Abstract
연구, 질병 모델링, 제약 및 임상 적용을위한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 이점을 극대화 심근 비롯한 기능성 세포 유형의 대규모 생산을위한 견고한 방법이 필요하다. 여기에서 우리는 WNT, TGF-β, 및 SHH의 시간 조작 경로를 시그널링 정적 서스펜션과 교반 서스펜션 생물 반응기 시스템 모두에 단일 셀의 고효율 심근 분화 계대 hPSC 라인에 이르게 것을 보여줍니다. 이 전략을 채택하는 것은 지속적으로 여러 hPSC 라인에서 검증 배양 15 일 후> 80 % 심장 트로포 닌 T 양성 세포를 포함, ~ 100 % 상회 회전 타원체의 결과. 우리는 또한 현재 42 hPSC 라인에서 검증 된 성공있는 단일 세포 계대에 적응하지 세포주에 사용이 프로토콜의 변형에보고한다. 이러한 프로토콜을 사용하여 생성 된 심근는 혈통 특정 마커와 쇼 예상 electrophys을 표현학적 기능. 우리 프로토콜 인간 심장 근세포의 대규모 제조를위한 간단하고 효율적이고 강력한 플랫폼을 제공한다.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)와 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)를 포함하여, 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)는 세 개의 배아 배엽 -1,2-의 세포로 분화하는 자기 갱신 및 용량의 능력을 가지고있다. 때문에 이러한 특성으로, hPSCs 임상 응용 프로그램 8 가능성이 높은 처리량 약물 검사 및 독성 분석 6,7 대한 인간의 질병 3-5, 모델링 질환 관련 세포 유형의 생성과 확장 성 생산을위한 가치있는 무제한 소스를 제공하고, . hPSCs에서 심근 세포의 발생으로 인해 중요한 동물 모델의 결여 및 / 또는 영향을받는 주요 조직의 이용에 특별히 이전에 우리의 능력의 범위를 넘어서는 복잡한 인간 심혈관 질환의 메카니즘과 가능한 치료법을 조사 할 기회를 제공한다.
hPSCs (n)의 전술 응용 프로그램의 모든고도로 농축 된 기능성 심근 엄청난 수의 생산 ecessitate. 따라서,의 가용성이 중요 여러 hPSC 라인을위한 효율적인 재현 적합한 시험 관내 심장 분화 프로토콜의 확장 인. 종래 심근 분화 프로토콜은 사이토킨 11 단백질 전달 수단 (12)의 칵테일 배아 체 형성 9 공동 배양 기술 (10)로 유도 다양한 전략을 이용했다. 이러한 기술의 진보에도 불구하고, 여전히 가장 열악한 효율 고통 비싼 성장 인자를 필요로하거나 여러 hPSC 선을 사용하려고 할 때 제한적인 완전성을 제공한다. 지금까지, 이러한 과제는 동물 모델에서 세포 치료제 연구 hPSC 심근 유래의 생산 제한뿐만 아니라, 약물 발견 (13) 제약 산업을 설정했다. 따라서, 대형위한 강력하고 저렴한 기술의 개발확장 성 문화 시스템의 기능 hPSC 유래 심근의 -scale 생산은 주로 상업 및 임상 응용을 촉진한다.
이 논문에서는 고도의 대규모 생산을위한 방법을 포함하여 소스 및 배양 방법의 다양한 발생 hESCs는 및 hiPSCs 높은 효능, 재현성 및 적용과 비용 효율적인 통합 심장 분화 시스템의 개발 보고서 생물 반응기를 사용하여 hPSC 유래 심근 세포의 풍부한 인구. 또한, 우리는 새로 설립 된 hiPSCs 또는 질병 메커니즘의 분석과 관련 hPSC 라인의 대규모 코호트 무료 및 / 또는 단일 세포 배양 공급기하도록하지 hPSC 라인,이 프로토콜을 최적화했다.
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Protocol
문화 미디어, 미분화 hPSCs의 세포 배양 플레이트의 코팅 및 유지 보수 1. 준비
- 미디어 준비
참고 : 최대 4 주 동안 빛으로부터 보호 4 ° C에서 0.22 μm의 여과 장치와 저장소를 사용하여 미디어를 소독. 시약 이름, 공급 업체 및 카탈로그 번호는 자료 표에 나열되어 있습니다.- 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 매체, 445 mL의 DMEM 50 ml의 우 태아 혈청 (FBS) 및 5 mL의 세포 배양 배지 (예를 들면, 루타)를 결합한다.
- hESC의 매체, 390 ml의 녹아웃-DMEM (KO-DMEM), 100 ml의 넉 아웃 혈청 교환 (KO-SR), 5 ㎖ 세포 배양 배지, 5 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 0.5 ml를 55 밀리미터 β 머 캅토 에탄올을 결합한다.
주의 : β-머 캅토 에탄올 독성이다. 흡입, 섭취, 피부 접촉을 피하십시오. - RPMI-B27 (RB) 보통의 경우, 475 ml의 RPMI 1640을 결합, 10 ML의 B27 마이너스인슐린, 5 ㎖ 세포 배양 배지, 5 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액, 5 mL의 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 0.5 ml의 55 밀리미터 β 머 캅토 에탄올.
- 해리 용액 (DS)의 경우 10 ml의 0.05 % 트립신, 4 mL의 KO-SR 1 ㎖의 콜라게나 제 IV 형 (1 ㎎ / ㎖) 5 ㎖ KO-DMEM, 20 μL CaCl2를 (1 M)을 결합한다.
- 피더 세포 조정 배지를 들어,와 T75 플라스크에 (bFGF를 제외) 15 ml의 hESC의 매체를 추가 사기꾼 FL uent 이전에 하나 마이 토마 이신 C 또는 조사에 의해 처리에 의해 불 활성화 된 피더 세포 (섬유 아 세포 포피 MEF 또는 인간). 수확은 24 시간 후에 매체를 조절하고 신선한 hESC의 배지로 교체합니다. 세포는 최대 2 주에 사용될 수있다.
- 세포 배양 플레이트의 코팅
- ECM 젤 코팅 :
- 이 제조업체의 지침에 따라, 균일하게 일관된 액체 상태가 될 때까지 구매시, 4 ° C에서 전자 재료 젤 추출물을 해동. 비로 희석-20 ° C에서 추위 KO - DMEM 매체 나누어지는 및 저장에 2 : 1.
참고 : ECM 젤의 준비를하는 동안, aliquotting 및 코팅 절차 감기에 사용하기 위해 필요한 모든 자료를 보관하십시오. ECM 젤의 농도는 배치 번호에 따라 달라집니다. 농도가 분취에 기록되어 있는지 확인합니다. 분취 량은 최대 6 개월 동안 -20 ℃에서 유지 될 수있다. - 4 °의 C에서 ECM 젤 나누어지는을 녹여. 해동 경우 0.34 mg / ml의 최종 농도 차가운 KO-DMEM 배지를 추가한다. 피펫은 잘 6 잘 접시의 잘 하나 당 0.75 ml를 추가합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어.
- 이 제조업체의 지침에 따라, 균일하게 일관된 액체 상태가 될 때까지 구매시, 4 ° C에서 전자 재료 젤 추출물을 해동. 비로 희석-20 ° C에서 추위 KO - DMEM 매체 나누어지는 및 저장에 2 : 1.
- Mitotically 비활성화 된 마우스 배아 섬유 아세포 피더 세포 (MEF) 코팅
주 :. MEF 피더 세포의 제조는 전술 한 (14)- 코트 부착 인자 (AF) 또는 5 분 동안 실온에서 0.1 % 젤라틴 (단계 1.2.3 참조) (6 웰 플레이트의 한 웰 당 0.75 mL)와 함께 6 웰 세포 배양 플레이트.제거하고 건조하는 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에 판을 둡니다.
- 3 분 - 약 2 37 ° C의 물을 욕조에 얼어 붙은 병을 전송하여 MEF를 해동.
- 15 ML 튜브 7 ml의에게 MEF 매체를 추가합니다. 세포의 바이 얼을 해동되면 천천히 15ml를 튜브에 콘텐츠를 전송. 4 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 뜨는을 기음과 MEF 매체에 세포를 재현 탁.
- 세포를 카운트 6 웰 플레이트 (~ 1.7 × 10 5 세포 / 웰) 당 1 × 10 6 세포를 접시. 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 전송하고 세포가 O / N 사용하기 전에 첨부 할 수 있습니다.
- 젤라틴 코팅 :
- 용액 (/ V W) 0.1 %을 초순수에 젤라틴 분말 1g을 녹인다. 다음 15 분 동안 121 ° C에서 상기 용액을 오토 클레이브 37 ° C에서 15 분 동안 인큐베이션. 냉각되면, 웰 필요한 수 (6 웰 플레이트의 한 웰 당 0.75 ㎖)을 추가하고, 37 ℃에서 15 분 동안 배양한다.
- 용액 (/ V W) 0.1 %을 초순수에 젤라틴 분말 1g을 녹인다. 다음 15 분 동안 121 ° C에서 상기 용액을 오토 클레이브 37 ° C에서 15 분 동안 인큐베이션. 냉각되면, 웰 필요한 수 (6 웰 플레이트의 한 웰 당 0.75 ㎖)을 추가하고, 37 ℃에서 15 분 동안 배양한다.
- 라미닌 코팅 :
- 해동 될 때까지 4 ° C에서 라미닌 (1 ㎎ / ㎖)를 해동. 라미닌 용액의 5 ㎕를 위해, 차가운 PBS 1 ㎖를 추가합니다. 피펫은 그럼 우물 필요한 수의 (6 웰 플레이트의 한 웰 당 0.75 ㎖)을 추가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- 스피너 플라스크 내부 표면의 실리콘 코팅 :
- 철저하게 먼지 및 / 또는 문화 잔류 물을 제거하는 세척 브러시를 사용하여, 증류수 (1 유리 진자) 100 ml의 스피너 플라스크를 씻어. 70 % 에탄올 및 증류수로 30 분간 린스 한 후 채운다. 5 M NaOH를 추가하고 O / N 두십시오.
- NaOH 용액을 제거하고 5 분 동안 흐르는 물 플라스크를 헹군다. 1 M HCl로 플라스크를 작성하고 15 분 동안 둡니다. 완전 이중 증류수 회 후 5 분 동안 흐르는 물로 씻어 플라스크염산의 흔적을 제거합니다. BSC에 완전히 건조 플라스크를 남겨주세요.
- 플라스크에 siliconizing 솔루션의 1.5 ML을 추가하고 모든 표면을 커버하는 수평으로 회전합니다. 유리 진자에 대해 동일한 절차를 반복한다.
- 1 시간 동안 100 ℃에서 건조 오븐에 코팅 된 플라스크를 가열하거나 RT에서 O / N을 건조 할 수 있습니다. 60 분 - 오븐에서 가열하면, 30 RT로 냉각 떠난다.
- 15 분마다 플라스크를 탈 이온수로 3 회 헹군 후, 20 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브에 의해 멸균.
- ECM 젤 코팅 :
- 미분화 hPSCs의 유지 보수
주 : 특별히 언급하지 않는 한, 설명 된 프로토콜의 각 세포 성장 및 6 웰 배양 접시와 볼륨의 우물에서 배양하는 내용이 형식에 대한 적절한 설명한다.- 정적 서스펜션 시스템의 미분화 회전 타원체로 교양 hPSCs
참고 : 다음 단계에 사용되는 세포는 이미 적응해야단일 셀 문화. (15)- 80 % 컨 플루 - hPSCs는 약 6 웰 배양 판에 ECM 겔 (70)을 배양하여 실험을 시작합니다. BSC에의 실체를 사용하여 차별화 된 식민지를 제거합니다. 10 μM의 ROCK 저해제 Y-27632을 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
참고 : 차별화 된 식민지를 제거, 분리 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 실체 현미경 아래에서 수동으로 모든 차별화 된 부분을 제거합니다. 미분화 식민지를 제거하지 않도록주의하십시오. - 인큐베이터 및 흡인 매체로부터 세포를 제거합니다. PBS를 제거하고 0.5 ml의 세포 분해 효소를 추가 ㎖로 1 세포를 씻으십시오. 37 ° C에서 5 분 - 4 세포를 인큐베이션.
- 1 ml의 hESC의 배지를 첨가하고, 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확. p1,000 피펫을 사용하여 단일 세포로 세포를 떼어 놓다. 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
- 2 × 10 5 실행 가능한 C에 재현 탁 세포피더 세포 조정 배지에서 ELL 학생 / ㎖ 100 NG / ㎖의 bFGF, 10 μM의 ROCK 저해제 Y-27632 보충. 5 ml를 피펫 (6 웰 플레이트의 웰 당 3 ㎖)를 사용하여 매우 낮은 첨부 접시에 세포를 전송합니다.
- 이일 후, 조심스럽게 매체 (약 1.5 ㎖)의 인큐베이터 및 흡인 반에서 세포를 제거합니다. 100 NG / ㎖의 bFGF와 보충 신선한 컨디셔닝 배지로 교체합니다.
- 일 5. 지금까지 100 NG / ㎖의 bFGF와 보충 컨디셔닝 된 매체 중 하나를 추가로 배양 세포, 계속 미분화 문화 통로 (단계 1.3.1.2 - 5)와 매일 매체의 절반을 변경하거나 심장 분화 (2 절에 사용 ). 계속 문화의 경우, 통로 세포마다 4~8일.
- 80 % 컨 플루 - hPSCs는 약 6 웰 배양 판에 ECM 겔 (70)을 배양하여 실험을 시작합니다. BSC에의 실체를 사용하여 차별화 된 식민지를 제거합니다. 10 μM의 ROCK 저해제 Y-27632을 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- 피더 세포에 배양과 콜라게나 유형 IV를 사용하여 계대 hPSCs
- hPSCs를 계대하기 전에, BSC의 실체를 사용하여 차별화 된 식민지를 제거합니다. 매체를 대기음 1 ml의 세포를 씻어잘 당 PBS. 0.75 ㎖의 콜라게나 제 IV 형 (1 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, (5) 37 ℃에서 배양한다 제거 - 박리 시작 콜로니의 에지를 가질 필요에 따라 15 분.
- 대기음 콜라게나 제와 잘 당 hESC의 배지 1 ㎖를 추가합니다. 그 다음 15 ㎖의 튜브에 p1,000 피펫을 사용하여 세포를 전송하고, 셀 스크레이퍼를 사용하여 작은 클러스터 콜로니를 분리. 작은 조각으로 클러스터를 중단하지 않도록주의하십시오.
- 남아있는 세포를 수집하고 15 ML 튜브에 추가 우물 1 ml의 hESC의 매체를 씻으십시오. 2 분 동안 100 XG에 원심 분리기. 100 NG / ㎖의 bFGF로 보충 hESC의 배지 상등액과 세포를 재현 탁 대기음.
- 인큐베이터에서 MEF 코팅 된 플레이트를 제거하고 MEF 매체를 대기음. 적절한 1:10 3 : 1의 비율로 세포를 옮긴다. 100 NG / ㎖의 bFGF와 보충 신선한 hESC의 매체와 매체 매일 변경합니다. 통로 세포마다 4~8일.
- 정적 서스펜션 시스템의 미분화 회전 타원체로 교양 hPSCs
2. Differenti정적 서스펜션 시스템의 타원체로 hPSCs의 ATION
- 제 1.3.1 준비로 하루 5 미분화 회전 타원체를 사용하여 실험을 시작합니다.
참고 :이 단계에서, 회전 타원체의 평균 크기는 175 ± 25 μm의를해야한다. 분화 실험을 시작할 때 50 타원체의 최소 사용되어야한다. - 전송 5 ML의 피펫을 사용하여 15 ML 튜브에 회전 타원체. 나머지 타원체를 수집하고 동일한 15 ML 튜브에 추가 우물 1 ㎖의 RB 매체를 씻으십시오. 타원체가 느슨한 펠렛을 (원심 분리하지 마십시오)을 형성 침전 될 때까지 5 분 동안 세포를 남겨주세요. 어떤 타원체을하지 않도록주의, 뜨는을 대기음.
- 3 ml의 12 μM CHIR99021 보충 RB 매체를 추가합니다. 다시 6 자 초저 부착 판의 한 우물에 세포를 전송합니다. 24 시간 후, 단계 2.2를 반복합니다.
참고 : RB 매체는 민감한 빛입니다. RB 매체로 작업하는 경우, BSC 표시등이 꺼져 유지. - 에이DD 3 ml를 세포 펠렛에 RB 매체. 다시 6 자 초저 부착 판의 한 우물에 세포를 전송합니다. 24 시간 후, 단계 2.2를 반복합니다.
- (5 μM 각) IWP2, purmorphamine 및 SB431542 보충 3 ㎖ RB 매체를 추가합니다. 다시 6 자 초저 부착 판의 한 우물에 세포를 전송합니다. 이일 후 단계 2.2를 반복합니다.
- 세포가 부착 할 수 있도록 젤라틴 코팅 플레이트 RB 중간 전사 3 ㎖의 세포를 재현 탁.
주의 :이 단계에서 세포는 현탁액에서 유지 될 수있다. 정적 현탁 배양을 계속 초저 부착 판에 다시 세포를 전송하기 위해. - 이일 후 3 ㎖의 RB 매체와 매체를 변경합니다. 문화는 다음 날 이길 시작합니다. RB 매체와 4 일 - 매체마다 3을 변경합니다.
교반 서스펜션 생물 반응기의 회전 타원체로 hPSCs 3. 차별화
- 미분화 회전 타원체 문화와 함께 실험을 시작합니다최소 3 통로 정적 현탁액 D (섹션 1.3.1 참조). 10 μM의 ROCK 저해제 Y-27632을 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 5 ml를 피펫을 사용하여 15 ML 튜브에 모든 회전 타원체를 전송합니다. 나머지 타원체를 수집하고 동일한 15 ML 튜브에 추가 우물 1 ml의 hESC의 매체를 씻으십시오. 타원체가 느슨한 펠렛을 (원심 분리하지 마십시오)을 형성 침전 될 때까지 5 분 동안 세포를 남겨주세요. 어떤 타원체을하지 않도록주의, 뜨는을 대기음.
- 1 ml의 PBS를 추가하여 세포를 씻으십시오. 타원체가 느슨한 펠렛을 (원심 분리하지 마십시오)을 형성 침전 될 때까지 5 분 동안 둡니다. 상층 액을 제거하고 0.5 ml의 0.05 % 트립신 플러스 0.53 mM의 EDTA를 추가합니다. 37 ° C에서 5 분 - 4 세포를 인큐베이션.
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 1 ml의에게 hESC의 매체를 추가 할 수 있습니다. p1,000 피펫을 사용하여, 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 세포를 계산, 단일 세포로 세포를 떼어 놓다. 2 × 10 5 viab에 재현 탁조건화 된 배지에서 제작 세포 / ml 100 NG / ㎖의 bFGF, 10 μM의 ROCK 저해제 Y-27632 보충.
- 한 진자와 실리콘 처리 생물 반응기 플라스크에 세포 현탁액을 100 ml의 이동 (섹션 1.2.5 참조). 35 rpm으로 교반하여 40 rpm으로 24 시간 증가 후에 시작합니다.
- 모든 회전 타원체가 플라스크의 바닥에 정착 할 때까지 10 분 - 48 시간 후, 5 교반을 중지합니다. 100 NG / ㎖의 bFGF와 보충 컨디셔닝 매체와 매체의 절반을 교체합니다. 5 일까지 같은 과정마다 24 시간을 반복합니다.
주의 :이 단계에서 175 ± 25 ㎛의 평균 크기로 미분화 구 상체를 형성한다. - 모든 회전 타원체가 플라스크의 바닥에 정착 할 때까지 10 분 - 5 교반을 중지합니다. 매체 (이하 50 ㎖)의 최소량에 50 ㎖ 튜브에 모두 타원체 전송. 주의 깊게 더 회전 타원체는 용기에 남아되지 않습니다 보장 생물 반응기 플라스크에 남아있는 매체를 폐기하십시오.
- LEAV전자는 5 - 모든 회전 타원체는 50 ML 튜브의 바닥에 정착 할 때까지 10 분 조심스럽게 느슨한 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. 모든 타원체 다시 느슨한 펠렛을 형성하고 50 ㎖ 튜브의 바닥에 침전 될 때까지 10 분 - 5 다음 다시두고, 칼슘 및 마그네슘 또는 RB 배지 25 ml의 PBS로 세척 하였다.
- 조심스럽게 상층 액을 제거하고 40 ml의 12 μM CHIR99021, 10 μM 바위 억제제 및 0.1 % 폴리 비닐 알코올 (PVA)로 보충 RB 매체를 추가합니다. 타원체를 재현 탁하고 생물 반응기 플라스크에 다시 모든 세포를 전송합니다. 총 부피 100ml로 만들기 위해 매체를 추가합니다. 24 시간 40 rpm에서 교반를 다시 시작합니다.
참고 : RB 매체는 민감한 빛입니다. 빛의 BSC를 유지 RB 매체로 작업 할 때 모드를 전환했다. - 반복 3.7 단계 - 3.8.
- 조심스럽게 상층 액을 제거하고 중간 0.1 % PVA 보충 된 40 ml의 RB를 추가합니다. 타원체를 재현 탁하고 t에 다시 모든 셀을 전송그는 플라스크 생물 반응기. 총 부피 100ml로 만들기 위해 매체를 추가합니다. 24 시간 40 rpm에서 교반를 다시 시작합니다.
- 반복 3.7 단계 - 3.8.
- 조심스럽게 (5 μM 각) 상층 액을 제거하고 40 ml의에게 IWP2, purmorphamine 및 SB431542 보충 RB 매체를 추가합니다. 타원체를 재현 탁하고 생물 반응기 플라스크에 다시 모든 세포를 전송합니다. 총 부피 100ml로 만들기 위해 매체를 추가합니다. 2 일간 40 rpm에서 교반를 다시 시작합니다.
- 반복 3.7-3.8 단계.
- 조심스럽게 상층 액을 제거하고 40 ml의에게 RB 매체 만 추가 할 수 있습니다. 타원체를 재현 탁하고 생물 반응기 플라스크에 다시 모든 세포를 전송합니다. 총 부피 100ml로 만들기 위해 매체를 추가합니다. 40 rpm에서 교반를 다시 시작합니다. 72 시간 이상 - 잔 타원체 48 관찰해야한다.
- 모든 회전 타원체가 용기의 바닥에 침전 될 때까지 10 분 - 5의 교반을 중지하여 사일 RB 매체 - 매 3 매체의 절반을 변경합니다. 조심스럽게 회전 타원체와 caref을 방해하지 않고 매체의 50 ㎖를 제거ully 신선한 RB 배지 50 ㎖로 교체합니다.
문화를 사용 hPSCs 4. 차별화는 싱글 셀과 Passaging에 적응하지
주 :이 방법은 단일 세포 배양 기술 엄청나게 노동 집약적이고 시간 소모적 인 프로세스에 적응하지 않고도 hPSC 라인들의 높은 수의 신속한 분화 특히 유용하다. 이 기술은 신설 hPSC 라인 효소 적 세포 해리 매우 민감한 세포주에 적용 할 수있다.
- 80 % 합류 - 약 70이다 (1.3.2 절에서와 같이) MEF에서 배양 hPSCs 실험을 시작합니다. BSC에의 실체를 사용하여 차별화 된 식민지를 제거합니다.
- 매체 제거하고 0.5 ml의 해리 솔루션 (DS)를 추가합니다. MEF 세포가 반올림하고 hPSCs 식민지의 가장자리가 명확하게 될 때까지 1 분 - 0.5에 대한 품어. 신속 DS를 제거하고 0.75 ㎖의 콜라게나 제 IV 형 (1 ㎎ / ㎖)을 추가한다.
- 품다37 ° C에서 15 분 - 5 세포. 전체 식민지가 꺼져 들어 올려 분리, 제거 콜라게나 제를 1.5 ml의 hESC의 매체를 추가하기 시작 때 배양 기간 동안 현미경으로 세포를 확인하고.
참고 : 15 분은 식민지의 대부분이 여전히 부착 한 후, 인큐베이터에 다시 세포를 넣어합니다. 현미경 매 5 분에서 세포를 확인합니다. 30 분 동안 콜라게나 제의 셀을 떠나지 않도록주의하십시오. 콜라게나 제 용액에서 많은 부동 콜로니가 존재하는 경우, 콜라게나 제를 제거하지 않는다; 단지 1 ml의 hESC의 매체를 추가 할 수 있습니다. - p1,000 피펫을 사용하여 부드럽게 식민지로 전체 식민지를 분리 피펫. 작은 조각으로 식민지를 중단하지 마십시오. 5 ml를 피펫을 사용하여 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다. 같은 튜브에 추가 남아있는 세포를 수집하기 위해 1 ml의 hESC의 배지로 잘 씻으십시오. 모든 식민지 (원심 분리하지 마십시오) 침전 될 때까지 5 분 동안 둡니다.
- 조심스럽게 상층 액을 제거하고 2 ml의에게 hESC의의 메디칼 추가음 100 NG / ㎖의 bFGF를 보충. 5 ml의 피펫 (24 웰 플레이트의 각 웰에 1 ㎖의 6 웰 플레이트의 각 웰에 3 ㎖)를 사용하여 초저 부착 플레이트에 세포를 옮긴다. 적어도 6 시간 (12 시간 최대) 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어.
- 이 기간 동안 단계 4.7에 대한 라미닌 - 코팅 된 웰 / 판의 필요한 수를 준비합니다. 추천 셀 전송 비율은 24 웰 플레이트 (또는 면적당 당량) 2 웰, 6 웰 플레이트의 한 웰 합류한다.
- 6 시간 후, 조심스럽게 5 ML의 피펫을 사용하여 15 ML 튜브에 식민지 집계를 전송합니다. 나머지 집계를 수집하고 동일한 15 ML 튜브 (24 웰에 대한 웰 당 0.5 ml의 6 웰 플레이트에 잘 당 1 ㎖)에 추가 RB 매체와 접시를 씻으십시오. 조심스럽게 뜨는을 대기음, 집계 침전물 때까지 5 분을 기다립니다. 느슨한 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 2 ㎖의 RB 매체는 12 μM CHIR99021 보충 조심스럽게 전송 추가(섹션 1.2.4에서와 같이) 귀하의 사전 준비 라미닌 코팅 된 웰에 5 ml를 피펫으로 세포가 부착 할 수 있도록합니다.
- 24 시간 후, 신중하게 잘 각각의 매체를 제거하고 1 ml의에게 RB 매체 만 추가 할 수 있습니다.
주 : 집합체의 일부는 배양 접시에 아주 약하게 부착 것이다; 그러므로 매체의 변화 과정에서 느슨해 질 수있는 큰 집계를 제거하지하는 것이 중요합니다. 그것은 중요하지만, 가능한 한 작은 세포 파편만큼 제거한다. - 24 시간 후, 조심스럽게 (5 μM 각) 매체를 제거하고 IWP2, purmorphamine 및 SB431542 보충 RB 매체를 추가합니다.
- RB 매체 만 2 일 후 매체를 변경합니다. 세포는 다음 날 이길 시작합니다.
- RB 매체 만에 4 일 - 매 3 매체를 변경합니다.
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Representative Results
hPSCs에서 심근 세포의 대규모 분화하기위한 간단한 방법을 확립하기 위해, 우리는 (16)과 후속 WNT의 억제제로 세포를 WNT / β 카테닌 활성제 (CHIR99021)로 처음 처리 하였다하는 프로토콜을 작성 / β- 카테닌 및 변형 성장 인자 β (TGF-β) 경로 (IWP2 16 SB431542 (17), 각각)와 소닉 고슴도치 (SHH) 통로 (purmorphamine)의 마지막 활성제 (17) (그림 1A). 우리 분화 전략에서, 구 상체의 약 50 % (175 ±은 구형 직경 크기가 25 μm의) 후,이 프로토콜을 이용하여 흥미로운 일 10 100 %로 증가 분화의 개시 후 7 일 치기 시작 분화 타원체가 관찰되었다 차별화 개시 18 후 60 일까지 치고 계속합니다. 해리 타원체에 인구 연구유동 세포 계측법에 의해 시험 셀보다 12 % 평활근 및 내피 세포 마커 (3.1 % 폰 Willibrand 인자 양성 동안 매일 15, 인구의 90 % 이상, 심장 트로포 닌 T의 양 (cTnT의 +) 세포를 함유하는 것으로 밝혀 (vWF의 +), 8.4 % 알파 평활근 액틴 양성 (ASMA +)) 18. 지금까지 정적 서스펜션 분화 프로토콜은 서로 다른 hPSC 라인 (그림 1B) 사이에이 프로토콜의 높은 재현성을 보여, 각 라인에서 타원체를 상회의 약 90 %의 결과 출력을, 5 hESC의 4 hiPSC 라인에서 테스트되었습니다.
인간 심장 근세포의 대규모 생산을위한 통합 플랫폼을 개발하기 위해, 우리는 교반 현탁 생물 반응기 (도 2a)에가는 정적 현탁 분화 전략을 적용 하였다. 차별화 스페 로이드는 생물 반응기 전자에서 비슷한 동작을 보여 주었다nvironment 정적 시스템 (그림 2B) 및 회전 타원체의 약 100 % 관찰로 (18). 면역 염색 일 cTnT를하고 심장 전사 인자 NKX2-5에 대한 항체를 사용하여 30에서 수집 된 타원체를 치고 섹션에 하루 10 박동 수, 보여 주었다 이 단백질은 각각 (그림 2C)의 세포질과 핵 식입니다. 분화 배양 15 일 후 볼륨 작업 100 ㎖에 1 억 셀 - 동적 현탁 배양 세포의 총 수율은 약 90이었다. 단 전지로서 hPSCs 확장 상에 접종 20,000,000 시작 hPSCs에서 -이 경우에도, 심근 수율 (90 % 분화 효능 관찰 60) 약 54-90000000 세포까지 도달 할 수있다. 우리는 추가로 단일 셀 패치 클램프 법을 이용하여 차별화 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성을 조사 하였다. 생물 반응기 배양에서 타원체를 치는 것은이었다전체 셀 패치 클램프 기술을 이용하여 대표적인 셀에 기록 된 일 (30) 및 작업 전위에서 단일 세포로 해리. 데이터는 하나의 셀 (18)의 인구의 3 주 심장 세포 유형 (atrial-, nodal- 심실 유사 세포)의 존재를 보여 주었다.
위에서 언급 한 두 가지 분화 기법, hPSCs 피더 무료 및 / 또는 단일 세포 현탁 배양 19-21에 적응 될 필요가있다. 일부 hPSC 라인은 그러나, 효소 세포 분리에 매우 민감하고 새로 설립 hiPSC 라인에서 관찰 할 수와 같은 분리 후 상당한 세포 생존 능력의 손실을 보여줍니다. 또한, 대형 공급기없는 모든 적응 라인의 동료, 및 단일 세포 배양 작업을 할 때하는 것은 엄청난 노동 집약적이고 시간이 소모 될 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 미분화 타원체가 미분화 세포 집합체 (도 3a)으로 대체 하였다.우리의 데이타는이 수정 된 기술을 사용하여, 구타 클러스터 7 일 분화 개시 후 나타난 것을 나타낸다. 이 수정 된 버전의 재현성은 모든 시험 선 (그림 3B) 수행 각각의 실험 일 (15)에 의해 평균 60 % 이상 cTnT를 + 세포에서 생성 된 42 hiPSC 라인을 사용하여 확인 하였다. 해리 구타 클러스터에서 cTnT를하고 NKX2-5에 대한 사용하여 항체를 면역 염색은 세포질과 핵 발현, 각각 (그림 3C)를 보여 주었다.
의 효율성 그림 1. 정적 정지 및 대표 데이터에 hPSCs에서 심근 분화의 도식. (A) 정적 서스펜션 시스템의 심근에 hPSCs 분화 실험 설계. (B) 평가심장 박동 차별화 타원체 (%)의 수를 카운트함으로써 측정된다. 5 hESC의 4 hiPSC 라인 (18)의 각각에서 적어도 3 분화 실험의 평균은 현재 위치 표시. 모든 라인에서 타원체를 상회의 전체 평균은 약 90 %이다. 오류 바 SD를 나타냅니다 (N = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다이나믹 서스펜션 시스템의 심근에 hPSCs 분화 그림 2. 동적 정지 및 대표 데이터에 hPSCs에서 심근 세포 분화의 전체 회로도. (A) 실험 설계. RI : 락 억제제 (B) 5 일 타원체의 위상 대비 이미지 (대표 연구) 아양 H5 hESC의 줄에서 esult. hESC의의 스케일 바 200 μm의 (C) 면역 염색은 유도를 제패 한 NKX2.5와 cTnT를위한 하루 30 단면 회전 타원체를. 스케일 바 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 단일 셀과 Passaging에 적응하지 배양을 사용 hPSCs에서 심근 분화의 전체 회로도. 해리의 (A) 단일 세포 계대에 적응하지 배양을 사용하여 심근에 hPSCs 분화 실험 설계. (B) 해리 집계 분석 (42) 테스트 hiPSC 라인에서 평균 60 % 이상 cTnT를 + 세포에 게재 유동 세포 계측법. (C) 면역 염색 심근 세포에서 파생 된NKX2.5와 cTnT를 (646-4 hiPSC 줄에서 대표적인 결과)에 대한 hiPSCs. 스케일 바 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
hPSCs로부터 유도 된 심근은 아마도 미래에 회생 인간 질병 치료 모델링, 약물 스크리닝 / 독성 시험에 사용하기에 매우 매력적이며 소스. 그러나, 이들 세포를 사용하는 주요 장애물 중 하나는, 그 유효 이용을 위해 충분히 높은 품질의 재료를 제공 할 수있는 능력이다. 우리의 설명 프로토콜을 사용하여, 우리는이 한계를 극복하는 방법을 제공합니다.
최근 cardiogenesis 관련된 특정 신호 전달 경로를 표적 합성 소분자는 심장 분화 16,17,22,23을 향상시키기 위해 설명되었다. 이들은 이제 재조합 사이토 카인 혈청 많은 정의 요소를 포함하고 배치 변화를 나타내는 대안으로 사용되고있다. 특이성 이외 소분자 프로토콜의 주요 장점은 저렴하고 구성 요소는 일반적으로 사이토 카인 또는 성장 인자를 함유하는 매체와 비교하여 연장 된 저장 수명을 가지고 있다는. 우리보고 프로토콜에서 사용되는 작은 분자는 저 분자량 화제는, 그들은 구조적 및 기능적으로 정의되며 세포막 (24, 25)을 통해 쉽게 확산 될 수있다.
지금까지 다양한 방법이 강력하고 확장 분화 기술을 확립하기 위해 hPSCs에 적용된; 그러나, 이러한 방법의 대부분은 가난한 확장 성 및 균일 성을 제공 할 수 2D 및 소규모 정적 문화로 설립되었습니다. 이러한 강제 응집 미세 인쇄 기술 및 마이크로 캐리어 배양 26-29 같은 기술은 현재 사용되어오고 있지만,이 영역의 일부 진보에도 불구하고, 이러한 방법은 높은에서의 용도에 필요한 세포 수를 제공 멀리 여전히 -demand 시스템. 제한 또는 검증되지 않은 재현성 및 확장 성, 때문에 hPSCs의 확대와 C에 대한 그들의 지시 분화 모두 비싼 미디어 (mTeSR1 또는 StemPro-34) 또는 마이크로 캐리어의 필요성에 높은 비용ardiomyocytes 30,31 높은 처리량 hPSCs 기술에 이러한 방법을 사용하는 단점이있다.
본 연구에서는 hPSC 유래 심근 세포의 생산을위한 간단하고 강력하고 확장 가능한 프로토콜을보고했다. 이 프로토콜의 재현성은 40 개 이상의 서로 다른 hPSC 라인을 검증되었습니다, 가장 광범위한 검증이 날짜로 보도했다. 이전에보고 된 서스펜션 프로토콜에 비해,이 방법은 생성 된 심근의 확장 성, 재현성, 저렴한 가격, 효능과 기능면에서 큰 장점을 보여줍니다. 우리 분화 프로토콜의 성공은 연구에 사용 hPSCs의 높은 품질에 완전히 의존한다. 그러므로 각 행의 핵형 및 실험 시작 전 면역 및 PCR에 의한 다 능성 마커 높고 지속적인 발현을 확인하는 것이 중요하다. 바이오 리액터에서 세포를 배양 할 때, 특히, 한 ㄴ hPSCs를 사용하는 중요EEN 분화의 개시 이전에 적어도 세 개의 통로를위한 단일 셀 레벨에서 계대. 우리의 프로토콜에서는 5 일 이후에 생성 된 타원체했다 175 ± 25 μm의 평균 크기와 회전 타원체를 사용하고 있습니다. 타원체 개별 hPSC 라인의 성장 속도에 따라 달라질 수도 크기 제한을 충족 일; 그러므로 크기 성장의 일 이상이 고려되는 것이 중요하다.
이 프로토콜은 또한 민감한 세포주 hPSC 라인 큰 집단에 적합하도록 조작 될 수있다. 고농축 심근이 프로토콜의 결과이지만, 순도는 락 테이트가 풍부한 배지 32 대사 선택 방법으로 분화 프로토콜을 결합하여 개선 될 수있다. 또한,이 프로토콜에 기재된 유도 된 심근 세포의 성숙 및 기능 향상이 입체 정렬 심장의 발생에 의해 도포 될 수있다(33) 어떤 조직이. 이 프로토콜의 제한 중 하나는 심근 세포의 특정 서브 타입은 특히 심방, 심실 및 림프절 세포의 단순한 혼합물을 생성하지 않는 점이다. 이 필드의 추가 연구가 대규모로 고도로 농축 된 아형 특이 심근 세포를 생산할 수있는 분화 프로토콜을 개발할 필요가있다. 일부 작은 크기의 프로토콜이 현재까지 개발되어 왔지만, 상기 방법은 엄격하게 스케일 업 (34) 수 있도록 테스트 할 필요가있을 것이다.
집적 플랫폼 개발 임상, 제약, 조직 공학을위한 hPSC 유래 심근 기술의 상업화를위한 중요한 단계로 고려 체외 장기 / organoid 개발 응용 될 수있다.
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Disclosures
빅터 창 심장 연구소에 관여하지 않으며, 연구를위한 인간 배아의 파괴를 묵과 않습니다. 이 연구에 기여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 작동하도록 제한되었다.
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
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