Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54265
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

Introduction

Ангиогенез инициируется внеклеточных сигнальных сигналов, которые способствуют эндотелиальные клетки (ЭКС) поляризовать, мигрируют с направленной специфичностью, и формируют новую сосудистую сеть в тканях, которые требуют кровоснабжение. Предрасполагающими факторами думали управлять ангиогенез являются сигналы от внеклеточного матрикса (ECM). В ответ на физические сигналы, КЭ расширить новые ветви с направленной специфичностью для направления направленного движения в формировании сосудистой сети 1,2. Архитектура морфологии EC и разветвленности определяется локализованной регуляции микротрубочек (МТ) цитоскелета способом , который согласовывается с регулированием ACTO-миозина сократительной 3. Для того , чтобы ветви ЕС для формирования, миозина-II должен быть локально подавлена, что приводит к локализованным мембранных выступов 4. В то же время и в том же месте внутри клетки, динамика роста МТ модифицируются в результате медленного и устойчивого роста МТ для содействия филиал Элондование и стабильность 5. Это скоординированы цитоскелета регулирование позволяет КЭ поляризовать их морфологии, чтобы облегчить направленную миграцию.

Развитие поляризованного клеточной морфологии требует поляризованного МТ узел 6. При переносе эпителиальные клетки, МЦ медленно и настойчиво специально растут на переднем крае клетки 7-9; в то время как в нейронах, инициирование и удлинение аксонов или дендритов требует , чтобы МЦ не только присутствуют, но они динамически происходят процессы сборки и разборки 10-15. Таким образом, локализованный контроль динамики роста МТ определяет архитектуру клетки и позволяет быстро ремоделирования морфологии клеток, как КЭ перемещаться по их ECM.

динамика роста МТ регулируются семейства молекулярных моторных белков и немоторных белков, называемых микротрубочек белков, ассоциированных или микротрубочек взаимодействующих белков (далее REFErred как MAPS). Карты могут быть локально активироваться или инактивируется, как правило , через сигнальные каскады , инициированные на границе соты ECM 16,17. После того, как активная функция, Картах путем связывания с МТ и изменения кинетики сборки и разборки МТ; таким образом , функционирует локально регулировать динамику МТ с целью продвижения формы клеток и полярность 18-20. Митотическое Центромера Associated Kinesin (MCAK) представляет собой семейство MAP Kinesin-13 , который связывается с МТ концами и пар АТФ гидролиза М. Т. разборке 21-23. Эта функциональная роль MCAK , как известно, решающее значение в пределах митотического веретена 24-28, а также во время интерфазы 29,30. В межфазной КЧС, MCAK опосредованной MT разборки регулируется локализованной Aurora-A индуцированного фосфорилирования MCAK в ответ на рану краем индуцированной активации Rac1 небольшой GTPase. Результатом этого сигнального каскада является ингибирование MCAK на переднем крае КЭ, что приводит к росту поляризованного МТ в направлении леADING край и MCAK индуцированный MT разборку на заднем крае мигрирующих ECs 31.

Традиционные методики измерения динамики роста МТ, как правило, используется отслеживание рук либо флуоресцентно меченных тубулина или, совсем недавно, флуоресцентно меченных MT Конец Связывание белка 1 или 3 (EB1 или EB3, соответственно). Флуоресцентные тубулина подход имеет преимущество маркировки весь массив МТ. Тем не менее, так как большинство митотических типов клеток поддерживать радиальный массив МЦ во время интерфазы 8,32,33, МЦ возле центросоме очень плотные, и в результате, отслеживание роста МТ и разборку с флуоресцентным тубулина обычно ограничивается периферическое регионы клетки. Из-за этих ограничений, использование флуоресцентно-меченых белков (EB EB1 или EB3) был более общий подход к измерению динамики MT. Поскольку ЭТ только знак растущих плюс концы МЦ, они отображаются в виде мелких (1-3 мкм), ярко флуоресцентный приходятTS, обеспечивая тем самым легко различимой маркер полимеризации MT с очень ограниченным фоновой флуоресценции 34-37. Хотя тот факт, что ЭТ метка только подмножество массива MT представляет собой большую прочность подхода EB, он также подчеркивает одно важное ограничение, что невегетационный МЦ не помечены EB3 подхода. Тем не менее, способность измерять и отслеживать EB3 комет с течением времени и визуализировать рост МТ в рамках субклеточном регионов делают этот подход идеальным решением для приложений, требующих региональной оценки организации МТ.

Другим важным ограничением традиционных методик для измерения динамики роста МТ была очень большие наборы данных и время, необходимое для анализа данных. Это ограничение связано с необходимостью ручного отслеживания сотен EB комет с высоким временным разрешением. Кроме того, эти измерения должны быть сделаны в статистически значимом количестве клеток, а также осуществляется под различными контроля и experimental условия. В последнее время эти ограничения были преодолены с помощью вычислительных методов анализа , специально направленных на отслеживание EB3 комет с помощью покадровой микроскопии в живых клетках 35. При правильном использовании, этот вычислительный подход служит как ограничить вероятность возникновения ошибки человека, связанного с ручным слежения в дополнение к предоставлению для метода с высокой пропускной способностью измерения полимеризации МТ. Компьютерный анализ динамики МТ с использованием программного пакета MatLab на основе, plusTipTracker, позволяет для измерения роста МТ путем отслеживания флуоресцентно-меченых EB3 кометы 5,31,35,38. Кроме того, программное обеспечение plusTipTracker позволяет для расчетов MT катастрофических событий (он же разборке) на основе исчезновения EB3 комет в пределах растущей дорожки MT, и позволяет субклеточном ( так называемый региональный) анализ динамики роста МТ в определенных пользователем регионах , представляющих интерес , Для наших исследований, динамика роста МТ сравнивали в пределахразветвленными регионов по сравнению с неразветвленных регионах, или в пределах ведущего по сравнению с задней кромок ячеек. Вывод данных из программного обеспечения plusTipTracker также могут быть использованы для создания цветовой кодировкой дорожки наложений для отдельных клеток и субклеточных регионах.

Здесь мы опишем методологию, используемую для изучения роли MCAK в модуляции динамики роста МТ и вклад этого MT depolymerase к регулированию ЕС ветвящегося морфологию и направленную миграцию. Наш подход используется первичной линии клеток человека, пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs), которые легко культивировать и высоко поддаются электропорации-индуцированной, временной трансфекции плазмиды кДНК. Затем мы использовали с высокой разрешающей способностью, замедленная флуоресценция микроскопия HUVECs трансфицированных MT-Энд-связывающим белком 3 (EB3) и Митотическое Центромера Associated Kinesin (MCAK) Определённые кДНК конструкции для оценки влияния на динамику МТ трансфицировали HUVECs. компьютерный анализ изображения PlusTipTracker основе из EB3меченных MT плюс концы в том, чтобы измерить скорость роста МТ и времена жизни роста МТ в покадровой изображений, для измерения и сравнения влияния экспериментальных манипуляций на динамику роста МТ. Данная методика позволяет при изучении динамики МТ и идентификации как локализованный регулирование динамики МТ в субклеточных регионах вносит свой вклад в развитие кровеносных сосудов процессов ЕС ветвления и миграции. Эти методы применимы к исследованию любой MAP, которые могут быть флуоресцентно меченных и выраженных в живых клетках.

Protocol

1. HUVEC Культура и техническое обслуживание

  1. Подготовить полный эндотелиальной базальной среды путем добавления все содержимое клеточного роста среднего дополнения пакета эндотелиальной и 5% пенициллина / стрептомицина смеси антибиотика по отношению к фенолу красный свободный эндотелиальной базальной носитель (см Материалы / Перечень оборудования для деталей). Теплый полный эндотелиальной базальной среды до 37 ° С в водяной бане.
  2. Удалите один из HUVEC криопробирку хранения жидкого азота и быстро таять в водяной бане С 37 ° С в течение 2 мин. При ~ 80-90% оттаивают, добавляют 500 мкл подогретого полной эндотелиальной базальной среды к криопробирку, перемешать с помощью пипетки и распределить клетки равномерно в 100 мм пластиковые ткани блюдо культуры, содержащей 15 мл подогретого полной эндотелиальной базальной среде.
  3. Место клеток в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. Разрешить клетки придерживаться в течение ночи. Не удалить или изменить среду для культивирования клеток.
  4. Когда 100 мм блюдо> 90% сплошности, передача HUVECs яNto 75 см 2 ткани культуры обрабатывают колбу и выдерживают при> 60% слияния в любое время (см шаг 1.5).
    Примечание: Когда поддерживали при плотности> 60%, HUVEC, время удвоения последовательно 18-20 часов.
    1. В ситуациях , когда пассирования клетки не требуется (т.е. плотность <90%), аспирация среду и заменить свежей полной эндотелиальной базальной среде каждые 48 ч.
  5. Когда HUVECs достигают> 90% сплошности, полоскание 2 раза с 10 мл 1x PBS, а затем удалить клетки из чашки для культивирования тканей путем их обработки 1,5 мл 0,25% трипсина в течение 1-2 мин при температуре 37 ° С. Примечание: Жизнеспособность HUVECs значительно снижается за счет расширения продолжительности воздействия трипсина.
  6. Спасательные клетки путем добавления 8,5 мл полной эндотелиальной базальной среды к трипсин / HUVEC смеси при соотношении 4: 1 эндотелиальную базальную медиа полная: трипсин (минимальное соотношение), и собирают в 15 мл коническую пробирку.
  7. Центрифуга при 1400 мкг в течение 4 мин. придыхательныйсупернатант.
  8. Ресуспендируют осадок в 2 мл полной эндотелиальной базальной среды и добавляют клетки в новую 225 см 2 для культуры ткани колбу , содержащую 25 мл полной эндотелиальной базальной среде.

2. покровного Подготовка До HUVEC культуры

  1. Покрытие Покровные с фибронектина подложках.
    1. Подготовить писклявым чистые 22 мм количество 1,5 покровные 39 и хранить при комнатной температуре (RT) в 100% этаноле.
    2. Используйте горелку, чтобы пламя покровное и поместить его в чашку Петри размером 35 мм с помощью пинцета.
    3. Приготовьте фибронектина / PBS смеси путем смешивания 10 мкл фибронектина запаса (1 мг / мл) с 990 мкл PBS.
    4. Внесите 250 мкл фибронектина / PBS смеси на покровное в 35 мм блюдо. Равномерно, чтобы покрыть поверхность покровного стекла.
    5. Инкубируйте блюдо в течение как минимум 3 ч при температуре 37 ° С и полоскать 3 раза с 2 мл 1x PBS перед использованием.
  2. покровное Активация
    1. Поместите 22 мм количество 1,5 покровное в 50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane в течение 10 мин на мешалке. После инкубации промыть 10 раз в течение 2 мин каждый в два раза дистиллированной H 2 O (DDH 2 O).
    2. Выдержите покровное в 0,5% глутарового альдегида в течение 30 мин на мешалке. После инкубации, мыть 10 раз в течение 2 мин в DDH 2 O.
  3. полиакриламидном Подготовка
    1. Приготовьте гель PA с соблюдением 0,7 килопаскалей (кПа) добавлением 3,75 мл 40% акриламида, 0,3 мл 2% бис-акриламид, и 0,95 мл DDH 2 O.
    2. Приготовьте 10% рабочего раствора персульфата аммония (APS) и не хранить на льду до использования.
    3. Для приготовления раствора PA 1 покровное (общий объем = 166,7 мкл), добавляют 0,83 мкл DDH 2 O, 41,7 мкл бис-акриламид раствор (на шаге 2.2.2.1), 124 мкл 10% APS, и0,25 мкл TEMED.
    4. Немедленно пипеткой 15 мкл раствора ПА на гидрофобной стекло (см Реагенты список) и крышка с активированным 22 мм No. 1.5 покровное. Дайте ПА полимеризоваться в течение 20 мин при комнатной температуре.
    5. Удалить покровное и передать на 35 мм блюдо. Промыть 3 раза с 2 мл 1x PBS. Хранить в течение <2 недель при температуре 4 ° С.
    6. Для связывания фибронектина в полиакриламидном геле, подвергают полиакриламида покрытием покровные до 2 мм сульфо-SANPAH с 7,500 J УФ-света (254 нм). Полоскание один раз с DDH 2 O.
    7. Приготовьте фибронектина / PBS смеси путем смешивания 10 мкл фибронектина запаса (1 мг / мл) с 990 мкл PBS.
    8. Пипетка 250 мкл фибронектина / PBS смесь на покровное (ов) в чашке Петри 35 мм. Равномерно, чтобы покрыть поверхность покровного стекла.
    9. Инкубируйте блюдо в течение как минимум 3 ч при температуре 37 ° С и полоскать 3 раза с 2 мл 1x PBS перед использованием.
класс = "jove_title"> 3. кДНК Трансфекция и HUVEC культуры на покровное

  1. Выполните шаги 1,5-1,6.
  2. С помощью гемоцитометра, подсчитать количество клеток и собрать тома, содержащего 100000 клеток / покровное (для Немигрирующий экспериментов) или 500000 клеток / покровное (для миграции экспериментов). Гранул клетки центрифугированием при 1400 х г в течение 4 мин.
    Примечание: Протокол миграции описана в разделе 9, ниже.
  3. Ресуспендируют клеток для трансфекции с помощью 100 мкл буфера для электропорации. Совместимый с 1 мкг кДНК и помещают в кювету для электропорации. Электропорации клетки: смесь ДНК , используя программу , предназначенную для электропорации HUVEC (например , программа #: A-034).
  4. Спасательные трансфецированных клеток с 500 мкл полных эндотелиальных базальной среды и пластинчатых клеток на фибронектин покрытием 22 мм Номер 1.5 покровное (см протокол 2.1, выше). Инкубируют при 37 ° С в течение 3-4 ч, чтобы обеспечить время для экспрессии кДНК конструктов.
ле "> 4. Подготовка образцов для обработки изображений

  1. Вырезать двухстороннюю ленту в 2,5 см х 0,65 см полоски.
  2. Получить чистую предметное стекло. Возьмите две полоски двусторонней клейкой ленты и закрепите их горизонтально вдоль верхнего и нижнего края слайда. Примечание: Важно, чтобы небольшое количество пространства между лентой и краем скольжения для герметизации камеры, как описано в пункте 4.5).
  3. Mount покровное (со стадии 3.4, ячейка стороной вниз) таким образом, что 2 края покровного остальных на ленте. Используйте пинцет, чтобы осторожно нажмите, чтобы закрепить покровное.
  4. Использование микропипетки, добавить 40 мкл среды визуализации (полный эндотелиальной базальной среде с добавлением 25 мкМ HEPES) между покровным и горкой. Убедитесь, что пространство между покровным и салазок полностью заполнена средой формирования изображения. Отберите среднего избытка изображения (при необходимости).
  5. Закройте все края с теплым VALAP (1: 1: 1: вазелин ланолин: парафин). Проверить на герметичность, сдавливая gentlу на покровного стекла.
  6. Бесплатно разместить смонтированы и запечатаны покровное на предварительно нагретом (37 ° C) предметный столик микроскопа.

5. Микроскопия

  1. Используя вращающийся диск конфокальной микроскопа, оборудованного с 60X, 1,40 Числовая апертура (NA) Дифференциальный интерференционный контраст (DIC) иммерсионным объективом, система автоматического контроля фокуса (PFS), электронный затвор для переданного освещения, Х-и-Y снабженный мотором этап, полосовыми фильтрами Размещенный в электронном колесе фильтра и монолитный модуль лазерного объединитель, фокусируют микроскоп на поверхности раздела клетки / покровным и использовать столик микроскопа джойстик, чтобы найти одну ячейку.
  2. Нажмите на кнопку "Настройки камеры" панели в программе изображения. В "время экспозиции" ниспадающего окна панели настроек камеры, выберите 400 мс.
    Примечание: Время экспозиции может изменяться и должны быть определены эмпирически.
  3. Нажмите на панели "ND" Приобретение вобраз программного обеспечения программы. На вкладке лямбда (λ) панели ND Acquisition, нажмите на флажки, чтобы выбрать 488 и 561 нм лазеров. На вкладке «время» панели ND Acquisition установите время съемки на 2 сек и общее время до 2 мин.
  4. Нажмите на кнопку "Запуск" на панели ND Приобретение приобрести покадровой последовательности изображений 2 мин с интервалом приобретения сек 2 с использованием 400 мс время экспозиции и для 488- и 561 нм освещения.
  5. В "Оптический Config" панели программы программного обеспечения и изображения с помощью настройки камеры, описанные в шаге 5.2, нажмите на кнопку 405 нм лазера, а затем нажмите "Acquire", чтобы захватить одно изображение синего флуоресцентного белка (BFP) меченные белки ,
    Примечание: Как правило, желательно, чтобы ограничить воздействие клеток (частота захвата изображения и / или времени экспозиции) до 405 нм лазерного излучения, поскольку эта длина волны может привести к повреждению клеток с течением времени.
    1. Для исследований MCAK-shRNA, Acquire одного 405 нм изображение, чтобы проверить экспрессию БПС-меченого shRNA.
  6. В "Оптический Config" панели программы программного обеспечения изображения и используя настройки камеры, описанные в шаге 5.2, нажмите на кнопку DIC, а затем нажмите кнопку "Приобретать", чтобы захватить одну DIC изображение ячейки для разветвления анализа морфологии (см раздел 10 , ниже).
  7. После получения изображения, используйте функцию "яркость / контраст" в программе изображения в цифровом увеличить сигнал изображения.
  8. Экспорт яркости и контрастности скорректированные изображения. Нажмите кнопку "Файл", затем "Сохранить как", а затем выберите ".tif" для типа файла изображения.
    Примечание: Как правило, это генерирует 61 .tif файлов изображений из одного 2 мин приобретения покадровой, когда захваченный, как описано в шаге 5.4.

6. Динамика MT Анализ

  1. Для отслеживания EB3, используйте программное обеспечение plusTipTracker 35, с открытым исходным кодом,MatLab на основе вычислительной пакет программного обеспечения, предназначенного для автоматического обнаружения, отслеживания, анализа и визуализации флуоресцентно меченых ЭТ.
  2. plusTipGetTracks графический интерфейс пользователя (GUI)
    1. Чтобы получить доступ к GUI plusTipGetTracks, типа plusTipGetTracks.
    2. Для обнаружения EB3 кометы, использовать графический интерфейс для просмотра и выберите родительский каталог, содержащий изображения .tif.
    3. В панели параметров слежения за plusTipGetTracks GUI, введите следующие значения: Поиск Диапазон Радиус = 5 - 10; Минимальная длина Sub-Track = 3; Max Gap Length (кадров) = 12; Max Factor Усадка = 1,0; Максимальный угол Форвард = 25; Максимальный угол назад = 10; Колебание Радиус (Пиксели) = 2; Частота кадров (сек) = 2; Размер пикселя (мкм) = 110.
      Примечание: Сначала проверьте оптимальных параметров слежения с использованием plusTipParamSweepGUI на представительном множестве .tif файлов изображений. Значение, введенное для размера пикселя является специфическим для объектива, используемого для приобретения покадровой изображенияs (действия 5.1-5.2, выше).
    4. Для области интереса (ROI) отбор, создание бинарных масок целой клетки вручную трассировки край ячейки, используя DIC изображение клетки, чтобы сформировать многоугольник.
    5. Для Подрегион интересов (суб-ROI) отбор, создать начальные и конечные края маски вручную рисовать толстую линию 2 точки по всей раной краевой ячейки интереса с использованием модифицированного plusTipTracker суб-ROI инструмент выбора.
      Примечание: линия должна быть проведена параллельно краю раны в положении , в котором клетка представляет интерес выходит за пределы соседних с фазным края ячейки 31.
  3. GUI plusTipSeeTracks
    1. Проверьте и визуально осмотреть дорожки накладки на .tif изображений, сохраненных в папке "ROI", нажав на кнопку "Plot Треки" в столбце Track Overlays. Повторите эти действия для всех наложений дорожек.
    2. Выполните группировку данных, нажав на кнопку "Создание групп" в столбце Дополнительные параметры. Выберите experimДанные СИХИЧЕСКОЕ, которые принадлежат одному и тому же набору данных, нажав на файлы данных. Сохраните выбор, давая «группу» имя, которое может быть легко идентифицирован (например, "контрольная группа").
    3. Для суб-ROI измерений динамики роста MT, введите минимальное количество кадров изображений, что один EB3 кометы трек должен быть обнаружен в суб-ROI для того, чтобы квалифицировать как "правильный путь" и извлечь экскурсии роста МТ в передней и задней кромки ROI нажав на кнопку "ручного выбора" в "Sub-трансформирования" панели GUI.
      Примечание: Например, можно использовать 3 блока (6 сек) в качестве минимальной длины обнаружения, чтобы экстрагировать в качестве "дорожки". Извлеченные треки из суб-трансформирования хранятся в папке подпроекта в исходной папке ROI для каждой ячейки.
    4. Рост MT суб-трек и анализ субпопуляции
      1. Вычислить среднюю скорость роста МТ и среднее время жизни роста МТ для "группы" наборов данных (этап 6.3.2), для каждого ROI (см Steр 6.2.4), и для каждой подгруппы ROI (см шаг 6.2.5).
    5. В Quadrant разброс участков столбца plusTipSeeTracks GUI, нажмите на "Выбрать группы" и нажмите на группы (созданные на шаге 6.3.2) для сравнения.
      1. Выберите "скорость роста" для параметра по оси Х и введите среднее значение для скорости роста (со стадии 6.3.4) в коробку. Выберите "Срок роста" для варианта оси у и введите среднее значение для жизни роста (со стадии 6.3.4) в коробку.
    6. Установите флажок рядом с надписью "Удалить дорожки на старте / конец" и рядом с "Пакетная обработка по группам." Нажмите на кнопку "Сделать участки", чтобы создать профиль распределения для треков роста МТ для всей клетки, передние кромки и задние кромки к югу от трансформирования.
      Примечание: Для исследований, описанных здесь, следы роста МТ распределены на четыре субпопуляции: медленно и недолго, медленно и долговечны, быстро и недолго, и быстро и долговечны.
    7. Нажмите на кнопку "Data", а затем нажмите на кнопку "Анализ данных" из окна ниспадающего данных. Выберите "T-тест: два образца предполагая равные дисперсии", чтобы сравнить средние скорости роста MT и времена жизни роста МТ. Выделите ячейки данных в электронной таблице, где Т-тест сравнения привести р-значение <0,001.

7. колокализацию анализ

  1. Для вычитания фона, используя "инструмент линии" программы для обработки изображений, рисовать области интереса (ROI), нажав на экране , чтобы создать квадратную форму , что составляет 10 мкм 2 на зеленый канал (488 нм возбуждения) в положением, в котором нет флуоресценции клеток (фон). Повторите эту процедуру для красного канала изображения (561 нм возбуждения), используя образы из шага 5.8.
  2. С помощью программного обеспечения визуализации PRogram, щелкните правой кнопкой мыши на ROI с шага 7.1 и выбрать "установить в качестве фона ROI." Нажмите на "Image", а затем нажмите на "вычтите фоне" из окна ниспадающего вычесть средние значения фона (из шага 7.1) от всего образ. Выполните вычитание фона для клеток коэкспрессирующей Em-Aurora A и либо mCherry-MCAK, MAPPLE-EB3 или MAPPLE-тубулина.
  3. На заднем плане вычитают красного канала изображения только нажмите на Binary ленте и выберите пункт "Определить порог", а затем выберите функцию "на канал", чтобы исключить назначенный флуоресцентный маркер.
    Примечание: Этап пороговая проводили либо на mCherry-MCAK, MAPPLE-EB3 или MAPPLE-тубулина изображение, чтобы разрешить рисование линий, которые специфически ознаменовали порогами объект для совместной локализации анализа (см шаг 7.4).
  4. С помощью инструмента линии в программном обеспечении визуализации, нарисуйте толстую линию 2-точка над исключенных объектов в пределах порогами изображения.
  5. Выберите объекты линии, проведенной на шаге 7.4. Скопируйте и вставьте объекты строки из красного канала на соответствующий ему зеленый канал (Em-Aurora A) изображения.
  6. Мера в оттенках серого значения интенсивности пикселей под объектами линии для расчета совместной локализации и суммарные значения Em-Aurora-A для каждой отдельной ячейки, выбрав "Мера", затем "Intensity Profile" из окна выпадающего в рамках программы для обработки изображений.
    1. Организуйте данные по экспериментальной обработки и субклеточном региона путем экспорта в программу электронных таблиц программного обеспечения и сохранения файла в качестве типа .xls (например, "control_grayscale_intensity.xls").
      Примечание: Данные, представленные в этом случае представляет собой совместную локализацию часть общего измеренного эм-Aurora-A на субклеточном области.
  7. Используя измеренные значения, начиная с шага 7.6, повторите шаг 6.3.7 для вычисления статистической значимости при использовании р <0,05 в качестве среза для значения.
  1. Fix клетки (этап 3.4) с параформальдегидом / глутаральдегид совместного извлечения / фиксации буфера (PGF-ФЭУ; 4% параформальдегидом, 0,15% глутарового альдегида, 0,2% моющего средства в 60 мМ PIPES, 27,3 мМ HEPES, 10 мМ EGTA, и 8,2 мМ MgSO 4, рН 7,0) в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. Промыть 3 раза в течение 5 мин с 2 мл 1x PBS.
  3. Лечите 2 раза в течение 15 мин с 0,01 г / мл NaBH 4 в 1x PBS для гашения реактивных альдегидов.
    Примечание: NaBH 4 образует пузырьки , которые могут вызвать покровные плавать. Крайне важно, чтобы покровные оставаться под водой в течение этих инкубирования. Если покровные начинают плавать, использовать пинцет, чтобы поднять один край покровного, с тем чтобы пузырьки бежать.
  4. Полоскание 2 раза 1x PBS перед блокированием с 5% обезжиренным молоком в PBS 1x на качающейся платформе в течение 1 часа при комнатной температуре.
  5. Инкубируйте клетки в первичных антител (кролик анти-pT288-Aurora A (1: 1000)) и крысы анти-α-тубулина (1: 500) получают в растворе 1х PBS. Инкубируйте при 4 ° С на качающейся платформе в течение ночи.
  6. Удалить первичные антитела и прополоскать 3 раза в течение 5 минут в 1X PBS перед инкубацией с вторичными антителами (осле анти-кролик (1: 1000) и козий анти-крыса (1: 1000)), полученного в 5% обезжиренном молоке в течение 2 часов при 37 ° С.
  7. Крепление покровное на предметное стекло в флуоресцентно-оптимизированной монтажной среды. Печать покровное края к слайду, используя четкие лак для ногтей, и хранить в темноте при 4 ° С.

9. Анализ миграции клеток

  1. Выполните HUVEC культуру для анализов миграции, как описано выше (Протокол 3: кДНК Трансфекция и HUVEC культуры на покровное, шаги 3.2-3.3).
  2. После трансфекции клеток, спасательных трансфицированных клеток с 80 мкл полной эндотелиальной базальной среде. Пипетировать образца 80 мкл в качестве одной капли на центр высушенной покрытой фибронектином 22-мм круглой No. 1.5 покровное. Не распространять 80 мкл УЦИп. Инкубируют при 37 ° С в течение 3-4 ч, чтобы обеспечить время для следования клеток в сливающийся монослой.
    Примечание: Сушка покровное необходимо, чтобы предотвратить падение 80 мкл распространения при контакте покровное. Такой подход позволяет HUVECs быть сосредоточены в небольшом участке покровным и тем самым способствует быстрому образованию сливающийся монослой клеток.
  3. Полоскание 2 раза в полной эндотелиальной базальной среде, чтобы удалить не-присоединенные клетки.
  4. Для того, чтобы создать "края раны," скрести покровное с стерилизованной лезвием бритвы, осторожно волоча чистую лезвие бритвы через монослой HUVEC (со стадии 9.2). Держите покровное мягко на месте с помощью пинцета, чтобы предотвратить соскальзывание лезвия бритвы во время выскабливание.
  5. Дайте клеткам восстанавливаться в C инкубаторе 37 ° в течение 3 часов. Собрать и смонтировать покровное (ы) для работы с изображениями (см протокол 4).
  6. Приобретать фазового контраста и 488 нм изображения с интервалом 10 мин в течение 12 ч на микроскоп с помощью10x фаза 0,45 NA цель и 0,52 NA LWD конденсатора с использованием "ND" Acquisition панель программного обеспечения получения изображений (описано в шаге 5.3).

10. Количественное HUVEC ветвление и миграции

  1. Для ветвления анализа и позволяют даже клеток освещения и объективной количественной оценки, приобретают микроскопический образ HUVEC трансфицированных (этап 3.3) и выражая MAPPLE-C1 кДНК построить, объемный клеточный маркер.
  2. С помощью программы для обработки изображений, откройте изображение MAPPLE-C1 и маркировать позицию по обе стороны ветви, где мембрана показывает наибольший угол кривизны. Соедините эти две точки прямой линией. Эта линия является "ветвь происхождения".
  3. С помощью инструмента линии программного обеспечения визуализации, визуально определить ветви, которые измеряют> 10 мкм в длину от "ветви" происхождения, определенной в пункте 10.2. Вычислить длину ветви, измеряя расстояние от йе "ветвь происхождения" к наиболее дистальной точки наконечника ветви (см рисунок 4).
  4. Подсчитайте количество разветвленных выступов, которые измеряют> 10 мкм в длину, чтобы получить "номер ячейки ветви."
  5. Для анализа миграции, используя изображения , собранные на этапе 9.6, визуально идентифицировать раной край HUVEC основан на физическом местоположении (т.е. клетки физически на краю раны) и профиль экспрессии (т.е. выбрать зеленую рану края ячейки , если эксперимент предполагает экспрессия GFP).
  6. С помощью фазового контраста изображения клетки, визуально определить ядро ​​(полупрозрачный сферическую структуру вблизи центра ячейки), а затем визуально идентифицировать ядрышко (небольшой, темного цвета, сферические структуры внутри ядра) в первый момент времени из покадровой изображений. Нажмите на положение ядрышек для обозначения х и у координаты ядрышек.
  7. С помощью программного обеспечения обработки изображений, вручную отслеживатьЯдрышко в последовательных покадровой изображений, нажав на позиции ядрышек маркировать х и у координаты ядрышек в каждом кадре покадровой фильма (рисунок 4).
  8. С помощью программного обеспечения обработки изображений, нажмите на кнопку "Файл", а затем нажмите Сохранить как ", а затем нажмите кнопку, чтобы выбрать тип файла образа" .xls ".
  9. Откройте файл данных вручную отслеживания (со стадии 10.8), используя программу электронных таблиц программного обеспечения. Вычислить среднюю скорость миграции и миграции означают расстояние до происхождения.
  10. Используя программу работы с электронными таблицами, нажмите на кнопку "Data", а затем нажмите на кнопку "Анализ данных" из окна ниспадающего данных. Выберите Бонферрони скорректированный, односторонний анализ теста дисперсии с> 95% уверенности в качестве среза статистической значимости.

Representative Results

HUVEC культуры для живых клеток микроскопии
Live-ячейки изображения HUVECs экспрессирующих флуоресцентные белки требует , чтобы HUVECs поддерживаются в среде, пригодной для нормального клеточного роста и технического обслуживания, а также нормальной экспрессии и функции белка. На рисунке 1 показано схематическое изображение протокола используется для подготовки буферном и закрытая система, которая поддерживает оптимизированные оптические характеристики для сбора покадровой изображений живых клеток. Тонкие полоски двухсторонней ленты помещают на предметное стекло (фиг.1А) , а затем покровное , содержащий культивированные HUVECs инвертируется на верхней части ленты таким образом, что клетки , обращенной к слайд (Фигура 1В). Таким образом, лента обеспечивает небольшой зазор между двумя стеклянными поверхностями, и создает пространство , в котором клетки могут быть залитое соответствующих среды для культивирования клеток (фиг.1С; см Протокол 4, выше). яна последний шаг, стекло покровное герметично присоединен к предметное стекло , используя вазелин: ланолин: парафин (1: 1: 1 смесь, VALAP; Рисунок 1D) , чтобы установить закрытую систему. Эта клеточная культура подход был использован как для более короткого времени последовательности визуализации EB3 комет и на более длительный временной последовательности ветвления и экспериментов в области миграции. Кроме того, воск, как последовательность VALAP позволяет легко удалять из предметного стекла и покровным в конце формирования изображения эксперимента таким образом, что дополнительные подходы, включая закрепление и immunolabelling (см протокол 8), могут быть выполнены на той же покровным и клеточного образца что визуализировали с использованием подхода живых клеток.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Методология HUVEC культуры для микроскопических изображений живых клеток (A) Отрежьте 2 куска двухсторонней ленты на 0,65 см х 2.50 см прямоугольные полосы и закрепить один кусок двухсторонней ленты горизонтально вдоль верхнего края слайда, а другая деталь, расположенных вдоль нижнего края слайда. Важно , чтобы небольшое количество пространства между лентой и краем скольжения для герметизации камеры , как описано в (D). (B) с помощью пинцета удалить покровное , содержащий HUVECs и инвертировать покровное (ячейка стороной вниз) поверх кусочков ленты. (С) С помощью микропипетки, добавить 40 мкл изображений носителя (полной эндотелиальной базальной среде , дополненной 25 мкМ HEPES) между покровным и предметное стекло. Убедитесь в том, что пространство между покровным и слайд полностью заполнен со средствами массовой работы с изображениями и избежать пузырей. С помощью аспиратора по краю покровного стекла, чтобы удалить избыток средств массовой информации, если это необходимо. (D) Использование теплой VALAP (1: 1: 1 вазелин: ланолин: парафин) для герметизации вокруг краев покровного стекла. Проверить на наличие утечек средств массовой обработки изображенийs, нажав вокруг мягко на покровное. Используйте дополнительные VALAP для исправления. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Автоматизированная отслеживания флуоресцентно-меченых EB3 позволяет для всестороннего анализа всей клетки и динамики роста MT региональных. Совокупность четких, отдельных и очень много времени и пространства разрешением микроскопических изображений белка EB3 имеет важное значение для анализа движений EB3 внутри клетки. HUVEC, выражение флуоресцентно-меченного EB3 колеблется в широких пределах от клетки к клетке и интенсивность флуоресценции, как правило, увеличивается в пределах той же самой клетке в течение часа. Таким образом, важно учитывать и отслеживать эти изменения в экспрессии профиля с целью выявления потенциальных последствий повышенной экспрессии EB на динамику роста МТ. Это лучше всего достигается путем оценки полутонового флуоресценции intensitу профилей для каждого изображаемого ячейку, а затем ограничивая анализ данных для тех ячеек, которые отображают определенный диапазон полутоновых профилей экспрессии. Первоначальная оценка наборов данных профиля экспрессии имеет решающее значение, и следует сравнивать с данными МТ динамика роста, которая получена с помощью программного обеспечения plusTipTracker для каждой ячейки. профили экспрессии могут быть нанесены на скорость роста МТ и долгий срок службы роста МТ для каждой ячейки в экспериментальной группе, с тем чтобы определить требуемый диапазон оттенков серого выражения и для определения потенциальных выбросов.

Рисунок 2 выдвигает на первый план HUVEC культивировали на подложке фибронектина (см протокол 2.1, выше) и выражая вблизи оптимальных уровней MAPPLE-меченого EB3. Флуоресцентные ЕВ3 кометы показаны в покадровой серии изображений в течение периода 12 сек (рис 2А). Анализ EB3 комет с использованием программного обеспечения plusTipTracker включает автоматизированную, кадр за кадром EB3 кометы детефикция (зеленые и желтые точки, рис. 2б) Кометы , обнаруженные в пределах каждого кадра затем связаны между собой , зависит от их изменения положения от кадра к кадру, чтобы генерировать EB3 дорожки и визуальный ЕВ3 дорожки наложения (рис 2C-F). Трек наложений имеют цветовую маркировку и цветовые различия могут быть определены с помощью параметров, введенных пользователем. Как правило, эти различия используют глобальное среднее значение скорости роста MT и MT жизни роста 5,31 и тем самым разделить данные на четыре группы: медленные и кратковременным (красный), медленных и долгоживущих (желтый), быстро и кратко- жил (зеленый), а также быстро и долговечны рост МТ (синий, рисунок 2G). PlusTipTracker-опосредованного отслеживание динамики роста МТ EB3-меченых также позволяет определенные пользователем области интереса (трансформирования). PlusTipTracker извлекает данные трека роста MT внутри определенной пользователем ROI (Рисунок 2A, B и F), что позволяет для сравнений DYNAM роста МТИКС в пределах разных регионов одной и той же ячейки.

фигура 2
Рисунок 2: обнаружение кометы EB3, отслеживание и выходные данные plusTipTracker (A) замедленная фильм из HUVEC выражения MAPPLE EB3.. Левая панель показывает весь вид клеток и всю маску клеток (белая линия) демаркации границы ячеек. Красная коробка представляет собой масштабируемую область, показанную в покадровой изображений (правая панели). Правые панели показывают необработанные полутоновых покадровой образы EB3 комет в последовательных кадрах изображений (T = 0 сек - т = 12 сек). (Б) обнаружение plusTipTracker из EB3 комет из изображений , показанных на стадии (а). Левая панель показывает весь вид клеток, обнаруженных комет (желтые точки). Красная коробка представляет собой масштабируемую область, показанную в покадровой изображений (правая панели). Правые панели выделить пять обнаруженных EB3 кометами (красные стрелки) и проследить эти пять комет в течение периода формирования изображения 12 сек. зеленый Точки представляют обнаружены EB3 кометы, которые не существовали (или не были обнаружены) в предыдущем временном интервале. (C) Максимальная интенсивность проекции 61 кадров (2 мин кино) от EB3 комет , показанных в (А). (D) plusTipTracker МТ дорожки наложения одних и тех же 61 кадров (2 мин кино) , показанных в (С). (E) Увеличение максимальной проекции интенсивности (красный прямоугольник в C). (F) Увеличить из plusTipTracker MT дорожки наложения максимальной проекции интенсивности (красный прямоугольник в D). (G) с цветовой кодировкой условные обозначения для наложения дорожек , показанных на (D) и (F). Обозначение, как медленно, быстро, недолго или долгоживущим на основе среднего значения для всех треков роста измеренных в группе десяти MAPPLE-EB3, выражающих HUVECs. Для облегчения визуализации, отслеживать оверлеи в (D) и (F) генерируются с использованием перевернутых интенсивности пикселя изображения ячейки, показанной в (А). Шкала бар = 20 мкм./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

HUVEC ветвления и модели миграции чувствительны к механо-физические сигналы от ECM.

HUVECs хорошо известны реагировать на различные типы сигнальных репликами и, при этом, чтобы пройти морфологические изменения , которые диктуют соответствующий клеточный ответ на конкретной сигнализации реплике (ов) 36,40-42. HUVECs культивировали на фибронектина покрытием стеклянных подложек (рис 3а), или на жестких 2-мерных полиакриламидных ЕСМ (55 кПа) обычно отображают круглую или продолговатую морфологию с несколькими различными разветвленными выступами (рис 3б). Тем не менее, при культивировании на очень мягких 2-мерных полиакриламидном ЕСМ (0,7 кПа), HUVECs отображения высокоразветвленного морфологии, которые, как известно, являются результатом соответствия индуцированных внизрегулирование миозина-II сократительной 4,5,31 (рис 3C). Таким образом, HUVECs регулируют их клеточную морфологию через ECM mechanosensing, и это достигается за счет локализованного модуляции динамики МТ и ACTO-миозина сократимость.

Поскольку HUVECs отображать большое разнообразие морфологических признаков, для того, чтобы измерить HUVEC ветвления важно, чтобы сначала определить, что разветвленная выступания, а затем, чтобы определить, каким образом разветвленным Выступ будет измеряться объективно. Один из методов использует четыре шага подход , с помощью которого граница ячейки или "маска" создается вручную прослеживания края ячейки , используя изображение клетки , экспрессирующие флуоресцентный маркер объема для определения краев ячейки (рис 3D). После генерации маски, ветви происхождение определяется местонахождение наибольший угол кривизны между разветвленными протрузии и тела клетки. Линия обращается к ДемаРК "ветвь происхождения" (пурпурные линии под углом; Рисунок 3E). Номер отделения измеряется просто путем подсчета количества ветвей с определенной ветви происхождения (рис 3F). Длина отделения определяется как расстояние от начала координат до ветви дистальной ветви наконечника (рис 3G). Для того, чтобы избежать включения небольших lamellipodial проекций на основе анализа данных, дополнительный критерий требует , чтобы ветви должны быть длиннее ( "длина ветви") , чем они широки (в "ветви происхождения"), и что ветви должны быть по меньшей мере в десять микрон в длину 5 , 31.

Рисунок 3
. Рисунок 3: Анализ HUVEC разветвлений морфологии (А - С) Примеры ДИК образу HUVECs культивировали на фибронектина с покрытием из стекла ЕСМ (А) жесткая (55 кПа) полиакриламид ЕСМ (B) и мягкие (0,7кПа) полиакриламид ЕСМ (C). Ветвление резко возросло в HUVECs культивируют на 0,7 кПа полиакриламидных ЕСМ (С) по сравнению с более жесткими ЕСМ (A, B). (D). DIC микроскопическое изображение (левое изображение) из трансфицированных HUVEC, экспрессирующих MAPPLE-C1 кДНК построить (объемный клеточный маркер; правое изображение). (Е) Определить ветви происхождения путем размещения наибольший угол кривизны (т.е. положение , при котором мембрана показывает наибольшую кривизну, окрашенного в пурпурный цвет линий) по обе стороны от ветви , а затем соединить углы с прямой линией (синие линии) , (F) Определить и выбрать разветвленные выступы , которые простираются> 10 мкм от "ветви происхождения" (определяемой в Е). Подсчитайте количество разветвленных выступов, чтобы получить "номер филиала." (G) Измерьте расстояние от центра "филиала" происхождения в месй дистальной точкой ветви с помощью инструмента линии в аннотациях и измерений применения NIS Elements Программное обеспечение для получения "длины ветви." Шкала баров = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

В дополнение к ощущению соответствия ECM, HUVECs также воспринимать и реагировать на устранение соседних клеточных контактов, вызванных царапин ранению. В анализа миграции, HUVECs культивировали в монослое подвергаются царапинам раны и характеристики миграции измеряются (см протокол 9, выше). После индукции раны царапанием монослой, раной край HUVECs поляризуют путем разработки протрузии передний край , который проходит в рану (фиг.4А, т = 0 ч). За время курса 10-12 ч, поляризованные раной край HUVECs мигрируют в область раны и заполнитьРана, создание нового сливающийся монослой (рис 4А, Т = 11 ч). Как и в случае HUVEC ветвления, существующие данные свидетельствуют о том , что поляризация и миграция в значительной степени зависит от скоординированной реорганизации МТ и актин цитоскелетом 43-49. Это достигается, в частности, за счет локализованного ингибирования MCAK-индуцированной MT разборки на переднем крае, но не на задней кромке раневой краем HUVECs 31. Чувствительность динамика МТ к ране, вызванной поляризации инициируется Rac1 ГТФазы, которая ориентирована многочисленные вниз по течению регулятор белков, включая Aurora-киназы, которая фосфорилирует и ингибирует MCAK на переднем крае, а также других киназ, которые способны ингибировать или активировать MAPs локально модулировать рост МТ и усадке 18,31,36,48,50-53. Обширные экспериментальные данные подтверждают мнение, что координация переднего края выступа и задней кромки сжатия, регулируется через циклы активации Rac1продвигать МТ сборку на переднем крае и активации RhoA к ACTO-миозина сократительной на задней кромке, в результате чего движение , направленное моторику 9,41,51,52,54-58.

На сегодняшний день существует не создана методология проведения автоматизированного отслеживания миграции клеток. Это является результатом сложности в вычислительном анализе границ клеток ECM, которые постоянно меняется, так как раной краевые клетки поляризуются и мигрируют. В то время как многие программы способны отслеживать флуоресцентно меченых клеток 59-64, популяция флуоресцентно меченных HUVECs в миграционных экспериментах с фазным края составляет приблизительно 30-40% от общей численности населения HUVEC, и , следовательно , большинство из раны края клетки должны быть визуализированы с помощью фазового контраста или изображения DIC. Кроме того, важно при измерении раной края миграции для оценки флуоресцентных и нефлуоресцентном клетки в пределах той же раны, с тем чтобы определить конкретныеЭффекты экспрессии конструкций как в рамках экспериментальных исследовательских групп и экспериментальных исследовательских групп. В настоящее время, лучший подход для измерения миграции HUVEC является использование отслеживания руки подход , в котором раной край соты сначала идентифицируется , а затем ядро и ядрышко идентифицируются (4В). Ядрышко используется в качестве позиции детерминанту для отслеживания клеток из-за его высокой плотности света рассеяния и относительно небольшого размера. Эти две особенности ядрышек облегчают идентифицировать и уменьшить погрешность измерений за счет ограничения области, в которой пользователь может размещать отдельные позиции дорожки. HUVEC миграции дорожки затем генерируется, нажав на ядрышек в последовательных кадров изображения покадровой. Наконец, скорость миграции и миграции расстояние до происхождения измеряются и анализируются для контрольной и экспериментальной групп клеток (рис 4б).

Рисунок 4 Рисунок 4: Анализ раной края HUVECs и отслеживания миграции (A) 20X фазового контраста изображения в заданный промежуток времени серии изображений 11 ч царапин с раной края HUVECs ( так называемый "анализа миграции").. Рана и направление миграции указаны в панели Т = 0 ч. HUVECs показаны пересечь заведенный край и продвижение в рану, пока монослой клеток не образуется (т = 3,5 ч - т = 11 ч). (В) Анализ миграции анализа времени покадровой съемки (как показано на A) требует сначала идентификацию отслеживаемого раной края HUVEC на основе расположения клеток (т.е. клеток физически на краю раны) и профиль экспрессии (я .е. выберите зеленую клетку края раны , если эксперимент включает экспрессию GFP). Используя контрастное изображение фазы, определить ядро ​​и ядрышко. Рука отслеживать нуклеолус в последовательных покадровой изображений с помощью АнОбозначения и измерений приложений в программном обеспечении NIS Elements, чтобы определить скорость миграции и расстояние до происхождения. Масштабные полоски = 100 мкм (А), 20 мкм (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Использование HUVECs в морфологии и миграции экспериментов.
Live-ячейки изображения динамики роста МТ EB3-меченных в пределах HUVECs требует соответствующих и воспроизводимые условия культивирования клеток для того, чтобы измерить и оценить изменения в росте MT и HUVEC морфологии, таким образом, что они затем могут быть назначены ЕСМ сигнализации кия. HUVECs представляют собой прекрасную модель для изучения формы и подвижность клеток. Они высоко поддаются трансфекции с флуоресцентно-меченых кДНК, они демонстрируют драматические морфологию в ответ как растворимых , так и физические сигналы сигнализации, и они сохраняют способность организовать себя в сосудистых трубок при условии соответствующих условий культивирования клеток 65-70. Первичные клеточные культуры, такие как HUVECs, требуют бережного обращения и контроля за номер сотового канала для того, чтобы обеспечить клетки здоровы, и что они будут вести себя нормально во время экспериментов. Например, при проведении экспериментов по исследованию cytoskeleт и / или морфологии клеток, HUVECs не должна использоваться для проведения экспериментов за пределами десятой клеточной культуры прохода, а HUVECs обычно начинают показывать неравномерные морфологию вокруг прохода двенадцати до пятнадцати.

Плотность клеток также является важным регулятором здоровья HUVEC и пролиферации. HUVEC ветвящиеся исследования (см протокол 10.1-10.4 выше) используют культуры относительно низкой плотности клеток, с тем чтобы обеспечить ячеек физического пространства для взаимодействия с их ECM и расширить разветвленные выступы. В противоположность этому, в изучении миграции раной краем (см протокол 10.5-10.8), HUVECs являются культура в монослое до ранению. Как таковые, раной край HUVECs отображения относительно снимите ветвистый морфологию, простираться передней кромки выступающих частей, и имеют межклеточные взаимодействия со своими ближайшими соседями, поскольку они мигрируют в рану.

Предостережения и преимущества слежения MT Динамика в жизни HUVECs.
Вращающемся диске микроскопии является отличным подходом кпроверить экспериментальные гипотезы, которые требуют конфокальной четкость изображения с высоким временным разрешением. При соответствующей камеры и лазерный модуль, этот микроскопию подход чувствителен к низкой флуоресценции излучения и может помочь в сниженной фотообесцвечиванию по сравнению с другими типами флуоресцентной микроскопии. Важно отметить, что этот подход также хорошо подходит для средних и высоких времени разрешающей способностью, как это требуется для выработки комплексных измерений динамики роста МТ с использованием маркировки подход EB3, во множестве различных типов клеток.

В то время как методология EB3 маркировки выращивания МТ плюс-концы имеет определенные преимущества по сравнению с другими методами флуоресцентной маркировки МЦ, он также имеет уникальные недостатки. Например, есть часть массива MT , который не активно растет в любой момент времени, в том числе как население дезассемблирование МЦ и населения Stábile, который нединамических МЦ 71-74. EB3 не маркировать эти две популяции МЦ иПоэтому вклад этих двух популяций не будут включены в экспериментальный анализ данных. Альтернативные методологии для оценки всего массива МТ сосредоточились на экспрессии флуоресцентно меченных тубулина, которая включает в себя во всех популяциях МЦ и позволяет идентифицировать растет, сокращается, и Stabile МЦ. Тем не менее, из-за относительно высокой плотности массива MT вблизи центра ячейки и рядом с микротрубочками организации центра (MTOC), маркировка весь массив МТ создает неудобство при выполнении анализа изображения концов МТ, которые не рядом с клеткой периферия 75-77. Эксперименты с использованием двухцветного совместного маркировки МЦ с флуоресцентным тубулина и флуоресцентного EB3 в живых клетках показали, качественно, что подавляющее большинство тубулина меченных МЦ также EB3 меченных 78. Кроме того, не было эффективным методом автоматизированного отслеживания МЦ, меченных флуоресцентной тубулина. Это означает, что данные COLLECния и измерения динамики МТ в клетках, экспрессирующих флуоресцентные тубулина требуют ручного отслеживания отдельных МЦ, процесс, который подвержен ошибкам и утомительным. В результате, автоматизированный вычислительный анализ EB3 меченый МЦ стала предпочтительным методологии для измерения динамики MT , как он может быть применен к МТ динамических экспериментов по многочисленным типам клеток и в различных экспериментальных режимах 35,79.

Связывание МТ Динамика роста к HUVEC морфологии и миграции.
С точки зрения исследователя цитоскелета, один чрезвычайно полезный адаптация plusTipTracker автоматизированного анализа отслеживания является возможность измерять и оценивать как целые клетки и региональные изменения в динамике роста МТ. Требование клетка, чтобы стать поляризованным является важнейшей предпосылкой для миграции направленной клеток. Как таковые, поляризованные сигналы сигнализации давно известны в качестве основных движущих факторов для направленной миграции клеток 30,31,51,54,56,80,81 2,82-87. Кроме того, в ответ на физические взаимодействия с ECM (например, соблюдение и размерностью mechanosensing), HUVECs модулировать их динамику МТ путем локального регулирования MAPs для стимулирования роста МТ в пределах удлиняя ветвистые выпячивания, и это служит для направления миграции HUVEC в направлении из кий 5,31,88. Таким образом, поляризация в ответ на внеклеточные сигналы сигнализации указывает на необходимость экспериментальной оценки локализованных изменений в динамике цитоскелета.

Одновременная живых клеток визуализации динамики МТ роста (с использованием EB3 подход) и миграции HUVEC клеток чрезвычайно трудно выполнить, потому что МЦ растут на временной шкале секунд, в то время как изменения в морфологии клеток и направленной миграции происходят на временной шкале часов. Тем не менее, оба процесса тесно Линкеd. Кроме того, непрерывное, быстрое отображение флуоресцентно-меченых EB3 на втором временном масштабе приводит к фотообесцвечиванию сигнала EB3. Попытки преодолеть эту проблему путем проведения коротких серий изображений из EB3 (серии 1-2 приобретения мин) через каждые 30 минут были успешными, но может быть достигнуто лишь в небольшом количестве КЭ, которые имели оптимальное выражение EB3 и что не показали неблагоприятных эффекты многократного лазерного излучения 5.

Альтернативный подход , который позволяет интерпретации , как динамика роста МТ способствуют изменениям в морфологии клеток и миграции является plusTipTracker область интереса (ROI) инструмента 35 (см протокол 6.6). Эта методика позволяет весь рост клеток МТ отслеживает быть подразделена на определенных пользователем областей, из которых дорожки роста MT затем могут быть извлечены и проанализированы. Например, сравнение "разветвленной" против "неразветвленных" областей клетки показали, что МЦ растут больше Sсмирен и более настойчиво в разветвленных регионах по сравнению с не ветвящегося периферии клетки 5. В поляризованном раной края HUVECs, сравнения передней кромки и задней кромки динамики роста МТ показали, что MCAK индуцированный MT разборки тормозится конкретно внутри передней кромки, но не заднюю кромку. Региональная оценка ведущих и хвостовых динамику роста края МТ в HUVECs, выражающие Rac1 и / или фосфорилирования мутанты MCAK дополнительно показали, что Rac1-индуцированной активации Aurora-киназы специфически и локально ингибирует MCAK активность в переднем крае управлять HUVEC поляризацию и направленную миграцию 31. Таким образом, сочетание автоматического отслеживания динамики роста МТ и региональной оценки динамики роста МТ в рамках разветвленных выступам и / или переднем крае раны края HUVECs позволило нам связать динамику роста МТ к HUVEC морфологии и миграции.

Описанные протоколы Дизайнd, чтобы обеспечить в целом простой и высокой повторяемостью методологии HUVEC культуры и экспериментального исследования. Тем не менее, многие детали протокола сложны и требуют много времени, которое, в свою очередь, предоставляет возможность ошибки или трудности в проведении экспериментальной методологии. В то время была предпринята попытка решить потенциальные проблемы по всему протоколу, здесь предусмотрено дополнительное, детальное устранение неполадок потенциальных проблем, которые являются менее распространенными или иным образом сокращенно нот в протоколах методологии.

В связи с покровные покрытия с полиакриламидных субстратов (Протокол 2.2), общая проблема, которая возникает сложный характер активации покровные стекла, муфта полиакриламида к стеклу, активизируя полиакриламида, а затем муфта ЕСМ в полиакриламида. Одним из наиболее трудным и потенциально проблематичным стадию культивирования HUVECs на гель фибронектина / полиакриламидном после воздействия на Полнаcrylamide покрытием покровные до 2 мм сульфо-SANPAH (этап 2.2.2.6, выше). Это имеет решающее значение для успеха культивирования HUVECs на этих подложках, что сульфо-SANPAH быть полностью удалены из экспериментальной системы ECM следующего сопряжения. Это может быть лучше всего достигается путем промывки с DDH 2 O и инкубирования покровные в DDH 2 O на шейкере в течение ночи. Если клетки, культивируемые на полиакриламидном ЕСМ не выживают, или если жизнеспособность меньше, чем ожидалось, увеличение и повторное промывание сульфо-SANPAH после конъюгации с фибронектином (этап 2.2.2.9) рекомендуется потенциально облегчить эту проблему.

Относящиеся к Протоколу 3 (кДНК трансфекции и HUVEC культуры на покровное), большое влияние на успех процедуры электропорации является обращение с HUVECs как во время трипсином клеток, чтобы удалить их из пластиковой колбы, и после завершения электропорации (шаги 3,3-3,4, выше). Крайне важно, чтобы заботитьсяполностью контролировать HUVECs в то время как в трипсин, и не должно превышать времени, необходимого для клеток "облавы" на поверхности колбы (обычно 1-2 мин). Чрезмерное время в трипсин является одной из основных причин смерти HUVEC, которая, как правило, не реализуется до тех пор, пока клетки не высевают на фибронектина покрытием покровные (шаг 3.4), а затем не прикрепляться к субстрату.

Такую же важность, HUVECs (и большинство типов первичных клеток) не преуспевают, когда приостанавливается в течение длительного времени в буфере электропорации. В ходе крупномасштабных экспериментов, например, когда пользователь имеет пять или более условий, которые требуют электропорации, то лучше сохранить клетки осаждали в отдельные пробирки (1 туба на трансфекцию) и смешать их, то один-на-времени , в электропорации буфере непосредственно перед электропорацией. Такой подход сводит к минимуму время инкубации в буфере электропорации и развернутом выживания HUVEC. Кроме того, немедленного спасения в полной культуральной среде также крitical следующие электропорации. задержки спасании одну минуту или более следующих электропорации может привести к почти полной гибели HUVEC и, таким образом, следует избегать.

Относящиеся миграцию клеток для анализа (протокол 9), методика культивирования HUVECs при чрезвычайно высокой плотности зависит от критической модификации (описанного в пункте 9.2) традиционных HUVEC методики культивирования клеток (описанной в Протоколе 3), что требует высыхание фибронектина покрытием покровное для того, чтобы дать возможность HUVEC культуру в очень небольшой площади покровного. Часто, если покровное не полностью высушены или, если предварительное покрытие покровного с фибронектином (шаги 2,1 или 2,2), не была эффективной, средства массовой информации, содержащих клетки, записываемый на покровное потеряет ее поверхностное натяжение и расширить до Края покровного стекла, тем самым снижая плотность клеток на покровное. Один из способов устранения этой потенциальной проблемы является аспирация носитель из покровного, а затемместо покровное (все еще в 35-мм блюдо) в задней части шкафа биологической безопасности в течение 5-10 мин. Это приспособление может помочь, чтобы позволить потоку воздуха внутри шкафа, чтобы помочь в сушке блюдо. Если какой-либо видимой жидкость остается на покровное после сушки на воздухе, аспирация жидкие пятна и снова дайте высохнуть на воздухе в течение 5-10 мин дополнительного в шкафу биологической безопасности. Важно отметить, что не существует никакого способа, чтобы полностью избежать этой проблемы, но это действительно становится меньше проблемы при повторном практике протокола. Кроме того, рекомендация поиск и устранение неисправностей, что при подготовке покровные для миграции клеток анализа (или любого анализа, в целом), чтобы подготовить дополнительные покровные и имеют дополнительные HUVECs готовые к использованию в случае возникновения проблем по пути.

С учетом этих соображений по устранению неполадок в виду, это также важно, чтобы подчеркнуть полезность обсуждаемых протоколов и их последствий в будущих исследованиях клеточной биологии. Применимость к polyacrиламид подход в широком диапазоне, и включает в себя не только двумерные исследования взаимодействия клеток ECM (описанного выше), но и трехмерные исследования 5. Это приложение имеет решающее значение для повышения нашего понимания того, как HUVECs регулировать форму и миграцию клеток в физиологических условиях и должны обеспечить исследователям общее представление о том, как морфологические изменения согласовываются с цитоскелета изменениями. В то время как протоколы, описанные здесь сосредоточены на измерении динамики роста МТ, большинство протоколов может и должен быть адаптирован для измерения любого количества других микроскопически измеряемыми аспектов клеточного ECM взаимодействий. Что касается динамики MT, есть множество карт, в том числе по крайней мере , 14 семей кинезинов 89, каждая из которых имеет потенциальную роль в содействии HUVEC полярности и направленной миграции, и все из которых могут быть исследованы с использованием протоколов , представленных.

Будущие исследования должныРБП быть направлены на взаимодействие клеток ECM в нормальных по сравнению с больными состояний. HUVEC протоколы, представленные здесь, применимы к исследованию нормальных сосудистых гомеостатических процессов, а также болезненных состояний, в том числе сердечно-сосудистые заболевания, ретинопатия, рост опухоли и метастазирование, чтобы назвать несколько. Связывая явно прозрачные ЕСМ и полиакриламида субстраты аменабельную соответствии с микроскопическими исследованиями позволит клеточной ECM обручальных исследований таким образом, что эндотелиальные клетки сосудистой ангиогенез можно наблюдать с высоким пространственным и временным разрешением. Эти типы экспериментальных подходов уже начали выявить важные различия в форме эндотелиальных клеток, полярности, миграции, а также эффекты белков , которые регулируют эти процессы 5,31,90. Дальнейшие усилия должны быть направлены на определение, как комбинация ECM соответствия и размерностью mechanosensing может служить для локального управления белков, которые нацелены и регулируют цитоскелета динамику.

Acknowledgments

Особая благодарность доктору Clare M. Waterman для наставничества и дискуссий, Мишель Baird и Майк Дэвидсон для обеспечения многих флуоресцентных кДНК конструкций, используемых в этих исследованиях, и Кэтрин Эпплгейт и Gaudenz Danuser для разработки программного обеспечения для анализа plusTipTracker MT. Эта работа была поддержана, в частности, за счет гранта Кам из Национального сердца легких и крови институт (NHLBI) и Национальный институт здоровья (NIH). (Грант: 4K22HL113069).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
  2. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
  3. Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
  4. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
  5. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
  6. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
  7. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
  8. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
  9. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
  10. Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  12. Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
  13. Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
  14. van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
  15. Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
  16. Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
  17. Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
  18. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
  19. Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
  20. Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
  21. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
  22. Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
  23. Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
  24. Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
  25. Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
  26. Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
  27. Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
  28. Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
  29. Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
  30. Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
  31. Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
  32. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
  33. Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
  34. Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
  35. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
  36. Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
  37. Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
  38. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138 (2014).
  39. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13 (2001).
  40. Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
  41. Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
  42. Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
  43. Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
  44. Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
  45. Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
  46. Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
  47. Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
  48. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
  49. Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
  50. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
  51. Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
  52. Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
  53. Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
  54. Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
  55. Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
  56. Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
  57. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
  58. Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
  59. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
  60. Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
  61. Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
  62. Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266 (2013).
  63. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636 (2013).
  64. Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
  65. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
  66. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  67. Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
  68. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601 (2012).
  69. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
  70. Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
  71. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  72. Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
  73. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
  74. Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
  75. Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
  76. Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
  77. Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
  78. Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
  79. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  80. Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
  81. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
  82. Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
  83. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569 (2013).
  84. Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
  85. Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
  86. Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
  87. Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833 (2013).
  88. Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
  89. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  90. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).

Tags

Клеточная биология выпуск 114 MCAK Аврора Rac1 микротрубочки эндотелиальные клетки ангиогенез электропорации флуоресцентная микроскопия живых клеток изображений
Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K.,… More

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K., Myers, K. A. High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (114), e54265, doi:10.3791/54265 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter