide celler fra BM af RBPJKO modtagere end fra BM af RBPJWT modtagere i uge 4, på det tidspunkt, hvor BM af RBPJKO mus viste et lavere indhold af Lys-NGL celler. Den kombinerede analyse af myeloide celler bosiddende i BM og myeloide celler cirkulerer i PB, viser, at i RBPJKO BM mikromiljø Lys-NGL celler udvide og er klar til at mobilisere hurtigere. Parallelle FACS analyse af Lys-NGL celler i rørknogler BM fra de samme mus viste en tendens svarende til den observerede af IVFM; forskellene mellem betingelserne var dog mindre udtalt (figur 4B).
Måling af afstand af enkelte Lys-NGL celler fra knoglen eller Vaskulaturen er vist i figur 5. I denne repræsentative undersøgelse, 3-D Segmenteringsanalyse af regionen LM i RBPJWT og RBPJKO calvarium på 6 uger fra BMT blev brugt (figur 5A). Afstand fra knogle og fartøjerne, der blev beregnet for hver celle i området: 200 celler i RBPJWT og 255 celler i RBPJKO, og dermed, udtrykt som et gennemsnit. Analysen viser, at Lys-NGL celler lokalisere på en tilsvarende afstand fra knogle i RBPJWT og RBPJKO mus (11 μm), men at de opholde sig mere fjernt fra Vaskulaturen i RBPJKO mus end i RBPJWT mus (15 μm vs 5 μm, henholdsvis). Dette resultat er spændende, som i RBPJKO mus Lys-NGL celler mobiliseret i omløb mere end i RBJWT mus, og ville således forventes at lokalisere tættere til skibe. Det er dog muligt, at forskellen i lokalisering afspejler en anden fase af differentiering af disse to populationer (i RBPJWT og RBPJKO), et punkt, som ikke kan løses af denne analyse. Betydningen af dette resultat vil blive fulgt op med en større pulje af celler i alle 6 regioner og ved at kombinere FACS analyse.
Samlede, suboptimale resultater opnås når et lille antal regioner er analyseret pr. mus. Imaging er særligt udfordrende i de tidlige tid point efter BMT, som dødbringende bestråling skader Vaskulaturen og udsivning af dextran fra kapillærerne reducerer billede definition. Det er således vigtigt at have et stort antal gentagelser, især på de tidligste tidspunkt punkter.
SHG er et nyttigt værktøj for at undersøge kollagen fiber organisation i 3D. Det er en anden ordens ulineære optiske proces, som stammer fra strukturer såsom kollagen fibre besidder ikke-centrosymmetry og en høj anden-ordens nonlinear koefficient. Når intens indfaldende lys interagerer med sådanne strukturer, genererer det lys på to gange den hændelsen frekvens eller halv hændelse bølgelængde. Derfor er ingen mærkning nødvendig for at fange SHG signal under 2-foton mikroskopi. Med 830 nm excitation bølgelængde fange vi SHG signal i den blå kanal med emission filter 430/100 nm.
Figur 1: Eksperimentel arbejdsproces. (A) induktion af Mx1-Cre/RBPJlox/lox mus til at generere RBPJKO og RBPJWT mus ~ 4 uger forudgående imaging; (B) forberedelsen af BM celler fra Lys-normal god landbrugspraksis Transgene mus; (C) Transplantation af BM Lys-NGL celler i lethally bestrålede RBPJKO eller RBPJWT modtagere; (D) IVFM af mus calvarium på 24 h, 2, 4 og 6 uger efter BMT, efterfulgt af aktiv dødshjælp og BM analyse af FACS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: IVFM af BM vaskulære Niche. (A) mosaik multi photon billede af Lys-EGFP musen calvarium viser de 6 standard regioner Imaging (UL: øverste venstre, UM: øverste midten, UR: øverst til højre, LL: lavere venstre, LM: lavere midten, LR: nederst til højre) (grøn, myeloide celler rød Vaskulaturen; grå, knogle) 10 X forstørrelse; (B-D) BM niche detaljer gengives som: (B) MIP, (C) 3D-Shadow projektion, (D) 3-D segmentering billede. Billeder blev behandlet - ved hjælp af en dedikeret 3D / 4D billede kvantificering og visualisering software (tabel 1). Skalere barer = 50 μm i B, C, D. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Myeloide celler Engraftment på uge 2. Billeder af Lys-NGL celler (grønne) og knoglen overfladen (grå) i regionerne 6 BM fra calvarium knogler i en RBPJWT og en RBPJKO mus (U: øverste, L: venstre, M: midten, R: ret). Skalere barer = 50 μm. Søjlediagrammer (højre) angiver antallet af celle tælles i hver region (RBPJWT range 64-258; RBPJKO spænder 265-573) og deres gennemsnitlige antal 135 STD +/-73 og 469 STD +/-121. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kinetik af myeloide celler Engraftment og Output følgende BMT. (A) billeder af Lys-NGL celler (grønne) og knoglen overfladen (grå) i én repræsentant region fra calvarium af en RBPJWT og RBPJKO musen på hvert af tidspunkter angivet. Skalere barer = 50 μm; (B) Dot blotting vis procentdel af Lys-NGL positive celler ved flowcytometri inden for BM i rørknogler høstet fra samme mus afbildet in vivo (ovenfor). (C) søjlediagrammer viser gennemsnitlige antal celler/regionen i 2 mus (samlede 12 regioner) ved hvert tidspunkt, +/-STD. (D) linje graf viser fold stigning i det samlede antal af neutrofiler (optalt af celle counter) præsenteret i PB af de samme mus end i (A) på de angivne tidspunkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Lokalisering af myeloide celler i BM slægtning til knoglen og Vaskulaturen. (A) repræsentative 3D-segmenterede billeder af Lys-NGL celler og Vaskulaturen, og Lys-NGL celler og knogle i den samme region af calvarium ben i RBPJWT og RBPJKO modtagere i uge 6 fra BMT. Skalere barer = 50 μm. (B) søjlegrafen opsummerer den gennemsnitlige afstand i μm +/-SEM af Lys-NGL celler fra knoglen overfladen eller Vaskulaturen. Antal celler målt i: RBPJWT n = 200 celler og RBPJKO n = 255 celler. Afstand af Lys-NGL celler fra Vaskulaturen er større i RBPJKO end RBPJWT mus, p < 0,001 (Students t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en eksperimentelle design, optimeret til at studere kinetik af hæmatopoietisk celler engraftment af Intravital fluorescerende mikroskopi. I denne undersøgelse, var udvidelsen af myeloide stamceller i en WT BM eller i et hak signalering defekte BM spores i ben calvarium af følgende Lys-normal god landbrugspraksis positive myeloide celler efter BMT i RBPJWT eller RBPJKO modtagere. Denne tilgang er foreslået som en model, der kan anvendes til løsning af lignende spørgsmål, for eksempel: Jeg) til at bestemme ekspansion og lokalisering i BM nicher af celler af andre slægter, såsom lymfoide, erythroid eller megakaryocytic celler ved hjælp af som donor celler hæmatopoietisk celler transporterer lineage specifikke initiativtagere køre normal god landbrugspraksis eller tomat-rød; II) til at vurdere forskellige mikro-miljømæssige determinanter ved hjælp af andre specifikke KO eller Transgene mus som modtagere.
Styrken af denne billeddannelse protokol i calvarium knoglen, er at de anatomiske landemærker bruges til at vælge BM regioner, tvedeling af den centrale vene og koronar sutur, bevares med rimelighed i alle mus, muliggør sammenhæng mellem enkelte eksperimenter samtidig give afkald på kravet om en automatiseret fase. Derudover bruger normal god landbrugspraksis model til at spore hæmatopoietisk celler viste sig for at være meget effektiv, som normal god landbrugspraksis anført et stabilt signal i suboptimal betingelser, som efter bestråling. Endelig, den billeddiagnostiske set-up beskrevet, ved hjælp af en omvendt mikroskop og en tilpasset stereotaxisk enhed hvor musen er i liggende stilling, høj grad minimere vejrtrækning artefakter.
To aspekter af dette eksperimentelle design, kunne hvis det gennemføres, føre til en bredere og mere effektiv anvendelse af IVFM af calvarium. Første, vil det være vigtigt at optimere og standardisere protokoller af langsgående imaging giver mulighed for observation af de samme mus på forskellige tidspunkter (fra dag 2 til flere uger) efter intervention (dvs. BMT eller terapi) i stedet for ved hjælp af uafhængige kohorter af mus. Da denne tilgang kræver passende betingelser for post-kirurgi inddrivelse og anvendelsen af foranstaltninger til at modvirke inflammation, infektion, og arret dannelse på webstedet af imaging, er dets anvendelse i øjeblikket begrænset. For det andet vil det være værdifuldt at udvikle en bred vifte af lineage tracking musemodeller transporterer fluorescerende proteiner i bestemte celler i BM niche (kar, knoglens endosteale, perivascular og neuronal) til at kombinere hæmatopoietisk cellefunktioner med specifikke Karakteristik af BM nicher.
Billeddannelse af knogle stadig har nogle udfordringer og begrænsninger i forhold til andre væv. Selvom to-foton mikroskopet kan trænge 100-1.000 micron dybt i væv, er det stadig udfordrende til image gennem hele tykkelsen af calvarium knoglen. Billeder mister kvalitet med stigende dybde, så protokollen her beskriver pålidelig analyse af BM regioner fra 60 mikron tyk stakke. En anden faktor, der kan resultere i inkonsekvens eller suboptimal imaging er buede form af den calvarium knogle, som kan bringe billedet ude af fokus. Det er afgørende at have kraniet placeret perfekt på glasfad over målet, eventuelt med et stereotaxisk enhed. Faktisk, skull størrelse er vigtigt: kraniet af mus for ung eller for lille måske ikke passer perfekt i en given stereotaxisk enhed. Som et eksempel passer enheden udnyttet her ikke mus yngre end 6 uger og mindre end 20 g.
En yderligere begrænsning er, at billedbehandling systemet udnyttes i denne undersøgelse er begrænset til 3 kanaler. Som den blå kanal tildeles automatisk indsamle ikke-mærkning baseret SHG signal af knogle kollagen, er kun 2 kanaler tilgængelige for specifikke fluorescens mærkning. Dette system har desuden en hastighedsbegrænsning på 1 frame/s på 2 μs/pixel dvæle tid og 512 x 512 pixel frame størrelse, som ikke er ideel til hurtig dynamiske processer (såsom måling af blodgennemstrømningen og evaluering af celle mobilisering i blodet).
En væsentlig udfordring er, at bestråling udført for BMT kompromiser integriteten af Vaskulaturen. Vaskulær lækage i BM efter bestråling forårsager vanskeligheder med segmentering/kvantitering af individuelle strukturer, som kan medføre vanskeligheder i den kvantitative analyse.
Endelig er det vigtigt at overveje at billeddannelse af en mus tager ca. 1 h, og antallet af mus der kan være afbildet i en given dag er begrænset (~ 4 til 6 mus). Således kan stigning i stikprøvestørrelse at opnå magt analyse kræve flere uafhængige eksperimenter, der kan øge variabilitet.
Efter denne protokol er antallet af hæmatopoietisk celler Lys-NGL+ celler opdaget af IVFM i BM efter 24 h fra BMT er ~ 30 celler/regionen og det ganske lille antal i forhold til de oprindelige input celler (3 x 106). Selv om en del af problemet er grund celle diffusering i lunge og lever før homing til BM efter i.v. injektion, det stadig undersøges, om der er regioner i calvarium end dem, der har valgt hvor de transplanterede celler hjem på højere effektivitet.
Målsøgende og engraftment af celler i BM efter BMT følges almindeligt ved flowcytometri ved måling af CD45.1/CD45.2 markører, normal god landbrugspraksis, Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eller en kombination af afstamning og stamceller markører. Brug af IVFM, især i tidlig tidspunkter, gør tilgængelige unikke og yderligere oplysninger, der ikke kan gives ved flowcytometri. For eksempel, ofte det er ikke nemt at skelne FACS hændelser, der er "celler" fra begivenheder, der er "artefakter", især når et lavt antal positive begivenheder er indsamlet (dvs. på 24 h fra BMT). IVFM indeholder oplysninger om morfologi og lokalisering af cellerne, der hjælper denne skelnen. Ligeledes indeholder FACS analyse af BM hæmatopoietisk celler høstet ved rødmen eller bryder knogler celler, der var bosat i niche og celler, der allerede var i omløb i det vaskulære system. Faktisk, IVFM tillader sondring og evaluering af celler hvile inden for BM niche og celler, der er ved at mobilisere i blodbanen. Denne skelnen er af stor værdi, når man studerer kinetik af målsøgende, lokalisering, differentiering og mobilisering i en bestemt model. Vigtigere, kan IVFM give entydige oplysninger om placeringen af hæmatopoietisk cellerne i forhold til de mikromiljø celler, der udgør en bestemt niche.
Andre metoder, der anvendes til at løse sammensætningen af BM niche, sådan histologiske analyse har været brugt. Sammenligning mellem intravital mikroskopi af BM og histologiske analyse af Konfokal mikroskopi er blevet grundigt og elegant drøftet Lo Celso et al. 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Imaging blev udført i Indiana Center for biologisk mikroskopi på Indiana University, instrueret af Dr. Ken Dunn. Stereotaxisk enheden er en prototype designet og fremstillet af Mark Soonpaa, brønde Center for pædiatrisk forskning. Dette arbejde blev støttet af NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN research Foundation (NC) og CTSI Collaborative projekt IUSM/Notre Dame (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
