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Developmental Biology

मानव स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत छोटे अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54276
Automatic Translation
*1,2,3,8, *1,8, 1, 6,7, 1, 6,7, 2,3,4, *2,3, *1,5
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran
* These authors contributed equally

Abstract

मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) अनुसंधान, रोग मॉडलिंग, दवा और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए के लाभ को अधिकतम cardiomyocytes सहित कार्यात्मक सेल प्रकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मजबूत तरीकों की आवश्यकता है। यहाँ हम दिखाना है कि WNT, TGF-β, और श के अस्थायी हेरफेर रास्ते संकेतन दोनों स्थिर निलंबन और हड़कंप मच गया निलंबन बायोरिएक्टर प्रणाली में एकल कोशिका की अत्यधिक कुशल cardiomyocyte भेदभाव passaged hPSC लाइनों की ओर जाता है। यह रणनीति काम ~ 100% की धड़कन spheroids के परिणामस्वरूप, लगातार संस्कृति के 15 दिनों के बाद> 80% हृदय ट्रोपोनिन टी पॉजिटिव कोशिकाओं, कई hPSC लाइनों में मान्य हैं। हम यह भी सेल लाइनों वर्तमान में एकल कोशिका passaging, सफलता, जिनमें से 42 hPSC लाइनों में सत्यापित किया गया है के लिए अनुकूल नहीं के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल के विभिन्नता पर रिपोर्ट। इन प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न cardiomyocytes वंश विशेष मार्करों और शो की उम्मीद व्यक्त करते electrophysiological कार्यक्षमताओं। हमारी प्रोटोकॉल मानव cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक सरल, कुशल और मजबूत मंच प्रस्तुत करता है।

Introduction

मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs), मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) सहित तीन भ्रूण रोगाणु परतों 1,2 की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए आत्म नवीकरण और क्षमता की क्षमता है। इन विशेषताओं के कारण, hPSCs नैदानिक ​​अनुप्रयोगों 8 के लिए मानव रोग 3-5, उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता assays 6.7 के लिए मॉडलिंग के लिए रोग-प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं की पीढ़ी और स्केलेबल उत्पादन के लिए एक मूल्यवान और असीमित स्रोत प्रदान करते हैं और संभावित । hPSCs से cardiomyocytes की पीढ़ी प्रासंगिक पशु मॉडल की कमी और / या प्रभावित प्राथमिक ऊतकों की उपलब्धता के कारण विशेष रूप से जटिल मानव हृदय रोगों के तंत्र और उनके उपचार संभव है, पहले अपनी क्षमताओं के दायरे से बाहर की जांच करने का अवसर प्रदान करता है।

hPSCs n के ऊपर उल्लिखित आवेदन के सभीअत्यधिक समृद्ध और कार्यात्मक cardiomyocytes की भारी संख्या के उत्पादन ecessitate। इस प्रकार, की उपलब्धता एक कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और कई hPSC लाइनों के लिए इन विट्रो हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल में स्केलेबल उपयुक्त महत्वपूर्ण है। परम्परागत cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल ऐसे embryoid शरीर गठन 9, सह संस्कृति तकनीक 10, प्रेरण 11 साइटोकिन्स और प्रोटीन पारगमन तरीकों 12 के कॉकटेल के साथ ही विभिन्न रणनीतियों कार्यरत है। इन तकनीकों के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, अधिकांश अभी भी, गरीब दक्षता से ग्रस्त महंगा विकास के कारकों की आवश्यकता होती है, या सीमित सार्वभौमिकता की पेशकश करते हैं जब कई hPSC लाइनों का उपयोग करने का प्रयास। तिथि करने के लिए, इन चुनौतियों पशु मॉडल में सेल थेरेपी की पढ़ाई के लिए hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes के उत्पादन के लिए सीमा है, साथ ही में दवाओं की खोज 13 के लिए दवा उद्योग की स्थापना की है। इसलिए, बड़े के लिए मजबूत और सस्ती तकनीक का विकासस्केलेबल संस्कृति प्रणालियों में कार्यात्मक hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes के -scale उत्पादन काफी हद तक उनके व्यावसायिक और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों की सुविधा होगी।

इस पांडुलिपि में, हम उच्च प्रभावकारिता, reproducibility और hESCs और hiPSCs स्रोतों और अत्यधिक के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक विधि सहित संस्कृति तरीकों की एक किस्म से उत्पन्न करने के लिए प्रयोज्यता के साथ एक लागत प्रभावी और एकीकृत हृदय भेदभाव प्रणाली के विकास के लिए रिपोर्ट एक बायोरिएक्टर का उपयोग कर hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes के समृद्ध आबादी। इसके अतिरिक्त, हम स्वतंत्र और / या एकल कोशिका संस्कृति फीडर के लिए अनुकूल नहीं hPSC लाइनों, इस तरह के नव स्थापित hiPSCs या रोग तंत्र के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक hPSC लाइनों की बड़ी साथियों के रूप में के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलित है।

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Protocol

1. संस्कृति, मीडिया, सेल संस्कृति प्लेटों की कोटिंग और undifferentiated hPSCs का रख-रखाव की तैयारी

  1. मीडिया तैयारी
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस से 4 सप्ताह के लिए प्रकाश से संरक्षित पर एक 0.22 माइक्रोन निस्पंदन डिवाइस और दुकान का उपयोग कर मीडिया जीवाणुरहित। अभिकर्मक के नाम, आपूर्तिकर्ताओं और सूची संख्या सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं।
    1. के लिए माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEF) मध्यम, 445 मिलीलीटर DMEM, 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 5 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया (जैसे, Glutamax) गठबंधन।
    2. hESC माध्यम के लिए, 390 मिलीलीटर नॉकआउट-DMEM (KO-DMEM), 100 मिलीलीटर नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (को-एसआर), 5 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया, 5 मिलीलीटर सदस्य न्यूनतम आवश्यक अमीनो एसिड समाधान और 0.5 मिलीलीटर 55 मिमी β-mercaptoethanol गठबंधन।
      चेतावनी: β-Mercaptoethanol विषैला होता है। साँस लेना, घूस और त्वचा से संपर्क करने से बचें।
    3. के लिए RPMI-B27 (आरबी) मध्यम, 475 मिलीलीटर RPMI 1640 गठबंधन, 10 मिलीलीटर B27 शून्यइंसुलिन, 5 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया, 5 मिलीलीटर सदस्य न्यूनतम आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.5 मिलीलीटर 55 मिमी β-mercaptoethanol।
    4. हदबंदी समाधान (डी एस) के लिए, 10 मिलीलीटर 0.05% trypsin, 4 मिलीलीटर KO-एसआर, 1 मिलीलीटर collagenase प्रकार चतुर्थ (1 मिलीग्राम / एमएल), 5 मिलीलीटर KO-DMEM और 20 μl CaCl 2 (1 एम) गठबंधन।
    5. फीडर सेल वातानुकूलित माध्यम के लिए, के साथ एक T75 फ्लास्क को 15 मिलीलीटर hESC मध्यम (bFGF बिना) जोड़ने चोर FL uent फीडर कोशिकाओं (MEF या मानव fibroblasts चमड़ी), जो पहले से है तो mitomycin सी के साथ या विकिरण द्वारा उपचार द्वारा निष्क्रिय कर दिया गया। हार्वेस्ट 24 घंटे के बाद वातानुकूलित मध्यम और ताजा hESC मध्यम के साथ बदलें। कोशिकाओं को 2 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. सेल संस्कृति प्लेटों की कोटिंग
    1. ईसीएम जेल कोटिंग:
      1. खरीद पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर ईसीएम जेल निकालने गल जब तक यह एक समान रूप से लगातार तरल अवस्था में है, निर्माता के निर्देशों के अनुसार। अनुपात में पतला2 ठंड KO-DMEM मध्यम, -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान में: 1।
        नोट: ईसीएम जेल की तैयारी के दौरान, सभी सामग्री aliquotting और कोटिंग प्रक्रिया ठंड में उपयोग के लिए आवश्यक रखने के लिए। ईसीएम जेल की एकाग्रता बैच नंबर के साथ बदलता रहता है। सुनिश्चित करें एकाग्रता aliquots पर उल्लेख किया है। Aliquots अप करने के लिए 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ईसीएम जेल विभाज्य पिघलना। जब thawed, 0.34 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ठंड KO-DMEM मध्यम जोड़ें। पिपेट अच्छी तरह से और एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से प्रति 0.75 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. Mitotically निष्क्रिय माउस भ्रूण fibroblast फीडर सेल (MEF) कोटिंग
      नोट:। MEF फीडर कोशिकाओं की तैयारी पहले से वर्णित किया गया है 14
      1. कोट 6 अच्छी तरह से अनुलग्नक फैक्टर (वायुसेना) या 0.1% जिलेटिन (कदम 1.2.3 देखें) 5 मिनट के लिए आरटी पर (6 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से प्रति 0.75 एमएल) के साथ सेल संस्कृति की थाली।निकालें और जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) सुखाने के लिए प्लेट में छोड़ दें।
      2. 3 मिनट - लगभग 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान करने के लिए एक जमे हुए शीशी के हस्तांतरण से MEF गला लें।
      3. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को 7 मिलीलीटर MEF मध्यम जोड़ें। जब कोशिकाओं की शीशी thawed है, धीरे-धीरे 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सामग्री हस्तांतरण। 4 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और MEF मध्यम में कोशिकाओं resuspend।
      4. कोशिकाओं की गणना और प्रति 6 अच्छी तरह से थाली (~ 1.7 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) 1 × 10 6 कोशिकाओं थाली। एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर पर स्थानांतरण और कोशिकाओं संलग्न करने के लिए हे / एन उपयोग करने से पहले अनुमति देते हैं।
    3. जिलेटिन कोटिंग:
      1. (डब्ल्यू / वी) समाधान के लिए एक 0.1% बनाने के लिए ultrapure पानी में जिलेटिन पाउडर का 1 ग्राम भंग। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं तो 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर समाधान आटोक्लेव। जब ठंडा, कुओं की अपेक्षित संख्या (एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से प्रति 0.75 एमएल) के लिए जोड़ सकते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. Laminin कोटिंग:
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर laminin (1 मिलीग्राम / एमएल) गला लें जब तक thawed। laminin समाधान के 5 μl करने के लिए, ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। पिपेट अच्छी तरह से तो कुओं की अपेक्षित संख्या (एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से प्रति 0.75 एमएल) के लिए जोड़ सकते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    5. स्पिनर फ्लास्क आंतरिक सतह की सिलिकॉन कोटिंग:
      1. अच्छी तरह से आसुत जल के साथ (1 गिलास पेंडुलम के साथ) एक 100 मिलीलीटर स्पिनर कुप्पी धोने, किसी भी धूल और / या संस्कृति के अवशेषों को हटाने के लिए एक सफाई ब्रश का उपयोग। 70% इथेनॉल के साथ और बाद में आसुत जल के साथ 30 मिनट कुल्ला भरें। 5 एम NaOH जोड़ें और छोड़ हे / एन।
      2. NaOH समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए पानी चलाने के अंतर्गत फ्लास्क कुल्ला। 1 एम एचसीएल के साथ कुप्पी भरें और 15 मिनट के लिए छोड़ दें। पूरी तरह से करने के लिए डबल आसुत जल के साथ दो बार 5 मिनट, तो पानी के लिए चलाने के साथ कुप्पी धोएचसीएल के किसी भी निशान को हटा दें। कुप्पी छोड़ दो बीएससी में पूरी तरह से सूखे के लिए।
      3. फ्लास्क siliconizing समाधान के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें और क्षैतिज बारी बारी से सभी सतहों को कवर करने के लिए। कांच पेंडुलम के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ।
      4. 1 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी ओवन में लेपित कुप्पी गर्मी या आरटी पर हे / एन सूखे के लिए अनुमति देते हैं। 60 मिनट - अगर एक ओवन में गरम किया, 30 के लिए आरटी को शांत करने के लिए छोड़ दें।
      5. 15 मिनट प्रत्येक के लिए फ्लास्क कुल्ला विआयनीकृत पानी के साथ 3 बार, फिर 20 मिनट के लिए 121 सेल्सियस पर autoclaving द्वारा बाँझ।
  3. Undifferentiated hPSCs का रखरखाव
    नोट:,     वर्णित प्रोटोकॉल के प्रत्येक जब तक विशेष रूप से कहा गया है, कोशिकाओं हो गई है और 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों और मात्रा के कुओं में संवर्धित कर रहे हैं के लिए इस प्रारूप के लिए उपयुक्त दिया जाएगा।
    1. एक स्टेटिक निलंबन प्रणाली में Undifferentiated Spheroids के रूप में संवर्धित hPSCs
      नोट: इन चरणों में इस्तेमाल किया कोशिकाओं को पहले से ही करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिएएकल कोशिका संस्कृति। 15
      1. प्रयोग शुरुआत के साथ hPSCs पर लगभग 70 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में ईसीएम जेल पर सुसंस्कृत - 80% confluency। बीएससी में stereomicroscope का उपयोग किसी भी भेदभाव कालोनियों निकालें। 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
        नोट: अलग-अलग कालोनियों को हटाने के लिए, एक विंदुक टिप का उपयोग अलग करने के लिए और धीरे stereomicroscope के तहत स्वयं सभी अलग-अलग भागों को हटा दें। अविभाजित कालोनियों को दूर करने के लिए सावधान रहें।
      2. इनक्यूबेटर और महाप्राण मध्यम से कोशिकाओं निकालें। एमएल पीबीएस, हटाने और 0.5 मिलीलीटर सेल हदबंदी एंजाइम को जोड़ने 1 के साथ कोशिकाओं को धो लें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट - 4 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      3. 1 मिलीलीटर hESC मध्यम जोड़ें और एक सेल खुरचनी का उपयोग कोशिकाओं फसल। एक p1,000 पिपेट का उपयोग एकल कक्षों में कोशिकाओं को अलग कर देना। Trypan नीले और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना।
      4. 2 × 10 5 व्यवहार्य सेल्सियस तक Resuspend कोशिकाओंफीडर सेल वातानुकूलित माध्यम में एल / एमएल 100 एनजी / एमएल bFGF और 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 के साथ पूरक। अल्ट्रा कम लगाव एक 5 मिलीलीटर पिपेट (6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 3 मिलीग्राम) का उपयोग प्लेटों कोशिकाओं स्थानांतरण।
      5. 2 दिन बाद, ध्यान इनक्यूबेटर और मध्यम (लगभग 1.5 एमएल) के महाप्राण आधे से कोशिकाओं को निकाल दें। ताजा वातानुकूलित 100 एनजी / एमएल bFGF के साथ पूरक माध्यम के साथ बदलें।
      6. वातानुकूलित माध्यम जब तक 5. दिन अब 100 एनजी / एमएल bFGF के साथ पूरक है, या तो आगे संस्कृति कोशिकाओं, जारी रखा undifferentiated संस्कृति के लिए पारित होने (कदम 1.3.1.2 - 5) के साथ हर दिन मध्यम के आधे बदलें, या हृदय भेदभाव (धारा 2 के लिए उपयोग )। जारी रखने के संस्कृति, तो पारित होने कोशिकाओं हर 4 - 8 दिन।
    2. hPSCs फीडर कोशिकाओं पर सभ्य और कोलेजिनेस प्रकार चतुर्थ का उपयोग passaged
      1. hPSCs passaging पहले, बीएससी में stereomicroscope का उपयोग किसी भी अलग-अलग कालोनियों को हटा दें। मध्यम Aspirate और 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोनेअच्छी तरह से प्रति पीबीएस। उसके बाद 0.75 मिलीग्राम collagenase प्रकार चतुर्थ (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए और 5 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते निकालें - के रूप में कालोनियों बंद छील करने के लिए शुरू के किनारों के लिए आवश्यक है, 15 मिनट।
      2. महाप्राण कोलैजिनेज़ और अच्छी तरह से प्रति hESC माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक सेल खुरचनी का उपयोग छोटे समूहों के लिए कालोनियों को अलग करें, तो एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक p1,000 पिपेट का उपयोग कोशिकाओं को हस्तांतरण। सावधान नहीं छोटे टुकड़ों में समूहों को तोड़ने के लिए किया जाना है।
      3. अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर hESC मध्यम धो किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 15 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ने के लिए। 2 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र। hESC मध्यम 100 एनजी / एमएल bFGF के साथ पूरक में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं aspirate।
      4. इनक्यूबेटर से एक MEF लेपित थाली निकालें और MEF मध्यम aspirate। के बीच 1 के अनुपात में कोशिकाओं स्थानांतरण: 3 और 1:10, के रूप में उपयुक्त। ताजा hESC मध्यम 100 एनजी / एमएल bFGF के साथ पूरक के साथ मध्यम दैनिक परिवर्तन। 8 दिन - पैसेज हर 4 कोशिकाओं।

2. Differentiएक स्टेटिक सस्पेंशन सिस्टम में spheroids के रूप में hPSCs की समझना

  1. धारा 1.3.1 में तैयार के रूप में दिन का उपयोग कर 5 undifferentiated spheroids प्रयोग शुरू करें।
    नोट: इस स्तर पर, spheroids का औसत आकार 175 ± 25 माइक्रोन होना चाहिए। 50 spheroids की एक न्यूनतम जब एक भेदभाव प्रयोग शुरू किया जाना चाहिए।
  2. स्थानांतरण एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में spheroids। अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर आरबी मध्यम धो किसी भी शेष spheroids इकट्ठा करने और एक ही 15 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ने के लिए। 5 मिनट के लिए छोड़ दें जब तक कोशिकाओं spheroids एक ढीला गोली (अपकेंद्रित्र नहीं है) के रूप में sedimented है। सतह पर तैरनेवाला Aspirate, किसी भी spheroids लेने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा।
  3. 3 मिलीग्राम आरबी मध्यम 12 माइक्रोन CHIR99021 के साथ पूरक जोड़ें। वापस 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव थाली के एक कुएं में कोशिकाओं स्थानांतरण। 24 घंटे के बाद, 2.2 कदम दोहराएँ।
    नोट: आरबी मध्यम प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। जब आरबी माध्यम के साथ काम कर रहे हैं, बीएससी प्रकाश बंद रहते हैं।
  4. एडीडी 3 मिलीग्राम सेल गोली आरबी माध्यम। वापस 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव थाली के एक कुएं में कोशिकाओं स्थानांतरण। 24 घंटे के बाद, 2.2 कदम दोहराएँ।
  5. 3 मिलीग्राम आरबी मध्यम IWP2, purmorphamine और SB431542 के साथ पूरक जोड़ें (प्रत्येक 5 माइक्रोन) के। वापस 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव थाली के एक कुएं में कोशिकाओं स्थानांतरण। 2 दिनों के बाद 2.2 कदम दोहराएँ।
  6. कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए एक जिलेटिन लेपित थाली करने के लिए आरबी मध्यम और हस्तांतरण के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
    नोट: इस चरण में, कोशिकाओं को भी निलंबन में रखा जा सकता है। आदेश, स्थिर निलंबन संस्कृति के साथ जारी रखने के लिए कोशिकाओं को एक अल्ट्रा कम लगाव प्लेट पर वापस करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए।
  7. 2 दिनों के बाद 3 मिलीग्राम आरबी माध्यम के साथ मध्यम बदलें। संस्कृतियों के अगले दिन हरा करने के लिए शुरू कर देंगे। आरबी माध्यम के साथ 4 दिन - मध्यम बदलें हर 3।

एक उभारा निलंबन बायोरिएक्टर में spheroids के रूप में hPSCs 3. भेदभाव

  1. अविभाजित spheroids संस्कृति के साथ प्रयोग शुरू करेंकम से कम 3 मार्ग के लिए स्थिर निलंबन में डी (धारा 1.3.1 देखें)। 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने और एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सभी spheroids हस्तांतरण। अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर hESC मध्यम धो किसी भी शेष spheroids इकट्ठा करने और एक ही 15 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ने के लिए। 5 मिनट के लिए छोड़ दें जब तक कोशिकाओं spheroids एक ढीला गोली (अपकेंद्रित्र नहीं है) के रूप में sedimented है। सतह पर तैरनेवाला Aspirate, किसी भी spheroids लेने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा।
  3. 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। 5 मिनट के लिए छोड़ दें जब तक spheroids एक ढीला गोली (अपकेंद्रित्र नहीं है) के रूप में sedimented है। तैरनेवाला निकालें और 0.5 मिलीलीटर 0.05% trypsin प्लस 0.53 मिमी EDTA जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट - 4 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने और 1 मिलीलीटर hESC माध्यम जोड़ें। एक p1,000 पिपेट का उपयोग करना, एकल कक्षों में कोशिकाओं को अलग कर देना Trypan नीले और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती। करने के लिए 2 × 10 5 viab ResuspendLe वातानुकूलित माध्यम में कोशिकाओं / एमएल 100 एनजी / एमएल bFGF और 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 के साथ पूरक।
  5. 1 पेंडुलम के साथ siliconized बायोरिएक्टर फ्लास्क में सेल निलंबन के 100 एमएल हस्तांतरण (धारा 1.2.5 देखें)। 35 आरपीएम आंदोलन के साथ और बाद में 40 rpm के लिए 24 घंटा वृद्धि शुरू करो।
  6. 48 घंटे के बाद, 5 के लिए आंदोलन रोक - 10 मिनट तक सभी spheroids कुप्पी के नीचे करने के लिए तय हो चुका है। 100 एनजी / एमएल bFGF के साथ पूरक वातानुकूलित माध्यम के साथ मध्यम के आधे बदलें। 5 दिन तक एक ही प्रक्रिया को दोहराएं हर 24 घंटा।
    नोट: इस स्तर पर, 175 ± 25 माइक्रोन के एक औसत आकार के साथ undifferentiated spheroids का गठन किया जाना चाहिए।
  7. 5 के लिए आंदोलन बंद करो - 10 मिनट तक सभी spheroids कुप्पी के नीचे करने के लिए तय हो चुका है। मध्यम (कम से कम 50 एमएल) की एक न्यूनतम राशि में एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सभी spheroids स्थानांतरण। बायोरिएक्टर फ्लास्क में किसी भी शेष मध्यम त्यागें, ध्यान से यह सुनिश्चित करने के लिए कोई spheroids के बर्तन में शेष रहे हैं।
  8. leavई 5 के लिए - 10 मिनट तक सभी spheroids 50 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे बसे हैं तो ध्यान से सतह पर तैरनेवाला ढीला सेल गोली बाधा पहुँचा के बिना हटा दें। कैल्शियम और मैग्नीशियम या आरबी माध्यम के साथ 25 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो लें, तो 5 के लिए फिर से छोड़ - जब तक सभी spheroids 50 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे बसे हैं फिर एक ढीला गोली फार्म के लिए 10 मिनट।
  9. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 40 मिलीलीटर आरबी मध्यम 12 माइक्रोन CHIR99021, 10 माइक्रोन रॉक अवरोध और 0.1% पाली विनाइल शराब (PVA) के साथ पूरक जोड़ें। spheroids Resuspend और सभी कोशिकाओं को बायोरिएक्टर कुप्पी को वापस हस्तांतरण। मध्यम कुल मात्रा 100 मिलीलीटर बनाने के लिए जोड़ें। 24 घंटे के लिए 40 rpm पर आंदोलन को पुनरारंभ करें।
    नोट: आरबी मध्यम प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। जब आरबी माध्यम के साथ काम कर रहे प्रकाश में बीएससी रखने मोड बंद कर दिया।
  10. दोहराएँ कदम 3.7 के - 3.8।
  11. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 40 मिलीलीटर आरबी मध्यम 0.1% PVA के साथ पूरक जोड़ें। spheroids Resuspend और सभी कोशिकाओं टी करने के लिए वापस हस्तांतरणवह कुप्पी बायोरिएक्टर। मध्यम कुल मात्रा 100 मिलीलीटर बनाने के लिए जोड़ें। 24 घंटे के लिए 40 rpm पर आंदोलन को पुनरारंभ करें।
  12. दोहराएँ कदम 3.7 के - 3.8।
  13. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला (प्रत्येक 5 सुक्ष्ममापी) को हटाने और 40 मिलीलीटर आरबी मध्यम IWP2, purmorphamine और SB431542 के साथ पूरक जोड़ें। spheroids Resuspend और सभी कोशिकाओं को बायोरिएक्टर कुप्पी को वापस हस्तांतरण। मध्यम कुल मात्रा 100 मिलीलीटर बनाने के लिए जोड़ें। 2 दिनों के लिए 40 rpm पर आंदोलन को पुनरारंभ करें।
  14. दोहराएँ 3.7-3.8 कदम।
  15. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और केवल 40 मिलीलीटर आरबी माध्यम जोड़ें। spheroids Resuspend और सभी कोशिकाओं को बायोरिएक्टर कुप्पी को वापस हस्तांतरण। मध्यम कुल मात्रा 100 मिलीलीटर बनाने के लिए जोड़ें। 40 rpm पर आंदोलन को पुनरारंभ करें। 72 घंटा बाद - बैरंग spheroids 48 मनाया जाना चाहिए।
  16. 10 मिनट तक सभी spheroids पोत के नीचे करने के लिए तय हो चुका है - केवल 5 के लिए आंदोलन को रोकने के द्वारा आरबी माध्यम के साथ 4 दिन - हर 3 में से आधे से मध्यम बदलें। ध्यान से spheroids और caref परेशान बिना माध्यम के 50 मिलीलीटर को दूरully ताजा आरबी माध्यम के 50 मिलीलीटर के साथ बदलें।

4. संस्कृतियों का उपयोग hPSCs के भेदभाव सिंगल सेल Passaging के अनुकूल नहीं

नोट: यह दृष्टिकोण एकल कोशिका संवर्धन तकनीक, एक अत्यधिक श्रम प्रधान और समय लेने वाली प्रक्रिया के लिए अनुकूल करने के लिए बिना hPSC लाइनों के एक उच्च संख्या के तेजी से भेदभाव के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। इस तकनीक को इस तरह के नव स्थापित hPSC लाइनों के रूप में सेल लाइनों जो अत्यधिक enzymatic सेल हदबंदी के प्रति संवेदनशील हैं, के लिए लागू है।

  1. 80% मिला हुआ - (धारा 1.3.2 के रूप में) MEF पर संवर्धित hPSCs जो लगभग 70 हैं के साथ प्रयोग शुरू करें। बीएससी में stereomicroscope का उपयोग किसी भी भेदभाव कालोनियों निकालें।
  2. मध्यम निकालें और 0.5 मिलीलीटर हदबंदी समाधान (डी एस) जोड़ें। 0.5 के लिए सेते हैं - 1 मिनट तक MEF कोशिकाओं गोल है और hPSCs कालोनियों के किनारों स्पष्ट हो गया है। जल्दी डी एस हटाने और 0.75 मिलीग्राम collagenase प्रकार चतुर्थ (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें।
  3. सेते37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट - 5 के लिए कोशिकाओं। ऊष्मायन अवधि के दौरान खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें, और जब पूरे कालोनियों लिफ्ट बंद करने के लिए और अलग है, हटाने कोलैजिनेज़ और 1.5 मिलीलीटर hESC मध्यम जोड़ने शुरू कर रहे हैं।
    नोट: यदि बाद 15 मिनट कालोनियों के अधिकांश अभी भी जुड़े होते हैं, इनक्यूबेटर वापस करने के लिए कोशिकाओं डाल दिया। माइक्रोस्कोप हर 5 मिनट के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें। सावधान अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए collagenase में कोशिकाओं को छोड़ने के लिए नहीं हो। collagenase समाधान में कई अस्थायी कालोनियों देखते हैं, तो कोलैजिनेज़ को दूर नहीं करते; सिर्फ 1 मिलीलीटर hESC माध्यम जोड़ें।
  4. एक p1,000 पिपेट का प्रयोग, धीरे कालोनियों के रूप में पूरे कालोनियों अलग करने के लिए पिपेट। छोटे टुकड़ों में कालोनियों मत तोड़ो। एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण। 1 मिलीलीटर hESC माध्यम के साथ अच्छी तरह से धो ही ट्यूब में जोड़ने के लिए किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए। 5 मिनट के लिए छोड़ दें जब तक सभी कालोनियों sedimented है (अपकेंद्रित्र नहीं है)।
  5. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 2 मिलीलीटर hESC मेडी जोड़नेउम 100 एनजी / एमएल bFGF के साथ पूरक। एक अल्ट्रा कम लगाव 5 मिलीलीटर पिपेट (24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर और एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 3 मिलीग्राम) का उपयोग कर थाली में कोशिकाओं स्थानांतरण। कम से कम 6 घंटा (12 घंटा की अधिकतम) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  6. इस समय के दौरान, कदम 4.7 के लिए laminin लेपित कुओं / प्लेटों के लिए आवश्यक संख्या में तैयार करते हैं। अनुशंसित सेल हस्तांतरण अनुपात एक 24 अच्छी तरह से थाली (या सतह क्षेत्र के प्रति बराबर राशि) के 2 वेल्स को 6 अच्छी तरह से थाली के 1 मिला हुआ अच्छी तरह से कर रहे हैं।
  7. 6 घंटे के बाद, ध्यान से 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कॉलोनी समुच्चय हस्तांतरण। आरबी माध्यम के साथ थाली धो किसी भी शेष समुच्चय को इकट्ठा करने और एक ही 15 मिलीलीटर ट्यूब (24 अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से प्रति 0.5 मिलीग्राम और 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर) को जोड़ने के लिए। समुच्चय तलछट तक 5 मिनट रुको, तो ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate। ढीले गोली परेशान नहीं सावधान रहें।
  8. जोड़ें 2 मिलीलीटर आरबी मध्यम 12 माइक्रोन CHIR99021 के साथ पूरक और ध्यान का स्थानांतरणअपने पूर्व तैयार laminin लेपित कुओं के लिए एक 5 मिलीलीटर पिपेट (धारा 1.2.4 के रूप में) के साथ कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  9. 24 घंटे के बाद, ध्यान से प्रत्येक में मध्यम अच्छी तरह से हटाने के लिए और केवल 1 मिलीलीटर आरबी माध्यम जोड़ें।
    नोट: समुच्चय के कुछ ही संस्कृति की थाली करने के लिए बहुत कमजोर संलग्न किया जाएगा; इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि किसी भी बड़े समुच्चय है जो मध्यम परिवर्तन की प्रक्रिया के दौरान ढीला आया हो सकता है को दूर करने के लिए नहीं। यह महत्वपूर्ण है, हालांकि, संभव के रूप में छोटे सेल मलबे के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए।
  10. 24 घंटे के बाद, ध्यान से मध्यम (प्रत्येक 5 माइक्रोन) के हटाने और आरबी मध्यम IWP2, purmorphamine और SB431542 के साथ पूरक जोड़ें।
  11. आरबी मध्यम के साथ ही 2 दिनों के बाद मध्यम बदलें। प्रकोष्ठों अगले दिन हरा करने के लिए शुरू कर देंगे।
  12. आरबी मध्यम के साथ ही 4 दिन - मध्यम बदलें हर 3।

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Representative Results

/ Β- आदेश hPSCs से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर भेदभाव के लिए एक सरल विधि की स्थापना करने के लिए, हम 16 और बाद में WNT के अवरोधकों के साथ एक प्रोटोकॉल है जो कोशिकाओं एक WNT / β-catenin उत्प्रेरक (CHIR99021) के साथ शुरू में इलाज किया गया बनाया catenin और बदलने वृद्धि कारक β (TGF-β) रास्ते (IWP2 16 और SB431542 17, क्रमशः) और अंत में ध्वनि का हाथी (श्श्श) मार्ग (purmorphamine) के एक उत्प्रेरक 17 (चित्रा 1 ए)। हमारे भेदभाव रणनीति में, spheroids के लगभग 50% (175 ± 25 माइक्रोन अंडाकार आकृति व्यास आकार) भेदभाव है, जो तब दिलचस्प बात यह दिन 10 से 100% की वृद्धि हुई, इस प्रोटोकॉल का उपयोग की दीक्षा के बाद 7 दिनों पीटना शुरू कर दिया, भेदभाव spheroids देखा गया है भेदभाव दीक्षा 18 के बाद 60 दिन तक मार जारी है। अलग spheroids पर जनसंख्या अध्ययनप्रवाह cytometry द्वारा जांच से पता चला है कि 15 दिन में, जनसंख्या का 90% से अधिक, हृदय ट्रोपोनिन टी सकारात्मक (cTnT +) कोशिकाओं को समाहित करते हुए कोशिकाओं के कम से कम 12% चिकनी मांसपेशियों और endothelial मार्कर (3.1% वॉन Willibrand फैक्टर के लिए सकारात्मक थे (vWF +), 8.4% अल्फा चिकनी पेशी actin पॉजिटिव (Asma +)) 18। तिथि करने के लिए, स्थिर निलंबन भेदभाव प्रोटोकॉल प्रत्येक पंक्ति से spheroids की धड़कन, विभिन्न hPSC लाइनों (चित्रा 1 बी) के बीच इस प्रोटोकॉल के उच्च reproducibility दिखाने का लगभग 90% है, जिसके परिणामस्वरूप outputs के साथ, 5 hESC और 4 hiPSC तर्ज पर परीक्षण किया गया है।

आदेश में मानव cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक एकीकृत मंच विकसित करने के लिए हम एक उभारा निलंबन बायोरिएक्टर (2A चित्रा) के लिए हमारी स्थिर निलंबन भेदभाव रणनीति लागू होता है। फर्क spheroids में बायोरिएक्टर ई समान व्यवहार से पता चलाnvironment स्थिर प्रणाली (चित्रा 2 बी) में और spheroids के लगभग 100% मनाया गया के रूप में 30 cTnT और हृदय प्रतिलेखन कारक NKX2-5 खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग दिन पर एकत्र spheroids पिटाई की वर्गों में 18। Immunostaining 10 दिन पर पिटाई किए जाने की, पता चला ये प्रोटीन, क्रमशः (चित्रा 2 सी) के cytoplasmic और परमाणु अभिव्यक्ति। भेदभाव संस्कृति के 15 दिनों के बाद मात्रा काम कर 100 मिलीलीटर में 100 मिलियन कोशिकाओं - गतिशील निलंबन संस्कृति में कोशिकाओं की कुल उपज लगभग 90 थी। 20 मिलियन शुरू hPSCs, एकल कक्षों के रूप में hPSCs विस्तार के चरण में टीका से - इस मामले जा रहा है, cardiomyocyte उपज लगभग 54-90 मिलियन कोशिकाओं (90% भेदभाव प्रभावकारिता मनाया 60 के साथ) तक पहुंच सकता है। हम इसके अतिरिक्त एकल कोशिका पैच दबाना विधि का उपयोग विभेदित cardiomyocytes के electrophysiological गुण की जांच की। बायोरिएक्टर संस्कृतियों से spheroids पीट रहे थेपूरे सेल पैच दबाना तकनीक का उपयोग प्रतिनिधि कोशिकाओं पर दर्ज दिन 30 और कार्रवाई की क्षमता पर एकल कक्षों में अलग। डेटा एकल कक्षों 18 की आबादी में तीन मुख्य हृदय प्रकार की कोशिकाओं (atrial-, nodal- और वेंट्रिकुलर कोशिकाओं की तरह) की उपस्थिति देखी गई।

दो भेदभाव से ऊपर उल्लेख किया तकनीकों के लिए, hPSCs फीडर से मुक्त और / या एकल कोशिका निलंबन संस्कृति 19-21 के लिए अनुकूलित किया जा करने की जरूरत है। कुछ hPSC लाइनों हालांकि, अत्यधिक enzymatic सेल हदबंदी के प्रति संवेदनशील हैं और हदबंदी के बाद महत्वपूर्ण सेल व्यवहार्यता हानि, जैसे नव स्थापित hiPSC लाइनों में मनाया जा सकता है दिखाने के लिए। साथ ही, जब लाइनों की बड़ी साथियों, फीडर से मुक्त करने के लिए सभी अनुकूल और एकल कोशिका संस्कृति के साथ काम कर काफी श्रम गहन और समय लगता होगा। इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, undifferentiated spheroids undifferentiated सेल समुच्चय (चित्रा 3) के साथ बदल दिया गया था।हमारे आंकड़े बताते हैं कि इस संशोधित तकनीक का उपयोग कर, की धड़कन समूहों 7 दिन भेदभाव दीक्षा के बाद दिखाई दिया। इस संशोधित संस्करण के reproducibility 42 hiPSC लाइनों, जहां सभी परीक्षण पंक्तियाँ एक प्रयोग किया (चित्रा 3 बी) के लिए 15 दिन से औसत 60% से अधिक cTnT + कोशिकाओं पर उत्पन्न का उपयोग कर पुष्टि की गई। अलग समूहों में पिटाई के cTnT और NKX2-5 खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग Immunostaining cytoplasmic और परमाणु अभिव्यक्ति, क्रमशः (चित्रा 3 सी) दिखाया।

आकृति 1
चित्रा 1। स्टेटिक सस्पेंशन और प्रतिनिधि डेटा में hPSCs से cardiomyocyte भेदभाव के योजनाबद्ध। (ए) स्थिर निलंबन प्रणाली में cardiomyocytes को hPSCs भेदभाव की प्रायोगिक डिजाइन। (बी) की दक्षता का मूल्यांकनहृदय की धड़कन भेदभाव spheroids (%) की संख्या की गणना के द्वारा मापा जाता है। यहाँ दिखाया 5 hESC और 4 hiPSC लाइनों 18 में से प्रत्येक से कम से कम 3 भेदभाव प्रयोगों के औसत हैं। सभी लाइनों से spheroids पिटाई की कुल औसत लगभग 90% है। त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व एसडी (एन = 3)। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
गतिशील निलंबन प्रणाली में cardiomyocytes को hPSCs भेदभाव की चित्रा 2। गतिशील निलंबन और प्रतिनिधि डेटा में hPSCs से cardiomyocytes भेदभाव के समग्र योजनाबद्ध। (ए) प्रायोगिक डिजाइन। आरआई: रॉक अवरोध (बी) के दिन 5 spheroids के चरण विपरीत छवि (प्रतिनिधि आरRoyan H5 hESC लाइन से esult)। स्केल बार 200 माइक्रोन (सी) hESC की Immunostaining निकाली गई पिटाई NKX2.5 और cTnT के लिए दिन के 30 में sectioned spheroids। स्केल बार 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3। सिंगल सेल Passaging के अनुकूल नहीं संस्कृतियों का उपयोग hPSCs से cardiomyocytes भेदभाव के समग्र योजनाबद्ध। (ए) एकल कोशिका passaging के लिए अनुकूल नहीं संस्कृतियों का उपयोग cardiomyocytes को hPSCs भेदभाव की प्रायोगिक डिजाइन। (बी) से फ्लो अलग समुच्चय के विश्लेषण के औसत 60% से अधिक cTnT + 42 परीक्षण किया hiPSC लाइनों में कोशिकाओं पर दिखा। (सी) अलग से Immunostaining cardiomyocytes से निकाली गईNKX2.5 और cTnT (646-4 hiPSC लाइन से प्रतिनिधि परिणाम) के लिए hiPSCs। स्केल बार 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

hPSCs से निकाली गई cardiomyocytes, पुनर्योजी उपचारों शायद भविष्य में मानव रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग / विषाक्तता परीक्षण में इस्तेमाल के लिए एक अत्यंत आकर्षक स्रोत हैं और। हालांकि इन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए प्रमुख बाधाओं में से एक, उनके प्रभावी उपयोग के लिए पर्याप्त उच्च गुणवत्ता की सामग्री प्रदान करने की क्षमता है। हमारे वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, हम एक तरीका है कि इस सीमा पर काबू पा प्रदान करते हैं।

हाल ही में, सिंथेटिक छोटे विशिष्ट संकेतन कार्डियोजेनेसिस में शामिल रास्ते को लक्षित अणुओं हृदय भेदभाव 16,17,22,23 बढ़ाने के लिए वर्णित किया गया है। ये अब पुनः संयोजक साइटोकिन्स और सीरम, कई कारकों अपरिभाषित युक्त और बैच बदलाव दिखा लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है। एक छोटा सा अणु प्रोटोकॉल, अपनी विशिष्टता के अलावा अन्य का मुख्य लाभ यह सस्ती और घटक कारकों आम तौर पर साइटोकिन्स या वृद्धि कारक युक्त मीडिया की तुलना में एक विस्तारित शैल्फ जीवन है वह यह है कि। के रूप में छोटे हमारे सूचना प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अणुओं कम आणविक भार एजेंट हैं, वे संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप में परिभाषित कर रहे हैं और कोशिका झिल्ली 24,25 के माध्यम से आसानी से फैलाना कर सकते हैं।

अब तक विभिन्न तरीकों आदेश मजबूत, स्केलेबल भेदभाव तकनीकों की स्थापना के लिए hPSCs करने के लिए लागू किया गया है; हालांकि, इन तरीकों में से सबसे अधिक 2 डी और छोटे पैमाने पर स्थिर संस्कृतियों, जो गरीब scalability और एकरूपता प्रदान कर सकता है के रूप में स्थापित किया गया है। ऐसे मजबूर एकत्रीकरण, सूक्ष्म मुद्रण प्रौद्योगिकी और माइक्रो-वाहक संस्कृतियों 26-29 के रूप में तकनीक अब उपयोग में आ रहे हैं, लेकिन इस क्षेत्र में कुछ अग्रिम के बावजूद, इन तरीकों सेल उच्च में उनके उपयोग के लिए आवश्यक संख्या उपलब्ध कराने से दूर भी कर रहे हैं मांग सिस्टम। लिमिटेड या अप्रमाणित reproducibility और scalability, और दोनों hPSCs के विस्तार और सी के लिए उनकी निर्देशित भेदभाव के लिए महंगा मीडिया (mTeSR1 या StemPro -34) या सूक्ष्म वाहक के लिए आवश्यकता के कारण उच्च लागतardiomyocytes 30,31, उच्च throughput hPSCs प्रौद्योगिकियों में इन तरीकों का उपयोग करने की कमियां हैं।

इस अध्ययन में, हम hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes के उत्पादन के लिए एक सरल, मजबूत और स्केलेबल प्रोटोकॉल की सूचना है। इस प्रोटोकॉल के reproducibility 40 से अधिक विभिन्न hPSC लाइनों के साथ मान्य किया गया है, सबसे व्यापक मान्यता तारीख को सूचना दी। पहले से सूचना दी निलंबन प्रोटोकॉल की तुलना में, इस विधि scalability, reproducibility, सामर्थ्य, प्रभावकारिता और उत्पन्न cardiomyocytes की कार्यक्षमता के मामले में महान लाभ से पता चलता है। हमारे भेदभाव प्रोटोकॉल की सफलता को अच्छी तरह से अध्ययन के लिए इस्तेमाल hPSCs की उच्च गुणवत्ता पर निर्भर है। इसलिए यह प्रत्येक पंक्ति के कुपोषण और प्रयोग शुरू करने से पहले immunostaining और पीसीआर द्वारा pluripotency मार्करों के उच्च और निरंतर अभिव्यक्ति की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, जब बायोरिएक्टर में संवर्धन कोशिकाओं, यह महत्वपूर्ण है कि hPSCs ख है का उपयोग करने के लिए हैeen भेदभाव की शुरुआत से पहले कम से कम तीन मार्ग के लिए एकल कोशिका के स्तर पर passaged। हमारे प्रोटोकॉल में हम 175 ± 25 माइक्रोन के एक औसत आकार, जो 5 दिनों के बाद उत्पन्न spheroids थे के साथ spheroids का इस्तेमाल किया है। दिन जो spheroids इस आकार प्रतिबंध व्यक्ति hPSC लाइनों की वृद्धि दर के आधार पर भिन्न हो सकते हैं को पूरा; इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि आकार, विकास के दिन की तुलना में अधिक है, को ध्यान में रखा जाता है।

इस प्रोटोकॉल भी संवेदनशील सेल लाइनों और hPSC लाइनों की बड़ी साथियों के लिए उपयुक्त बनने के लिए चालाकी से किया जा सकता है। हालांकि अत्यधिक समृद्ध cardiomyocytes में इस प्रोटोकॉल के परिणाम, पवित्रता ऐसे लैक्टेट समृद्ध मध्यम 32 के रूप में एक चयापचय चयन विधि के साथ भेदभाव प्रोटोकॉल के संयोजन से सुधार किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, परिपक्वता और इस प्रोटोकॉल में वर्णित निकाली गई cardiomyocytes की कार्यक्षमता में सुधार के लिए तीन आयामी, गठबंधन हृदय की पीढ़ी द्वारा लागू किया जा सकता है33 ऊतकों। इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक है कि cardiomyocytes के विशेष उपप्रकार विशेष रूप से उत्पन्न नहीं कर रहे हैं, बस आलिंद, वेंट्रिकुलर और नोडल कोशिकाओं का एक मिश्रण है। इस क्षेत्र में आगे की जांच पड़ताल भेदभाव प्रोटोकॉल जो बड़े पैमाने में अत्यधिक समृद्ध उप प्रकार विशेष cardiomyocytes उत्पादन कर सकते हैं विकसित करने की जरूरत है। हालांकि कुछ छोटे पैमाने पर प्रोटोकॉल तिथि करने के लिए विकसित किया गया है, विधियों कड़ाई से सुनिश्चित करने के लिए बड़े पैमाने अप संभव है 34 परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता होगी।

इस तरह के एकीकृत प्लेटफार्मों के विकास के नैदानिक, दवा, ऊतक इंजीनियरिंग के लिए hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes प्रौद्योगिकियों के व्यावसायीकरण की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में माना जा सकता है, और इन विट्रो अंग में / organoid विकास अनुप्रयोगों।

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Disclosures

विक्टर चांग कार्डिएक रिसर्च इंस्टीट्यूट में संलग्न नहीं है, न ही यह नज़रअंदाज़ करता है, अनुसंधान के लिए मानव भ्रूण का विनाश। इस अध्ययन के लिए अपने योगदान मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल पर काम करने के लिए ही सीमित था।

लेखक घोषणा करते है कि उनमें कोई वित्तीय हितों की प्रतिस्पर्धा नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 113 मानव स्टेम कोशिकाओं स्टेम कोशिका जीव विज्ञान cardiomyocytes कार्डिएक भेदभाव छोटे अणुओं उभारा निलंबन बायोरिएक्टर
मानव स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत छोटे अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग
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Fonoudi, H., Ansari, H.,… More

Fonoudi, H., Ansari, H., Abbasalizadeh, S., Blue, G. M., Aghdami, N., Winlaw, D. S., Harvey, R. P., Bosman, A., Baharvand, H. Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol. J. Vis. Exp. (113), e54276, doi:10.3791/54276 (2016).

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