Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग और जीवित मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं में microtubule गतिशीलता की स्वचालित विश्लेषण

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54265
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

Introduction

एंजियोजिनेसिस बाह्य सिगनल संकेत है कि endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) को बढ़ावा देने, फूट डालना दिशात्मक विशिष्टता के साथ विस्थापित हो, और ऊतकों है कि रक्त की आपूर्ति की आवश्यकता में नए वाहिका के लिए फार्म से शुरू हो रहा है। कारकों angiogenesis ड्राइव करने के लिए सोचा योगदान बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से संकेत कर रहे हैं। शारीरिक संकेतों के जवाब में, ईसीएस दिशात्मक विशिष्टता के साथ नई शाखाओं का विस्तार संवहनी नेटवर्क 1,2 के गठन में दिशात्मक आंदोलन मार्गदर्शन करने के लिए। चुनाव आयोग आकृति विज्ञान और शाखाओं की वास्तुकला का एक तरीका है कि Acto-मायोसिन सिकुड़ना 3 के विनियमन के साथ समन्वित है में microtubule (एमटी) cytoskeleton के स्थानीय विनियमन द्वारा परिभाषित किया गया है। चुनाव आयोग की शाखाओं के रूप में करने के लिए आदेश में, मायोसिन- द्वितीय स्थानीय स्तर पर downregulated किया जाना चाहिए, स्थानीय झिल्ली उभार 4 में जिसके परिणामस्वरूप। एक ही समय में और सेल के भीतर एक ही स्थान में, मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता धीमी गति से और लगातार मीट्रिक टन विकास में जिसके परिणामस्वरूप शाखा एलोन को बढ़ावा देने के लिए संशोधित हो जाते हैंgation और स्थिरता 5। इस समन्वित cytoskeletal विनियमन ईसीएस उनकी आकृति विज्ञान का ध्रुवीकरण करने के लिए दिशात्मक प्रवास की सुविधा के लिए अनुमति देता है।

एक ध्रुवीकृत सेल आकृति विज्ञान के विकास ध्रुवीकृत मीट्रिक टन विधानसभा 6 की आवश्यकता है। उपकला कोशिकाओं पलायन में, एमटीएस सेल 7-9 के अग्रणी धार पर धीरे-धीरे और लगातार विशेष रूप से बढ़ने; न्यूरॉन्स में रहते हुए, दीक्षा और एक्सोन या डेन्ड्राइट के बढ़ाव की आवश्यकता है कि एमटीएस न केवल मौजूद हैं, लेकिन लगता है कि वे गतिशील विधानसभा और disassembly 10-15 की प्रक्रिया के दौर से गुजर रहे हैं। इस तरह, मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के स्थानीय नियंत्रण सेल की वास्तुकला निर्धारित करता है और के रूप में ईसीएस उनकी ईसीएम के माध्यम से नेविगेट सेल आकृति विज्ञान के तेजी से remodeling के लिए अनुमति देता है।

मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता आणविक मोटर प्रोटीन और गैर-मोटर प्रोटीन के परिवारों द्वारा विनियमित रहे हैं, करार दिया microtubule जुड़े प्रोटीन या microtubule बातचीत प्रोटीन (अब refeनक्शे के रूप में करने के लिए rred)। नक्शे स्थानीय स्तर पर सक्रिय किया जा सकता या निष्क्रिय, आम तौर पर सेल ईसीएम इंटरफेस 16,17 पर शुरू cascades संकेत के माध्यम से। मीट्रिक टन करने के लिए बाध्य है और मीट्रिक टन विधानसभा और disassembly के कैनेटीक्स बदलकर एक बार सक्रिय, नक्शे समारोह; जिससे कार्य कर स्थानीय स्तर पर आदेश सेल आकार और polarity 18-20 बढ़ावा देने के लिए मीट्रिक टन गतिशीलता को विनियमित करने के लिए। Mitotic गुणसूत्रबिंदु एसोसिएटेड kinesin (MCAK) एक kinesin-13 परिवार नक्शा है कि मीट्रिक टन समाप्त होता है और जोड़ों मीट्रिक टन disassembly 21-23 एटीपी हाइड्रोलिसिस को बांधता है। MCAK की यह कार्यात्मक भूमिका mitotic धुरा 24-28 के भीतर महत्वपूर्ण है, साथ ही अंतरावस्था 29,30 के दौरान किया जाता है। अंतरावस्था ईसीएस के भीतर, MCAK की मध्यस्थता मीट्रिक टन disassembly के जवाब में MCAK के स्थानीय अरोड़ा-ए प्रेरित फोस्फोराइलेशन द्वारा विनियमित है घाव-किनारे करने के लिए Rac1 छोटे GTPase प्रेरित सक्रियण। इस संकेत झरना के परिणाम, ईसीएस के अग्रणी धार पर MCAK का निषेध है le की ओर ध्रुवीकृत मीट्रिक टन विकास में जिसके परिणामस्वरूपईसीएस 31 पलायन के अनुगामी किनारे पर बढ़त और MCAK प्रेरित मीट्रिक टन disassembly ading।

मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता को मापने के लिए पारंपरिक तरीके में आमतौर पर या तो fluorescently लेबल tubulin या, और अधिक हाल ही में, fluorescently लेबल मीट्रिक टन समाप्ति बाइंडिंग प्रोटीन 1 या 3 (EB1 या EB3, क्रमशः) के हाथ पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया है। फ्लोरोसेंट tubulin दृष्टिकोण पूरे मीट्रिक टन सरणी लेबलिंग का लाभ दिया है। हालांकि, क्योंकि mitotic प्रकार की कोशिकाओं के बहुमत अंतरावस्था 8,32,33 दौरान लाख टन की एक रेडियल सरणी बनाए रखने, केंद्रपिंड पास एमटी बहुत घने हैं, और एक परिणाम के रूप में, फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन साथ मीट्रिक टन विकास और disassembly ट्रैकिंग आम तौर पर परिधीय तक सीमित है सेल के क्षेत्रों के। क्योंकि इन सीमाओं के कारण, fluorescently लेबल ईबी प्रोटीन (EB1 या EB3) के उपयोग मीट्रिक टन गतिशीलता को मापने के लिए और अधिक आम दृष्टिकोण से किया गया है। क्योंकि ईबीएस केवल लाख टन की बढ़ती प्लस समाप्त होता लेबल, वे के रूप में छोटे (1-3 माइक्रोन) दिखाई देते हैं, चमकीले फ्लोरोसेंट आटीएस, इस प्रकार बहुत ही सीमित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति 34-37 मीट्रिक टन के साथ polymerization के एक आसानी से discernable मार्कर प्रदान करते हैं। तथ्य यह है कि ईबीएस लेबल केवल मीट्रिक टन सरणी के एक सबसेट ईबी दृष्टिकोण का एक प्रमुख शक्ति का प्रतिनिधित्व करता है, यह भी एक महत्वपूर्ण सीमा पर प्रकाश डाला गया है, जबकि यह है कि गैर-बढ़ रही टन EB3 दृष्टिकोण से लेबल नहीं हैं। फिर भी, मापने के लिए और समय के साथ EB3 धूमकेतु पर नज़र रखने और उप सेलुलर क्षेत्रों के भीतर मीट्रिक टन विकास की कल्पना करने की क्षमता के अनुप्रयोगों है कि मीट्रिक टन संगठन के क्षेत्रीय मूल्यांकन की आवश्यकता के लिए इस दृष्टिकोण आदर्श बनाते हैं।

मापने मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के लिए पारंपरिक तरीके का एक अन्य महत्वपूर्ण सीमा बहुत बड़े डेटा सेट और समय डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक हो गया है। यह सीमा उच्च समय संकल्प पर ईबी धूमकेतु के सैकड़ों हाथ नज़र रखने के लिए जरूरत से उपजा है। इसके अलावा, इन मापों कोशिकाओं का एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण संख्या में किया जा करने के लिए और भी नियंत्रण और experime की एक किस्म के तहत प्रदर्शन की जरूरत हैntal की स्थिति। हाल ही में, इन बाधाओं को जीवित कोशिकाओं 35 में समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कम्प्यूटेशनल विश्लेषण तकनीक विशेष रूप से ट्रैकिंग EB3 धूमकेतु पर निर्देशित के माध्यम से दूर किया गया है। जब उचित इस्तेमाल किया, यह कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण दोनों मीट्रिक टन polymerization को मापने का एक उच्च throughput विधि के लिए प्रदान करने के अलावा हाथ से नज़र रखने के साथ जुड़े मानव त्रुटि के लिए क्षमता को सीमित करने के लिए कार्य करता है। MATLAB आधारित सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग मीट्रिक टन गतिशीलता के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण, plusTipTracker, fluorescently लेबल EB3 धूमकेतु 5,31,35,38 पर नज़र रखने से मीट्रिक टन विकास के मापन के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, plusTipTracker सॉफ्टवेयर मीट्रिक टन तबाही घटनाओं (उर्फ disassembly) एक से बढ़ मीट्रिक टन ट्रैक के भीतर EB3 धूमकेतु के लापता होने के आधार पर की गणना के लिए अनुमति देता है, और ब्याज के उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों के भीतर मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के उप सेलुलर (उर्फ क्षेत्रीय) के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । हमारे अध्ययन के लिए, मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के भीतर की तुलना में थेbranched क्षेत्रों बनाम गैर शाखाओं क्षेत्रों, या सेल किनारों अनुगामी बनाम प्रमुख के भीतर। plusTipTracker सॉफ्टवेयर से डेटा उत्पादन भी व्यक्ति की कोशिकाओं और उप सेलुलर क्षेत्रों के लिए कलर-कोडेड ट्रैक ओवरले उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यहाँ हम मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता और चुनाव आयोग के विनियमन आकृति विज्ञान और दिशात्मक प्रवास शाखाओं में बंटी को यह मीट्रिक टन depolymerase का योगदान नियमन में MCAK की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया पद्धति का वर्णन है। हमारा दृष्टिकोण एक प्राथमिक मानव कोशिका लाइन, मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) है, जो आसानी से सुसंस्कृत और अत्यधिक electroporation प्रेरित, प्लाज्मिड सीडीएनए के क्षणिक अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी हैं प्रयोग किया जाता है। हम तो उच्च संकल्प इस्तेमाल किया, मीट्रिक टन समाप्ति के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs बाइंडिंग प्रोटीन 3 (EB3) और mitotic गुणसूत्रबिंदु एसोसिएटेड kinesin (MCAK) विशिष्ट सीडीएनए के समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी मीट्रिक टन गतिशीलता पर प्रभाव ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs मूल्यांकन करने के लिए निर्माण करती है। EB3 की PlusTipTracker आधारित कम्प्यूटेशनल छवि विश्लेषण-labeled मीट्रिक टन से अधिक सिरों समय चूक छवियों में मीट्रिक टन विकास की गति और मीट्रिक टन विकास जन्मों को मापने के लिए, उपाय और मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता पर प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के प्रभाव की तुलना करने के लिए किया गया था। इस पद्धति मीट्रिक टन गतिशीलता का अध्ययन और कैसे उप सेलुलर क्षेत्रों के भीतर मीट्रिक टन गतिशीलता के स्थानीय विनियमन चुनाव आयोग शाखाओं में बंटी और प्रवास की एन्जियोजेनिक प्रक्रियाओं के लिए योगदान की पहचान के लिए अनुमति देता है। इन तकनीकों में किसी भी नक्शे की जांच कि fluorescently लेबल किया जा सकता है और व्यक्त जीवित कोशिकाओं में करने के लिए लागू कर रहे हैं।

Protocol

1. HUVEC संस्कृति और रखरखाव

  1. लाल मुक्त endothelial बेसल मीडिया फिनोल के लिए (विवरण के लिए सामग्री / उपकरण सूची देखें) endothelial सेल मध्यम विकास के पूरक पैकेज और 5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक मिश्रण की सारी सामग्री को जोड़कर पूरा endothelial बेसल मध्यम तैयार करें। एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पूरा endothelial बेसल मध्यम।
  2. तरल नाइट्रोजन भंडारण से एक HUVEC cryovial निकालें और 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तेजी से पिघलना। जब ~ 80-90% thawed, cryovial को गरम पूरा endothelial बेसल मध्यम के 500 μl जोड़ने pipetting द्वारा मिश्रण है, और कोशिकाओं को एक 100 मिमी प्लास्टिक टिशू कल्चर गरम पूरा endothelial बेसल मध्यम के 15 मिलीग्राम से युक्त डिश में समान रूप से बांटना।
  3. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेस कोशिकाओं। कोशिकाओं रात भर पालन करने की अनुमति दें। हटाने या सेल संस्कृति के माध्यम से बदल नहीं है।
  4. जब 100 मिमी पकवान> 90% मिला हुआ है, HUVECs मैं हस्तांतरणएक 75 सेमी 2 टिशू कल्चर इलाज कुप्पी Nto और हर समय में> 60% संगम बनाए रखने के (1.5 कदम देखें)।
    नोट: जब एक घनत्व> 60% पर बनाए रखा, HUVEC दुगनी समय 18-20 मानव संसाधन लगातार है।
    1. स्थितियों में, जहां कोशिकाओं passaging आवश्यक नहीं है (यानी घनत्व है <90%), मध्यम aspirate और ताजा पूरा endothelial बेसल मध्यम हर 48 घंटा के साथ बदलें।
  5. जब तक पहुंचने HUVECs> 90% संगम, 1x पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ 2 बार कुल्ला, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए उन्हें 0.25% trypsin के 1.5 मिलीलीटर के इलाज से टिशू कल्चर पकवान से कोशिकाओं को निकाल दें। नोट: HUVECs की व्यवहार्यता बहुत trypsin जोखिम की लंबाई का विस्तार से कम है।
  6. 4 के अनुपात में trypsin / HUVEC मिश्रण करने के लिए 8.5 मिलीलीटर पूरा endothelial बेसल मध्यम जोड़कर बचाव कोशिकाओं: 1 endothelial बेसल मीडिया पूरा: trypsin (न्यूनतम अनुपात), और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा।
  7. 4 मिनट के लिए 1400 XG पर अपकेंद्रित्र। महाप्राणसतह पर तैरनेवाला।
  8. पूरा endothelial बेसल मध्यम 2 मिलीलीटर में गोली Resuspend और पूर्ण endothelial बेसल मध्यम के 25 मिलीलीटर युक्त एक नया 225 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क कोशिकाओं जोड़ें।

2. Coverslip तैयारी HUVEC संस्कृति से पहले

  1. फ़ाइब्रोनेक्टिन substrates के साथ कोटिंग coverslips।
    1. चीख़-साफ 22 मिमी नं 1.5 coverslips 39 और 100% इथेनॉल में कमरे के तापमान (आरटी) पर दुकान तैयार करें।
    2. एक coverslip लौ और एक 35 मिमी पेट्री डिश में चिमटी का उपयोग कर यह जगह एक लेम्प बर्नर का प्रयोग करें।
    3. पीबीएस के 990 μl के साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन शेयर के 10 μl (1 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण से एक फ़ाइब्रोनेक्टिन / पीबीएस मिश्रण तैयार करें।
    4. पिपेट 35 मिमी डिश में coverslip पर फ़ाइब्रोनेक्टिन / पीबीएस मिश्रण के 250 μl। समान रूप से फैला coverslip की सतह को कवर करने के लिए।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा की एक न्यूनतम के लिए पकवान सेते हैं और उपयोग करने से पहले 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ 3 बार कुल्ला।
  2. coverslip एक्टिवेशन
    1. 50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane में एक 22 मिमी नं 1.5 coverslip हलचल प्लेट पर 10 मिनट के लिए रखें। ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक में 2 मिनट के लिए 10 बार धोने डबल आसुत एच 2 ओ (DDH 2 हे)।
    2. एक हलचल प्लेट पर 30 मिनट के लिए 0.5% glutaraldehyde में coverslip सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, DDH 2 ओ में 2 मिनट के लिए 10 बार धोने
  3. polyacrylamide तैयारी
    1. 0.3 2% की मिलीलीटर बीआईएस acrylamide 3.75 मिलीलीटर की 40% एक्रिलामाइड जोड़कर 0.7 kilopascal (केपीए) के एक अनुपालन के साथ एक फिलीस्तीनी अथॉरिटी जेल तैयार है, और DDH 2 ओ के 0.95 मिलीलीटर
    2. अमोनियम persulfate (ए पी) के एक 10% काम कर समाधान तैयार है और उपयोग करें जब तक बर्फ पर दुकान।
    3. 1 coverslip (कुल मात्रा = 166.7 μl) के लिए पीए समाधान तैयार करने के लिए, DDH 2 हे की 0.83 μl, बीआईएस acrylamide समाधान के 41.7 μl जोड़ने (कदम 2.2.2.1 में किए गए), 10% ए पी एस के 124 μl, औरTEMED के 0.25 μl।
    4. इसके तत्काल बाद एक गिलास स्लाइड पर हाइड्रोफोबिक पीए समाधान के 15 μl pipet (देखें अभिकर्मकों सूची) और एक सक्रिय 22 मिमी नं 1.5 coverslip के साथ कवर। पीए आरटी पर 20 मिनट के लिए भाजन करने की अनुमति दें।
    5. coverslip निकालें और एक 35 मिमी डिश को हस्तांतरण। 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर <2 सप्ताह के लिए दुकान।
    6. polyacrylamide जेल के लिए बाध्य करने के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन, यूवी प्रकाश की 7,500 जम्मू (254nm) के साथ 2 मिमी sulfo-SANPAH के लिए polyacrylamide लेपित coverslips बेनकाब। DDH 2 ओ के साथ एक बार कुल्ला
    7. पीबीएस के 990 μl के साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन शेयर के 10 μl (1 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण से एक फ़ाइब्रोनेक्टिन / पीबीएस मिश्रण तैयार करें।
    8. पिपेट एक 35 मिमी पेट्री डिश में coverslip (एस) पर फ़ाइब्रोनेक्टिन / पीबीएस मिश्रण के 250 μl। समान रूप से फैला coverslip की सतह को कवर करने के लिए।
    9. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा की एक न्यूनतम के लिए पकवान सेते हैं और उपयोग करने से पहले 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ 3 बार कुल्ला।
वर्ग = "jove_title"> 3। सीडीएनए अभिकर्मक और HUVEC संस्कृति coverslip पर

  1. पूर्ण कदम 1.5-1.6।
  2. एक hemocytometer का उपयोग, सेल नंबर गिनती और एक मात्रा 100,000 कोशिकाओं / coverslip (गैर पलायन प्रयोगों के लिए) या 500,000 कोशिकाओं / coverslip (माइग्रेशन प्रयोगों के लिए) युक्त इकट्ठा। 4 मिनट के लिए 1400 XG पर centrifugation के माध्यम से गोली कोशिकाओं।
    नोट: प्रवासन प्रोटोकॉल धारा 9 में वर्णन किया गया है, नीचे दिए गए।
  3. Resuspend कोशिकाओं 100 μl electroporation बफर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हो। 1 माइक्रोग्राम सीडीएनए के साथ जुडा है और electroporation क्युवेट में जगह है। Electroporate कोशिकाओं: कार्यक्रम HUVEC electroporation के लिए नामित (: A-034 जैसे कार्यक्रम #) का उपयोग डीएनए मिश्रण।
  4. बचाव एक fibronectin लेपित 22 मिमी नं 1.5 coverslip पर ट्रांसफ़ेक्ट 500 μl पूरा endothelial बेसल मध्यम और प्लेट कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 2.1 देखते हैं, ऊपर)। 3-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं सीडीएनए निर्माणों की अभिव्यक्ति के लिए समय की अनुमति है।
Le "> 4। इमेजिंग के लिए नमूना की तैयारी

  1. 2.5 सेमी x 0.65 सेमी स्ट्रिप्स में दो तरफा टेप में कटौती।
  2. एक साफ कांच स्लाइड प्राप्त करते हैं। डबल पक्षीय टेप के दो स्ट्रिप्स ले लो और उन्हें क्षैतिज रूप से सुरक्षित स्लाइड के ऊपर और नीचे बढ़त के साथ। नोट: यह कदम 4.5) में वर्णित के रूप में चैम्बर सील करने के लिए टेप और स्लाइड किनारे के बीच अंतरिक्ष की एक छोटी राशि की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. (3.4 कदम से, सेल-नीचे की ओर) माउंट coverslip टेप पर coverslip बाकी का ऐसा है कि 2 किनारों। संदंश का प्रयोग करें coverslip सुरक्षित करने के लिए धीरे नीचे दबाएं।
  4. एक micropipette का प्रयोग, इमेजिंग मध्यम के 40 μl जोड़ने coverslip और स्लाइड के बीच (पूरा endothelial बेसल मध्यम 25 माइक्रोन के HEPES के साथ पूरक)। सुनिश्चित करें कि coverslip और स्लाइड के बीच अंतरिक्ष के लिए पूरी तरह से इमेजिंग मध्यम से भर जाता है। महाप्राण अतिरिक्त इमेजिंग मध्यम (यदि आवश्यक हो)।
  5. (: 1: 1 पेट्रोलियम जेली: लानौलिन: पैराफिन 1) गर्म VALAP के साथ सभी किनारों को सील। gentl धक्का द्वारा लीकेज के लिए जाँच करेंकांच coverslip पर वाई।
  6. घुड़सवार और पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) खुर्दबीन मंच पर coverslip सील कर रखें।

5. माइक्रोस्कोपी

  1. एक कताई डिस्क confocal एक 60x, 1.40 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस, एक स्वचालित फोकस निगरानी प्रणाली (PFS), प्रेषित रोशनी के लिए इलेक्ट्रॉनिक शटर के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एक एक्स और वाई motored मंच, बैंड पास फिल्टर एक इलेक्ट्रॉनिक फिल्टर पहिया में रखे, और एक अखंड लेजर combiner मॉड्यूल, सेल / coverslip के इंटरफेस में माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित करने और एक एकल कोशिका का पता लगाने की खुर्दबीन मंच जॉयस्टिक का उपयोग करें।
  2. छवि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में "कैमरा सेटिंग्स" पैनल पर क्लिक करें। कैमरा सेटिंग्स पैनल के "जोखिम समय" लटकती खिड़की के भीतर, 400 मिसे का चयन करें।
    नोट: जोखिम बार भिन्न हो सकते हैं और अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. में "एन डी अधिग्रहण" पैनल पर क्लिक करेंछवि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम। एनडी अधिग्रहण पैनल के लैम्ब्डा (λ) टैब के भीतर, 488 और 561 एनएम लेज़रों चयन करने के लिए चेक बॉक्स पर क्लिक करें। एनडी अधिग्रहण पैनल के "समय" टैब के भीतर, 2 सेकंड और 2 मिनट के लिए कुल समय के लिए अधिग्रहण के समय निर्धारित किया है।
  4. दोनों 488- और 561 एनएम रोशनी के लिए एक 400 मिसे जोखिम समय का उपयोग कर 2 सेकंड अधिग्रहण के अंतराल पर एक 2 मिनट समय चूक छवि अनुक्रम प्राप्त करने के लिए एन डी अधिग्रहण पैनल के भीतर "अब भागो" बटन पर क्लिक करें।
  5. छवि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के "ऑप्टिकल विन्यास" पैनल और कदम 5.2 में वर्णित कैमरा सेटिंग्स का उपयोग, में 405 एनएम लेजर बटन पर क्लिक करें और फिर "मोल" नीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक भी छवि पर कब्जा करने के लिए क्लिक करें (BFP) -labeled प्रोटीन ।
    नोट: यह आम तौर पर सेल जोखिम इस तरंग दैर्ध्य समय के साथ कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में 405 एनएम लेजर रोशनी करने के लिए (छवि पर कब्जा और / या जोखिम समय की आवृत्ति) को सीमित करने की सलाह दी जाती है।
    1. MCAK-shRNA पढ़ाई के लिए, एकएक भी 405 एनएम की छवि cquire BFP लेबल shRNA की अभिव्यक्ति सत्यापित करने के लिए।
  6. छवि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के "ऑप्टिकल विन्यास" पैनल में और कदम 5.2 में वर्णित कैमरा सेटिंग्स का उपयोग कर, डीआईसी बटन पर क्लिक करें और फिर क्लिक करें "मोल" आकृति विज्ञान विश्लेषण शाखाओं में बंटी के लिए सेल का एक भी डीआईसी छवि पर कब्जा करने (धारा 10 देखें , नीचे)।
  7. छवि अधिग्रहण के बाद, छवि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में "चमक / विपरीत" समारोह का उपयोग डिजिटल छवि सिग्नल बढ़ाने के लिए।
  8. चमक और विपरीत समायोजित छवियों को निर्यात। क्लिक करें "फाइल" तो क्लिक करें "के रूप में सहेजें," तो छवि फ़ाइल प्रकार के लिए ".tif" का चयन करने के लिए क्लिक करें।
    नोट: यह आम तौर पर जब कब्जा कर लिया चरण 5.4 में वर्णित के रूप में एक भी 2 मिनट का समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण से 61 .tif छवि फ़ाइलों को उत्पन्न करता है।

6. मीट्रिक टन गतिशीलता विश्लेषण

  1. EB3 ट्रैकिंग के लिए, plusTipTracker सॉफ्टवेयर 35 उपयोग, एक खुला स्रोत,MATLAB आधारित कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर पैकेज स्वत: पता लगाने, ट्रैकिंग, विश्लेषण और fluorescently लेबल ईबीएस के दृश्य के लिए बनाया गया है।
  2. plusTipGetTracks ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई)
    1. plusTipGetTracks जीयूआई, प्रकार plusTipGetTracks उपयोग करने के लिए।
    2. EB3 धूमकेतु का पता लगाने के लिए, ब्राउज़ करें और मूल निर्देशिका कि .tif चित्र शामिल हैं का चयन करने के जीयूआई इस्तेमाल करते हैं।
    3. plusTipGetTracks जीयूआई की ट्रैकिंग पैरामीटर पैनल के भीतर, निम्न मान दर्ज करें: खोज रेंज त्रिज्या = 5 - 10; न्यूनतम उप-ट्रैक की लंबाई = 3; मैक्स अंतर लंबाई (फ्रेम) 12 =; मैक्स फैक्टर संकोचन = 1.0; अधिकतम कोण फॉरवर्ड = 25; अधिकतम कोण पिछड़ा = 10; अस्थिरता त्रिज्या (पिक्सेल) = 2; फ्रेम दर (एसईसी) = 2; पिक्सेल आकार (माइक्रोन) = 110।
      नोट: पहले .tif छवि फ़ाइलों का एक प्रतिनिधि सेट पर plusTipParamSweepGUI का उपयोग कर इष्टतम ट्रैकिंग पैरामीटर के लिए जाँच करें। पिक्सेल आकार के लिए प्रवेश मूल्य उद्देश्य समय चूक छवि प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया लेंस के लिए विशिष्ट हैएस (ऊपर चरण देखें 5.1-5.2)।
    4. ब्याज (आरओआई) के चयन के क्षेत्र के लिए, मैन्युअल सेल के डीआईसी छवि का उपयोग करते हुए एक बहुभुज के लिए फार्म सेल बढ़त अनुरेखण द्वारा पूरे सेल के द्विआधारी मास्क बनाने के लिए।
    5. ब्याज (उप आरओआई) चयन के उप क्षेत्र के लिए, प्रमुख और मैन्युअल हित के घाव बढ़त सेल भर में एक 2 बिंदु मोटी रेखा एक संशोधित plusTipTracker उप रॉय चयन उपकरण का उपयोग ड्राइंग द्वारा किनारे मास्क अनुगामी पैदा करते हैं।
      नोट: लाइन स्थिति जहां ब्याज की सेल पड़ोसी घाव बढ़त कोशिकाओं 31 परे फैली हुई है पर घाव बढ़त के समानांतर तैयार किया जाना चाहिए।
  3. plusTipSeeTracks जीयूआई
    1. सत्यापित करें और नेत्रहीन पर क्लिक करके "रॉय" फ़ोल्डर में संग्रहीत .tif छवियों का ट्रैक ओवरले का निरीक्षण बटन "प्लॉट पटरियों" ट्रैक ओवरले कॉलम में। सभी ट्रैक ओवरले के लिए दोहराएँ।
    2. वैकल्पिक सेटिंग कॉलम में "बनाएँ समूह" बटन पर क्लिक करके डेटा समूहीकरण प्रदर्शन करना। experim का चयन करेंअंदरूनी डेटा है कि डेटा फ़ाइलों पर क्लिक करके एक ही डाटासेट के हैं। "समूह" एक ऐसा नाम है जो आसानी से पहचाना जा सकता है (उदाहरण के लिए, "नियंत्रण समूह") देकर चयन बचाओ।
    3. उप-रॉय मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता माप के लिए, न्यूनतम संख्या की छवि फ्रेम कि एक EB3 धूमकेतु ट्रैक क्रम के प्रमुख और अनुगामी किनारे रॉय के भीतर एक 'ट्रैक' के रूप में योग्य और मीट्रिक टन विकास यात्रा निकालने के लिए में उप रॉय के भीतर पता लगाया जाना चाहिए दर्ज "मैनुअल चयन" पर क्लिक जीयूआई "उप ROIs" पैनल के भीतर से।
      नोट: उदाहरण के लिए, 3 फ्रेम (6 सेकंड) का उपयोग कम से कम पता लगाने की लंबाई के रूप में एक के रूप में निकाला जा करने के लिए "ट्रैक।" उप ROIs से निकाली पटरियों प्रत्येक कक्ष के लिए मूल रॉय फ़ोल्डर के भीतर एक उप परियोजना फ़ोल्डर के भीतर जमा हो जाती है।
    4. मीट्रिक टन विकास उप-ट्रैक और उप-जनसंख्या विश्लेषण
      1. मतलब मीट्रिक टन विकास की गति की गणना और मतलब है "समूह" डेटासेट (कदम 6.3.2 देखें), प्रत्येक रॉय के लिए के लिए मीट्रिक टन विकास जीवनकाल (काएं देखनापी 6.2.4), और प्रत्येक उप रॉय के लिए (कदम 6.2.5 देखें)।
    5. plusTipSeeTracks जीयूआई का चक्र स्कैटर भूखंडों स्तंभ के भीतर, पर "चुनें समूह" पर क्लिक करें और समूहों (चरण 6.3.2 में बनाया) तुलना में किया जा करने के लिए पर क्लिक करें।
      1. एक्स अक्ष विकल्प के लिए "विकास की गति" का चयन करें और विकास की गति बॉक्स में (चरण 6.3.4 से) के लिए मतलब मान लिखें। Y अक्ष विकल्प के लिए "विकास आजीवन" का चयन करें और बक्से में (चरण 6.3.4 से) विकास जीवन भर के लिए मतलब मूल्य टाइप करें।
    6. बॉक्स अगले "शुरू / अंत में पटरियों निकालें" करने के लिए और अगले करने के लिए जाँच करें "समूह पर बैच प्रक्रिया है।" "भूखंडों बनाओ" पूरे सेल के लिए मीट्रिक टन विकास पटरियों, प्रमुख किनारों के लिए एक वितरण प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए पर क्लिक करें और अनुगामी किनारों उप ROIs।
      नोट: धीमी और कम रहता है, धीमी गति और लंबे समय रहते, तेज और कम रहता है, और तेजी से और लंबे समय रहते: यहाँ वर्णित अध्ययन के लिए, मीट्रिक टन विकास पटरियों चार उप-जनसंख्या में वितरित कर रहे हैं।
    7. पर क्लिक करें "डाटा," तो डेटा लटकती खिड़की से "पर डेटा विश्लेषण" पर क्लिक करें। चुनें "टी परीक्षण: दो बराबर प्रसरण संभालने नमूना" तुलना करने के लिए मीट्रिक टन विकास की गति और मीट्रिक टन विकास जन्मों से मतलब है। स्प्रेडशीट जहां टी परीक्षण तुलना एक पी मूल्य <0,001 में परिणाम के भीतर डेटा कोशिकाओं को हाइलाइट करें।

7. Colocalization विश्लेषण

  1. पृष्ठभूमि घटाव के लिए, इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के "लाइन उपकरण" का उपयोग, पर एक चौकोर आकार कि ग्रीन चैनल छवि (488 एनएम उत्तेजना) पर 10 माइक्रोन 2 बनाने के लिए स्क्रीन पर क्लिक करके ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र को आकर्षित जहां एक की स्थिति कोई सेल प्रतिदीप्ति (पृष्ठभूमि) है। लाल चैनल छवि (561 एनएम उत्तेजना) चरण में 5.8 से छवियों का उपयोग करने के लिए इस दोहराएँ।
  2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर पीआर का उपयोगogram, सही कदम 7.1 रॉय पर क्लिक करें और "पृष्ठभूमि रॉय के रूप में निर्धारित किया है।" पर क्लिक करें "छवि," तो लटकती खिड़की से "घटाना पृष्ठभूमि" पर क्लिक करें पूरे से (चरण 7.1) औसत पृष्ठभूमि मूल्यों घटाना छवि। सह व्यक्त उन्हें अरोड़ा एक और या तो mCherry-MCAK, Mapple-EB3, या Mapple ट्यूबिलिन कोशिकाओं के लिए पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन करना।
  3. पृष्ठभूमि घटाया लाल चैनल छवि में केवल बाइनरी रिबन पर क्लिक करें और "दहलीज को परिभाषित करें" का चयन करें और फिर "प्रति चैनल" समारोह नामित फ्लोरोसेंट मार्कर बाहर करने के लिए चयन करें।
    नोट: thresholding कदम लाइनों है कि विशेष रूप से सह स्थानीयकरण विश्लेषण (कदम 7.4 देखें) के लिए thresholded वस्तु चिह्नित ड्राइंग अनुमति देने के लिए या तो mCherry-MCAK, Mapple-EB3, या Mapple ट्यूबिलिन छवि पर प्रदर्शन किया गया था।
  4. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में लाइन उपकरण का उपयोग, thresholded छवि के भीतर बाहर रखा वस्तुओं पर एक 2-बिंदु मोटी रेखा खींचना।
  5. लाइन वस्तुओं कदम 7.4 में तैयार चयन करें। कॉपी और अपनी इसी ग्रीन चैनल (ईएम अरोड़ा ए) छवि पर लाल चैनल से लाइन वस्तुओं पेस्ट करें।
  6. स्केल पिक्सेल तीव्रता मूल्यों उपाय के तहत लाइन इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के भीतर लटकती खिड़की से चयन "उपाय," फिर "तीव्रता प्रोफ़ाइल" द्वारा प्रत्येक व्यक्ति के सेल के लिए सह स्थानीयकरण और कुल उन्हें अरोड़ा-ए मूल्यों की गणना करने के लिए वस्तुओं।
    1. एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के लिए निर्यात और ( "control_grayscale_intensity.xls" उदाहरण के लिए) के रूप में प्रकार .xls फ़ाइल सहेजकर प्रयोगात्मक उपचार और उप सेलुलर क्षेत्र से डेटा को व्यवस्थित करें।
      नोट: इस तरह से प्रस्तुत डाटा कुल मापा प्रति उप सेलुलर क्षेत्र एम-अरोड़ा-ए का सह स्थानीयकरण अंश का प्रतिनिधित्व करता है।
  7. कदम 7.6, दोहराने कदम 6.3.7 से मापा मूल्यों का प्रयोग महत्व के लिए कटऑफ के रूप में पी <0.05 का उपयोग कर सांख्यिकीय महत्व की गणना करने के लिए।
  1. 60 मिमी पाइप, 27.3 मिमी HEPES, 10 मिमी EGTA, और 8.2 मिमी MgSO में 4% paraformaldehyde, 0.15% glutaraldehyde, 0.2% डिटर्जेंट, (3.4 कदम देखें) कोशिकाओं paraformaldehyde / glutaraldehyde सह निकासी / निर्धारण बफर (PGF-PHEM साथ तय 4, 7.0 पीएच) आरटी पर 10 मिनट के लिए।
  2. 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला।
  3. 0.01 ग्राम / मिलीलीटर NaBH 4 में 1x पीबीएस के साथ 15 मिनट के लिए 2 बार समझो प्रतिक्रियाशील एल्डीहाइड बुझाने के लिए।
    नोट: NaBH 4 रूपों बुलबुले कि coverslips फ्लोट करने के लिए पैदा कर सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि इन coverslips incubations के दौरान जलमग्न रहते हैं। coverslips फ्लोट करने के लिए शुरू करते हैं, तो आदेश बुलबुले से बचने के लिए अनुमति देने के लिए coverslip के एक किनारे तरक्की के लिए संदंश का उपयोग करें।
  4. आरटी पर 1 घंटे के लिए एक कमाल मंच पर 1x पीबीएस में 5% वसा रहित दूध के साथ अवरुद्ध होने से पहले 1x पीबीएस के साथ 2 बार कुल्ला।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी में कोशिकाओं (खरगोश विरोधी pT288 अरोड़ा ए (1: 1,000)) सेते हैं और चूहे विरोधी α ट्यूबिलिन (1: 500) 1x पीबीएस समाधान में तैयार किया। एक कमाल मंच रातोंरात पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. (गधा विरोधी खरगोश (1: 1,000) और बकरी विरोधी चूहा (1: 1,000)) माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ incubating से पहले 1x पीबीएस में 5 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और 3 बार कुल्ला 2 घंटे के लिए 5% वसा रहित दूध में तैयार 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  7. प्रतिदीप्ति-अनुकूलित बढ़ते मध्यम में एक गिलास स्लाइड पर माउंट coverslip। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग कर, और अंधेरे में स्टोर करने के लिए coverslip किनारों को सील।

9. सेल प्रवास परख

  1. जैसा कि ऊपर वर्णित प्रवास assays के लिए HUVEC संस्कृति प्रदर्शन करना (प्रोटोकॉल 3: coverslip पर सीडीएनए अभिकर्मक और HUVEC संस्कृति, कदम 3.2-3.3)।
  2. सेल अभिकर्मक, 80 μl पूरा endothelial बेसल माध्यम के साथ बचाव ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के बाद। एक सूखे fibronectin लेपित 22 मिमी दौर नं 1.5 coverslip के केंद्र पर एक एक बूंद के रूप में 80 μl नमूना पिपेट। 80 μl Dro फैल मतपी। 3-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते एक मिला हुआ monolayer में सेल पालन के लिए समय की अनुमति है।
    नोट: coverslip सुखाने coverslip के संपर्क पर फैलने से 80 μl बूंद को रोकने के लिए आवश्यक है। इस दृष्टिकोण के लिए HUVECs coverslip के एक छोटे से क्षेत्र के भीतर केंद्रित करने की अनुमति देता है और इस तरह की कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer के तेजी से गठन को बढ़ावा देता है।
  3. पूरा endothelial बेसल मध्यम में 2 बार कुल्ला संयुक्त राष्ट्र के संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए।
  4. एक "घाव बढ़त," बनाने के लिए धीरे (चरण 9.2 से) HUVEC monolayer भर में एक साफ रेजर ब्लेड खींचकर एक निष्फल धार के साथ coverslip परिमार्जन। coverslip स्क्रैप के दौरान धार की फिसलन को रोकने के लिए संदंश के साथ जगह में धीरे पकड़ो।
  5. कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ठीक करने के लिए अनुमति दें। इकट्ठा और इमेजिंग के लिए coverslip (ओं) माउंट (प्रोटोकॉल 4 देखें)।
  6. माइक्रोस्कोप एक का उपयोग करने पर 12 घंटे के लिए मोल 10 मिनट के अंतराल पर चरण विपरीत और 488 एनएम छवियों10x 0.45 एनए चरण उद्देश्य और एक 0.52 एनए LWD कंडेनसर छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के 'एन डी अधिग्रहण "पैनल का उपयोग (5.3 चरण में वर्णित)।

10 HUVEC शाखाओं में बंटी और प्रवासन की मात्रा

  1. विश्लेषण शाखाओं में बंटी और यहां तक ​​कि सेल रोशनी और निष्पक्ष मात्रा का ठहराव के लिए, एक HUVEC ट्रांसफ़ेक्ट की एक सूक्ष्म छवि के अधिग्रहण की अनुमति के लिए (3.3 कदम देखें) और Mapple-C1 सीडीएनए का निर्माण, एक सेल की मात्रा मार्कर व्यक्त करने के लिए।
  2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करना, Mapple-C1 छवि को खोलने और शाखा जहां झिल्ली वक्रता की सबसे बड़ी कोण को प्रदर्शित करता है के दोनों किनारों पर स्थिति लेबल। एक सीधी रेखा के साथ उन दो अंक कनेक्ट। इस लाइन "शाखा मूल है।"
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर की लाइन उपकरण का उपयोग, नेत्रहीन शाखाओं कि मापने "शाखा मूल" चरण में निर्धारित 10.2 से लंबाई में> 10 माइक्रोन की पहचान। वें से दूरी को मापने के द्वारा शाखा लंबाई की गणनाई "शाखा मूल" शाखा टिप के सबसे बाहर बात करने के लिए (चित्रा 4 देखें)।
  4. branched उभार कि मापने प्राप्त करने के लिए लंबाई में> 10 माइक्रोन की संख्या की गणना "सेल शाखा संख्या।"
  5. पलायन विश्लेषण के लिए, चरण 9.6 में एकत्र छवियों का उपयोग, नेत्रहीन एक घाव बढ़त HUVEC भौतिक स्थान के आधार पर (घाव के किनारे पर यानी कोशिकाओं शारीरिक रूप से) और अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पहचान (यानी, एक हरे रंग की बढ़त घाव कक्ष का चयन करें, तो प्रयोग शामिल GFP की अभिव्यक्ति)।
  6. सेल के चरण विपरीत छवियों का उपयोग करना, नेत्रहीन नाभिक (सेल के केंद्र के पास अर्द्ध पारदर्शी गोलाकार संरचना) की पहचान है, और फिर नेत्रहीन में न्यूक्लियस (एक, छोटे काले रंग का, नाभिक के भीतर गोलाकार संरचना) की पहचान समय चूक छवियों के पहले समय बिंदु। न्यूक्लियस की स्थिति पर क्लिक करें न्यूक्लियस की एक्स और वाई निर्देशांक लेबल करने के लिए।
  7. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, हाथ-ट्रैकन्यूक्लियस की स्थिति को समय चूक फिल्म (चित्रा 4) के प्रत्येक फ्रेम में न्यूक्लियस की एक्स और वाई निर्देशांक लेबल करने के लिए पर क्लिक करके लगातार समय चूक छवियों में न्यूक्लियस।
  8. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग, "फाइल" पर क्लिक करें फिर सहेजें पर क्लिक करें .xls "तो छवि फ़ाइल प्रकार का चयन करने के लिए क्लिक करें" के रूप में। "
  9. (कदम 10.8 से) हाथ से ट्रैकिंग डेटा फ़ाइल एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर खोलें। मतलब पलायन वेग की गणना और मूल करने के लिए पलायन दूरी मतलब है।
  10. एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग, "डाटा" पर क्लिक करें तो डेटा लटकती खिड़की से "पर डेटा विश्लेषण" पर क्लिक करें। Bonferroni-सही, एक तरह से> 95% सांख्यिकीय महत्व के लिए कटऑफ के रूप में विश्वास के साथ विचरण परीक्षण के विश्लेषण का चयन करें।

Representative Results

रहते सेल माइक्रोस्कोपी के लिए HUVEC संस्कृति
HUVECs का लाइव सेल इमेजिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की आवश्यकता है कि HUVECs एक वातावरण सामान्य कोशिकाओं के विकास और रखरखाव, साथ ही सामान्य प्रोटीन अभिव्यक्ति और समारोह के लिए उपयुक्त है कि में रखा जाता है। चित्रा 1 से पता चलता प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रण एक बफर तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया और बंद व्यवस्था जीवित कोशिकाओं के समय चूक छवियों इकट्ठा करने के लिए अनुकूलित का कहना है कि ऑप्टिकल विशेषताओं। दो तरफा टेप की पतली स्ट्रिप्स एक गिलास स्लाइड (चित्रा 1 ए) पर रखा जाता है और फिर coverslip सुसंस्कृत HUVECs युक्त टेप है कि इस तरह की कोशिकाओं स्लाइड (चित्रा 1 बी) का सामना कर रहे के शीर्ष पर उलटा है। इस तरह, टेप के बीच दो गिलास सतहों एक छोटे से अंतराल प्रदान करता है, और एक अंतरिक्ष में जो कोशिकाओं उचित सेल संस्कृति मीडिया में नहाया जा सकता है बनाता है (चित्रा 1C, देखो प्रोटोकॉल 4, ऊपर)। मैंएक बंद व्यवस्था स्थापित करने के लिए, (चित्रा 1 डी 1 मिश्रण, VALAP: 1: 1): लानौलिन: पैराफिन मोम na अंतिम कदम है, गिलास coverslip गिलास स्लाइड एक पेट्रोलियम जेली का उपयोग करने के सील है। यह सेल संस्कृति दृष्टिकोण EB3 धूमकेतु के दोनों छोटे समय के अनुक्रम इमेजिंग और लंबे समय के अनुक्रम शाखाओं में बंटी और प्रवास के प्रयोगों के लिए के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अतिरिक्त, VALAP की मोम की तरह स्थिरता एक इमेजिंग के अंत में कांच स्लाइड और coverslip से आसान हटाने के लिए कि इस तरह के निर्धारण और immunolabelling सहित पूरक दृष्टिकोण (प्रोटोकॉल 8 देखें) प्रयोग की अनुमति देता है, एक ही coverslip और सेल नमूना पर किया जा सकता है कि लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग कर कल्पना की गई थी।

आकृति 1
चित्रा 1:। सूक्ष्म इमेजिंग रहते सेल के लिए HUVEC संस्कृति की पद्धति (ए) 0.65 सेमी एक्स 2 में डबल पक्षीय टेप के 2 टुकड़े काटें।50 सेमी आयताकार स्ट्रिप्स और क्षैतिज स्लाइड के शीर्ष बढ़त के साथ दो तरफा टेप का एक टुकड़ा है, और अन्य टुकड़ा, स्लाइड के नीचे बढ़त के साथ सुरक्षित है। यह (डी) में वर्णित के रूप में चैम्बर सील करने के लिए टेप और स्लाइड किनारे के बीच अंतरिक्ष की एक छोटी राशि की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है। (बी) संदंश HUVECs युक्त coverslip हटाने और टेप के टुकड़े के शीर्ष पर coverslip (नीचे सेल की ओर) पलटना का उपयोग करना। (सी) एक micropipette का प्रयोग, 40 coverslip और गिलास स्लाइड के बीच (25 माइक्रोन के HEPES के साथ पूरक पूरा endothelial बेसल मध्यम) इमेजिंग मीडिया के μl जोड़ें। सुनिश्चित करें कि coverslip और स्लाइड के बीच अंतरिक्ष के लिए पूरी तरह से इमेजिंग मीडिया से भर जाता है और बुलबुले से बचें। अतिरिक्त मीडिया को दूर करने के लिए, यदि आवश्यक हो तो coverslip की बढ़त के साथ एक Aspirator का प्रयोग करें। (डी) गर्म VALAP उपयोग करें (1: 1: 1 वैसलीन: लानौलिन: आयल) coverslip के किनारों के आसपास सील करने के लिए। इमेजिंग मीडिया रिसाव के लिए जाँच करेंcoverslip पर धीरे चारों ओर धकेलने के द्वारा एस। अतिरिक्त उपाय करने VALAP का प्रयोग करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

fluorescently लेबल EB3 की स्वचालित ट्रैकिंग पूरे सेल और क्षेत्रीय मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के व्यापक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। EB3 प्रोटीन की, साफ अलग है, और अत्यधिक समय और स्थान के हल सूक्ष्म छवियों के संग्रह कोशिका के भीतर EB3 आंदोलनों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है। fluorescently लेबल EB3 की HUVEC अभिव्यक्ति सेल को और प्रतिदीप्ति तीव्रता आम तौर पर मानव संसाधन की अवधि में एक ही कोशिका के भीतर बढ़ जाती सेल से व्यापक रूप से भिन्न होता है। इस प्रकार, यह विचार करने और आदेश मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता पर बढ़ा ईबी अभिव्यक्ति की संभावित प्रभाव की पहचान करने में अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में इन परिवर्तनों पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है। यह सबसे अच्छा मूल्यांकन के ग्रे पैमाने पर प्रतिदीप्ति intensit द्वारा पूरा किया हैप्रत्येक imaged सेल के लिए y प्रोफाइल, और फिर उन कोशिकाओं है कि ग्रे पैमाने पर अभिव्यक्ति प्रोफाइल का एक निर्धारित सीमा प्रदर्शित करने के लिए डेटा विश्लेषण सीमित। अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल डेटा सेट की प्रारंभिक मूल्यांकन महत्वपूर्ण है, और मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता डेटा है कि प्रत्येक कक्ष के लिए plusTipTracker सॉफ्टवेयर द्वारा प्राप्त की है के साथ तुलना की जानी चाहिए। अभिव्यक्ति प्रोफाइल आदेश ग्रे पैमाने पर अभिव्यक्ति की वांछित सीमा निर्धारित करने के लिए और संभावित outliers की पहचान करने में मीट्रिक टन विकास की गति और एक प्रयोगात्मक समूह के भीतर प्रत्येक कक्ष के लिए मीट्रिक टन विकास जीवनकाल के खिलाफ साजिश रची जा सकता है।

चित्रा 2 डाला एक HUVEC एक fibronectin सब्सट्रेट पर संवर्धित (प्रोटोकॉल 2.1, ऊपर देखें) और Mapple लेबल EB3 के अधिकतम स्तर के पास व्यक्त। फ्लोरोसेंट EB3 धूमकेतु 12 सेकंड (2A चित्रा) की अवधि में छवियों का एक समय चूक श्रृंखला में दिखाए जाते हैं। plusTipTracker सॉफ्टवेयर का उपयोग कर EB3 धूमकेतु के विश्लेषण से एक स्वचालित, फ्रेम-दर-फ्रेम EB3 धूमकेतु देते शामिलction (हरे और पीले डॉट्स, चित्रा 2 बी)। प्रत्येक फ्रेम के भीतर का पता चला तो धूमकेतु, जुड़े हुए हैं फ्रेम के लिए फ्रेम से स्थिति में उनके परिवर्तन पर निर्भर करता है, EB3 पटरियों और एक दृश्य EB3 ट्रैक ओवरले (चित्रा -2 सी एफ) उत्पन्न करने के लिए। ट्रैक ओवरले कलर-कोडेड और रंग भेद उपयोगकर्ता द्वारा दर्ज मापदंडों के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। आमतौर पर, इन भेद मीट्रिक टन विकास की गति और मीट्रिक टन विकास आजीवन 5,31 के वैश्विक मतलब का उपयोग करें और जिससे चार समूहों में विभाजित डेटा: धीमी गति से और अल्पकालिक (लाल), धीमी और लंबे समय रहते (पीला), तेज और लघु रहते थे (हरा), और तेजी से और लंबे समय रहते मीट्रिक टन विकास (नीला, चित्रा 2 जी)। EB3 लेबल मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता की PlusTipTracker की मध्यस्थता ट्रैकिंग भी ब्याज (ROIs) के उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों में सक्षम बनाता है। PlusTipTracker, उपयोगकर्ता परिभाषित रॉय (चित्रा 2A, बी और एफ) के भीतर से मीट्रिक टन विकास की पटरी डेटा निकालता है जिससे मीट्रिक टन विकास dynam की तुलना के लिए अनुमति देता हैएक ही सेल के विभिन्न क्षेत्रों के भीतर आईसीएस।

चित्र 2
चित्रा 2: EB3 धूमकेतु का पता लगाने, ट्रैकिंग, और plusTipTracker डेटा निर्गम (ए) एक HUVEC व्यक्त Mapple EB3 के समय चूक फिल्म।। वाम पैनल एक पूरे सेल देखें और पूरे सेल मुखौटा (सफेद लाइन) सेल सीमाओं demarking पता चलता है। लाल बॉक्स समय चूक छवियों (सही पैनल) में दिखाया गया जूम क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। सही पैनल कच्चे ग्रे पैमाने पर समय चूक लगातार इमेजिंग फ्रेम (- टी = 12 सेकंड टी = 0 सेकंड) में EB3 धूमकेतु की छवियों को दिखाने के लिए। (बी) plusTipTracker में (ए) दिखाया छवियों से EB3 धूमकेतु का पता लगाने। वाम पैनल का पता चला धूमकेतु (पीले डॉट्स) की एक पूरी सेल दृश्य दिखाता है। लाल बॉक्स समय चूक छवियों (सही पैनल) में दिखाया गया जूम क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। सही पैनल पांच पता लगाया EB3 धूमकेतु (लाल तीर) पर प्रकाश डाला और 12 सेकंड इमेजिंग अवधि में उन पांच धूमकेतु का पता लगा। हरा डॉट्स EB3 धूमकेतु है कि पिछले समय के अंतराल में मौजूद नहीं था (या नहीं पाया गया) का पता चला प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) (ए) में दिखाया गया EB3 धूमकेतु की 61 फ्रेम (2 मिनट फिल्म) की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। (डी) एक ही फ्रेम 61 (2 मिनट की फिल्म) (सी) में दिखाया गया है plusTipTracker मीट्रिक टन ट्रैक ओवरले। (ई) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के ज़ूम (सी में लाल बॉक्स)। (एफ) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के plusTipTracker मीट्रिक टन ट्रैक ओवरले के ज़ूम (डी में लाल बॉक्स)। (G) रंग कोडित में (डी) से पता चला ट्रैक ओवरले और (एफ) के लिए कथा। पद के रूप में धीमी गति से, तेज, अल्पकालिक या लंबे समय रहते सभी विकास पटरियों दस Mapple-EB3 व्यक्त HUVECs के एक समूह में मापा के लिए मतलब मूल्य पर आधारित है। आसान दृश्य के लिए, (डी) और (एफ) में ट्रैक ओवरले (ए) में दिखाया सेल छवि के उल्टे पिक्सेल तीव्रता का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन।/files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

HUVEC शाखाओं में बंटी और प्रवास पैटर्न ईसीएम से mechano-शारीरिक संकेतों के प्रति संवेदनशील हैं।

HUVECs अच्छी तरह से संकेत संकेतों के विभिन्न प्रकार का जवाब और, ऐसा करने में, रूपात्मक परिवर्तन है कि विशेष रूप से सिगनल क्यू (s) 36,40-42 के लिए एक उपयुक्त सेलुलर प्रतिक्रिया हुक्म से गुजरना करने के लिए जाना जाता है। HUVECs fibronectin लेपित ग्लास substrates (चित्रा 3 ए) पर संवर्धित, या कठोर 2-आयामी polyacrylamide ईसीएम पर (55 किलो पास्कल) आम तौर पर एक गोल या कुछ अलग शाखाओं उभार (चित्रा 3 बी) के साथ लम्बी आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, जब बहुत नरम 2-आयामी polyacrylamide ईसीएम (0.7 किलो पास्कल) पर सुसंस्कृत, HUVECs एक अत्यधिक branched आकृति विज्ञान कि से परिणाम के लिए जाना जाता है प्रदर्शित नीचे अनुपालन प्रेरितमायोसिन- द्वितीय सिकुड़ना 4,5,31 (चित्रा 3 सी) के विनियमन। इस प्रकार, HUVECs ईसीएम mechanosensing के माध्यम से उनके सेलुलर आकृति विज्ञान को विनियमित, और इस मीट्रिक टन गतिशीलता और Acto-मायोसिन सिकुड़ना के स्थानीय मॉडुलन के माध्यम से पूरा किया है।

क्योंकि HUVECs, रूपात्मक विशेषताओं का एक व्यापक विविधता के प्रदर्शन का क्रम शाखाओं में बंटी HUVEC को मापने के लिए यह पहली बार परिभाषित करने के लिए क्या एक branched फलाव है, और फिर कैसे एक branched फलाव निष्पक्ष मापा जाएगा परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक तकनीक एक चार कदम दृष्टिकोण है जिसके द्वारा एक सेल सीमा या "नकाब" हाथ एक सेल एक फ्लोरोसेंट मात्रा मार्कर सेल किनारों (चित्रा 3 डी) को परिभाषित करने के लिए व्यक्त की एक छवि का उपयोग करते हुए सेल के किनारों अनुरेखण द्वारा उत्पन्न होता है उपयोग करता है। मुखौटा पीढ़ी के बाद, शाखा मूल शाखाओं फलाव और सेल शरीर के बीच वक्रता की सबसे बड़ी कोण लगाने के द्वारा परिभाषित कर रहे हैं। एक लाइन dema के लिए तैयार हैआरके "शाखा मूल" (बैंगनी कोणीय लाइनों, चित्रा 3E)। शाखा संख्या एक परिभाषित शाखा मूल (चित्रा 3F) के साथ शाखाओं की संख्या की गणना करके बस मापा जाता है। शाखा लंबाई बाहर का शाखा टिप (चित्रा 3 जी) शाखा मूल से दूरी के रूप में मापा जाता है। डेटा विश्लेषण से छोटे lamellipodial अनुमानों के शामिल किए जाने से बचने के लिए अतिरिक्त कसौटी की आवश्यकता होती है कि शाखाओं अब ( "शाखा लंबाई") होना चाहिए की तुलना में वे व्यापक हैं ( "शाखा मूल" में), और है कि शाखाओं की लंबाई 5 में कम से कम दस माइक्रोन होना चाहिए 31।

चित्र तीन
। चित्रा 3: HUVEC शाखाओं में बंटी आकृति विज्ञान के विश्लेषण (ए - सी) HUVECs की डीआईसी छवि उदाहरण fibronectin लेपित गिलास ईसीएम (ए) कड़ी (55 किलो पास्कल) polyacrylamide ईसीएम (बी) और मुलायम पर संवर्धित (0.7केपीए) polyacrylamide ईसीएम (सी)। शाखाओं में नाटकीय रूप से 0.7 किलो पास्कल polyacrylamide ईसीएम (सी) पर संवर्धित HUVECs में वृद्धि हुई है stiffer ईसीएम (ए, बी) की तुलना में। (डी)। डीआईसी सूक्ष्म छवि (बाएं छवि) एक ट्रांसफ़ेक्ट HUVEC की एक Mapple-C1 सीडीएनए निर्माण व्यक्त (एक सेल मात्रा मार्कर, सही छवि)। (ई) वक्रता की सबसे बड़ी कोण लगाने के द्वारा शाखा मूल परिभाषित (स्थिति जहां झिल्ली सबसे बड़ी वक्रता को प्रदर्शित करता है यानी, बैंगनी रंग लाइनों) शाखा के दोनों तरफ और फिर एक सीधी रेखा के साथ कनेक्ट कोण (नीली लाइनों) । (एफ) को पहचानें और शाखाओं उभार कि "शाखा मूल" (ई में परिभाषित) से विस्तार> 10 माइक्रोन का चयन। branched उभार की संख्या की गणना प्राप्त करने के लिए "शाखा संख्या है।" (G) मो करने के लिए "शाखा मूल" के केंद्र से दूरी को मापनेशाखा एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर का एनोटेशन और माप आवेदन प्राप्त करने के लिए लाइन उपकरण का उपयोग कर के सेंट बाहर बिंदु "शाखा लंबाई।" स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संवेदन ईसीएम के अनुपालन के अलावा, HUVECs भी भावना और आसन्न सेलुलर संपर्क के रूप में खरोंच लोग घायल हो गए द्वारा प्रेरित के उन्मूलन का जवाब। पलायन परख में, HUVECs एक monolayer में संवर्धित एक खरोंच घाव के अधीन हैं और प्रवास विशेषताओं मापा जाता है (प्रोटोकॉल 9 देखते हैं, ऊपर)। Monolayer scratching द्वारा घाव के शामिल होने के बाद, घाव बढ़त HUVECs एक उत्क्षेपणशील अग्रणी बढ़त है कि घाव (चित्रा -4 ए, टी = 0 घंटा) में फैली विकसित करके फूट डालना। 10-12 घंटा की एक समय के पाठ्यक्रम पर, ध्रुवीकरण घाव बढ़त HUVECs घाव क्षेत्र में विस्थापित और भरनेघाव, एक नया मिला हुआ monolayer की स्थापना (चित्रा -4 ए, टी 11 मानव संसाधन =)। HUVEC शाखाओं में बंटी के साथ के रूप में, वर्तमान सबूत से पता चलता है कि ध्रुवीकरण और प्रवास गंभीर रूप मीट्रिक टन के समन्वित फिर से संगठन और actin cytoskeletons 43-49 पर निर्भर है। इस भाग में हासिल की है, अग्रणी धार पर MCAK प्रेरित मीट्रिक टन disassembly के स्थानीय निषेध के माध्यम से, लेकिन घाव बढ़त HUVECs 31 के अनुगामी किनारे पर नहीं। मीट्रिक टन गतिशीलता की संवेदनशीलता घाव प्रेरित ध्रुवीकरण Rac1 GTPase, जो सहित अरोड़ा-ए काइनेज कि phosphorylates और अग्रणी धार पर MCAK रोकता है, और अन्य kinases कि बाधा या सक्रिय करने के नक्शे के लिए सक्षम हैं कई बहाव के नियामक प्रोटीन, लक्ष्य द्वारा शुरू की है करने के लिए स्थानीय स्तर पर करने के लिए मीट्रिक टन विकास मिलाना और संकोचन 18,31,36,48,50-53। व्यापक प्रयोगात्मक सबूत धारणा है कि अग्रणी धार फलाव और अनुगामी किनारे संकुचन के समन्वय Rac1 सक्रियण के चक्र के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है का समर्थन करता हैअनुगामी किनारे पर Acto-मायोसिन सिकुड़ना करने के लिए अग्रणी धार पर मीट्रिक टन विधानसभा और RhoA सक्रियण को बढ़ावा देने के लिए, जिससे निर्देशित गतिशीलता 9,41,51,52,54-58 चला।

तिथि करने के लिए, वहाँ सेल प्रवास के स्वचालित ट्रैकिंग के प्रदर्शन के लिए एक स्थापित पद्धति नहीं है। यह computationally सेल ईसीएम सीमाओं कि लगातार घाव बढ़त कोशिकाओं फूट डालना और पलायन के रूप में बदल रहे हैं का विश्लेषण करने में कठिनाई का एक परिणाम है। जबकि कई सॉफ्टवेयर प्रोग्राम fluorescently लेबल कोशिकाओं 59-64 नज़र रखने में सक्षम हैं, fluorescently की आबादी घाव बढ़त पलायन प्रयोगों में HUVECs लेबल कुल HUVEC आबादी का लगभग 30-40% है, और इसलिए घाव बढ़त कोशिकाओं के बहुमत चाहिए चरण विपरीत या डीआईसी इमेजिंग द्वारा देखे जा। इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण है जब मापने घाव बढ़त प्रवास के क्रम में विशिष्ट पहचान करने के लिए एक ही घाव के भीतर फ्लोरोसेंट और गैर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं मूल्यांकन करने के लिएअभिव्यक्ति के प्रभाव को दोनों प्रयोगात्मक अध्ययन समूहों के भीतर और प्रयोगात्मक अध्ययन समूहों के बीच निर्माण करती है। वर्तमान में, सबसे अच्छा तरीका HUVEC प्रवास को मापने के लिए एक हाथ ट्रैकिंग दृष्टिकोण जिसमें एक घाव बढ़त सेल पहले की पहचान की है और उसके बाद नाभिक और न्यूक्लियस में पहचाने जाते हैं (चित्रा 4 बी) का उपयोग है। न्यूक्लियस इसकी उच्च प्रकाश बिखरने घनत्व और अपेक्षाकृत छोटे आकार की वजह से सेल ट्रैकिंग के लिए स्थिति निर्धारक के रूप में प्रयोग किया जाता है। न्यूक्लियस के इन दो सुविधाओं के लिए यह आसान पहचान करने और क्षेत्र में जो उपयोगकर्ता व्यक्ति ट्रैक की स्थिति जगह कर सकते हैं सीमित द्वारा माप त्रुटि को कम करने के लिए बनाते हैं। HUVEC प्रवास पटरियों तो लगातार समय चूक छवि फ्रेम में न्यूक्लियस पर क्लिक करके उत्पन्न कर रहे हैं। अंत में, पलायन वेग और उत्पत्ति के लिए प्रवास दूरी मापी और नियंत्रण और प्रयोगात्मक सेल समूह (चित्रा 4 बी) के लिए विश्लेषण कर रहे हैं।

चित्रा 4 चित्रा 4: घाव बढ़त HUVECs और प्रवास पर नज़र रखने के विश्लेषण से खरोंच घाव बढ़त HUVECs (उर्फ "प्रवासन परख") की एक 11 घंटा समय चूक इमेजिंग श्रृंखला के (ए) 20X चरण विपरीत छवियों।। घाव और पलायन की दिशा में पैनल टी = 0 घंटा संकेत कर रहे हैं। HUVECs घाव में घाव बढ़त और अग्रिम पार करने के लिए दिखाए जाते हैं, जब तक कोशिकाओं की एक monolayer का गठन किया है (टी = 3.5 मानव संसाधन - टी 11 मानव संसाधन =)। (बी) प्रवास परख समय चूक इमेजिंग के विश्लेषण के रूप में (ए में दिखाया गया है) पहली बार एक trackable घाव बढ़त सेल स्थान पर आधारित HUVEC की पहचान (यानी कोशिकाओं घाव के किनारे पर शारीरिक रूप से) और अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल (मैं करें.ई. की आवश्यकता है। ,) एक हरे घाव बढ़त कक्ष का चयन करें, तो प्रयोग GFP की अभिव्यक्ति शामिल है। चरण विपरीत छवि का उपयोग करना, नाभिक और न्यूक्लियस की पहचान। हाथ एक का उपयोग कर लगातार समय चूक छवियों में न्यूक्लियस ट्रैकएनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर में अंकन और माप आवेदन प्रवास वेग और मूल करने के लिए दूरी तय करने के लिए। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन (ए), 20 माइक्रोन (बी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

आकृति विज्ञान और प्रवासन प्रयोगों में HUVECs का उपयोग करना।
HUVECs भीतर मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता EB3 लेबल का लाइव सेल इमेजिंग आदेश मापने के लिए और मीट्रिक टन की वृद्धि और HUVEC आकृति विज्ञान में परिवर्तन, जैसे कि वे तो एक ईसीएम संकेत क्यू को सौंपा जा सकता मूल्यांकन करने के लिए उचित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल संस्कृति शर्तों की आवश्यकता है। HUVECs सेल आकार और गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। वे अत्यधिक fluorescently लेबल cDNAs साथ अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी हैं, वे दोनों घुलनशील और शारीरिक सिगनल संकेतों के जवाब में नाटकीय morphologies दिखा रहे हैं, और वे जब उचित सेल संस्कृति शर्तों 65-70 प्रदान की खुद को संवहनी ट्यूबों में व्यवस्थित करने की क्षमता बनाए रखने के लिए। ऐसे HUVECs के रूप में प्राथमिक सेल संस्कृतियों, ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और वे प्रयोग के दौरान सामान्य रूप से व्यवहार करेंगे कि सावधानी से निपटने और सेल बीतने संख्या की निगरानी की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, जब cytoskele की जांच के प्रयोगों का आयोजनटन और / या सेल आकृति विज्ञान, HUVECs दसवें सेल संस्कृति पारित होने से परे प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए के रूप में HUVECs आम तौर पर पंद्रह बीतने के बारह के आसपास गैर वर्दी morphologies प्रदर्शित करने के लिए शुरू करते हैं।

सेल घनत्व भी HUVEC स्वास्थ्य और प्रसार का एक महत्वपूर्ण नियामक है। HUVEC शाखाओं में बंटी जांच (प्रोटोकॉल 10.1-10.4, ऊपर देखें) आदेश कोशिकाओं उनके ईसीएम के साथ बातचीत करने के लिए भौतिक स्थान उपलब्ध कराने के लिए और शाखाओं उभार का विस्तार करने में अपेक्षाकृत कम घनत्व सेल संस्कृतियों का उपयोग करें। इसके विपरीत, घाव बढ़त प्रवासन अध्ययन में (प्रोटोकॉल 10.5-10.8 देखें), HUVECs लोग घायल हो गए करने से पहले एक monolayer में संस्कृति है। इस तरह, घाव बढ़त HUVECs एक अपेक्षाकृत संयुक्त राष्ट्र के branched आकृति विज्ञान प्रदर्शन के रूप में, अग्रणी धार उभार का विस्तार, और उनकी तत्काल पड़ोसियों के साथ सेल सेल बातचीत प्रदर्शनी के रूप में वे घाव में पलायन।

निरंतर और लिविंग HUVECs में ट्रैकिंग मीट्रिक टन गतिशीलता का लाभ।
डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई के लिए एक शानदार तरीका हैप्रयोगात्मक परिकल्पना है कि उच्च समय संकल्प के साथ confocal छवि स्पष्टता की आवश्यकता होती है परीक्षा। उचित कैमरा और लेजर मॉड्यूल के साथ, इस माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण कम उत्सर्जन प्रतिदीप्ति के प्रति संवेदनशील है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अन्य प्रकार की तुलना में कम photobleaching में सहायता कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण को भी अच्छी तरह से उच्च समय संकल्प इमेजिंग के लिए उदार के लिए अनुकूल के रूप में, EB3 लेबलिंग दृष्टिकोण का उपयोग मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के व्यापक माप पैदा विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म में के लिए आवश्यक है।

लेबलिंग की EB3 कार्यप्रणाली से बढ़ रही है जबकि मीट्रिक टन से अधिक सिरों fluorescently लेबलिंग लाख टन के अन्य तरीकों पर अलग फायदे हैं, यह भी अद्वितीय नुकसान है। उदाहरण के लिए, वहाँ है कि सक्रिय रूप से किसी भी समय पर नहीं बढ़ रहा है, दोनों disassembling लाख टन की आबादी और स्थिर, गैर गतिशील लाख टन 71-74 की आबादी सहित मीट्रिक टन सरणी के एक अनुपात है। EB3 लाख टन के इन दो आबादी लेबल नहीं होता औरइसलिए इन दो आबादी के योगदान की प्रयोगात्मक डेटा विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाएगा। पूरे मीट्रिक टन सरणी के मूल्यांकन के लिए वैकल्पिक तरीकों fluorescently लेबल tubulin, एमटीएस के सभी आबादी में शामिल किया गया और बढ़ रही है, सिकुड़ने की पहचान के लिए अनुमति देता है, और स्थिर लाख टन की अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, microtubule का आयोजन केंद्र (MTOC) के लिए सेल के केंद्र और आसन्न पास मीट्रिक टन सरणी, पूरे मीट्रिक टन सरणी लेबलिंग के अपेक्षाकृत उच्च घनत्व की वजह से मीट्रिक टन सिरों की छवि विश्लेषण प्रदर्शन में एक नुकसान यह है कि सेल के पास नहीं हैं बनाता है परिधि 75-77। जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन और फ्लोरोसेंट EB3 साथ टन के दो रंग सह-लेबलिंग का उपयोग कर प्रयोगों से पता चला है, गुणात्मक, कि tubulin लेबल लाख टन के विशाल बहुमत भी EB3 लेबल 78 हैं। इसके अतिरिक्त, वहाँ फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन के साथ लेबल लाख टन की स्वचालित ट्रैकिंग का एक कारगर तरीका नहीं किया गया है। यह है कि डेटा संग्रह का मतलबtion और फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं में मीट्रिक टन गतिशीलता का माप अलग-अलग लाख टन के हाथ पर नज़र रखने के लिए एक प्रक्रिया है कि त्रुटि प्रवण और थकाऊ की आवश्यकता होती है। नतीजतन, EB3 लेबल लाख टन की स्वचालित कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के रूप में यह कई प्रकार की कोशिकाओं के पार और प्रयोगात्मक शासनों 35,79 की एक किस्म के भीतर मीट्रिक टन गतिशीलता प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता मीट्रिक टन गतिशीलता को मापने के लिए पसंदीदा पद्धति बन गया है।

HUVEC आकृति विज्ञान और प्रवासन के लिए मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता जोड़ने।
एक cytoskeletal अन्वेषक के दृष्टिकोण से, plusTipTracker स्वचालित ट्रैकिंग विश्लेषण का एक अत्यंत उपयोगी अनुकूलन मापने के लिए और मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता में दोनों पूरे सेल और क्षेत्रीय परिवर्तन का मूल्यांकन करने की क्षमता है। आवश्यकता है एक सेल ध्रुवीकृत बनने के लिए दिशात्मक सेल प्रवास के लिए एक अनिवार्य पूर्वापेक्षा है। इस तरह, ध्रुवीकरण सिगनल संकेतों लंबे दिशात्मक सेल प्रवास 30,31,51,54,56,80,81 के लिए महत्वपूर्ण कारकों ड्राइविंग के रूप में जाना जाता है के रूप में 2,82-87 में वीईजीएफ़ क्यू की ओर मीट्रिक टन विकास को प्रेरित। इसके अतिरिक्त, ईसीएम के साथ शारीरिक बातचीत (उदाहरण के लिए, अनुपालन और dimensionality mechanosensing के लिए) के जवाब में, HUVECs उनकी मीट्रिक टन गतिशीलता स्थानीय स्तर को विनियमित करने के नक्शे शाखाओं उभार elongating भीतर मीट्रिक टन विकास को बढ़ावा देने से मिलाना है, और इस की दिशा में HUVEC प्रवास मार्गदर्शन करने के लिए कार्य करता है क्यू 5,31,88। इस प्रकार, बाह्य सिगनल संकेतों के जवाब में ध्रुवीकरण cytoskeletal गतिशीलता में स्थानीय परिवर्तन की प्रायोगिक मूल्यांकन के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला।

मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता (EB3 दृष्टिकोण का उपयोग) और HUVEC सेल प्रवास का एक साथ रहते सेल इमेजिंग क्योंकि लाख टन सेकंड के एक समय के पैमाने पर विकसित प्रदर्शन करने के लिए है, जबकि सेल आकृति विज्ञान और दिशात्मक प्रवास में परिवर्तन घंटे के समय के पैमाने पर होते हैं बेहद मुश्किल है। फिर भी दोनों प्रक्रियाओं परिचित Linke हैंघ। इसके अलावा, लगातार दूसरी बार पैमाने पर fluorescently लेबल EB3 के तेजी से इमेजिंग EB3 संकेत के photobleaching की ओर जाता है। EB3 (1-2 मिनट के अधिग्रहण श्रृंखला) हर 30 मिनट में सफल रहे हैं की छोटी इमेजिंग श्रृंखला का आयोजन करके इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए प्रयास करता है, लेकिन केवल कि EB3 का इष्टतम अभिव्यक्ति थी ईसीएस की एक छोटी संख्या में पूरा किया जा सकता है और कहा कि प्रतिकूल प्रदर्शित नहीं किया था बार-बार लेजर रोशनी से 5 प्रभाव।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि कैसे मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता सेल आकृति विज्ञान और प्रवास में परिवर्तन करने के लिए योगदान व्याख्याओं के लिए अनुमति देता है ब्याज (आरओआई) उपकरण 35 (प्रोटोकॉल 6.6 देखें) की plusTipTracker क्षेत्र है। इस पद्धति पूरे सेल मीट्रिक टन विकास के लिए उप-विभाजित उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों, जिसमें से मीट्रिक टन विकास पटरियों तो निकाले और विश्लेषण किया जा सकता है में होना करने के लिए पटरियों की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, बनाम सेल की "गैर शाखाओं" क्षेत्र "branched" की तुलना से पता चला है कि लाख टन बढ़ने की अधिक रोंनीच और गैर शाखाओं सेल परिधि 5 की तुलना में branched क्षेत्रों के भीतर और अधिक लगातार। ध्रुवीकृत घाव बढ़त HUVECs में अग्रणी धार और अनुगामी किनारे मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता की तुलना से पता चला है कि MCAK प्रेरित मीट्रिक टन disassembly के अग्रणी धार के भीतर विशेष रूप से हिचकते हैं, लेकिन नहीं अनुगामी किनारे। अग्रणी और HUVECs में बढ़त मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता Rac1 और / या MCAK के फोस्फोराइलेशन म्यूटेंट व्यक्त अनुगामी के क्षेत्रीय मूल्यांकन आगे से पता चला है कि अरोड़ा-ए काइनेज का Rac1 प्रेरित सक्रियण विशेष और स्थानीय स्तर पर HUVEC ध्रुवीकरण और दिशात्मक प्रवास ड्राइव करने के लिए अग्रणी धार के भीतर MCAK गतिविधि को रोकता है 31। इस प्रकार, मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता और शाखाओं उभार और / या घाव बढ़त HUVECs के अग्रणी धार के भीतर मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के क्षेत्रीय मूल्यांकन के स्वचालित ट्रैकिंग का संयोजन हमें HUVEC आकृति विज्ञान और प्रवास के लिए मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता से जोड़ने के लिए अनुमति दी गई है।

प्रोटोकॉल वर्णित तैयार बनाया गया हैंडी HUVEC संस्कृति और प्रायोगिक जांच के लिए एक आम तौर पर सीधा और अत्यधिक repeatable कार्यप्रणाली प्रदान करने के लिए। फिर भी, प्रोटोकॉल विवरण के कई जटिल और समय लेने वाली हैं, जो, बारी में, त्रुटियों या प्रयोगात्मक कार्यप्रणाली के संचालन में कठिनाइयों के लिए अवसर प्रदान करता है। हालांकि यह प्रोटोकॉल भर में संभावित समस्याओं का समाधान करने का प्रयास किया गया था, यहाँ संभावित समस्या है कि कम आम या अन्यथा कार्यप्रणाली प्रोटोकॉल के भीतर नोटों के रूप में संक्षिप्त कर रहे हैं के अतिरिक्त, विस्तृत समस्या निवारण प्रदान की जाती है।

polyacrylamide substrates के साथ कोटिंग coverslips (प्रोटोकॉल 2.2), एक आम समस्या यह है कि उठता है, कांच coverslips को सक्रिय करने के लिए कांच polyacrylamide युग्मन, polyacrylamide को सक्रिय करने, और फिर polyacrylamide के लिए ईसीएम युग्मन के जटिल प्रकृति से संबंधित। एक विशेष रूप से कठिन है और संभावित समस्याग्रस्त कदम Polya के प्रदर्शन के बाद फ़ाइब्रोनेक्टिन / polyacrylamide जेल पर HUVECs संवर्धन कर रहा है2 मिमी sulfo-SANPAH को crylamide लेपित coverslips (कदम 2.2.2.6, ऊपर)। यह इन substrates कि पर HUVECs संवर्धन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है Sulfo-SANPAH पूरी तरह से ईसीएम विकार निम्नलिखित प्रायोगिक प्रणाली से हटा दिया जाना। यह सबसे अच्छा DDH 2 हे के साथ धोने और रात में एक प्रकार के बरतन पर DDH 2 हे में coverslips incubating द्वारा पूरा किया जा सकता है। polyacrylamide ईसीएम पर संवर्धित कोशिकाओं जीवित नहीं है, या यदि व्यवहार्यता कम उम्मीद है, वृद्धि हुई है और फ़ाइब्रोनेक्टिन (कदम 2.2.2.9) के विकार के बाद sulfo-SANPAH की धुलाई दोहराया से सिफारिश की है संभवतः इस समस्या को कम करने के लिए।

प्रोटोकॉल 3 (सीडीएनए अभिकर्मक और एक coverslip पर HUVEC संस्कृति) से संबंधित है, electroporation प्रक्रिया की सफलता के लिए एक प्रमुख प्रभाव उन्हें प्लास्टिक की कुप्पी से दूर करने के लिए दोनों कोशिकाओं के trypsinization दौरान HUVECs की हैंडलिंग, और के समापन के बाद है electroporation (3.3-3.4 कदम, ऊपर)। यह ध्यान करने के लिए महत्वपूर्ण हैपूरी तरह से HUVECs पर नजर रखने, जबकि trypsin में, और समय कुप्पी (आमतौर पर 1-2 मिनट) की सतह पर 'राउंड अप "के लिए कोशिकाओं के लिए आवश्यक से अधिक नहीं। trypsin में अत्यधिक समय HUVEC मौत, जो आम तौर पर एहसास नहीं है जब तक कोशिकाओं fibronectin लेपित coverslips (3.4 कदम) पर चढ़ाया जाता है और फिर सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए असफल का एक प्रमुख कारण है।

समान महत्व की, HUVECs (और सबसे प्राथमिक प्रकार की कोशिकाओं) अच्छी तरह से जब electroporation बफर में लंबे समय के लिए निलंबित कर दिया किराया नहीं है। बड़े पैमाने पर प्रयोग के दौरान, उदाहरण के लिए, जहां उपयोगकर्ता पांच या उससे अधिक की स्थिति है कि electroporation की आवश्यकता होती है, तो यह बेहतर है एक-पर-एक-समय कोशिकाओं व्यक्ति ट्यूबों में pelleted (अभिकर्मक प्रति 1 ट्यूब) रखने के लिए और उन्हें मिश्रण करने के लिए है, , electroporation से पहले electroporation बफर तुरंत में। यह दृष्टिकोण electroporation बफर और अधिकतम HUVEC अस्तित्व में ऊष्मायन समय को कम करता है। इसके अतिरिक्त, पूरी संस्कृति मीडिया में तत्काल बचाव भी करोड़ हैitical निम्नलिखित electroporation। एक मिनट या अधिक electroporation निम्न में से बचाव देरी पूरा HUVEC मौत के पास में परिणाम कर सकते हैं और इस तरह से बचा जाना चाहिए।

संबंधित सेल प्रवास परख (प्रोटोकॉल 9), अत्यंत उच्च घनत्व पर HUVECs संवर्धन की तकनीक एक महत्वपूर्ण संशोधन पारंपरिक HUVEC सेल संस्कृति कार्यप्रणाली (प्रोटोकॉल 3 में वर्णित) के (कदम 9.2 में वर्णित) कि fibronectin लेपित coverslip के सूखने की आवश्यकता पर निर्भर करता है आदेश coverslip के एक बहुत छोटे से क्षेत्र में HUVEC संस्कृति सक्षम करने के लिए। अक्सर बार, अगर coverslip पूरी तरह से सूख नहीं है या यदि फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ coverslip की पूर्व कोटिंग (कदम 2.1 या 2.2) कुशल नहीं था, मीडिया युक्त कोशिकाओं है कि coverslip पर रखा गया है इसकी सतह तनाव कम है और करने के लिए विस्तार होगा coverslip के किनारों, जिससे coverslip पर कोशिकाओं के घनत्व को कम करने। इस संभावित समस्या के निवारण के लिए एक विधि coverslip से और फिर मीडिया aspirate करने के लिए है5-10 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट की पीठ में coverslip (अभी भी अपने 35 मिमी डिश में) जगह है। यह अनुकूलन पकवान सुखाने में सहायता करने के लिए कैबिनेट के भीतर हवा के प्रवाह को अनुमति देने के लिए मदद कर सकते हैं। किसी भी दृश्य तरल हवा सुखाने के बाद coverslip पर रहता है, तरल स्पॉट aspirate और फिर से जैव सुरक्षा कैबिनेट में 5-10 मिनट के लिए अतिरिक्त शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं। यह नोट करने के लिए कोई रास्ता पूरी तरह से इस संभावित समस्या से बचने के लिए है कि वहाँ महत्वपूर्ण है, लेकिन यह प्रोटोकॉल का बार-बार अभ्यास के साथ एक मुद्दे के कम हो जाता है। यह भी एक समस्या निवारण सिफारिश है कि जब सेल प्रवास परख (या किसी भी परख सामान्य रूप में,) के लिए coverslips की तैयारी, अतिरिक्त coverslips तैयार करने और अतिरिक्त HUVECs तैयार करने के लिए जाना जिस तरह से साथ समस्याओं के मामले में है।

मन में इन समस्या निवारण विचारों के साथ, यह भी प्रोटोकॉल पर चर्चा की और भविष्य कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में अपने प्रभाव की उपयोगिता पर प्रकाश डाला करने के लिए महत्वपूर्ण है। polyacr को प्रयोज्यताylamide दृष्टिकोण व्यापक है, और न केवल सेल ईसीएम सगाई (ऊपर वर्णित) के दो आयामी अध्ययन, लेकिन यह भी तीन आयामी जांच 5 शामिल हैं। यह आवेदन कैसे HUVECs सेल आकार और प्रवास को विनियमित शारीरिक वातावरण में की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है और जांचकर्ताओं को कैसे morphological परिवर्तन cytoskeletal परिवर्तन के साथ समन्वय कर रहे हैं की एक बुनियादी समझ प्रदान करना चाहिए। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता की माप पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, प्रोटोकॉल का बहुमत और सेल ईसीएम बातचीत के अन्य microscopically measureable पहलुओं के किसी भी संख्या को मापने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए सकता है। मीट्रिक टन गतिशीलता के लिए सम्मान के साथ, वहाँ kinesins 89 से कम से कम 14 परिवारों, HUVEC polarity और निर्देशित प्रवास करने के लिए योगदान करने में एक संभावित भूमिका के साथ एक, और सभी का जो प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग जांच की जा सकता सहित, कई नक्शे हैं।

भविष्य में जांच करना चाहिए एकLSO रोगग्रस्त राज्यों की तुलना में सामान्य में सेल ईसीएम सगाई पर लक्षित किया। यहाँ प्रस्तुत HUVEC प्रोटोकॉल सामान्य संवहनी होमियोस्टैटिक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए लागू है, साथ ही, हृदय रोग, रेटिनोपैथी, ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस सहित एक ही नाम के लिए रोग राज्यों के लिए कर रहे हैं। सूक्ष्म अध्ययन के साथ उत्तरदायी अनुपालन का दिख पारदर्शी ईसीएम और polyacrylamide substrates conjugating सेल ईसीएम सगाई की पढ़ाई के लिए अनुमति देगा कि इस तरह के endothelial सेल संवहनी angiogenesis उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ नजर रखी जा सकती है। प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के इन प्रकार के पहले से ही endothelial सेल आकार, polarity, प्रवास में महत्वपूर्ण मतभेद, और प्रोटीन है कि इन प्रक्रियाओं 5,31,90 विनियमित के प्रभाव को प्रकट करने के लिए शुरू कर दिया है। भविष्य प्रयासों कैसे ईसीएम अनुपालन और dimensionality mechanosensing के संयोजन स्थानीय स्तर पर नियंत्रण प्रोटीन है कि लक्ष्य और cytoskeletal गतिशीलता को विनियमित करने के लिए सेवा कर सकते हैं की पहचान करने का लक्ष्य रखना चाहिए।

Acknowledgments

plusTipTracker मीट्रिक टन विश्लेषण सॉफ्टवेयर को विकसित करने के लिए सदस्यता और विचार विमर्श, मिशेल बेयर्ड और माइक डेविडसन इन अध्ययनों में प्रयुक्त फ्लोरोसेंट सीडीएनए निर्माणों के कई प्रदान करने के लिए के लिए डॉ क्लेयर एम डांडी, और कैथरीन Applegate और Gaudenz Danuser लिए विशेष धन्यवाद। इस काम के हिस्से में समर्थन किया था, से KAM करने के लिए एक अनुदान द्वारा राष्ट्रीय हृदय फेफड़े और रक्त संस्थान (NHLBI) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच)। (अनुदान: 4K22HL113069)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
  2. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
  3. Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
  4. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
  5. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
  6. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
  7. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
  8. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
  9. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
  10. Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  12. Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
  13. Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
  14. van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
  15. Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
  16. Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
  17. Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
  18. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
  19. Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
  20. Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
  21. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
  22. Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
  23. Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
  24. Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
  25. Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
  26. Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
  27. Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
  28. Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
  29. Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
  30. Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
  31. Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
  32. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
  33. Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
  34. Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
  35. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
  36. Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
  37. Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
  38. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138 (2014).
  39. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13 (2001).
  40. Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
  41. Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
  42. Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
  43. Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
  44. Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
  45. Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
  46. Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
  47. Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
  48. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
  49. Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
  50. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
  51. Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
  52. Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
  53. Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
  54. Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
  55. Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
  56. Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
  57. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
  58. Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
  59. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
  60. Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
  61. Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
  62. Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266 (2013).
  63. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636 (2013).
  64. Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
  65. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
  66. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  67. Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
  68. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601 (2012).
  69. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
  70. Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
  71. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  72. Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
  73. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
  74. Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
  75. Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
  76. Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
  77. Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
  78. Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
  79. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  80. Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
  81. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
  82. Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
  83. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569 (2013).
  84. Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
  85. Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
  86. Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
  87. Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833 (2013).
  88. Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
  89. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  90. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 114 MCAK अरोड़ा Rac1 microtubule endothelial सेल angiogenesis electroporation प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लाइव सेल इमेजिंग
उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग और जीवित मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं में microtubule गतिशीलता की स्वचालित विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K.,… More

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K., Myers, K. A. High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (114), e54265, doi:10.3791/54265 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter