Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54276
Automatic Translation
*1,2,3,8, *1,8, 1, 6,7, 1, 6,7, 2,3,4, *2,3, *1,5
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran
* These authors contributed equally

Abstract

تعظيم الاستفادة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) للأبحاث، والنمذجة المرض والأدوية والتطبيقات السريرية يتطلب أساليب قوية للإنتاج على نطاق واسع من أنواع الخلايا الوظيفية، بما في ذلك العضلية. هنا علينا أن نظهر أن التلاعب الزمني للWNT، TGF-β، وSHH مسارات إشارات تؤدي إلى خطوط hPSC كفاءة عالية cardiomyocyte تمايز وحيدة الخلية passaged في كل تعليق ثابت وأنظمة التعليق مفاعل حيوي أثار. توظيف هذه الاستراتيجية أدت إلى ~ 100٪ الضرب الكروية، التي تحتوي على الدوام> 80٪ التروبونين القلبي خلايا T إيجابية بعد 15 يوما من الثقافة، والتحقق من صحة في خطوط hPSC متعددة. نفيدكم أيضا على الاختلاف من هذا البروتوكول للاستخدام مع خطوط الخلايا لم تتكيف حاليا إلى الركض وحيدة الخلية، وقد تم التحقق من نجاح الذي في 42 خطوط hPSC. العضلية تم إنشاؤها باستخدام هذه البروتوكولات التعبير عن علامات-نسب محددة، ومن المتوقع عرض electrophysوظائف iological. يقدم بروتوكول لدينا منصة بسيطة وفعالة وقوية لإنتاج على نطاق واسع العضلية الإنسان.

Introduction

خلايا الإنسان الجذعية المحفزة (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، لديها القدرة على تجديد الذات والقدرة على التمايز إلى خلايا ثلاث طبقات جرثومية جنينية 1،2. ونظرا لهذه الخصائص، وتوفر hPSCs مصدرا قيما وغير محدودة لتوليد وقابلة للإنتاج أنواع الخلايا من الأمراض ذات الصلة لنمذجة الأمراض التي تصيب البشر 3-5، لالإنتاجية العالية فحص المخدرات وسمية المقايسات 6،7 ويحتمل أن تكون للتطبيقات السريرية 8 . جيل الخلايا العضلية من hPSCs يوفر فرصة للتحقيق على وجه التحديد آليات أمراض القلب والأوعية الدموية البشرية المعقدة والعلاجات الممكنة، في وقت سابق خارج نطاق قدراتنا نظرا لعدم وجود نماذج حيوانية ذات الصلة و / أو توافر الأنسجة الأساسية المتضررة.

جميع التطبيقات المذكورة أعلاه hPSCs نecessitate إنتاج أعداد هائلة من العضلية عالية التخصيب والوظيفية. وهكذا، فإن توافر الكفاءة واستنساخه وقابلة للتطوير في المختبر بروتوكول تمايز القلب مناسبة لخطوط hPSC متعددة أمر بالغ الأهمية. وقد استخدمت التقليدية بروتوكولات cardiomyocyte التمايز استراتيجيات مختلفة مثل تشكيل هيئة مضغي 9، تقنيات شارك في الثقافة 10، الاستقراء مع الكوكتيلات السيتوكينات 11 و طرق بروتين تنبيغ 12. وعلى الرغم من التقدم في هذه التقنيات، معظمها لا يزال يعاني من ضعف كفاءة، تتطلب عوامل النمو مكلفة، أو تقديم العالمية محدود عند محاولة استخدام خطوط hPSC متعددة. حتى الآن، وقد وضعت هذه التحديات حدود لإنتاج الخلايا العضلية المستمدة hPSC للدراسات العلاج بالخلايا في النماذج الحيوانية، وكذلك في مجال الصناعات الدوائية لاكتشاف الأدوية 13. ولذلك، فإن تطوير تقنيات قوية وبأسعار معقولة لكبيران الانتاج -scale من الوظائف العضلية المستمدة hPSC في أنظمة ثقافة قابلة للتسهيل إلى حد كبير من التطبيقات التجارية والسريرية الخاصة بهم.

في هذه المخطوطة، ونحن التقرير تطور نظام التمايز القلب فعالة من حيث التكلفة ومتكامل مع كفاءة عالية، واستنساخ وتطبيق لhESCs وhiPSCs ولدت من مجموعة متنوعة من المصادر والأساليب الثقافة، بما في ذلك وسيلة لإنتاج على نطاق واسع للغاية السكان المخصب العضلية المستمدة hPSC باستخدام مفاعل حيوي. بالإضافة إلى ذلك، لدينا الأمثل هذا البروتوكول لخطوط hPSC لا تتكيف مع المغذية ثقافة الخلية الحرة و / أو واحدة، مثل hiPSCs المنشأة حديثا أو أفواج كبيرة من خطوط hPSC ذات الصلة لتحليل آلية المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، طلاء لوحات زراعة الخلايا وصيانة مشوه hPSCs

  1. إعداد وسائل الاعلام
    ملاحظة: تعقيم وسائل الإعلام باستخدام جهاز 0.22 ميكرون الترشيح وتخزينها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء لمدة تصل إلى 4 أسابيع. يتم سرد أسماء كاشف والموردين وأرقام مصورة في مواد الجدول.
    1. لماوس الجنينية الخلايا الليفية (MEF) متوسطة، والجمع بين 445 مل DMEM، 50 مل مصل بقري جنيني (FBS) و 5 مل وسائل الإعلام ثقافة الخلية (على سبيل المثال، Glutamax).
    2. لHESC المتوسطة، والجمع بين 390 مل خروج المغلوب-DMEM (KO-DMEM)، 100 مل استبدال خروج المغلوب المصل (KO-ريال)، 5 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية، 5 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية و 0.5 مل 55 ملي β-المركابتويثانول.
      تنبيه: β-المركابتويثانول سامة. تجنب استنشاق، ابتلاع وملامسة الجلد.
    3. لRPMI-B27 (RB) متوسطة، والجمع بين 475 مل RPMI 1640، 10 مل B27 ناقصالأنسولين، 5 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية، 5 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين و 0.5 مل 55 ملي β-المركابتويثانول.
    4. لحل التفكك (DS)، والجمع بين 10 مل 0.05٪ التربسين، 4 مل KO-ريال، 1 مل نوع كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل)، و 5 مل KO-DMEM و 20 ميكرولتر CaCl 2 (1 M).
    5. لتغذية خلايا المتوسطة مكيفة، إضافة 15 مل المتوسطة HESC (بدون bFGF) إلى قارورة T75 مع صراعات uent الخلايا المغذية (MEF أو القلفة البشرية الليفية) والتي تم المعطل من قبل العلاج مع أي ميتوميسين C أو بواسطة أشعة. حصاد مكيفة المتوسطة بعد 24 ساعة واستبدالها مع المتوسطة HESC جديدة. الخلايا يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  2. طلاء لوحات ثقافة الخلية
    1. ECM جل طلاء:
      1. عند الشراء، ذوبان الجليد استخراج جل ECM في 4 درجات مئوية حتى أنها في حالة سائلة بما يتفق بالتساوي، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع بنسبة1: 2 في البرد KO-DMEM المتوسطة، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
        ملاحظة: أثناء إعداد هلام ECM، والحفاظ على جميع المواد اللازمة للاستخدام في aliquotting والطلاء الداخلي البرد. تركيز ECM هلام يختلف مع رقم الدفعة. ضمان ويلاحظ تركيز على قسامات. يمكن أن تظل aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      2. ذوبان الجليد قسامة هلام ECM في 4 درجات مئوية. عندما إذابة، إضافة الباردة المتوسطة KO-DMEM لتركيز النهائي من 0.34 ملغ / مل. ماصة جيدا وإضافة 0.75 مل لكل بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
    2. ميتوتيكلي المعطل الفأر الجنينية الخلايا الليفية الطاعم الخليوي (MEF) طلاء
      ملاحظة: وقد وصفت إعداد الخلايا المغذية MEF السابق 14
      1. معطف 6 جيدا وحة زراعة الخلايا مع عامل ملحق (AF) أو 0.1٪ الجيلاتين (راجع الخطوة 1.2.3) في RT لمدة 5 دقائق (0.75 مل لكل بئر واحدة من لوحة 6 جيدا).إزالة وترك لوحة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) لتجف.
      2. ذوبان الجليد MEF عن طريق نقل قارورة المجمدة إلى 37 درجة مئوية الماء الحمام لحوالي 2-3 دقائق.
      3. إضافة 7 مل المتوسطة MEF إلى أنبوب 15 مل. عند إذابة قارورة من الخلايا، ونقل ببطء المحتويات إلى أنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 4 دقائق. نضح في وطاف resuspend الخلايا في المتوسط ​​MEF.
      4. عد الخلايا ولوحة 1 × 10 6 خلايا في 6 لوحة جيدا (~ 1.7 × 5 10 خلايا / جيد). نقل إلى حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 وتسمح للخلايا لإرفاق O / N قبل الاستخدام.
    3. الجيلاتين طلاء:
      1. حل 1 غرام من مسحوق الجيلاتين في الماء عالى النقاء لجعل 0.1٪ (ث / ت) حل. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم الأوتوكلاف الحل في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة. عندما تبرد، إضافة إلى العدد المطلوب من الآبار (0.75 مل لكل بئر واحدة من لوحة 6 جيدا)، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. Laminin طلاء:
      1. ذوبان الجليد laminin (1 ملغ / مل) في 4 درجات مئوية حتى إذابة. 5 ميكرولتر من حل laminin، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. ماصة جيدا ثم يضاف إلى العدد المطلوب من الآبار (0.75 مل لكل بئر واحدة من لوحة 6 جيدا)، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    5. السيليكون طلاء السطح سبينر قارورة الداخلية:
      1. اغسل 100 مل الدوار قارورة (مع 1 البندول الزجاج) مع الماء المقطر، وذلك باستخدام فرشاة التنظيف لإزالة أي غبار و / أو بقايا الثقافة. ملء مع 70٪ من الإيثانول وبعد شطف 30 دقيقة مع الماء المقطر. إضافة 5 M هيدروكسيد الصوديوم وترك O / N.
      2. إزالة محلول هيدروكسيد الصوديوم وشطف قارورة تحت الماء الجاري لمدة 5 دقائق. ملء قارورة مع 1 M حمض الهيدروكلوريك ويترك لمدة 15 دقيقة. غسل القارورة مع المياه الجارية لمدة 5 دقائق، ثم مرتين مع الماء المقطر المزدوج إلى تماماإزالة أي أثر للحمض الهيدروكلوريك. ترك القارورة حتى يجف تماما في ش.
      3. إضافة 1.5 مل من محلول siliconizing إلى القارورة وتدوير أفقيا لتغطية جميع الأسطح. كرر نفس الإجراء البندول الزجاج.
      4. تسخين قارورة المغلفة في الفرن الجاف عند 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو السماح ليجف O / N في RT. إذا تم تسخينه في فرن، تترك لتبرد لRT عن 30 - 60 دقيقة.
      5. شطف القارورة 3 مرات مع الماء منزوع الأيونات لمدة 15 دقيقة لكل منهما، ثم تعقيم بواسطة التعقيم في 121 مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. صيانة مشوه hPSCs
    ملاحظة:     سوف لكل من البروتوكولات المذكورة، ما لم ينص تحديدا، وتزرع الخلايا ومثقف في الآبار لوحات ثقافة 6 جيدا وأحجام إعطاء مناسبة لهذا الشكل.
    1. hPSCs مثقف كما مشوه الأجسام الشبه الكروية في نظام تعليق ثابت
      يجب بالفعل أن تتكيف الخلايا المستخدمة في هذه الخطوات ل: مذكرةوحيد الخلية الثقافة. 15
      1. بدء التجربة مع hPSCs مثقف على هلام ECM في لوحة الثقافة 6 جيدا في حوالي 70-80٪ confluency. إزالة أي مستعمرات متباينة باستخدام مجهر تشريحي في ش. إضافة 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: لإزالة المستعمرات المتباينة، استخدم طرف ماصة لفصل بلطف وإزالة كافة أجزاء متباينة يدويا تحت مجهر تشريحي. يجب الحرص على عدم إزالة المستعمرات غير متمايزة.
      2. إزالة الخلايا من الحاضنة والمتوسطة نضح. غسل الخلايا مع 1 مل برنامج تلفزيوني، وإزالة وإضافة 0.5 مل خلية الانزيم التفكك. احتضان الخلايا لمدة 4-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      3. إضافة 1 مل HESC المتوسطة وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. فصل الخلايا إلى خلايا واحدة باستخدام ماصة p1،000. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
      4. Resuspend الخلايا إلى 2 × 10 5 ج قابلة للحياةملتعلمي اللغة اإلنكليزية / مل في تغذية خلايا المتوسطة مكيفة تستكمل مع 100 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632. نقل الخلايا لوحات مرفق منخفضة للغاية باستخدام ماصة 5 مل (3 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا).
      5. بعد 2 أيام، وإزالة بعناية الخلايا من الحاضنة ونصف نضح من المتوسط ​​(حوالي 1.5 مل). استبدال المتوسطة مشروط جديدة تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF /.
      6. تغيير نصف المتوسط ​​كل يوم مع متوسط ​​مشروط تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF / حتى يوم 5. الآن، إما المزيد من الخلايا ثقافة، مرور لاستمرار ثقافة غير متمايزة (الخطوة 1.3.1.2 - 5)، أو استخدام للتمايز القلب (القسم 2 ). إذا استمرار ثقافة، وخلايا مرور كل 4-8 أيام.
    2. hPSCs مثقف على الخلايا المغذية وPassaged عن طريق كولاجيناز النوع الرابع
      1. قبل الركض hPSCs، وإزالة أي مستعمرات متباينة باستخدام مجهر تشريحي في ش. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع 1 ملبرنامج تلفزيوني لكل بئر. إزالة ثم إضافة 0.75 مل نوع كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة، كما يشترط أن تكون حواف المستعمرات بدأت تقشر.
      2. نضح كولاجيناز وإضافة 1 مل من HESC المتوسطة لكل بئر. فصل المستعمرات إلى مجموعات صغيرة باستخدام مكشطة الخلية، ثم نقل الخلايا باستخدام ماصة p1،000 في أنبوب 15 مل. يجب الحرص على عدم تفريق التجمعات إلى قطع صغيرة.
      3. يغسل جيدا مع 1 مل HESC المتوسطة لجمع أي الخلايا المتبقية وإضافة إلى 15 مل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح الخلايا وطاف resuspend في المتوسط ​​HESC تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF /.
      4. إزالة لوحة MEF المغلفة من الحاضنة ونضح المتوسطة MEF. نقل الخلايا في النسبة بين 1: 3 و 1:10، حسب الاقتضاء. تغيير متوسطة يوميا مع متوسط ​​HESC جديدة تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF /. خلايا مرور كل 4-8 أيام.

2. Differentiأوجه من hPSCs كما الأجسام الشبه الكروية في نظام تعليق ثابت

  1. بدء التجربة باستخدام اليوم 5 الكروية غير متمايزة كما أعدت في القسم 1.3.1.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن يكون متوسط ​​حجم الكروية 175 ± 25 ميكرون. وينبغي أن تستخدم ما لا يقل عن 50 الكروية عند بدء التجربة التمايز.
  2. نقل الكروية في أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 5 مل. يغسل جيدا مع 1 مل RB المتوسطة لجمع أي الكروية المتبقية وإضافة إلى نفس أنبوب 15 مل. ترك الخلايا لمدة 5 دقائق حتى الرسوبية الكروية لتشكيل بيليه فضفاضة (لا أجهزة الطرد المركزي). نضح طاف، والحرص على عدم اتخاذ أي الكروية.
  3. إضافة 3 مل المتوسطة RB تستكمل مع 12 ميكرومتر CHIR99021. نقل الخلايا مرة أخرى في بئر واحدة من 6 جيدا لوحة مرفق منخفضة للغاية. بعد 24 ساعة، كرر الخطوة 2.2.
    ملاحظة: RB المتوسطة خفيف حساسة. عند العمل مع المتوسط ​​RB، والحفاظ على ضوء ش.م.ب مغلقا.
  4. ادد 3 مل المتوسطة الظهير الأيمن إلى بيليه الخلية. نقل الخلايا مرة أخرى في بئر واحدة من 6 جيدا لوحة مرفق منخفضة للغاية. بعد 24 ساعة، كرر الخطوة 2.2.
  5. إضافة 3 مل المتوسطة RB تستكمل مع IWP2، purmorphamine وSB431542 (5 ميكرومتر لكل منهما). نقل الخلايا مرة أخرى في بئر واحدة من 6 جيدا لوحة مرفق منخفضة للغاية. 2 بعد أيام كرر الخطوة 2.2.
  6. resuspend الخلايا في 3 مل من المتوسط ​​RB ونقل إلى لوحة الجيلاتين المغلفة للسماح للخلايا لنعلق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، ويمكن أيضا أن تبقى الخلايا في تعليق. من أجل الاستمرار مع ثقافة تعليق ثابتة، نقل الخلايا إلى لوحة مرفق منخفضة للغاية.
  7. تغيير المتوسطة مع 3 مل المتوسطة RB بعد 2 أيام. فإن الثقافات تبدأ للفوز اليوم التالي. تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام مع متوسط ​​RB.

3. تمايز hPSCs كما الأجسام الشبه الكروية في مفاعل حيوي لتعليق حرك

  1. بدء التجربة مع الثقافة الكروية غير متمايزةد في تعليق ثابت لا يقل عن 3 مقاطع (انظر القسم 1.3.1). إضافة 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. إزالة الخلايا من الحاضنة ونقل جميع الكروية في أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 5 مل. يغسل جيدا مع 1 مل HESC المتوسطة لجمع أي الكروية المتبقية وإضافة إلى نفس أنبوب 15 مل. ترك الخلايا لمدة 5 دقائق حتى الرسوبية الكروية لتشكيل بيليه فضفاضة (لا أجهزة الطرد المركزي). نضح طاف، والحرص على عدم اتخاذ أي الكروية.
  3. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني. يترك لمدة 5 دقائق حتى الرسوبية الكروية لتشكيل بيليه فضفاضة (لا أجهزة الطرد المركزي). إزالة طاف وإضافة 0.5 مل التربسين 0.05٪ زائد 0.53 ملي EDTA. احتضان الخلايا لمدة 4-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. إزالة الخلايا من الحاضنة وإضافة 1 مل المتوسطة HESC. باستخدام ماصة p1،000، فصل الخلايا إلى خلايا واحدة، عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات. و resuspend إلى 2 × 10 5 viabلو خلية / مل في المتوسط ​​مشروط تستكمل مع 100 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632.
  5. نقل 100 مل من تعليق خلية في قارورة مفاعل حيوي صلكنزد مع 1 البندول (انظر القسم 1.2.5). تبدأ مع الانفعالات 35 دورة في الدقيقة، وبعد الزيادة 24 ساعة إلى 40 دورة في الدقيقة.
  6. بعد 48 ساعة، والتوقف عن التحريض على 5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية إلى أسفل القارورة. استبدال نصف المتوسطة مع مشروط تستكمل مع 100 نانوغرام مل bFGF /. كرر نفس العملية كل 24 ساعة حتى يوم 5.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، ينبغي تشكيل الكروية غير متمايزة مع متوسط ​​حجم 175 ± 25 ميكرون.
  7. وقف التحريض على 5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية إلى أسفل القارورة. نقل جميع الكروية إلى أنبوب 50 مل في الحد الأدنى من المتوسط ​​(أقل من 50 مل). تجاهل أي وسيط المتبقية في قارورة مفاعل حيوي، وضمان بعناية أي الكروية هي المتبقية في وعاء.
  8. اوراقه ل5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل ثم إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية فضفاضة. يغسل مع 25 مل PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم أو المتوسطة RB، ثم يترك مرة أخرى ل5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل لتشكيل مرة أخرى بيليه فضفاضة.
  9. إزالة بعناية طاف وإضافة 40 مل المتوسطة RB تستكمل مع 12 ميكرومتر CHIR99021، 10 ميكرومتر مثبط روك و 0.1٪ كحول البولي فينيل (PVA). Resuspend والكروية ونقل جميع الخلايا إلى قارورة مفاعل حيوي. إضافة المتوسطة لجعل إجمالي حجم 100 مل. إعادة تشغيل التحريض على 40 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: RB المتوسطة خفيف حساسة. عند العمل مع المتوسط ​​RB حفاظ على درجة البكالوريوس في ضوء مغلقا واسطة.
  10. كرر الخطوات من 3،7-3،8.
  11. إزالة بعناية طاف وإضافة 40 مل RB تستكمل المتوسطة بنسبة 0.1٪ بولي. Resuspend والكروية ونقل جميع الخلايا إلى رانه مفاعل حيوي قارورة. إضافة المتوسطة لجعل إجمالي حجم 100 مل. إعادة تشغيل التحريض على 40 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
  12. كرر الخطوات من 3،7-3،8.
  13. إزالة بعناية طاف وإضافة 40 مل المتوسطة RB تستكمل مع IWP2، purmorphamine وSB431542 (5 ميكرومتر لكل منهما). Resuspend والكروية ونقل جميع الخلايا إلى قارورة مفاعل حيوي. إضافة المتوسطة لجعل إجمالي حجم 100 مل. إعادة تشغيل التحريض على 40 دورة في الدقيقة لمدة 2 أيام.
  14. كرر الخطوات من 3،7-3،8.
  15. إزالة بعناية طاف وإضافة 40 مل المتوسطة RB فقط. Resuspend والكروية ونقل جميع الخلايا إلى قارورة مفاعل حيوي. إضافة المتوسطة لجعل إجمالي حجم 100 مل. إعادة تشغيل التحريض على 40 دورة في الدقيقة. ينبغي مراعاتها الكروية بفوزه 48 - بعد 72 ساعة.
  16. تغيير نصف المتوسط ​​كل 3 - 4 أيام مع متوسط ​​RB فقط من خلال وقف التحريض على 5-10 دقائق حتى استقر كل الكروية في الجزء السفلي من السفينة. إزالة بعناية 50 مل من المتوسط ​​من دون إزعاج الكروية وcarefاستبدال ully مع 50 مل من المتوسط ​​RB جديدة.

4. تمايز hPSCs عن طريق الثقافات لا تتكيف مع الركض وحيد الخلية

ملاحظة: هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للالتمايز السريع لعدد كبير من خطوط hPSC دون الحاجة إلى التكيف مع تقنيات زراعة وحيدة الخلية، عملية جدا كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. هذه التقنية قابلة للتطبيق على خطوط الخلايا التي تعتبر حساسة للغاية لتفكك خلية الأنزيمية، مثل خطوط hPSC التي أنشئت حديثا.

  1. بدء التجربة مع hPSCs مثقف على MEF (كما هو الحال في القسم 1.3.2) والتي ما يقرب من 70-80٪ متموجة. إزالة أي مستعمرات متباينة باستخدام مجهر تشريحي في ش.
  2. إزالة المتوسطة وإضافة 0.5 مل تفارق الحل (DS). احتضان ل0،5-1 دقيقة حتى اعتقلت خلايا MEF صعودا وحواف المستعمرات hPSCs أصبحت واضحة. بسرعة إزالة DS وإضافة 0.75 مل نوع كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل).
  3. احتضانالخلايا لمدة 5-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فحص الخلايا تحت المجهر خلال فترة الحضانة، وعندما المستعمرات كلها بدأت يقلع وفصل، وإزالة كولاجيناز وإضافة 1.5 مل HESC المتوسطة.
    ملاحظة: إذا كان بعد 15 دقيقة معظم المستعمرات لا تزال تعلق، ووضع الخلايا إلى حاضنة. فحص الخلايا تحت المجهر كل 5 دقائق. يجب الحرص على عدم ترك الخلايا في كولاجيناز لأكثر من 30 دقيقة. إذا كان هناك العديد من المستعمرات العائمة في حل كولاجيناز، لا إزالة كولاجيناز. فقط إضافة 1 مل HESC المتوسطة.
  4. باستخدام ماصة p1،000، ماصة بلطف المستعمرات لفصل المستعمرات بأسرها. لا كسر المستعمرات إلى قطع صغيرة. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 5 مل. يغسل جيدا مع 1 مل HESC المتوسطة لجمع أي الخلايا المتبقية إضافة إلى الأنبوب نفسه. يترك لمدة 5 دقائق حتى الرسوبية جميع المستعمرات (لا أجهزة الطرد المركزي).
  5. إزالة بعناية طاف وإضافة 2 مل HESC ميديأم أن تستكمل مع 100 نانوغرام / مل bFGF. نقل الخلايا إلى لوحة مرفق منخفضة للغاية باستخدام ماصة 5 مل (1 مل في كل بئر من 24 لوحة جيدا و 3 مل في كل بئر من لوحة 6 جيدا). احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لا يقل عن 6 ساعة (بحد أقصى 12 ساعة).
  6. خلال هذا الوقت، وإعداد العدد المطلوب من الآبار / لوحات المغلفة laminin لخطوة 4.7. نسب نقل خلية الموصى بها هي 1 متكدسة بئر من لوحة 6 جيدا إلى 2 آبار لوحة 24-جيدا (أو ما يعادلها في المساحة السطحية).
  7. بعد 6 ساعات، ونقل بعناية المجاميع مستعمرة في أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 5 مل. غسل لوحة مع متوسط ​​RB لجمع أي الركام المتبقي، ويضاف إلى الأنبوب نفسه 15 مل (0.5 مل لكل بئر لمدة 24 جيدا و1 مل لكل بئر ل6 لوحات أيضا). انتظر 5 دقائق حتى الرواسب الركام، ثم نضح بعناية طاف. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه فضفاضة.
  8. إضافة 2 مل المتوسطة RB تستكمل مع 12 ميكرومتر CHIR99021 ونقل بعنايةمع ماصة 5 مل لديك معدة سلفا laminin المغلفة الآبار (كما هو الحال في القسم 1.2.4) للسماح للخلايا لنعلق.
  9. بعد 24 ساعة، وإزالة بعناية المتوسطة في كل بئر وإضافة 1 مل المتوسطة RB فقط.
    ملاحظة: بعض المجاميع قد تعلق فقط ضعيفة جدا إلى لوحة الثقافة. ولذا فمن المهم أن لا إزالة أي المجاميع الكبيرة التي قد تأتي فضفاضة أثناء إجراء تغيير المتوسطة. من المهم، مع ذلك، لإزالة أكبر قدر من حطام خلية صغيرة ممكن.
  10. بعد 24 ساعة، وإزالة بعناية على المدى المتوسط ​​وإضافة المتوسطة RB تستكمل مع IWP2، purmorphamine وSB431542 (5 ميكرومتر لكل منهما).
  11. تغيير المتوسطة بعد 2 أيام مع متوسط ​​RB فقط. سوف تبدأ خلايا للفوز اليوم التالي.
  12. تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام مع متوسط ​​RB فقط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل إنشاء طريقة بسيطة للتمييز واسع النطاق للالعضلية من hPSCs، أنشأنا البروتوكول الذي تم علاج الخلايا في البداية مع المنشط WNT / β-كاتينين (CHIR99021) 16 و في وقت لاحق مع مثبطات للWNT / β- كاتينين ومسارات تحويل النمو عامل β (TGF-β) (IWP2 16 و SB431542 17، على التوالي)، وأخيرا منشط القنفذ سونيك (SHH) مسار (purmorphamine) 17 (الشكل 1A). في استراتيجية التمايز لدينا، ما يقرب من 50٪ من الأجسام الشبه الكروية (175 ± 25 ميكرون كروي حجم القطر)، وقد لوحظ الكروية متباينة بدأ الضرب 7 أيام بعد بدء التمايز، والتي زادت بعد ذلك إلى 100٪ بعد يوم 10. ومن المثير للاهتمام، وذلك باستخدام هذا البروتوكول لمواصلة الضرب تصل إلى 60 يوما بعد التمايز بدء 18. الدراسات السكانية في الكروية نأتفحص التدفق الخلوي وكشف أنه في يوم 15، وأكثر من 90٪ من السكان الواردة التروبونين القلبي T الموجب (cTnT +) الخلايا، في حين كانت أقل من 12٪ من الخلايا إيجابية لالعضلات الملساء وعلامات البطانية (3.1٪ فون Willibrand عامل (VWF +)، 8.4٪ ألفا العضلات الملساء الأكتين إيجابية (أسماء +)) 18. حتى الآن، تم اختبار ثابت بروتوكول تعليق التمايز على خطوط 5 HESC و 4 hiPSC، مع مخرجات مما أدى إلى ما يقرب من 90٪ من ضرب الأجسام الشبه الكروية من كل سطر، والتي تبين استنساخ عالية من هذا البروتوكول بين مختلف خطوط hPSC (الشكل 1B).

من أجل تطوير منصة متكاملة للإنتاج على نطاق واسع العضلية الإنسان، طبقنا استراتيجيتنا تعليق التمايز ثابتة لمفاعل حيوي تعليق أثار (الشكل 2A). أظهرت الكروية التفريق سلوك مماثل يحدث في مفاعل حيوي هnvironment كما هو الحال في نظام ثابت (الشكل 2B) ولوحظت ما يقرب من 100٪ من الكروية إلى أن الضرب في يوم 10 18. المناعية في أقسام الضرب الكروية التي تم جمعها في يوم 30 باستخدام أجسام مضادة ضد cTnT وعامل النسخ القلب NKX2-5، أظهرت التعبير حشوية والنووي من هذه البروتينات، على التوالي (الشكل 2C). وكان العائد الكلي للخلايا في الثقافة تعليق ديناميكية حوالي 90-100٬000٬000 الخلايا في 100 مل حجم العمل بعد 15 يوما من ثقافة التمايز. مع هذا هو الحال، يمكن أن العائد cardiomyocyte تصل إلى ما يقرب من 54 حتي 90000000 الخلايا (مع احظت 60-90٪ التمايز فعالية) من 20 مليون hPSCs ابتداء، تلقيح في مرحلة hPSCs التوسع كما الخلايا وحيدة. نحن بالإضافة إلى فحص الخصائص الكهربية العضلية متباينة باستخدام وحيدة الخلية طريقة المشبك التصحيح. الضرب الكروية من الثقافات مفاعل حيوي كانتنأت إلى خلايا واحدة في اليوم 30 والعمل إمكانات سجلت على الخلايا تمثيلية باستخدام خلية التصحيح تقنية المشبك بأكملها. أظهرت بيانات وجود ثلاثة أنواع رئيسية خلية القلب (atrial-، nodal- وخلايا تشبه البطيني) في عدد من الخلايا واحد (18).

لتقنيات التمايز المذكورتين أعلاه، تحتاج إلى أن تتكيف مع و/ خالية من التغذية أو وحيدة الخلية ثقافة تعليق 19-21 hPSCs. بعض خطوط hPSC ومع ذلك، هي حساسة للغاية لتفكك خلية الأنزيمية وتظهر كبيرة فقدان بقاء الخلية بعد التفكك، مثل يمكن ملاحظتها في خطوط hiPSC التي أنشئت حديثا. بالإضافة إلى ذلك، عند العمل مع الأفواج الكبيرة من خطوط، والتكيف مع كل لالمغذية مجانا وثقافة وحيدة الخلية ستكون هائلة كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. لمعالجة هذه القضايا، تم استبدال الكروية غير متمايزة مع المجاميع خلية متمايزة (الشكل 3A).وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن استخدام هذه التقنية المعدلة، ظهرت مجموعات الضرب بعد 7 أيام بدء التمايز. وأكد استنساخ هذه النسخة المعدلة باستخدام 42 خطوط hiPSC، حيث ولدت جميع خطوط اختبارها في المتوسط ​​أكثر من 60٪ cTnT + خلايا يوم 15 لكل تجربة يؤديها (الشكل 3B). المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد cTnT وNKX2-5 في مجموعات الضرب فصلها أظهرت حشوية والنووي التعبير، على التوالي (الشكل 3C).

شكل 1
الشكل 1. تخطيطي Cardiomyocyte التمايز من hPSCs في تعليق ثابت والممثل البيانات. (A) التصميم التجريبي من hPSCs التمايز إلى العضلية في نظام تعليق ثابت. (ب) تقييم كفاءةيتم قياس التمايز القلب عن طريق حساب عدد من ضرب الأجسام الشبه الكروية (٪). المعروضة هنا هي متوسطات لا يقل عن 3 تجارب التمايز من كل 5 HESC و 4 خطوط hiPSC 18. المعدل العام من ضرب الأجسام الشبه الكروية من جميع خطوط ما يقرب من 90٪. تمثل أشرطة الخطأ SD (ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل (2). التخطيطي العام فى العضلية التمايز من hPSCs في التعليق الديناميكي والممثل البيانات. (A) التصميم التجريبي من hPSCs التمايز إلى العضلية في نظام التعليق الديناميكي. RI: المانع روك (ب) صورة المرحلة النقيض من يوم 5 الكروية (الممثل صesult من خط رويان H5 HESC). الكروية مقطوع في يوم 30 للNKX2.5 وcTnT شريط مقياس 200 ميكرون (C) المناعية من HESC الضرب المشتقة. شريط مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3). التخطيطي الشامل العضلية التمايز من hPSCs باستخدام الثقافات لا تتكيف مع الركض وحيد الخلية. (أ) التصميم التجريبي من hPSCs التمايز إلى العضلية باستخدام الثقافات لا تتكيف مع الركض خلية واحدة. (ب) تحليل التدفق الخلوي من المجاميع فصلها تظهر في المتوسط ​​أكثر من 60٪ cTnT + الخلايا في 42 خطوط hiPSC اختبارها. (C) المناعية للفصل العضلية المستمدة منhiPSCs لNKX2.5 وcTnT (نتيجة التمثيلية 646-4 خط hiPSC). مقياس شريط 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العضلية المستمدة من hPSCs تعتبر مصدرا جذابا للغاية لاستخدامها في نماذج الأمراض التي تصيب البشر، المخدرات فحص / اختبار السمية، وربما في المستقبل، علاجات التجدد. واحدة من العقبات الرئيسية لاستخدام هذه الخلايا ومع ذلك، هو القدرة على توفير ما يكفي من مواد ذات جودة عالية لاستخدامها على نحو فعال. استخدام لدينا بروتوكول وصفها، وتقدم الطريقة التي يتغلب هذا القيد.

في الآونة الأخيرة، وقد وصفت الجزيئات الصغيرة الاصطناعية التي تستهدف مسارات الإشارات المحددة المعنية في تخلق القلب إلى القلب تعزيز 16،17،22،23 التمايز. ويجري حاليا استخدام هذه كبديل للالسيتوكينات المؤتلف والمصل، تحتوي على العديد من العوامل غير المحددة والتي تبين الاختلاف دفعة واحدة. والميزة الرئيسية لبروتوكول جزيء صغير، وغيرها من خصوصيته، هو أنه العوامل غير مكلفة والمكون عموما ممتدة العمر الافتراضي بالمقارنة مع وسائل الإعلام التي تحتوي على السيتوكينات أو عوامل النمو. كما الجزيئات الصغيرة المستخدمة في منطقتنا بروتوكول المبلغ عنها منخفضة الوزن الجزيئي وكلاء، فهي تعرف هيكليا ووظيفيا، ويمكن أن ينتشر بسهولة من خلال غشاء الخلية 24،25.

حتى الآن، وقد تم تطبيق أساليب مختلفة لhPSCs من أجل إقامة قوية، وتقنيات التمايز قابلة لل. ومع ذلك، فقد أنشئت معظم هذه الطرق كما 2D و الثقافات ثابتة على نطاق ضيق، والتي قد توفر الفقيرة والتدرجية، والتجانس. تقنيات مثل التجميع القسري، وتقنيات الطباعة الدقيقة والثقافات حاملة الصغيرة 26-29 تأتي الآن في الاستخدام، ولكن على الرغم من بعض التقدم في هذا المجال، وهذه الأساليب لا تزال بعيدة عن توفير أعداد الخلايا المطلوبة لاستخدامها في ارتفاع نظم -demand. استنساخ محدود أو غير مثبتة، والتدرجية، وتكاليف عالية نظرا لضرورة لوسائل الإعلام غالية (mTeSR1 أو StemPro-34) أو شركات الصغرى على حد سواء توسيع hPSCs وإخراج التمايز لجardiomyocytes 30،31، هي عيوب استخدام هذه الأساليب في مجال تكنولوجيا hPSCs عالية الإنتاجية.

في هذه الدراسة، ونحن قد ذكرت بروتوكول بسيطة وقوية وقابلة لإنتاج الخلايا العضلية المستمدة hPSC. وقد تم التحقق من صحة استنساخ هذا البروتوكول مع أكثر من 40 خطوط hPSC مختلفة، حسبما ذكرت والتحقق من صحة الأكثر شمولا حتى الآن. مقارنة بروتوكولات تعليق ذكرت سابقا، ويظهر هذا الأسلوب مزايا كبيرة من حيث قابلية، استنساخ، القدرة على تحمل التكاليف والفعالية والأداء الوظيفي للالعضلية ولدت. نجاح بروتوكول التمايز لدينا يعتمد تماما على الجودة العالية للhPSCs المستخدمة في الدراسة. لذلك لا بد من التحقق من النمط النووي كل سطر والتعبير مرتفع ومستدام من علامات تعدد القدرات التي المناعية وPCR قبل بدء التجربة. بشكل خاص، عند زراعة خلايا في مفاعل حيوي، لا بد من استخدام hPSCs التي بpassaged التابعين على مستوى خلية واحدة على الأقل لثلاثة مقاطع قبل بدء التمايز. في بروتوكولات لدينا استخدمنا الكروية مع متوسط ​​حجم 175 ± 25 ميكرون، والتي كانت الكروية ولدت بعد 5 أيام. في اليوم الذي الكروية تلبية هذا القيد حجم قد تختلف تبعا لمعدل نمو خطوط hPSC الفردية؛ ولذا فمن المهم أن حجم، أكثر من يوم للنمو، يؤخذ بعين الاعتبار.

كما يمكن التلاعب بها هذا البروتوكول لتصبح مناسبة لخطوط الخلايا الحساسة وأفواج كبيرة من خطوط hPSC. وعلى الرغم من هذه النتائج البروتوكول في العضلية التخصيب، يمكن تحسين نقاء من خلال الجمع بين بروتوكول التمايز مع طريقة اختيار التمثيل الغذائي مثل التخصيب اللاكتات المتوسطة 32. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق التحسينات في النضج وظائف العضلية المستمدة الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل جيل من ثلاثي الأبعاد للقلب الانحيازالأنسجة 33. واحد من أوجه القصور في هذا البروتوكول هو أن فرعية معينة من العضلية لا يتم إنشاء تحديدا، ببساطة خليط من الأذيني، البطين والخلايا العقدية. هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق في هذا المجال لتطوير بروتوكولات التمايز التي يمكن أن تنتج العضلية-سلالة معينة عالي التخصيب في نطاق واسع. على الرغم من أن وضعت بعض البروتوكولات على نطاق ضيق حتى الآن، فإن هناك حاجة إلى اختبارات صارمة لضمان توسيع النطاق ممكن 34 الأساليب.

ويمكن اعتبار تطوير مثل هذه البرامج المتكاملة باعتبارها خطوة هامة نحو تسويق التكنولوجيات العضلية المستمدة hPSC لالسريرية، الصيدلة، هندسة الأنسجة، وفي الجهاز المختبر / تطوير التطبيقات عضي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

معهد أبحاث القلب تشانغ فيكتور لا تشارك في، ولا تتغاضى عن تدمير الأجنة البشرية لأغراض البحث. مساهمته في هذه الدراسة كانت محدودة للعمل على الخلايا الجذعية المحفزة التي يتسبب فيها الإنسان.

الكتاب تعلن أنها لا تملك المصالح المالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 113، الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان، بيولوجيا الخلايا الجذعية، العضلية، والتمايز القلب، والجزيئات الصغيرة، تعليق حرك مفاعل حيوي
إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fonoudi, H., Ansari, H.,… More

Fonoudi, H., Ansari, H., Abbasalizadeh, S., Blue, G. M., Aghdami, N., Winlaw, D. S., Harvey, R. P., Bosman, A., Baharvand, H. Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol. J. Vis. Exp. (113), e54276, doi:10.3791/54276 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter