Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54265
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

Introduction

Angiogenes utlöses av extracellulära signalerings ledtrådar som främjar endotelceller (EC) för att polarisera, migrera med riktnings specificitet, och bilda nya kärl i vävnader som kräver blodtillförsel. Bidragande faktorer som tros driva angiogenes är signaler från den extracellulära matrisen (ECM). Som svar på fysiska signaler, EC förlänga nya kontor med riktnings specificitet för att styra riktad rörelse i bildandet av den vaskulära nätverket 1,2. Arkitekturen i EG-morfologi och förgrening definieras av lokal reglering av mikrotubuli (MT) cytoskelettet på ett sätt som är samordnad med regleringen av acto-myosin kontraktilitet 3. För EG grenar för att bilda måste myosin-II lokalt nedregleras, vilket resulterar i lokala membran utsprång 4. Samtidigt och på samma plats i cellen, blir MT tillväxtdynamik modifierade resulterar i långsam och ihållande MT tillväxt för att främja gren Elondighet och stabilitet 5. Detta samordnade cytoskelettala reglering tillåter EC att polarisera deras morfologi för att underlätta riktad migration.

Utvecklingen av en polariserad cellmorfologi kräver polariserat MT enheten 6. Migrera epitelceller, MT växer långsamt och ihärdigt särskilt vid den främre kanten av cellen 7-9; medan i neuroner, initiering och förlängning av axoner eller dendriter kräver att MT är inte bara närvarande, men att de är dynamiskt genomgå processerna för montering och demontering 10-15. På detta sätt, lokal kontroll över MT tillväxtdynamik bestämmer arkitekturen i cellen och möjliggör snabb ombyggnad av cellmorfologi som EC navigera genom sin ECM.

MT tillväxtdynamiken regleras av familjer av molekylära motorproteiner och icke-motorproteiner, benämnda mikrotubuli associerade proteiner eller mikrotubuli växelverkande proteiner (hädanefter Referred till kartor). Kartor kan lokalt aktiveras eller inaktiveras, vanligtvis via signaleringskaskader initierade vid cell ECM-gränssnittet 16,17 den. När aktiv, kartor funktion genom att binda till MT och förändra kinetiken för MT montering och demontering; därigenom fungerar lokalt reglera MT dynamik i syfte att främja cellform och polaritet 18-20. Mitotiska centromer Associated Kinesin (MCAK) är en Kinesin-13 familjen MAP som binds till MT ändar och par ATP hydrolys till MT demontering 21-23. Denna funktionella roll MCAK är känd för att vara kritisk i den mitotiska spindeln 24-28, samt under interfas 29,30. Inom inter EC är MCAK medierad MT demontering regleras genom lokaliserad Aurora-A-inducerad fosforylering av MCAK som svar på sår kant inducerad aktivering av RAC1 små GTPas. Resultatet av denna signalkaskad är hämningen av MCAK i framkant av EC, vilket resulterar i polariserat MT tillväxt mot leading kant och MCAK-inducerad MT demontering vid bakkanten att migrera EC 31.

Traditionella metoder för att mäta MT tillväxtdynamiken har vanligtvis används handen spårning av antingen fluorescensmärkt tubulin eller, mer nyligen, fluorescensmärkt MT end bindande protein 1 eller 3 (EB1 eller EB3 respektive). Den fluorescerande tubulin tillvägagångssätt har fördelen att märkning av hela MT array. Emellertid, därför att majoriteten av mitotiska celltyper bibehålla en radiell array med MTs under interfas 8,32,33, MTs nära centrosom är mycket tät, och som ett resultat, spårning MT tillväxt och demontering med fluorescerande tubulin är vanligen begränsad till den perifera regioner av cellen. På grund av dessa begränsningar, har användningen av fluorescensmärkta EB proteiner (EB1 eller EB3) varit vanligare metod för att mäta MT dynamik. Eftersom EBS endast märka de växande plus-ändarna av MTS, de verkar så liten (1-3 pm), ljust fluorescerande kommats, vilket ger en lätt urskiljbara markör för MT polymerisation med mycket begränsad bakgrundsfluorescens 34-37. Även det faktum att EBS etiketten endast en delmängd av MT arrayen representerar en stor styrka av EB tillvägagångssätt belyser också en viktig begränsning är att icke växande MT inte märkt av EB3 strategi. Ändå förmågan att mäta och följa EB3 kometer över tiden och att visualisera MT tillväxt inom undercellulära regioner gör denna metod idealisk för applikationer som kräver regionala utvärdering av MT organisation.

En annan kritisk begränsning av traditionella metoder för att mäta MT tillväxtdynamiken har varit mycket stora datamängder och den tid som krävs för dataanalys. Denna begränsning härrör från behovet av handen spårning av hundratals EB kometer med hög tidsupplösning. Dessutom är dessa mätningar måste göras på ett statistiskt signifikant antal celler och även utföras under en mängd olika kontroll och experimespecialist- villkor. Nyligen har dessa begränsningar övervunnits genom beräkningsanalystekniker specifikt riktade mot spårning EB3 kometer med time-lapse mikroskopi i levande celler 35. När det används på rätt sätt, tjänar detta beräknings förhållningssätt till både begränsar risken för mänskliga fel i samband med hand spårning förutom att ge en hög genomströmning metod för att mäta MT polymerisation. Beräknings analys av MT dynamik med hjälp av MatLab-baserad mjukvara, plusTipTracker, möjliggör mätningar av MT tillväxt genom att spåra fluorescensmärkta EB3 kometer 5,31,35,38. Dessutom ger plusTipTracker programvara för beräkningar av MT katastrofhändelser (aka demontering) baserat på försvinnandet av EB3 kometer inom en växande MT spår, och gör det möjligt att sub-cellulära (aka regionala) analys av MT tillväxtdynamiken inom användardefinierade områden av intresse . För våra studier var MT tillväxtdynamiken jämföras inomgrenade regioner jämfört med icke-grenade regioner eller inom ledande kontra bakre cellkanter. utdata från plusTipTracker programvara kan också användas för att generera färgkodade spår över för enskilda celler och sub-cellulära regioner.

Här beskriver vi den metod som används för att undersöka vilken roll MCAK modulera MT tillväxtdynamik och bidrag denna MT depolymerase till regleringen av EG förgrenings morfologi och riktad migration. Vår metod som används en primär human cellinje, Human navelvenendotelceller (HUVEC), som är lätt odlas och mycket mottagliga för elektroporering-inducerad, övergående transfektion av plasmid cDNA. Vi använde sedan med hög upplösning, time-lapse fluorescensmikroskopi av HUVEC transfekterade med MT end bindande protein 3 (EB3) och Mitotisk centromer Associated Kinesin (MCAK) -specifika cDNA konstruktioner för att utvärdera effekterna på MT dynamik transfekterade HUVEC. PlusTipTracker baserade beräknings bildanalys av EB3-märkt MT plus ändar var att mäta MT tillväxthastigheter och MT tillväxt livslängd i tidsförlopp bilder, för att mäta och jämföra effekterna av experimentella manipulationer på MT tillväxtdynamiken. Denna metod gör det möjligt att studera MT dynamik och identifiering av hur lokal reglering av MT dynamik inom sub-cellulära regioner bidrar till angiogena processer EG förgrening och migration. Dessa tekniker kan tillämpas på undersökningar av någon karta som kan fluorescerande och uttrycks i levande celler.

Protocol

1. HUVEC Kultur och underhåll

  1. Förbered komplett endotelceller basalmedium genom att lägga till hela innehållet i endotelcelltillväxt mediumsupplement paket och 5% penicillin / streptomycin antibiotika blandningen till fenolrött gratis endothelial basala media (se Material / utrustning lista för detaljer). Varm fullständig endotelial basalmedium till 37 ° C i ett vattenbad.
  2. Ta bort en HUVEC cryovial från lagrings flytande kväve och tina snabbt i ett 37 ° C vattenbad i två minuter. När ~ 80-90% tinas, tillsätt 500 pl värmas komplett endotelceller basalmedium till cryovial, blanda genom att pipettera och fördela celler jämnt i en 100 mm plastvävnadsodlingsskål innehållande 15 ml uppvärmd komplett endotelceller basalmedium.
  3. Placera cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Tillåta cellerna att vidhäfta över natten. Ta inte bort eller ändra cellodlingsmediet.
  4. När 100 mm skål är> 90% sammanflytande, överföra HUVEC into ett 75 cm 2 vävnadsodlingsbehandlade kolv och hålls kvar vid> 60% konfluens vid alla tidpunkter (se steg 1.5).
    Obs: När hålls vid en densitet> 60%, är HUVEC fördubbling tid genomgående 18-20 tim.
    1. För situationer där passage av cellerna är det inte nödvändigt (dvs. densiteten är <90%), aspirera mediet och ersätta med färskt fullständigt endoteliala basalmedium varje 48 h.
  5. När HUVEC nå> 90% sammanflödet, skölj 2 gånger med 10 ml 1 x PBS, och sedan ta bort cellerna från vävnadsodlingsplatta genom att behandla dem 1,5 ml 0,25% trypsin under 1-2 minuter vid 37 ° C. Anmärkning: Viabilitet av HUVEC-celler reduceras i hög grad genom att förlänga längden av trypsin exponering.
  6. Räddnings celler genom tillsats av 8,5 ml komplett endotelceller basalmedium till trypsin / HUVEC blandning i förhållandet 4: 1 endothelial basala media komplett: trypsin (minimal förhållande), och samlas i en 15 ml koniska rör.
  7. Centrifugera vid 1400 xg under 4 min. Aspirerasupernatanten.
  8. Återsuspendera pelleten i 2 ml komplett endothelial basalt medium och tillsätt cellerna till en ny 225 cm2 vävnadsodlingskolv innehållande 25 ml av komplett endothelial basal medium.

2. Cover Förberedelser Före HUVEC kultur

  1. Beläggning Täck med fibronektin underlag.
    1. Förbered pipig-ren 22 mm Antal 1,5 täck 39 och lagra vid rumstemperatur (RT) i 100% etanol.
    2. Använda en Bunsenbrännare att flamma ett täckglas och placera den i en 35 mm petriskål med användning av pincett.
    3. Förbered en fibronektin / PBS blandning genom att blanda 10 | il av fibronektin lager (1 mg / ml) med 990 ^ il PBS.
    4. Pipett 250 ul av fibronektin / PBS blandningen på täck i 35 mm skålen. Sprid jämnt för att täcka ytan av täckglas.
    5. Inkubera skålen under ett minimum av 3 h vid 37 ° C och skölj 3 gånger med 2 ml 1 x PBS före användning.
  2. täckglas Aktivering
    1. Placera en 22 mm Antal 1,5 täck i 50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane 10 minuter på en omrörningsplatta. Efter inkubation, tvätta 10 gånger under 2 minuter vardera i dubbeldestillerat H2O (DDH 2 O).
    2. Inkubera täckglas i 0,5% glutaraldehyd under 30 min på en omrörningsplatta. Efter inkubation, tvätta 10 gånger under 2 min i DDH 2 O.
  3. polyakrylamid Framställning
    1. Förbereda en PA-gel med en överensstämmelse 0,7 kilopascal (kPa) genom att tillsätta 3,75 ml av 40% akrylamid, 0,3 ml 2% bis-akrylamid, och 0,95 ml av DDH 2 O.
    2. Bered en 10% arbetslösning av ammoniumpersulfat (APS) och förvara på is fram till användning.
    3. För att förbereda PA lösningen för en täck (total volym = 166,7 pl), tillsätt 0,83 pl DDH 2 O, 41,7 pl av bis-akrylamid lösning (i steg 2.2.2.1), 124 pl 10% APS, och0,25 pl TEMED.
    4. Omedelbart pipett 15 ul av PA-lösning på en hydrofob glasskiva (se Reagens List) och täck med en aktiverad 22 mm Antal 1,5 täckglas. Göra det möjligt för PA polymerisera under 20 min vid RT.
    5. Ta bort täck och överför till en 35 mm maträtt. Tvätta 3 gånger med 2 ml 1 x PBS. Lagra för <2 veckor vid 4 ° C.
    6. Att binda fibronektin till polyakrylamidgelen, exponera polyakrylamid belagda täck till 2 mM sulfo-SANPAH med 7500 J av UV-ljus (254 nm). Skölj en gång med DDH 2 O.
    7. Förbered en fibronektin / PBS blandning genom att blanda 10 | il av fibronektin lager (1 mg / ml) med 990 ^ il PBS.
    8. Pipettera 250 ul av fibronektin / PBS blandningen på täckglas (er) i en 35 mm petriskål. Sprid jämnt för att täcka ytan av täckglas.
    9. Inkubera skålen under ett minimum av 3 h vid 37 ° C och skölj 3 gånger med 2 ml 1 x PBS före användning.
class = "jove_title"> 3. cDNA transfektion och HUVEC Kultur på Cover

  1. Utför steg 1,5-1,6.
  2. Med hjälp av en hemocytometer, räkna antalet celler och samla en volym innehållande 100.000 celler / täck (för icke-migrations experiment) eller 500.000 celler / täckglas (för migrations experiment). Pellets cellerna via centrifugering vid 1400 x g under 4 min.
    Obs: Migration protokoll beskrivs i avsnitt 9 nedan.
  3. Resuspendera cellerna som skall transfekteras med 100 | j, l elektroporation buffert. Kombinera med 1 mikrogram cDNA och placera i elektroporationskyvett. Electroporate celler: DNA-blandningen med hjälp av program som utsetts för HUVEC elektroporering (t.ex. program #: A-034).
  4. Rescue transfekterade celler med 500 mikroliter komplett endotelceller basalmedium och platt celler på ett fibronektin-belagda 22 mm Antal 1,5 täck (se protokoll 2.1 ovan). Inkubera vid 37 ° C under 3-4 h för att ge tid för expression av cDNA-konstruktioner.
le "> 4. Beredning av prover för Imaging

  1. Skär dubbelhäftande tejp i 2,5 cm x 0,65 cm remsor.
  2. Skaffa en ren glasskiva. Ta två remsor av dubbelsidig tejp och säkra dem horisontellt längs den övre och nedre kanten av bilden. OBS: Det är viktigt att tillåta en liten mängd utrymme mellan tejpen och glidkant för tätning av kammaren såsom beskrivs i steg 4.5).
  3. Mount täck (från steg 3,4, cell nedåt) så att 2 kanterna på täck vila på bandet. Använd pincett för att trycka ner försiktigt för att säkra täck.
  4. Med hjälp av en mikropipett, tillsätt 40 pl bildalstringsmedium (komplett endotelceller basalmedium kompletterat med 25 ^ M HEPES) mellan täck och bild. Säkerställa att utrymmet mellan täckglas och objektglas är helt fylld med bildalstringsmediumet. Aspirera överskott bildalstringsmediumet (vid behov).
  5. Täta alla kanter med varm valap (1: 1: 1 vaselin: lanolin: paraffin). Kontrollera om läckage genom att trycka gently på glaset täckglas.
  6. Placera monterad och tätad täckglas på förvärmda (37 ° C) mikroskop scenen.

5. Mikroskopi

  1. Med hjälp av en snurrande skiva konfokalmikroskop utrustad med en 60X, 1,40 numeriska bländaröppningen (NA) Differential Interference Contrast (DIC) oljeimmersionsobjektiv, ett automatiserat fokus övervakningssystem (PFS), elektronisk slutare för överförd belysning, motored en X-och Y stadium, bandpassfilter inrymda i en elektronisk filterhjul, och en monolitisk laser kombinerarmodulen, fokusera mikroskopet vid gränsytan av cellen / täckglas och använda mikroskop scenen joystick för att lokalisera en enda cell.
  2. Klicka på "Kamerainställningar" panel i bildprogrammet. Inom "exponeringstiden" rullgardinsfönster panelen kamerainställningar, välj 400 ms.
    Anmärkning: Exponeringstider kan variera och bör bestämmas empiriskt.
  3. Klicka på "ND Acquisition" panel ibildbehandlingsprogram program. Inom fliken lambda (λ) av ND Acquisition panelen, klicka på kryssrutorna för att välja de 488 och 561 nm lasrar. Inom "tid" fliken ND Acquisition panelen ställer förvärvet tiden till 2 sekunder och den totala tiden till 2 min.
  4. Klicka på "Kör nu" -knappen i ND Acquisition panelen att förvärva en 2 min time-lapse bildsekvens på 2 sek förvärvsintervaller med hjälp av en 400 ms exponeringstid för både 488- och 561 nm belysning.
  5. I "Optisk Config" panel av bildprogrammet och använda kamerainställningar som beskrivs i steg 5,2, klicka på 405 nm laser knappen och klicka sedan på "Hämta" för att fånga en enda bild av blått fluorescerande protein (BFP) -märkta proteiner .
    Obs: Det är i allmänhet tillrådligt att begränsa cellexponering (frekvens av fotografering och / eller exponeringstid) till 405 nm laserbelysning som denna våglängd kan skada cellerna över tiden.
    1. För MCAK-shRNA studier, encquire en enda 405 nm bilden för att kontrollera expressionen av BFP-märkta shRNA.
  6. I "Optisk Config" panel av bildprogrammet och använda kamerainställningar som beskrivs i steg 5,2, klicka på DIC-knappen och klicka sedan på "Hämta" för att fånga en enda DIC bild av cellen för förgrening bildanalys (se avsnitt 10 , Nedan).
  7. Följande bild förvärv, använd "ljusstyrka / kontrast" -funktionen i bilden program att digitalt öka bildsignalen.
  8. Exportera ljusstyrka och kontrast justerade bilder. Klicka på "File" och klicka sedan på "Spara som" markera ".tif" för den typ bildfil.
    Obs: Detta genererar typiskt 61 TIF bildfiler från en enda 2 min time-lapse förvärv när fångas som beskrivs i steg 5,4.

6. MT Dynamics Analys

  1. För EB3 spårning använder plusTipTracker programvara 35, en öppen källkod,MatLab-baserade beräknings programpaket avsedd för automatisk detektering, spårning, analys och visualisering av fluorescerande EBS.
  2. plusTipGetTracks grafiskt användargränssnitt (GUI)
    1. För att komma åt plusTipGetTracks GUI, typ plusTipGetTracks.
    2. För EB3 komet upptäckt, använder det grafiska gränssnittet för att bläddra och välja den överordnade katalogen som innehåller .tif bilder.
    3. Inom spårningsparametrar panel plusTipGetTracks GUI, ange följande värden: Sök Range Radius = 5-10; Minsta Sub-Track Längd = 3; Max Gap Length (Frames) = 12; Max Krympning Factor = 1,0; Maximal vinkel Framåt = 25; Maximal vinkel bakåt = 10; Fluktuationer Radius (bildpunkter) = 2; Bildhastighet (sek) = 2; Pixelstorlek (^ m) = 110.
      Obs: Kontrollera först för optimala spårningsparametrar med hjälp av plusTipParamSweepGUI på ett representativt urval av .tif bildfiler. Det angivna värdet för pixelstorleken är specifik för objektiv som används för att förvärva tidsförlopp bilds (se steg 5,1-5,2, ovan).
    4. För Region of Interest (ROI) val, skapa binära masker av hela cellen genom att manuellt spåra cellkanten med hjälp av DIC bilden av cellen för att bilda en polygon.
    5. För delregion of Interest (sub-ROI) val, skapa främre och bakre kantmasker genom att manuellt dra en två poäng tjock linje över såret kant cell av intresse med hjälp av en modifierad plusTipTracker under ROI markeringsverktyg.
      Obs: Linjen ska dras parallellt med sårkanten i den position där cellen av intresse sträcker sig längre än grann sår-kantceller 31.
  3. plusTipSeeTracks GUI
    1. Kontrollera och visuellt inspektera spåröver av .tif bilder som lagrats i "ROI" mappen genom att klicka på "Rita Spår" -knappen i spåröverlägg kolumnen. Upprepa för alla spåröverlägg.
    2. Utföra datagrupp genom att klicka på knappen "Skapa grupper" i kolumnen valfria inställningar. Välj experimental data som hör till samma datamängd genom att klicka på datafiler. Spara valet genom att ge "grupp", ett namn som lätt kan identifieras (till exempel "kontrollgruppen").
    3. För under ROI MT tillväxtdynamik mätningar anger det minsta antalet bildrutor att en EB3 komet spår måste detekteras inom under ROI för att kvalificera sig som ett "spår" och extrahera MT tillväxt utflykter i den främre och bakre kanten ROI genom att klicka på "manuellt val" inom "Sub-ROI" panel av det grafiska gränssnittet.
      Obs: Använd till exempel 3 bilder (6 sek) som den lägsta detektions längd extraheras som ett "spår". Extraherade spår från under ROI lagras i en mapp delprojekt inom den ursprungliga ROI mapp för varje cell.
    4. MT tillväxt sub-spår och subpopulationen analys
      1. Beräkna medelvärdet MT tillväxthastighet och menar MT tillväxt livstid för "grupp" dataset (se steg 6.3.2) för varje ROI (se step 6.2.4), och för varje under ROI (se steg 6.2.5).
    5. Inom Quadrant Scatter Tomter kolumnen i plusTipSeeTracks GUI, klicka på "Välj grupper" och klicka på grupperna (skapade i steg 6.3.2) som ska jämföras.
      1. Välj "Tillväxt hastighet" för x-axeln alternativ och skriv medelvärdet för tillväxt hastighet (från steg 6.3.4) i rutan. Välj "Tillväxt livstid" för y-axeln alternativ och skriv medelvärdet för tillväxt livstid (från steg 6.3.4) i rutan.
    6. Markera kryssrutan bredvid "Ta bort spår på start / slut" och bredvid "Batch process Groups." Klicka på "Gör Tomter" för att generera en fördelningsprofil för MT tillväxtspår för hela cellen, framkanter och bakkanter sub-ROI.
      Obs: För studier som beskrivs här, är MT tillväxtspår fördelas i fyra subpopulationer: långsam och kortvarig, långsam och långlivade, snabb och kortlivade, och snabb och långlivat.
    7. Klicka på "Data" och sedan klicka på "Data Analysis" från datalistfönstret. Välj "t-test: två prov under antagande lika varianser" att jämföra betyda MT tillväxthastigheter och MT tillväxt livslängd. Markera dataceller i kalkylbladet där t-test jämförelser resulterar i ett p-värde <0,001.

7. colocalization Analys

  1. För bakgrunds subtraktion, med hjälp av "linjeverktyget" av bildvisningsprogram, rita en region av intresse (ROI) genom att klicka på skärmen för att skapa en kvadratisk form som är 10 mikrometer två på den gröna kanalen bild (488 nm excitation) vid ett läge där det inte finns någon cell fluorescens (bakgrunden). Upprepa detta för den röda kanalen bilden (561 nm excitation) med hjälp av bilder från steg 5,8.
  2. Med hjälp av bildprogram program, högerklicka på ROI från steg 7,1 och välj "Använd som bakgrund ROI." Klicka på "Bild" och sedan klicka på "subtrahera bakgrund" från rullgardinsfönstret för att subtrahera de genomsnittliga bakgrundsvärdena (från steg 7,1) från hela bild. Utför bakgrund subtraktion för celler som samuttrycker Em-Aurora A och antingen mCherry-MCAK, Mapple-EB3 eller Mapple-tubulin.
  3. I bakgrunden subtraheras röda kanalen bilden, klicka på den binära band och välj "Definiera Threshold" och välj sedan "per kanal" -funktion för att utesluta den utsedda fluorescerande markör.
    Obs! Tröskelsteg utfördes på antingen mCherry-MCAK, Mapple-EB3 eller Mapple-tubulin bilden för att göra det möjligt att rita linjer som är särskilt markerade i tröskel föremål för samlokalisering analys (se steg 7,4).
  4. Använda linjeverktyget i bildbehandlingsprogram, dra en två-punkt tjock linje över de uteslutna objekt i tröskel bilden.
  5. Välj linjeobjekt som dras i steg 7,4. Kopiera och klistra in linjeobjekt från den röda kanalen på dess motsvarande gröna kanalen (Em-Aurora A) bild.
  6. Mät gråskala pixelintensitetsvärdena under linjeobjekt för att beräkna samlokalisering och totalt Em-Aurora-A-värden för varje enskild cell genom att välja "Measure" och sedan "Intensity profil" från rullgardinsfönster i bildvisningsprogram.
    1. Organisera data av experimentell behandling och sub-cellulär region genom att exportera till ett kalkylprogrammet och spara filen som typ .xls (till exempel "control_grayscale_intensity.xls").
      Notera: Data som presenteras på detta sätt representerar samlokaliseringen fraktionen av totalt uppmätt Em-Aurora-A per sub-cellulär region.
  7. Med hjälp av mätvärdena från steg 7,6, upprepa steg 6.3.7 att beräkna statistisk signifikans med användning av p <0,05 som cutoff för betydelse.
  1. Fix celler (se steg 3,4) med paraformaldehyd / glutaraldehyd co-extraktion / fixering buffert (PGF-PHEM; 4% paraformaldehyd, 0,15% glutaraldehyd, 0,2% tvättmedel i 60 mM PIPES, 27,3 mM HEPES, 10 mM EGTA, och 8,2 mM MgSO 4, pH 7,0) under 10 min vid RT.
  2. Skölj 3 gånger under 5 min med 2 ml av 1 x PBS.
  3. Behandla 2 gånger i 15 min med 0,01 g / ml NaBH4 i 1 x PBS för att släcka reaktiva aldehyder.
    Obs: NaBH4 bildar bubblor som kan orsaka täck att flyta. Det är viktigt att täck förblir nedsänkt under dessa inkubationer. Om täckglas börjar flyta, använda pincett för att lyfta en kant av täckglas för att tillåta bubblorna att fly.
  4. Skölj 2 gånger med 1 x PBS innan blockering med 5% fettfri mjölk i 1 x PBS på en gungande plattform under 1 h vid RT.
  5. Inkubera cellerna i primära antikroppar (kanin anti-pT288-Aurora A (1: 1000)) och rått-anti-α-tubulin (1: 500) framställd i 1 x PBS-lösning. Inkubera vid 4 ° C på en gungande plattform över natten.
  6. Avlägsna primära antikroppar och skölj 3 gånger under 5 minuter i 1 x PBS före inkubering med sekundära antikroppar (åsne-anti-kanin (1: 1000) och get-anti-råtta (1: 1000)) framställd i 5% fettfri mjölk under 2 timmar vid 37 ° C.
  7. Montera täck på en glasskiva i fluorescens-optimerade monteringsmedel. Täta täck kanterna på glaset med hjälp av genomskinligt nagellack, och förvara i mörker vid 4 ° C.

9. Cell Migration Assay

  1. Utför HUVEC kultur för migrationsanalyser som beskrivits ovan (Protokoll 3: cDNA transfektion och HUVEC Kultur på Cover, steg från 3,2 till 3,3).
  2. Efter cell transfektion, räddnings transfekterade celler med 80 pl komplett endotelceller basalmedium. Pipettera provet 80 | il som en enda droppe på mitten av en torkad fibronektin-belagda 22-mm rund nr 1,5 täckglas. Inte sprida 80 pl dros. Inkubera vid 37 ° C under 3-4 timmar för att ge tid för cellvidhäftning till ett sammanhängande monoskikt.
    Notera: Torkning av täckglas är nödvändiga för att förhindra 80 l droppe från att spridas vid kontakt av täckglas. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för HUVEC att koncentreras inom ett litet område av täckglas och därigenom främjar den snabba bildningen av ett sammanflytande monoskikt av celler.
  3. Skölj 2 gånger i fullständigt endotelceller basalmedium för att avlägsna icke-bundna celler.
  4. Att skapa en "sårkanten" skrapa täck med en steriliserad rakblad genom att försiktigt dra en ren rakblad över HUVEC monolager (från steg 9,2). Håll täck försiktigt på plats med pincett för att förhindra glidning av rakbladet under skrapning.
  5. Tillåta cellerna att återhämta sig i en 37 ° C inkubator under 3 h. Montera och montera täck (s) för avbildning (se protokoll nr 4).
  6. Förvärva faskontrast och 488 nm bilder med 10 minuters intervall under 12 h på mikroskopet med hjälp av en10x 0,45 NA fas objektiv och en 0,52 NA LWD kondensor med "ND Acquisition" panel av bilden förvärvet programvara (beskrivs i steg 5,3).

10. Kvantifiering av HUVEC förgrening och migration

  1. För förgrening analys och för att möjliggöra även cell belysning och opartisk kvantifiering, förvärva en mikroskopisk bild av en HUVEC transfekterad (se steg 3,3) och uttrycker Mapple-C1 cDNA-konstruktionen, en cellvolym markör.
  2. Med hjälp av bildvisningsprogram öppnar Mapple-C1 bild och märka position på båda sidor om den gren där membranet visar den största vinkeln radie. Anslut dessa två punkter med en rak linje. Denna linje är "grenen ursprung."
  3. Använda linjeverktyget i bildprogram, visuellt identifiera grenar som mäter> 10 mikrometer i längd från "grenen ursprung" bestäms i steg 10.2. Beräkna grenlängd genom att mäta avståndet från the "gren ursprung" till den mest distala punkten i grenen spets (se Figur 4).
  4. Räkna antalet förgrenade utsprång som mäter> 10 mikrometer i längd för att erhålla "cell gren nummer."
  5. För migrering analys, med hjälp av bilderna som samlats in i steg 9,6, visuellt identifiera ett sår kant HUVEC baserat på fysisk plats (det vill säga celler fysiskt vid kanten av såret) och uttrycksprofil (dvs att välja en grön sårkanten cell om försöket innebär uttryck av GFP).
  6. Använda fas-kontrastrika bilder i cellen, visuellt identifiera kärnan (den halvgenomskinliga sfärisk struktur nära mitten av cellen), och sedan visuellt identifiera kärnsystemet (en liten, mörk, sfärisk struktur i kärnan) på den första tidpunkten för tidsförlopp bilder. Klicka på positionen för kärnsystemet att märka x och y-koordinater i kärnsystemet.
  7. Med hjälp av bildhanteringsprogram, hand spårakärnsystemet i successiva tidsförlopp bilder genom att klicka på läget för kärnsystemet att märka x och y-koordinater för kärnsystemet i varje ram av time-lapse film (Figur 4).
  8. Med hjälp av bildbehandlingsprogram, klicka på "Arkiv" och sedan klicka på Spara som "markera bildens filtyp" .xls. "
  9. Öppna handspårnings datafil (från steg 10,8) med en kalkylprogrammet. Beräkna medelmigrationshastighet och menar migrationsavstånd till ursprunget.
  10. Med hjälp av ett kalkylprogram program, klicka på "Data", klicka sedan på "Data Analysis" från rullgardinsfönstret Data. Välj Bonferroni-korrigerad, envägs variansanalys test med> 95% förtroende som cutoff för statistisk signifikans.

Representative Results

HUVEC kultur för live-cell mikroskopi
Live-cell imaging av HUVEC uttrycker fluorescerande proteiner kräver att HUVEC hålls i en miljö som är lämplig för normal celltillväxt och underhåll, samt normal proteinuttryck och funktion. Figur 1 visar en schematisk avbildning av det protokoll som används för att framställa ett buffrat och slutet system som upprätthåller optimerat optiska egenskaper för att samla in tidsförlopp bilder av levande celler. Tunna remsor av dubbelsidig tejp placeras på ett objektglas (Figur 1A) och sedan täckglas innehållande den odlade HUVEC-celler är inverterad på toppen av tejpen så att cellerna är vända mot sliden (Figur 1B). På detta sätt, ger bandet ett litet gap mellan de två glasytor, och skapar ett utrymme i vilket cellerna kan badas i lämpligt cellodlingsmedium (Figur 1C; se protokoll 4, ovan). jagna sista steget, är glastäck förseglas till objektglaset med hjälp av en vaselin: lanolin: paraffinvax (1: 1: 1 blandning, valap, figur 1D) att upprätta ett slutet system. Denna cellkultur användes för både kortare tidssekvens avbildning av EB3 kometer och för längre tidssekvens förgrening och migrations experiment. Dessutom, det vaxliknande konsistens valap möjliggör enkelt avlägsnande från glasskivan och täckglas vid slutet av en avbildande experimentera så att kompletterande metoder, bland annat fixering och inmärkning (se protokoll 8), kan utföras på samma täckglas och cellprov som visualiserades med hjälp av live-cell avbildningsteknik.

Figur 1
Figur 1:. Metodik HUVEC kultur för live-cell mikroskopisk avbildning (A) Klipp 2 bitar av dubbelhäftande tejp i 0,65 cm x 2.50 cm rektangulära remsor och säkra en bit dubbelhäftande tejp horisontellt längs den övre kanten av bilden, och den andra delen, längs den nedre kanten av bilden. Det är viktigt att tillåta en liten mängd utrymme mellan tejpen och glidkant för tätning av kammaren såsom beskrivits i (D). (B) Använd pincett bort täck innehåller HUVEC och invertera täck (cell nedåt) ovanpå tejpbitarna. (C) med hjälp av en mikropipett, tillsätt 40 pl imaging media (komplett endotelceller basalmedium kompletterat med 25 ^ M HEPES) mellan täck och glasskiva. Säkerställa att utrymmet mellan täckglas och objektglas är helt fylld med bildgivande medier och undvika bubblor. Använda en aspirator längs kanten av täckglas för att avlägsna överskott medier, om så är nödvändigt. (D) Använd varmt valap (1: 1: 1 vaselin: lanolin: paraffin) för att täta runt kanterna på täckglas. Kontrollera om läckage imaging medias genom att trycka runt försiktigt på täckglas. Använd ytterligare valap att åtgärda. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Automatiserad spårning av fluorescensmärkt EB3 möjliggör omfattande analys av hela cellen och regionala MT tillväxtdynamiken. Insamlingen av tydliga, distinkta, och mycket tid och rymd lösas mikroskopiska bilder av EB3 protein är viktigt för analysen av EB3 rörelser i cellen. HUVEC expression av fluorescensmärkt EB3 varierar kraftigt från cell till cell och fluorescensintensiteten ökar typiskt inom samma cell under en period av timmar. Därför är det viktigt att beakta och övervaka dessa förändringar i uttrycksprofilen för att identifiera potentiella effekter av ökad EB uttryck på MT tillväxtdynamiken. Detta uppnås bäst genom att utvärdera gråskala fluorescens intensity profiler för varje avbildas cell, och sedan begränsa dataanalys till de celler som uppvisar ett definierat område av grå skala uttrycksprofiler. Första utvärdering av uttrycksprofilen dataset är kritisk, och skall jämföras med MT tillväxtdynamiken data som erhållits genom plusTipTracker programvara för varje cell. Expressionsprofiler kan plottas mot MT tillväxthastighet och MT tillväxt livstid för varje cell inom en experimentell grupp, i syfte att bestämma det önskade området av gråskalan expression och för att identifiera potentiella extremvärden.

Figur 2 belyser en HUVEC odlades på en fibronektin substrat (se protokoll 2.1 ovan) och uttrycka nära optimala nivåer av Mapple-märkt EB3. Fluorescerande EB3 kometer visas i en time-lapse serie bilder under en period av 12 sekunder (Figur 2A). Analys av EB3 kometer hjälp plusTipTracker programvara innebär en automatiserad, bildruta för bildruta EB3 komet detection (gröna och gula prickar, Figur 2B). Kometer upptäckts inom varje ram länkas sedan, beroende på deras lägesändring från ram till ram, för att generera EB3 spår och en visuell EB3 spår overlay (Figur 2C-F). Spår över är färgkodade och färgskillnader kan bestämmas av parametrar som anges av användaren. Vanligtvis dessa distinktioner använder globala medelvärdet av MT tillväxthastighet och MT tillväxt livstid 5,31 och därmed dela data i fyra grupper: långsam och kortvarig (röd), långsamma och långlivade (gul), snabba och korta levde (grön), och snabb och långlivat MT tillväxt (blå, figur 2G). PlusTipTracker-medierad spårning av EB3-märkt MT tillväxtdynamik möjliggör också användardefinierade områden av intresse (ROI). PlusTipTracker extraherar data MT tillväxt spår inifrån användardefinierade ROI (Figur 2A, B och F), vilket möjliggör jämförelser av MT tillväxt Dynamics inom olika regioner i samma cell.

figur 2
Figur 2: EB3 komet upptäckt, spårning och plusTipTracker datautgång (A) time-lapse film av en HUVEC uttrycker mapple EB3.. Vänstra panelen visar en hel cell vy och hela cell mask (vit linje) demarking cellgränserna. Röda rutan representerar den zoomade område som visas i tidsförlopp bilder (höger paneler). Höger sida visar rå gråskala time-lapse bilder av EB3 kometer i successiva avbildningsramar (t = 0 sek - t = 12 sek). (B) plusTipTracker detektering av EB3 kometer från bilderna i (A). Vänstra panelen visar en hel cell vy upptäckta kometer (gula prickar). Röda rutan representerar den zoomade område som visas i tidsförlopp bilder (höger paneler). Höger sida markera fem detekterade EB3 kometer (röda pilar) och spåra de fem kometer under 12 sek bildbehandling period. Grön prickar representerar upptäckt EB3 kometer som inte existerar (eller inte upptäckts) i det föregående tidsintervallet. (C) Maximal intensitet projektion av 61 ramar (2 min film) av EB3 kometer som visas i (A). (D) plusTipTracker MT spåröverlagring av samma 61 ramar (2 min film) som visas i (C). (E) Zoom av maximal intensitet projektion (röd ruta i C). (F) Zoom av plusTipTracker MT spårlagring av maximal intensitet projektion (röd ruta i D). (G) Färgkodade legend för spåröverlägg som visas i (D) och (F). Beteckning som långsam, snabb, kortvarig eller långlivat baseras på medelvärdet för alla tillväxtspår som uppmätts i en grupp av tio Mapple-EB3 uttrycker HUVEC. För enklare visualisering, är spår överlägg i (D) och (F) som alstras med användning av inverterade pixelintensiteter i cellen bilden som visas i (A). Skalstrecken = 20 | im./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

HUVEC förgrening och migrationsmönster är känsliga för mekanisk-fysiska signaler från ECM.

HUVECs är väl kända att svara på olika typer av signalerings cues och, i att göra så, att genomgå morfologiska förändringar som dikterar ett lämpligt cellulärt svar på den speciella signalerings cue (er) 36,40-42. HUVEC odlades på fibronektin belagt glassubstrat (figur 3a), eller på styva två-dimensionella polyakrylamid ECM (55 kPa) för att visa normalt en runda eller avlånga morfologi med några distinkta grenade utsprång (Figur 3B). Men när de odlas på mycket mjuka två-dimensionella polyakrylamid ECM (0,7 kPa), HUVEC visar en starkt förgrenad morfologi som är känd för att resultera från efterlevnaden-inducerad nedreglering av myosin-II kontraktilitet 4,5,31 (Figur 3C). Således HUVEC reglerar deras cellulära morfologi genom ECM mechanosensing, och detta sker genom lokal modulering av MT dynamik och acto-myosin kontraktilitet.

Eftersom HUVECs visa ett brett utbud av morfologiska attribut, för att mäta HUVEC förgrening är det viktigt att först definiera vad en förgrenad utsprång är, och sedan för att definiera hur en förgrenad utskjutande kommer att mätas objektivt. En teknik använder en metod i fyra steg, genom vilken en cellgräns eller "mask" genereras hand spåra kanterna i cellen med hjälp av en bild av en cell som uttrycker en fluorescerande volym markör för att definiera cellkanterna (Figur 3D). Efter mask generation, är gren ursprung definieras genom att placera största vinkel av krökning mellan den grenade utsprånget och cellkroppen. En linje dras för att demark den "gren ursprung" (lila vinklade linjer, Figur 3E). Gren nummer mäts helt enkelt genom att räkna antalet kontor med en definierad gren ursprung (figur 3F). Grenlängd mäts som avståndet från grenen ursprunget till den distala grenen spetsen (figur 3G). För att undvika införandet av små lamellipodial prognoser från dataanalys, ytterligare kriterium kräver att grenar måste vara längre ( "grenlängd") än de är breda (i "grenen ursprung"), och att grenar måste vara minst tio mikrometer i längd 5 , 31.

Figur 3
Fig. 3: Analys av HUVEC förgrenings morfologi (A - C) DIC bild exempel på HUVEC odlades på fibronektin belagt glas ECM (A) styva (55 kPa) polyakrylamid ECM (B) och mjuka (0,7kPa) polyakrylamid ECM (C). Förgrening ökat dramatiskt i HUVEC odlades på 0,7 kPa polyakrylamid ECM (C) jämfört med styvare ECM (A, B). (D). DIC mikroskopisk bild (vänstra bilden) av en transfekterad HUVEC uttrycker en Mapple-C1 cDNA-konstruktionen (en cellvolym markör, högra bilden). (E) Definiera gren ursprung genom att placera den största vinkel av krökning (dvs. den position där membranet visar den största krökningen, lila-färgade linjer) på vardera sidan av grenen och sedan ansluta vinklar med en rak linje (blå linjer) . (F) Identifiera och välja grenade utsprång som sträcker sig> 10 mikrometer från "grenen ursprung" (definierat i E). Räkna antalet förgrenade utsprång för att erhålla den "-grenen numret." (G) Mät avståndet från mitten av "gren ursprung" till most distala punkten i grenen med hjälp av linjeverktyget i anteckningar och mätningar tillämpning av NIS Elements för att få "grenlängd." Skalstrecken = 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Förutom avkänning ECM efterlevnad, HUVEC också känna av och svara på eliminering av intilliggande cellulära kontakter induceras av scratch sårskada. I analys migration, HUVEC odlades i ett monoskikt utsätts för en repa sår och migrationsegenskaper mäts (se protokoll 9, ovan). Efter induktion av såret genom att skrapa monoskiktet, sår-kant HUVEC polarisera genom att utveckla en UTSTÅENDE framkant som sträcker sig in i såret (Figur 4A, t = 0 h). Över en tidsperiod av 10-12 timmar, polariserade sår-kant HUVEC vandrar in i sårområdet och fyllasår, inrättande av en ny sammanflytande monolager (Figur 4A, t = 11 h). Som med HUVEC förgrening, tyder aktuella bevis på att polariseringen och migration är kritiskt beroende av samordnad omorganisation av MT och aktin cytoskeletons 43-49. Detta uppnås delvis genom lokal hämning av MCAK-inducerad MT demontering i framkant, men inte vid bakkanten av sår kant HUVEC 31. Känsligheten hos MT dynamik att såra-inducerad polarisation initieras av RAC1 GTPas, som riktar många nedströms regulatorproteiner, inklusive Aurora-A-kinas som fosforylerar och hämmar MCAK i framkant, och andra kinaser som har förmåga att inhibera eller aktivera MAP lokalt modulera MT tillväxt och krympning 18,31,36,48,50-53. Omfattande experimentella bevis stöder uppfattningen att samordningen av framkanten utskjutande och bakkant kontraktion styrs genom cykler av RAC1 aktiveringatt främja MT montering i framkant och RhoA aktivering till acto-myosin kontraktilitet vid bakkanten, därigenom driva riktad motilitet 9,41,51,52,54-58.

Hittills finns det inte en etablerad metod för att utföra automatiserad spårning av cellmigration. Detta är ett resultat av svårigheter i beräknings analysera cell ECM gränser som konsekvent förändras som sår-kantceller polarisera och migrera. Medan många program är kapabla att spåra fluorescerande celler 59-64, är befolkningen i fluorescerande HUVEC i sår-kantmigrations experiment cirka 30-40% av den totala HUVEC befolkningen, och därför majoriteten av sår-kantceller måste visualiseras genom faskontrast eller DIC imaging. Dessutom är det viktigt vid mätning sår-kant migrering för att utvärdera fluorescerande och icke-fluorescerande celler inom samma såret i syfte att identifiera specifikaeffekter av uttryckskonstruktioner både inom experimentella studiegrupper och mellan experimentella studiegrupper. För närvarande det bästa sättet att mäta HUVEC migration är att använda en hand tracking metod där ett sår kant cellen först identifierades och sedan kärnan och kärnsystemet identifieras (Figur 4B). Kärnsystemet används som positions determinant för spårning cell på grund av dess höga ljusspridningstäthet och relativt ringa storlek. Dessa två funktioner i kärnsystemet gör det lättare att identifiera och reducera mätfel genom att begränsa det område där användaren kan placera enskilda spårlägen. HUVEC migration spår genereras sedan genom att klicka på kärnsystemet i successiva tidsförlopp bildrutor. Slutligen migration hastighet och migration avståndet till ursprungs mäts och analyseras för kontroll och experimentella cellgrupper (Figur 4B).

figur 4 Figur 4: Analys av sår-kant HUVEC och spårning migration (A) 20X faskontrast bilder av en 11 h time-lapse avbildning serie scratch sår kant HUVEC (aka "Migration Assay").. Såret och riktningen för migration är indikerade i panel t = 0 tim. HUVEC visas att korsa såret kant och gå vidare in i såret tills ett monoskikt av celler bildas (t = 3,5 tim - t = 11 h). (B) Analys av migrationsanalystiden lapse avbildning (som visas i A) kräver först identifiering av en spårbar sår kant HUVEC baserad på cellposition (dvs. celler fysiskt vid kanten av såret) och uttrycksprofil (dvs. väljer en grön sårkanten cell om försöket innebär uttryck av GFP). Använda faskontrastbilden identifiera kärnan och kärnsystemet. Hand spåra kärnsystemet i successiva tidsförlopp bilder med hjälp av ennoteringar och mätningar tillämpning i NIS Elements att bestämma migrations hastighet och avstånd till ursprunget. Skalstrecken = 100 pm (A), 20 pm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Använda HUVEC i morfologi och migrations Experiment.
Live-cell imaging av EB3-märkt MT tillväxtdynamiken inom HUVEC kräver lämpliga och reproducerbara cellodlingsbetingelser för att mäta och utvärdera förändringar i MT tillväxt och HUVEC morfologi, så att de sedan kan hänföras till en ECM-signal cue. HUVEC utgör en utmärkt modell för att studera cellform och motilitet. De är mycket mottagliga för transfektion med fluorescensmärkta cDNA uppvisar de dramatiska morfologier som svar på både lösliga och fysiska signalerings signaler, och de bibehåller förmågan att organisera sig i vaskulära rör när de tillhandahålls lämpliga cellodlingsbetingelser 65-70. Primära cellodlingar, såsom HUVEC, kräver noggrann hantering och övervakning av cellpassager nummer för att säkerställa att cellerna är friska och att de kommer att bete sig normalt under experiment. Till exempel, när de utför experiment som undersöker cytoskeleton och / eller cell morfologi, bör HUVEC inte användas för experiment utanför tionde cellodlings passage, som HUVEC börjar vanligtvis att visa oenhetliga morfologier runt passagen tolv till femton.

Celldensiteten är också en kritisk regulator av HUVEC hälsa och proliferation. HUVEC förgreningsUndersökningar (se protokoll 10,1-10,4, ovan) använda relativt låga kulturer celltäthet för att ge cellerna fysiskt utrymme för att interagera med sin ECM och att utvidga grenade utsprång. Däremot i sår-kantstudier migrations (se protokoll från 10,5 till 10,8), HUVEC är kultur i ett monoskikt innan sårskada. Som sådan, sår-kant HUVEC visar en relativt un-grenade morfologi, förlänga ledande kant utsprång och uppvisar cell-cell-interaktioner med sina närmaste grannar när de flyttar in i såret.

Varningar och Fördelar med spårnings MT Dynamics i Living HUVEC.
Spinning disk mikroskopi är en utmärkt metod för atttesta experimentella hypoteser som kräver konfokala bildkvalitet med hög tidsupplösning. Med lämplig kamera och lasermodul, är detta mikroskopi tillvägagångssätt känslig för låga fluorescensemission och kan hjälpa till vid reducerad fotoblekning i förhållande till andra typer av fluorescensmikroskopi. Viktigt är denna metod också väl lämpad för måttlig till hög tidsupplösning som krävs för att generera omfattande mätningar av MT tillväxtdynamik med hjälp av EB3 märkningstillvägagångssättet, i en mängd olika celltyper.

Medan EB3 metoder för märkning växande MT plus-ändar har tydliga fördelar jämfört med andra metoder för fluorescerande märkning MT har också unika nackdelar. Till exempel finns det en del av MT array som inte är aktivt växande vid en viss tidpunkt, både befolkningen i demontering MTS och befolkningen i stabila, icke-dynamiska MT 71-74. EB3 skulle inte märka dessa två populationer av MTS ochdärför inte skulle ingå bidrag dessa två populationer i experimentell dataanalys. Alternativa metoder för att utvärdera hela MT array har fokuserat på uttryck av fluorescensmärkt tubulin, som införlivar alla populationer av MTS och gör det möjligt att identifiera växande, krympande och stabil meter. Men på grund av den relativt höga densiteten hos MT array nära mitten av cellen och intill den mikrotubuli organisera centrum (MTOC), märkning av hela MT array skapar en nackdel i att utföra bildanalys av MT ändar som inte är i närheten cellen periferi 75-77. Experiment med hjälp av två-färg co-märkning av MT med fluorescerande tubulin och fluorescerande EB3 i levande celler har visat kvalitativt, att de allra flesta av tubulin-märkta MT är också EB3-märkt 78. Dessutom har det inte funnits en effektiv metod för automatiserad spårning av MT märkta med fluorescerande tubulin. Detta innebär att data kollekning och mätningar av MT dynamik i celler som uttrycker fluorescerande tubulin kräver handen spårning av enskilda MTS, en process som är felbenägen och tråkiga. Som ett resultat har automatiserad computational analys av EB3 märkta MTs blivit den föredragna metod för mätning av MT dynamik eftersom den kan tillämpas på MT dynamik experiment över flera celltyper och inom en mängd olika experimentella regimer 35,79.

Länka MT Growth Dynamics till HUVEC morfologi och migration.
Ur en cytoskelettala utredare, är en extremt användbar anpassning av plusTipTracker automatiserad spårning analys förmågan att mäta och utvärdera både hela celler och regionala förändringar i MT tillväxtdynamiken. Kravet på en cell för att bli polariserad är en viktig förutsättning för riktad cellmigrering. Som sådan, polariserade signalerings ledtrådar har länge varit kända som viktiga drivkrafter för riktad cellmigrering 30,31,51,54,56,80,81 2,82-87. Dessutom, som svar på fysiska samverkan med ECM (t.ex. efterlevnad och dimension mechanosensing), HUVEC modulera sina MT dynamik genom att lokalt reglera Kartor för att främja MT tillväxt inom förlängning grenade utsprång, och detta tjänar till att vägleda HUVEC migration i riktning mot cue 5,31,88. Således, polarisering som svar på extracellulära signalerings ledtrådar understryker behovet av experimentell utvärdering av lokala förändringar i cytoskelettala dynamik.

Samtidig levande cell imaging av MT tillväxtdynamik (med hjälp av EB3 tillvägagångssätt) och HUVEC cellmigration är extremt svårt att utföra eftersom MT växa på en tidsskala sekunder, medan förändringar i cellmorfologi och riktad migration förekommer på en tidsskala av timmar. Ändå båda processerna är intimt Linked. Dessutom kontinuerlig, snabb avbildning av fluorescensmärkt EB3 på andra tidsskalan leder till fotoblekning av EB3 signalen. Försök att lösa detta problem genom att göra korta avbildning serie EB3 (1-2 min förvärv serien) var 30 minuter har varit framgångsrika, men kunde bara åstadkommas på ett litet antal EC som hade optimal expression av EB3 och som inte uppvisar negativa effekter av upprepad laserbelysning 5.

Ett alternativt tillvägagångssätt som gör det möjligt för tolkningar av hur MT tillväxtdynamiken bidrar till förändringar i cellmorfologi och migration är plusTipTracker Region of Interest (ROI) verktyg 35 (se protokoll 6,6). Denna metod gör det möjligt för hela cell MT tillväxt spår att delas upp i användardefinierade områden, där MT tillväxtspår då kan extraheras och analyseras. Till exempel, har jämförelser av "grenad" kontra "icke-grenade" regioner av cellen avslöjade att MTs växa fler södmjuk och mer ihärdigt inom grenade regioner jämfört med den icke-grenade cell periferi 5. I polariserad sår kant HUVEC, jämförelser av framkanten och bakkanten MT tillväxtdynamiken avslöjade att MCAK-inducerad MT demontering hämmas specifikt inom framkanten, men inte bakkanten. Regional utvärdering av främre och bakre kant MT tillväxtdynamiken i HUVEC uttrycker RAC1 och / eller fosforylering mutanter av MCAK avslöjade vidare att RAC1-inducerad aktivering av Aurora-A-kinas specifikt och lokalt hämmar MCAK aktivitet inom framkanten för att driva HUVEC polarisering och riktad migration 31. Således har kombinationen av automatiserad spårning av MT tillväxtdynamik och regional utvärdering av MT tillväxtdynamiken inom grenade utsprång och / eller framkanten av sår kant HUVEC tillät oss att koppla MT tillväxtdynamiken till HUVEC morfologi och migration.

Protokollen är designed för att ge en i huvudsak enkel och hög repeterbarhet metod för HUVEC kultur och experimentella undersökningar. Ändå är många av de protokollinformation är komplexa och tidskrävande, vilket i sin tur ger möjlighet för fel eller svårigheter med att leda den experimentella metodik. Även om det försökte att ta itu med potentiella problem i hela protokollet här ges ytterligare, detaljerad felsökning av potentiella problem som är mindre vanliga eller på annat sätt förkortat noter inom metodprotokoll.

Relaterade till beläggningstäck med poly-substrat (protokoll 2,2), ett vanligt problem som uppstår är den komplexa naturen att aktivera glastäck, koppling polyakrylamid till glaset, aktiverande polyakrylamid, och sedan koppla ECM till polyakrylamid. En särskilt svår och potentiellt problematiskt steg odling HUVEC på fibronektin / polyakrylamidgel efter exponering av polyAcrylamide belagda täckglas till 2 mM sulfo-SANPAH (steg 2.2.2.6, ovan). Det är avgörande för framgången för odling av HUVEC på dessa substrat som sulfo-SANPAH tas bort helt från det experimentella systemet efter ECM konjugering. Detta kan bäst åstadkommas genom tvättning med ddHaO 2 O och inkubera täckglas i DDH 2 O på en skakare över natten. Om celler odlade på polyakrylamid-ECM: n inte överlever, eller om livsduglighet är mindre än väntat, ökad och upprepad tvättning av sulfo-SANPAH efter konjugering till fibronektin (steg 2.2.2.9) rekommenderas för att potentiellt minska detta problem.

Relaterade till protokoll 3 (cDNA transfektion och HUVEC kultur på ett täck), en stor inverkan på framgången för elektroporering förfarande är hanteringen av HUVECs både under trypsinisering av cellerna för att ta bort dem från plastflaska, och efter ingåendet av elektroporering (steg från 3,3 till 3,4, ovan). Det är viktigt att ta handfullständigt övervaka HUVEC medan i trypsin, och att inte överskrida den tid som behövs för cellerna till "round-up" på ytan av kolven (typiskt 1-2 min). Alltför mycket tid i trypsin är en viktig orsak till HUVEC död, som är normalt inte realiseras tills cellerna stryks ut på fibronektinbelagda täckglas (steg 3,4) och sedan misslyckas med att fästa till substratet.

Av lika stor betydelse, inte HUVEC (och mest primära celltyper) inte klarar sig bra när de är suspenderade under långa tider i elektroporering buffert. Under större skaleexperiment, till exempel, där användaren har fem eller flera villkor som kräver elektroporering, är det bättre att hålla cellerna pelleterade i individuella rör (1 rör per transfektion) och att blanda dem, en-at-a-time i elektroporering buffert omedelbart före elektroporering. Detta tillvägagångssätt minimerar inkubationstid i elektroporering buffert och maximerad HUVEC överlevnad. Dessutom är omedelbar räddning i fullständigt odlingsmedia också spitical följande elektroporation. Räddnings förseningar på en minut eller mer efter elektroporering kan resultera i nästan fullständig HUVEC död och därför bör undvikas.

Relaterade cellmigrationsassay (Protokoll 9), den teknik för odling av HUVEC vid extremt hög täthet är beroende av en kritisk modifiering (beskrivs i steg 9,2) av den traditionella HUVEC cellodlingsmetod (beskriven i protokoll 3) som kräver torkning av fibronektin belagda täckglas för att göra det möjligt för HUVEC kultur i en mycket liten del av täck. Ofta, om täckglaset inte är helt torr eller om den tidigare beläggningen av täckglas med fibronektin (steg 2,1 eller 2,2) var inte effektiva, de medieinnehållande celler som är placerade på täckglas kommer att förlora sin ytspänning och expandera till kanterna på täckglas, vilket minskar tätheten av celler på täckglas. En metod för att felsöka detta potentiella problem är att aspirera media från täck och sedanPlacera täck (fortfarande i sin 35mm skål) på baksidan av biosäkerhet skåpet för 5-10 min. Denna anpassning kan bidra till att tillåta flödet av luft inom skåpet för att hjälpa till att torka skålen. Om någon synlig vätska kvar på täck efter lufttorkning, aspirera flytande fläckar och återigen låt lufttorka i 5-10 ytterligare minuter i biosäkerhet skåpet. Det är viktigt att notera att det inte finns något sätt att helt undvika detta potentiella problem, men det blir mindre av ett problem med upprepade praktiken av protokollet. Det är också en felsökning rekommendation att vid utarbetandet av täck för analysen cellmigration (eller någon analys i allmänhet), för att förbereda extra täck och har extra HUVEC ready-to-go i händelse av problem på vägen.

Med dessa felsöknings överväganden, är det också viktigt att framhålla nyttan av de protokoll som diskuterats och deras konsekvenser i framtiden cellbiologisk forskning. Tillämpningen på polyacrylamid tillvägagångssätt är omfattande och inkluderar inte bara tvådimensionella studier av cell-ECM engagemang (beskriven ovan), utan också tredimensionella undersökningar 5. Denna ansökan är avgörande för att öka vår förståelse av hur HUVEC reglerar cellform och migration i fysiologiska miljöer och bör ge utredarna en grundläggande förståelse för hur morfologiska förändringar samordnas med cytoskelettala förändringar. Medan protokoll som beskrivs här är inriktade på mätningar av MT tillväxtdynamiken, de flesta av protokollen kan och bör anpassas för att mäta ett antal andra mikroskopiskt mätbara aspekter av cell ECM interaktioner. När det gäller MT dynamik, det finns många kartor, varav minst 14 familjer kinesiner 89, var och en med en potentiell roll för att bidra till HUVEC polaritet och riktad migration, och alla som kan undersökas med hjälp av de protokoll som presenteras.

Framtida undersökningar bör enLSO riktas till cell ECM engagemang i normal kontra sjukdomstillstånd. HUVEC protokoll som presenteras här gäller för undersökningar av normala vaskulära homeostatiska processer, samt sjukdomstillstånd, inklusive hjärtsjukdomar, retinopati, tumörtillväxt och metastas, för att nämna några. Konjugera synligt transparent ECM och polyakrylamid substrat av mottaglig överensstämmelse med mikroskopiska undersökningar kommer att möjliggöra cell-ECM engagemang studier så att endotelceller vaskulär angiogenes kan övervakas med hög spatial och temporal upplösning. Dessa typer av experimentella metoder har redan börjat att avslöja viktiga skillnader i endotelceller form, polaritet, migration, och effekterna av proteiner som reglerar dessa processer 5,31,90. Framtida insatser bör syfta till att fastställa hur kombinationen av ECM efterlevnad och dimension mechanosensing kan användas för att lokalt kontrollproteiner som riktar och reglerar cytoskelettala dynamik.

Acknowledgments

Ett särskilt tack till Dr. Clare M. Waterman för mentorskap och diskussioner, Michelle Baird och Mike Davidson för att tillhandahålla många av de fluorescerande cDNA-konstruktioner som används i dessa studier, och Kathryn Applegate och Gaudenz Danuser för att utveckla plusTipTracker MT analysprogram. Detta arbete stöddes delvis av ett bidrag till KAM från National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) och National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
  2. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
  3. Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
  4. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
  5. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
  6. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
  7. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
  8. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
  9. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
  10. Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  12. Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
  13. Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
  14. van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
  15. Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
  16. Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
  17. Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
  18. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
  19. Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
  20. Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
  21. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
  22. Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
  23. Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
  24. Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
  25. Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
  26. Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
  27. Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
  28. Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
  29. Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
  30. Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
  31. Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
  32. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
  33. Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
  34. Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
  35. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
  36. Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
  37. Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
  38. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138 (2014).
  39. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13 (2001).
  40. Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
  41. Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
  42. Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
  43. Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
  44. Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
  45. Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
  46. Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
  47. Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
  48. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
  49. Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
  50. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
  51. Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
  52. Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
  53. Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
  54. Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
  55. Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
  56. Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
  57. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
  58. Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
  59. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
  60. Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
  61. Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
  62. Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266 (2013).
  63. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636 (2013).
  64. Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
  65. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
  66. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  67. Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
  68. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601 (2012).
  69. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
  70. Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
  71. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  72. Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
  73. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
  74. Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
  75. Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
  76. Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
  77. Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
  78. Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
  79. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  80. Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
  81. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
  82. Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
  83. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569 (2013).
  84. Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
  85. Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
  86. Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
  87. Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833 (2013).
  88. Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
  89. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  90. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).

Tags

Cellbiologi MCAK Aurora RAC1 mikrotubuli endotelceller angiogenes elektroporering fluorescensmikroskopi levande cell imaging
Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K.,… More

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K., Myers, K. A. High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (114), e54265, doi:10.3791/54265 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter