Abstract
最大化人多能干细胞（hPSCs）用于研究，疾病建模，药物和临床应用的利益需要用于大规模生产的功能细胞类型，包括心肌细胞的稳健的方法。在这里，我们证明了WNT，TGF-β，和SHH的时间操纵信号通路导致静态悬浮和搅拌生物反应器系统的单细胞的高效心肌细胞的分化传代HPSC线。采用这种策略导致〜100％打浆球体，始终如一地含有后培养15天> 80％肌钙蛋白T阳性细胞，在多个HPSC行验证。我们也对这个协议与目前不适合于单细胞传代，成功其中已在42 HPSC线被验证的细胞系使用的变化情况。使用这些协议所产生的心肌细胞表达系特异性标志物和展预计electrophysiological功能。我们的协议提出了大规模生产人类心肌细胞的简单，高效，强大的平台。
Introduction
人多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）和诱导多能干细胞（人iPS细胞），具有自我更新和能力的分化成三个胚层1,2的细胞的能力。由于这些特点，hPSCs人类疾病3-5，用于高通量药物筛选和毒性测定6,7-建模为临床应用8提供用于产生和可扩展的生产疾病相关的细胞类型的有价值的和无限制的源和潜在。从hPSCs心肌细胞的产生提供了机会，专门研究复杂的人类心血管疾病的机制及其可能的治疗方法，以前超出了我们的能力范围内，由于缺乏相关的动物模型和/或受影响的主要组织的可用性。
所有hPSCs n的上述申请的ecessitate生产高度浓缩的和功能性心肌细胞的大量数字。因此，可用一个高效的，可重复和可扩展的体外心脏分化协议适用于多种HPSC行是至关重要的。传统的心肌细胞的分化协议使用了不同的策略，如胚体的形成9，共培养技术10，诱导细胞因子11和蛋白转导方法12鸡尾酒。尽管这些技术的进步，大多数仍然效率低下苦，需要昂贵的生长因子，或试图使用多个HPSC线路时，提供有限的普遍性。迄今为止，这些挑战设置限制以生产用于在动物模型中的细胞疗法的研究HPSC衍生的心肌的，以及在制药工业中用于药物发现13。因此，对于大型强大且经济技术的发展进制生产的可伸缩的培养体系功能HPSC衍生的心肌将在很大程度上促进他们的商业和临床应用。
在这个手稿，我们报告具有成本效益和综合心脏分化系统具有疗效高，再现性和适用性从各种来源和培养方法，包括用于大规模生产的高度的方法产生的胚胎干细胞和人iPS细胞的发展使用生物反应器HPSC衍生的心肌的富集群体。此外，我们已经优化了这个协议并不适用于无饲养和/或单细胞培养HPSC线，如新建立的iPS细胞或相关疾病机理分析HPSC线大同伙。
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Protocol
1，文化传媒，细胞培养板的涂层和维护未分化hPSCs的制备
- 媒体准备
注意：使用消毒用0.22微米的过滤装置和存储介质在避光长达4周5℃。试剂的名称，供应商和目录编号列在材料表 。- 对于小鼠胚胎成纤维（MEF）中，结合445毫升DMEM 50毫升胎牛血清（FBS）和5 ml细胞培养基（ 如 Glutamax的）。
- 对于人类胚胎干细胞中，结合390毫升敲除的DMEM（KO-DMEM）中，将100ml敲除血清替代品（KO-SR），5 ml细胞培养基，将5ml的MEM最小必需氨基酸溶液和0.5ml 55毫β巯基乙醇。
注意：β巯基乙醇是有毒的。避免吸入，食入和皮肤接触。 - 对于RPMI-B27（RB）中，结合475毫升RPMI 1640，将10毫升B27减胰岛素，将5ml细胞培养基，将5ml的MEM最小必需氨基酸溶液，5 ml青霉素/链霉素和0.5ml 55毫β巯基乙醇。
- 对于解离溶液（DS），结合10毫升0.05％胰蛋白酶，4-毫升KO-SR 1 ml胶原酶IV型（1毫克/毫升），5毫升KO-DMEM和20微升的CaCl 2（1μM）。
- 馈线细胞条件培养基，15毫升人类胚胎干细胞培养基（无bFGF）的增加与T75烧瓶CON FL uent先前已通过用任一丝裂霉素C或通过辐照灭活的饲养细胞（MEF或人包皮成纤维细胞）。收获条件培养基后24小时，用新鲜的人类胚胎干细胞培养基更换。细胞可用于为最多2周。
- 细胞培养板的涂层
- ECM凝胶涂层：
- 购买时，解冻的ECM凝胶提取在4℃下，直到它在一个均匀一致的液体状态，按照制造商的说明。稀释在一个比的1：2的冷KO-DMEM培养基，分装并贮存在-20℃。
注：在ECM凝胶的准备，保持在aliquotting和涂层过程冷加工使用所需的所有材料。 ECM凝胶的浓度与批号而异。确保浓度的等分注意。等分试样可以保持在-20℃下长达6个月。 - 解冻在4℃的ECM凝胶等分试样。当解冻，为0.34毫克/毫升的最终浓度添加冷KO-DMEM培养基。吸管孔并添加0.75毫升每一个孔中一个6孔板的。在37℃下孵育1小时。
- 购买时，解冻的ECM凝胶提取在4℃下，直到它在一个均匀一致的液体状态，按照制造商的说明。稀释在一个比的1：2的冷KO-DMEM培养基，分装并贮存在-20℃。
- 有丝分裂灭活小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞（MEF）涂层
注意：MEF饲养细胞的制备以前已描述14- 涂层6孔细胞培养板带附件因子（AF）或0.1％明胶（见步骤1.2.3）在RT 5分钟（0.75毫升，每一个6孔板的一个孔中）。取下并在生物安全柜（BSC）干离开板。
- 3分钟 - 用冷冻瓶转移到37℃水浴中约2解冻的MEF。
- 添加7毫升MEF培养基至15毫升管。当细胞的小瓶解冻，慢慢的内容传送到15毫升管。离心在300×g离心4分钟。吸出上清液和悬浮细胞在MEF培养基。
- 计数细胞，和板每6孔板（〜1.7×10 5个细胞/孔）1×10 6个细胞。转移到37°C / 5％ 二氧化碳培养箱，并允许O / N使用前细胞附着。
- 明胶涂层：
- 溶解1g明胶粉末的超纯水，使0.1％（重量/体积）溶液。孵育15分钟，在37℃，然后在121℃高压灭菌该溶液15分钟。当冷却时，加入所需数量的井（0.75毫升，每一个6孔板的一个孔中），在37℃下孵育15分钟。
- 溶解1g明胶粉末的超纯水，使0.1％（重量/体积）溶液。孵育15分钟，在37℃，然后在121℃高压灭菌该溶液15分钟。当冷却时，加入所需数量的井（0.75毫升，每一个6孔板的一个孔中），在37℃下孵育15分钟。
- 层粘连蛋白涂层：
- 在4℃下解冻层粘连蛋白（1毫克/毫升），直至解冻。 5微升层粘连蛋白溶液，加入1毫升冷的PBS。吸管孔然后添加对所需数量的井（0.75毫升，每一个6孔板的一个孔中），在37℃下孵育1小时。
- 旋转烧瓶内表面的硅涂层：
- 用蒸馏水彻底洗100毫升旋转瓶（1杯摆），用清洁刷上的灰尘和/或培养的残留物。用70％乙醇和30分钟后，用蒸馏水冲洗填充。加入5 M氢氧化钠和离开O / N。
- 删除NaOH溶液，并在5分钟流水冲洗瓶。填用1M HCl将烧瓶和离开15分钟。用5分钟，然后流水用双蒸水至完全洗烧瓶两次除去HCl的痕迹。离开烧瓶中的BSC完全干燥。
- 添加1.5的硅化溶液到烧瓶ml和水平旋转以覆盖所有表面。重复同样的步骤为玻璃钟摆。
- 加热该涂布的烧瓶在干燥炉中在100℃下1小时或晾干O / N在室温。如果在烘箱中加热，离开冷却至室温30 - 60分钟。
- 冲洗烧瓶，用去离子水洗涤3次，每次15分钟，然后通过高压灭菌器在121℃灭菌20分钟。
- ECM凝胶涂层：
- 未分化hPSCs保养
注意：对于每一个所描述的，协议的，除非特别说明，细胞生长和在6孔培养板和卷的孔培养将给出适用于这种格式。- hPSCs培养的未分化细胞球体在静态悬架系统
注意：在这些步骤中使用的细胞应已适应单细胞培养物。15- 开始实验hPSCs在6孔培养板上的ECM凝胶培养在约70 - 80％的汇合。删除使用在BSC的立体任何区别殖民地。添加10μM的ROCK抑制剂Y-27632，并在37℃下孵育1小时。
注：卸下分化的殖民地，用枪头取下，轻轻地手动删除体视显微镜下的所有差异化的部分。要小心，不要除去未分化的殖民地。 - 取下孵化器和吸中等细胞。清洗细胞用1毫升的PBS，捞出加0.5 ml细胞分解酶。孵育4细胞 - 5分钟，在37℃。
- 加入1 ml人类胚胎干细胞培养基和收获使用细胞刮细胞。解离细胞进入使用P1,000吸管单细胞。使用计数台盼蓝和血球活细胞。
- 悬浮细胞以2×10 5存活Ç在饲养细胞条件培养基厄尔/毫升补充有100纳克/ ml的bFGF和10μMROCK抑制剂Y-27632。转移细胞对使用5毫升吸管（3毫升6孔板的每孔）超低附着板上。
- 术后第2天，小心地取出从中期（大约1.5毫升）的孵化器和吸半电池。用补充有100纳克/ ml的bFGF新鲜条件培养基更换。
- 每天更换一半培养基与补充有100纳克/ ml的bFGF，直到第5天立即条件培养基，或者进一步培养细胞，通过如持续未分化培养（步骤1.3.1.2 - 5），或用于心肌分化（第2节）。如果继续培养，每4代细胞 - 8天。
- 开始实验hPSCs在6孔培养板上的ECM凝胶培养在约70 - 80％的汇合。删除使用在BSC的立体任何区别殖民地。添加10μM的ROCK抑制剂Y-27632，并在37℃下孵育1小时。
- hPSCs在饲养细胞上培养传代使用IV型胶原酶
- 传代hPSCs之前，删除使用在BSC的立体任何区别的殖民地。吸出介质并洗涤细胞用1mlPBS每孔。删除然后添加0.75毫升胶原酶IV型（1毫克/毫升），在37℃下孵育5 - 15分钟，因为需要具有开始剥离菌落的边缘。
- 吸胶原酶并加入每孔1毫升人类胚胎干细胞培养基。分离使用细胞刮落至小簇，然后用P1,000吸管将细胞转移到15毫升管。小心不要集群分解成小块。
- 洗井用1毫升人类胚胎干细胞中收集任何剩余的细胞，并添加15毫升管。离心在100 xg离心2分钟。吸在补充有100纳克/ ml的bFGF人类胚胎干细胞培养基上清液和重悬细胞。
- 从孵化器中删除MEF涂层板，吸了MEF网上平台。转移细胞以1之间的比率：3和1:10，根据。每天培养基辅以100毫微克/毫升bFGF的新鲜人类胚胎干细胞中的变化。 8天 - 每4代细胞。
- hPSCs培养的未分化细胞球体在静态悬架系统
2. Differenti在静态悬架系统hPSCs为球体的通货膨胀
- 使用一天，在第1.3.1节准备5无差别的球体开始实验。
注意：在此阶段，球状体的平均尺寸应为175±25微米。 50球体至少应该在开始分化实验时使用。 - 转印球体成使用5毫升吸管15毫升管。洗井用1毫升RB中收集任何剩余的球体，并添加到同一个15ml试管。离开细胞5分钟，直到球体已沉淀以形成松散的粒料（DO NOT离心）。吸出上清液，小心不要采取任何球体。
- 加入3 10ml补充有12μMCHIR99021 RB网上平台。转移细胞放回6孔超低附着板的一个孔中。 24小时后，重复步骤2.2。
注：RB介质对光敏感。当与RB中工作，保持BSC光关闭。 - 一个DD 3毫升细胞沉淀RB介质。转移细胞放回6孔超低附着板的一个孔中。 24小时后，重复步骤2.2。
- 添加补充有IWP2，嘌吗啡胺和SB4315423毫升RB培养基（每5微米）。转移细胞放回6孔超低附着板的一个孔中。术后第2天重复步骤2.2。
- 重悬在3ml RB介质和转移的细胞明胶涂覆的板，以允许细胞附着。
注意：在此阶段，细胞也可以保持在悬浮液中。为了继续使用静态悬浮培养，转移细胞回超低安装板。 - 后第2天改变用3ml RB介质的介质。文化将开始打第二天。改变介质每3 - 4天RB网上平台。
在搅拌的生物反应器作为hPSCs球体的3分化
- 未分化的球体文化开始实验在至少3代静态悬挂D（见第1.3.1节）。添加10μM的ROCK抑制剂Y-27632，并在37℃下孵育1小时。
- 从培养箱中取出细胞，并使用5毫升吸管所有球状体转移到15毫升管。洗井用1毫升人类胚胎干细胞中收集任何剩余的球体，并添加到同一个15ml试管。离开细胞5分钟，直到球体已沉淀以形成松散的粒料（DO NOT离心）。吸出上清液，小心不要采取任何球体。
- 通过加入1ml的PBS洗涤细胞。离开5分钟，直到球体已经沉淀，形成一个松散的颗粒（不要离心）。除去上清液，将0.5ml 0.05％胰蛋白酶加0.53毫米EDTA。孵育4细胞 - 5分钟，在37℃。
- 从孵化器中取出细胞，并加入1 ml人类胚胎干细胞培养基。用吸管P1,000，游离细胞成单个细胞，计数采用台盼蓝和血球细胞。重悬至2×10 5 VIAB在条件培养基勒细胞/ ml补充有100纳克/ ml的bFGF和10μMROCK抑制剂Y-27632。
- 将100 ml的细胞悬液与1钟摆硅化生物反应器瓶（参见1.2.5节）。先从35转搅拌，24小时后提高到40转。
- 48小时后，停5搅动 - 10分钟，直到所有的球状体已结算到烧瓶底部。用补充有100纳克/ ml的bFGF条件培养基替换一半培养基。重复同样的过程每隔24小时，直到5天。
注：在此阶段，要形成具有175±25微米的平均尺寸的未分化的球体。 - 停5搅动 - 10分钟，直到所有的球状体已结算到烧瓶底部。传输所有球体至50ml管中培养基（小于50毫升）的最小量。丢弃在生物反应器烧瓶任何剩余介质，小心确保没有球状体是在容器中剩余的。
- LEAVE对于5 - 10分钟，直到所有的球体都在50毫升管的底部落户然后小心地除去上清液而不破坏松散细胞沉淀。洗用25毫升PBS中的钙，镁或RB介质，然后再进行5离开 - 10分钟，直到所有的球体已在50ml管中的底部安定以再次形成一个松散颗粒。
- 小心取出上清液，加40 10ml补充有12μMCHIR99021，10μM岩抑制剂和0.1％的聚乙烯醇（PVA）RB网上平台。悬浮球体和转移所有的细胞回生物反应器烧瓶中。添加介质，使总体积为100ml。以40rpm进行24小时重新开始搅拌。
注：RB介质对光敏感。当与RB中工作保持BSC光关闭模式。 - 重复步骤3.7 - 3.8。
- 小心取出上清液，加入40毫升RB培养基中添加0.1％的PVA。悬浮球体和转移所有的细胞回到T他生物反应器烧瓶中。添加介质，使总体积为100ml。以40rpm进行24小时重新开始搅拌。
- 重复步骤3.7 - 3.8。
- 小心取出上清液，加40 10ml补充与IWP2，嘌吗啡胺和SB431542 RB介质（每次5微米）。悬浮球体和转移所有的细胞回生物反应器烧瓶中。添加介质，使总体积为100ml。以40rpm 2天重新开始搅拌。
- 重复步骤3.7-3.8。
- 小心取出上清液，只添加40毫升RB网上平台。悬浮球体和转移所有的细胞回生物反应器烧瓶中。添加介质，使总体积为100ml。以40rpm重新启动搅拌。 72小时后 - 跳动球体，应观察48。
- 仅通过停止搅拌5与铷介质4天 - - 10分钟，直到所有的球状体已结算到容器的底部改变一半培养基每3条。小心取出50mL培养基中，而不会干扰球体和caref用50毫升新鲜的RB培养基ully替换。
4. hPSCs使用文化分化不适应单细胞传代
注意：此方法是专门为一个高数HPSC线的快速分化有用，而无需适应单细胞培养技术，一个极为劳动密集且耗时的过程。这个技术适用于细胞系是对酶促细胞解离高度敏感，如新建立HPSC线。
- 开始实验在MEF培养（如第1.3.2）hPSCs这是大约70 - 80％汇合。删除使用在BSC的立体任何区别殖民地。
- 除去介质和将0.5ml解离溶液（DS）。孵育0.5 - 1分钟，直到MEF细胞已围捕和hPSCs殖民地的边缘变得清晰起来。快速去除DS和添加0.75毫升胶原酶IV型（1毫克/毫升）。
- 孵化细胞5 - 15分钟，在37℃。检查显微镜下细胞在潜伏期，当整个殖民地开始升空和分离，去除胶原酶，并添加1.5毫升人类胚胎干细胞培养基。
注意：如果15分钟后多数殖民地都还连着，把细胞回孵化器。检查每5分钟，在显微镜下的细胞。要小心，不要留在胶原酶细胞超过30分钟。如果在胶原酶溶液许多漂浮的殖民地，不删除胶原酶;刚刚加入1ml人类胚胎干细胞培养基。 - 用吸管P1,000，轻轻吸取菌落分离作为一个整体的殖民地。不要打破殖民地切成小块。转移细胞进入使用5毫升吸管15毫升管。用1ml的hESC培养基洗井收集任何剩余的细胞以添加到同一管中。离开5分钟，直到所有的殖民地都沉积（不要离心）。
- 小心取出上清液，加2ml人类胚胎干细胞MEDI嗯补充有100纳克/毫升的bFGF。转移细胞进入用5毫升吸管（1毫升到24孔板的每个孔和3ml到6孔板的每个孔）的超低附着板上。在37℃/ 5％CO 2的至少6小时（最多12小时的）。
- 在此期间，准备所需数量的层粘连蛋白包被的孔/板的用于步骤4.7。推荐的细胞传递比是一个6孔板2的孔24孔板（或每表面积等效量）的1汇合井。
- 6小时后，小心地转移集落聚集到用5毫升吸管15毫升管。与铷介质洗涤板以收集任何残留的聚集物，并加入到同一15ml试管（0.5毫升，每孔为24孔和每孔1毫升6孔板）。等待5分钟，直到聚集体沉淀物，然后小心地吸出上清液。要小心，不要打扰松散颗粒。
- 加2ml RB培养基中添加12μMCHIR99021并仔细转移用5毫升吸管到您的预先准备层粘连蛋白包被的孔（如在第1.2.4节），以允许细胞附着。
- 24小时后，小心地取出在每个媒体以及只有加入1ml RB网上平台。
注意：某些聚集体将只附着非常弱到培养板;因此，重要的是不能清除可能介质的变化过程中松动的任何大的聚集体。是很重要的，但是，以除去尽可能多的小细胞碎片尽可能的。 - 24小时后，小心地取出介质，并添加补充IWP2，嘌吗啡胺和SB431542 RB介质（每次5微米）。
- 术后第2天只用RB中改变介质。细胞将开始打第二天。
- 只有RB介质4天 - 改变介质每3。
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Representative Results
为了建立一个简单的方法，用于从hPSCs心肌细胞的大规模分化，我们创造了一种细胞用WNT /β连环蛋白活化剂（CHIR99021）最初处理的协议16，随后用WNT抑制剂/β-连环蛋白和转化生长因子β（TGF-β）的途径（IWP2 16和SB431542 17，分别）和最后的音猬（SHH）途径（嘌吗啡胺）的活化剂17（ 图1A）。在我们的差异化策略，（175±25微米的球体的直径尺寸）开始分化，然后通过第10天有趣提高到100％，使用该协议开始后跳动7天，分化球状体已被观察到的球状体的约50％继续分化开始后18击败长达60天。在分离的球体人口研究通过流式细胞术检查表明，在第15天，超过90％的人口中包含肌钙蛋白T阳性（肌钙蛋白+）细胞，而细胞的小于12％呈阳性反应的平滑肌和内皮标记物（3.1％冯Willibrand因子（vWF的+），8.4％的α-平滑肌肌动蛋白阳性（ASMA +））18。迄今为止，静态悬浮分化方案已通过测试5的hESC和4 hiPSC线，导致从每行跳动球状体，呈现出不同的HPSC线（ 图1B）之间的这种协议的高再现性的约90％的输出。
为了开发用于大规模生产人类心肌细胞的一个综合平台，我们应用我们的静态悬挂的差异化战略，以搅拌的生物反应器（ 图2A）。差分球体显示，在生物反应器中ë类似的行为nvironment如在静态系统（ 图2B），并观察球状体的约100％至在第10天18。免疫染色在跳动在使用针对cTnT和心脏转录因子NKX2-5抗体30天收集球体的章节中跳动，显示这些蛋白质，分别（ 图2C）的细胞质和细胞核的表达。在动态悬浮培养的细胞的总产率为约90 - 在100毫升后分化培养15天的工作空间100百万个细胞。来自20个百万开始hPSCs，接种到hPSCs扩张相为单细胞 - 与此既然如此，心肌收率可达约54-90百万个细胞（90％分化的功效与观测60）。我们采用单细胞膜片钳方法还检查分化的心肌细胞的电生理特性。从生物反应器培养物跳动球状体分别在记录在使用全细胞膜片钳技术代表单元30天和动作电位离解成单细胞。数据显示，三种主要的心脏细胞类型（atrial-，nodal-和心室样细胞）的单细胞18的人口的存在。
对于上述两种分化技术，hPSCs需要适应于无饲养和/或单细胞悬浮培养19-21。然而，一些HPSC线对酶促细胞解离高度敏感，并显示解离后显著细胞活力的损失，例如可以在新成立的hiPSC线被观察到。此外，用大队列线，适应所有到无饲养和单细胞培养物工作时将是巨大的劳动密集且耗时的。为了解决这些问题，无差别的球状体与未分化的细胞聚集体（ 图3A）所取代。我们的数据显示，使用这种改良法，殴打集群出现分化开始后7天。这种修改后的版本的再现，使用42 hiPSC行，其中平均60％以上的cTnT +细胞产生的第15天所有测试线执行（ 图3B）的每个实验证实。免疫染色使用抗cTnT和NKX2-5离解跳动簇表明细胞质和细胞核的表达，分别为（ 图3C）。
效率的图 1。 从静态暂停和代表性的数据hPSCs示意图心肌细胞分化 。（A）hPSCs分化为静态悬挂系统的心肌细胞实验设计（二）评价心脏分化通过计数跳动球体（％）的数量来衡量。这里示出的是从每5的hESC和4 hiPSC线18中的至少3分化实验的平均值。从所有行跳动球体的总平均约为90％。误差棒代表SD（N = 3）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2， 从动态悬挂和代表性的数据hPSCs心肌分化的总体示意图 。（A）实验hPSCs分化的设计，动态悬架系统的心肌细胞。 RI：ROCK抑制剂（B）第5天球体的相衬图像（代表性R鲁瓦扬从人类胚胎干细胞H5线esult）。比例尺200微米（C）人类胚胎干细胞免疫染色派生在击败了NKX2.5和肌钙蛋白30天切片球体。比例尺100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3。使用不适合单细胞传代培养心肌细胞hPSCs分化的总体示意图。的解离（A）的 hPSCs分化使用不适合于单细胞传代培养的心肌细胞的实验设计。（B）的流式细胞仪分离的聚集体的分析结果表明，平均60％以上的cTnT +细胞在42测试hiPSC线（C）的免疫染色心肌细胞来源于iPS细胞的NKX2.5和肌钙蛋白（从646-4 hiPSC线代表结果）。比例尺20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
从hPSCs衍生的心肌细胞是人类疾病模型，药物筛选/毒性试验使用一个非常有吸引力的源，也许在将来，再生疗法。一个主要的障碍然而使用这些细胞，是为他们的有效利用提供足够高的品质的材料的能力。使用我们描述的协议，我们提供克服了这一限制的方法。
最近，针对参与心脏发生特定信号传导途径合成的小分子已被描述为增强心肌分化16,17,22,23。这些现在正在使用作为替代重组细胞因子和血清，含有许多不确定的因素，并示出批量的变化。小分子协议，比其特异性其它的主要优点是，它是便宜的，并构成要素通常具有延长的保质期相比含有细胞因子或生长因子的媒体。如在我们的报告协议中使用的小分子是低分子量剂，但它们在结构上和功能上定义，并且可以很容易地通过细胞膜24,25扩散。
到目前为止，不同的方法已被应用到hPSCs，以便建立可靠，可扩展分化技术;然而，这些方法大多已经建立二维和小规模的静态文化，它可以提供可扩展性差和均匀性。技术如被迫聚集，微印刷技术与微载体培养物26-29，现在来使用，但是，尽管在这方面的一些进展，这些方法仍远未提供用于其在高的使用所需的细胞数系统的按需。有限或未经证实的重现性和可扩展性，且成本高，由于有必要使用昂贵的介质（mTeSR1或StemPro-34）或微载体为扩张hPSCs和它们的定向分化至cardiomyocytes 30,31，是用在高通量hPSCs技术这些方法的缺点。
在这项研究中，我们已经报道用于生产HPSC衍生的心肌的一个简单的，坚固的和可扩展的协议。此协议的可重复性已被证实拥有超过40种不同的HPSC线，最广泛的验证报告的日期。相比于此前报道悬架协议，这种方法显示在可扩展性，可重复性，可负担性，所产生的心肌细胞的疗效和功能方面的巨大优势。我们的分化方案的成功完全取决于用于研究hPSCs的高质量。因此，这是至关重要的，检查每一行的核型和开始实验前通过免疫染色和PCR多潜能标志物的高和持续表达。特别是，在生物反应器中培养细胞时，关键的是要使用已经b hPSCsEEN在微分之前的开始传代在单细胞水平为至少三个通道。在我们的协议，我们已经使用球状体与175±25微米的平均尺寸，这是在5天后产生的球状体。该球体满足这种尺寸限制可以根据个人HPSC系的生长速率而变化的日期;因此，重要的是尺寸，比生长的天以上，被考虑在内。
该协议也可以被操纵以成为适合敏感的细胞系和HPSC线大同伙。虽然这个协议的结果高度富集的心肌细胞，纯度可以通过如乳酸丰富的介质中32分化协议与代谢选择相结合的方法来改善。此外，在该协议中描述的衍生的心肌细胞的成熟和功能的改进可以由代应用于三维，对准心脏的组织中33。一个这种协议的限制是心肌细胞的特定亚型没有具体生成，心房，心室和节点细胞简单的混合物。在这一领域的进一步调查，需要开发一种能够在大规模生产高浓度亚型特异性心肌细胞分化协议。虽然一些小规模的协议已被开发迄今，这些方法都需要进行严格测试，以确保放大是可能34。
这样的集成平台发展可以被认为是朝着HPSC衍生的心肌技术用于临床，制药，组织工程商业化的一个重要步骤，并在体外器官/组织体开发应用。
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Disclosures
维克多昌心脏研究所不参与，也不纵容，人类胚胎研究的破坏。对这一研究的贡献是有限的人类诱导多能干细胞的工作。
作者宣称他们没有竞争的经济利益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
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