Abstract
Maximierung der Nutzen der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Forschung, Krankheitsmodelle, pharmazeutische und klinische Anwendungen erfordert robuste Verfahren für die großtechnische Produktion von funktionellen Zelltypen, einschließlich Kardiomyozyten. Hier zeigen wir, dass die zeitliche Manipulation von WNT, TGF-β und SHH-Signalwege führt zu einer hocheffizienten cardiomyocyte Differenzierung von Einzelzell-passagierten HPSC Linien in sowohl statische Suspension und gerührten Suspension Bioreaktorsysteme. Bei Anwendung dieser Strategie führte zu ~ 100% schlagen Sphäroiden, konsequent mit> 80% kardiales Troponin T-positiven Zellen nach 15 Tagen der Kultur, validiert in mehreren HPSC Linien. Wir berichten auch auf eine Variante dieses Protokolls für die Verwendung mit Zelllinien derzeit nicht Passagierung Einzelzell angepasst, deren Erfolg in 42 HPSC Linien überprüft wurde. erzeugt Kardiomyozyten mit Hilfe dieser Protokolle ausdrücken linienspezifischen Markern und Show erwartet electrophysiologische Funktionalitäten. Unser Protokoll stellt eine einfache, effiziente und robuste Plattform für die großtechnische Produktion von humanen Kardiomyozyten.
Introduction
Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierte pluripotenter Stammzellen (hiPSCs), haben die Fähigkeit der Selbsterneuerung und die Fähigkeit , in Zellen der drei embryonalen Keimschichten 1,2 zu differenzieren. Aufgrund dieser Eigenschaften bieten hPSCs eine wertvolle und unbegrenzte Quelle für die Erzeugung und skalierbare Produktion von krankheitsrelevanten Zelltypen für die menschliche Krankheit Modellierung 3-5, für Hochdurchsatz - Wirkstoff - Screening und Toxizitätsassays 6,7 und potenziell für klinische Anwendungen 8 . Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus hPSCs bietet die Möglichkeit, gezielt die Mechanismen der komplexen menschlichen Herz-Kreislauf- Erkrankungen und deren mögliche Behandlungen zu untersuchen, die zuvor über den Rahmen unserer Möglichkeiten aufgrund des Fehlens von relevanten Tiermodellen und / oder die Verfügbarkeit der betroffenen Primärgewebe.
Alle der oben genannten Anwendungen von hPSCs necessitate die Produktion von massiven Zahlen von hoch angereichertem und funktionellen Kardiomyozyten. Somit ist die Verfügbarkeit eines effizienten, reproduzierbaren und skalierbaren in vitro kardialen Differenzierungs Protokoll geeignet für mehrere Linien HPSC entscheidend. Herkömmliche Kardiomyozytendifferenzierung Protokolle haben unterschiedliche Strategien wie Embryoidkörperbildung Bildung 9, Co-Kulturtechniken 10, Induktion mit Cocktails von Zytokinen 11 und Proteintransduktion Verfahren verwendet 12. Trotz der Fortschritte bei diesen Techniken, die meisten leiden immer noch unter schlechten Wirkungsgrad, erfordern teure Wachstumsfaktoren oder begrenzte Universalität bieten bei dem Versuch, mehrere HPSC Linien zu verwenden. Bis heute haben diese Herausforderungen Grenzen für die Produktion von HPSC abgeleitete Kardiomyozyten für die Zelltherapie - Studien in Tiermodellen festgelegt, sowie in der pharmazeutischen Industrie für Wirkstoffforschung 13. Daher ist die Entwicklung von robusten und erschwinglichen Techniken für große-Skala Herstellung von funktionellen HPSC abgeleitete Kardiomyozyten in skalierbaren Kultursystemen würden ihre kommerziellen und klinischen Anwendungen weitgehend erleichtern.
In diesem Manuskript berichten wir die Entwicklung eines kosteneffektiven und integrierte kardialen Differenzierungssystem mit hoher Wirksamkeit, Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit auf hESCs und hiPSCs aus einer Vielzahl von Quellen und Kulturverfahren erzeugt werden, einschließlich eines Verfahrens für die Herstellung im großen Maßstab von hoch angereicherten Populationen von HPSC abgeleitete Kardiomyozyten einen Bioreaktor mit. Darüber hinaus haben wir dieses Protokoll für HPSC Linien optimiert nicht frei und / oder einzelne Zellkultur, wie neu gegründeten hiPSCs oder großen Kohorten von HPSC Linien relevant Analyse von Krankheitsmechanismus Zubringer angepasst.
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Protocol
1. Herstellung von Kulturmedien, Beschichtung von Zellkulturplatten und Wartung von Undifferenzierte hPSCs
- Nährmedienzubereitung
Hinweis: Sterilisieren Medien eine 0,22 um Filtrationsvorrichtung und lagern bei 4 ° C lichtgeschützt mit bis zu 4 Wochen. Reagenz Namen, Lieferanten und Katalognummern sind in der Material Tabelle aufgeführt.- Für Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Medium vereinen 445 ml DMEM, 50 ml Fetal Bovine Serum (FBS) und 5 ml Zellkulturmedium (zB Glutamax).
- Für hESC Medium, kombinieren 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout Serumersatz (KO-SR), 5 ml Zellkulturmedien, 5 ml MEM Minimum essentiellen Aminosäuren-Lösung und 0,5 ml 55 mM β-Mercaptoethanol.
ACHTUNG: β-Mercaptoethanol ist giftig. Vermeiden Sie das Einatmen, Verschlucken und Hautkontakt. - Für RPMI-B27 (RB) Medium, kombinieren 475 ml RPMI 1640, 10 ml B27 minusInsulin, 5 ml Zellkulturmedium, 5 ml MEM minimale essentielle Aminosäuren Lösung, 5 ml Penicillin / Streptomycin und 0,5 ml 55 mM β-Mercaptoethanol.
- Für die Dissoziationslösung (DS), vereinige 10 ml 0,05% Trypsin, 4 ml KO-SR, 1 ml Kollagenase Typ IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM und 20 & mgr; l CaCl 2 (1 M).
- Für Feeder-Zellen konditioniertes Medium, 15 ml hES-Medium (ohne bFGF) in einen T75-Kolben mit Kon fl ießend Nährzellen (MEF oder Human-Vorhaut-Fibroblasten), die zuvor durch Behandlung mit entweder Mitomycin C oder durch Bestrahlung inaktiviert wurden. Ernte-konditionierte Medium nach 24 Stunden und ersetzen mit frischen hESC Medium. Zellen können bis zu 2 Wochen verwendet werden.
- Beschichtung von Zellkulturplatten
- ECM Gel Beschichtung:
- Nach dem Kauf, tauen die ECM-Gel-Extrakt bei 4 ° C, bis sie in einer gleichmäßig konsistente flüssigen Zustand ist, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünne mit einem Verhältnisvon 1: 2 in kaltem KO-DMEM-Medium, aliquotieren und bei -20 ° C.
Hinweis: Während der Vorbereitung des ECM - Gel, halten alle Materialien für den Einsatz erforderlich in der Aliquotierung und Beschichtungsverfahren kalt. Die Konzentration an ECM Gel variiert mit Chargennummer. Sicherstellen, dass die Konzentration auf Teilmengen festgestellt. Aliquots können für bis zu 6 Monate bei -20 ° C aufbewahrt werden. - Tauen Sie ein ECM-Gel-Aliquot bei 4 ° C. Beim Auftauen, fügen kalt KO-DMEM-Medium für eine endgültige Konzentration von 0,34 mg / ml. Pipette gut und fügen Sie 0,75 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. bei 37 ° C für 1 Stunde inkubiert.
- Nach dem Kauf, tauen die ECM-Gel-Extrakt bei 4 ° C, bis sie in einer gleichmäßig konsistente flüssigen Zustand ist, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünne mit einem Verhältnisvon 1: 2 in kaltem KO-DMEM-Medium, aliquotieren und bei -20 ° C.
- Mitotisch inaktivierten embryonalen Maus - Fibroblasten - Feeder - Zell (MEF) Beschichtung
. Hinweis: Herstellung von feeder - Zellen MEF zuvor beschrieben 14- Mantel eine 6-Well-Zellkulturplatte mit Befestigungsfaktor (AF) oder 0,1% Gelatine (siehe Schritt 1.2.3) bei RT für 5 min (0,75 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte).Entfernen Sie und lassen Sie Platte in der Biosicherheitsschrank (BSC), um zu trocknen.
- Auftauen MEF durch eine gefrorene Ampulle zu einem 37 ° C Wasserbad Transferieren ca. 2 - 3 min.
- In 7 ml MEF Medium in ein 15-ml-Tube. Wenn das Fläschchen von Zellen aufgetaut wird, übertragen den Inhalt langsam in die 15-ml-Tube. Zentrifuge bei 300 × g für 4 min. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen in MEF Medium.
- Zählen Sie die Zellen und die Platte 1 × 10 6 Zellen pro 6 - Well - Platte (~ 1,7 x 10 5 Zellen / Vertiefung). Transfer in ein 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator und erlauben Zellen O / N vor der Verwendung zu befestigen.
- Gelatinebeschichtung:
- Man löst 1 g Gelatinepulver in Reinstwasser, um eine 0,1% machen (w / v) Lösung. bei 37 ° C für 15 min inkubieren, dann 15 min die Lösung bei 121 ° C autoklaviert. Wenn abgekühlt, fügen 15 min bei 37 ° C in die gewünschte Anzahl von Vertiefungen (0,75 ml pro Well einer 6-Well-Platte) und inkubieren.
- Man löst 1 g Gelatinepulver in Reinstwasser, um eine 0,1% machen (w / v) Lösung. bei 37 ° C für 15 min inkubieren, dann 15 min die Lösung bei 121 ° C autoklaviert. Wenn abgekühlt, fügen 15 min bei 37 ° C in die gewünschte Anzahl von Vertiefungen (0,75 ml pro Well einer 6-Well-Platte) und inkubieren.
- Laminin Beschichtung:
- Laminin (1 mg / ml) bei 4 ° C auftauen, bis aufgetaut. Zu 5 ul Laminin-Lösung, 1 ml kaltem PBS. Pipette gut dann auf die erforderliche Anzahl von Vertiefungen (0,75 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) hinzufügen und bei 37 ° C für 1 Stunde inkubiert.
- Silicon Beschichtung von Spinnerflasche Interne Oberfläche:
- Gründlich waschen 100 ml Spinnerflasche (mit 1 Glas Pendel) mit destilliertem Wasser, eine Reinigungsbürste mit Staub zu entfernen und / oder Kulturrückstand. Füllen Sie mit 70% Ethanol und nach 30 min Spülen mit destilliertem Wasser. In 5 M NaOH und O / N verlassen.
- Entfernen NaOH-Lösung und spülen Sie den Kolben unter Wasser für 5 min läuft. Füllen Sie den Kolben mit 1 M HCl und 15 Minuten verlassen. Waschen Sie die Flasche mit Wasser für 5 min läuft, dann zweimal mit doppelt destilliertem Wasser vollständigjede Spur von HCl zu entfernen. Lassen Sie den Kolben vollständig in der BSC zu trocknen.
- In 1,5 ml Silizierverfahren Lösung in den Kolben und drehen sich horizontal alle Oberflächen zu bedecken. Wiederholen Sie den Vorgang für die Glaspendel.
- Erhitzen des beschichteten Kolben in einem Trockenofen bei 100 ° C für 1 Stunde oder zulassen O / N bei RT trocknen. Wenn in einem Ofen erhitzt, lassen für 30 bis RT abkühlen - 60 min.
- Spülen Sie den Kolben 3 mal mit VE-Wasser für jeweils 15 Minuten, dann sterilisieren durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 min.
- ECM Gel Beschichtung:
- Wartung von Undifferenzierte hPSCs
Anmerkung: Für jedes der Protokolle beschrieben, sofern dies nicht ausdrücklich angegeben ist , werden die Zellen gezüchtet und kultiviert in Wells von 6-Well - Kulturplatten und Volumen werden für dieses Format gegeben geeignet.- hPSCs Cultured als undifferenzierte Sphäroiden in einer statischen Suspension System
Anmerkung: Die Zellen in diesen Schritten verwendet werden , sollten bereits angepasst werdenSingle-Zellkultur. 15- Starten Sie experimentieren mit hPSCs auf ECM-Gel kultiviert in einer 6-Well-Kulturplatte bei etwa 70 bis 80% Konfluenz. Entfernen Sie alle differenzierten Kolonien das Stereomikroskop in der BSC mit. In 10 uM ROCK-Inhibitor Y-27632 und bei 37 ° C für 1 Stunde.
Hinweis: Für die differenzierte Kolonien zu entfernen, verwenden Sie eine Pipettenspitze zu lösen und entfernen Sie vorsichtig alle differenzierten Teile manuell unter dem Stereomikroskop. Seien Sie vorsichtig, nicht undifferenzierte Kolonien zu entfernen. - Entfernen Zellen aus Inkubator und absaugen Medium. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS, zu entfernen und 0,5 ml Zelldissoziationsmedium Enzym hinzufügen. Inkubieren der Zellen für 4 - 5 min bei 37 ° C.
- 1 ml hES-Medium und Ernte der Zellen einen Zellschaber verwenden. Distanzieren Sie die Zellen in einzelne Zellen eine p1,000 Pipette. Zählen Sie die lebenden Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer.
- Die Zellen auf 2 × 10 5 lebensfähige cells / ml in Feeder-Zellen konditioniertes Medium mit 100 ng / ml bFGF und 10 uM ROCK-Inhibitor Y-27632 ergänzt. Übertragen Zellen zu ultra-niedrigen Befestigungsplatten unter Verwendung einer 5 ml Pipette (3 ml pro Vertiefung von 6-Well-Platte).
- Nach 2 Tagen sorgfältig Zellen aus Inkubator und aspirieren die Hälfte des Mediums (ca. 1,5 ml) zu entfernen. Ersetzen mit frischem konditioniertes Medium mit 100 ng / ml bFGF ergänzt.
- Ändern Sie die Hälfte des Mediums jeden Tag mit konditionierten Medium, das mit 100 ng / ml bFGF bis zum Tag 5. Nun, entweder weitere Kulturzellen, Passage für die weitere undifferenzierte Kultur (Schritt 1.3.1.2 - 5), oder verwenden Sie für Herz-Differenzierung (Abschnitt 2 ). Bei Fortsetzung der Kultur, jeder Passage Zellen 4 - 8 Tage.
- Starten Sie experimentieren mit hPSCs auf ECM-Gel kultiviert in einer 6-Well-Kulturplatte bei etwa 70 bis 80% Konfluenz. Entfernen Sie alle differenzierten Kolonien das Stereomikroskop in der BSC mit. In 10 uM ROCK-Inhibitor Y-27632 und bei 37 ° C für 1 Stunde.
- hPSCs Cultured auf Feeder - Zellen und Verwendung von Kollagenase Typ IV agierten
- Bevor hPSCs Passagierung, entfernen Sie alle differenzierte Kolonien das Stereomikroskop in der BSC mit. Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 1 mlPBS pro Vertiefung. Add entfernen dann 0,75 ml Kollagenase Typ IV (1 mg / ml) und Inkubation bei 37 ° C für 5 bis 15 min, je nach Bedarf, die Kanten der Kolonien zu haben, beginnend abzuschälen.
- Absaugen Kollagenase und 1 ml hES-Medium pro Vertiefung. Trennen Kolonien zu kleinen Clustern einem Zellschaber verwenden, dann die Zellen übertragen eine p1,000 Pipette in ein 15-ml-Röhrchen mit. Achten Sie darauf, nicht die Cluster in kleine Stücke zu zerbrechen.
- Waschen Sie die gut mit 1 ml hESC Medium alle verbleibenden Zellen zu sammeln und zu 15 ml Röhrchen hinzufügen. Zentrifuge bei 100 × g für 2 min. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen in hES-Medium mit 100 ng / ml bFGF ergänzt.
- Entfernen eines MEF-beschichtete Platte aus dem Inkubator und absaugen MEF Medium. Übertragen, um die Zellen in einem Verhältnis zwischen 1: 3 und 1:10, als angemessen. Ändern Medium täglich mit frischen hESC-Medium mit 100 ng / ml bFGF ergänzt. Passage-Zellen alle 4 - 8 Tage.
- hPSCs Cultured als undifferenzierte Sphäroiden in einer statischen Suspension System
2. Differentiation von hPSCs als Sphäroiden in einer statischen Suspension System
- Starten Sie Experiment mit Tag 5 undifferenzierten Sphäroiden, wie in Abschnitt 1.3.1 vorbereitet.
Anmerkung: In diesem Stadium ist die durchschnittliche Größe der Sphäroide sollte 175 ± 25 & mgr; m sein. Ein Minimum von 50 Sphäroiden sollte verwendet werden, wenn eine Differenzierung Experiment zu starten. - Transfer Sphäroide in einen 15-ml-Röhrchen 5 ml Pipette. Waschen Sie die gut mit 1 ml RB Medium alle verbleibenden Sphäroiden zu sammeln und auf den gleichen 15-ml-Röhrchen hinzufügen. Lassen Sie die Zellen für 5 min bis Sphäroiden sedimentiert haben eine lose Pellet zu bilden (nicht schleudern). Den Überstand aspirieren, achten Sie darauf, keine Sphäroiden zu nehmen.
- 3 ml RB-Medium, ergänzt mit 12 & mgr; M CHIR99021. Übertragen Sie die Zellen wieder in eine Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte. Nach 24 Stunden wiederholen Schritt 2.2.
Hinweis: RB Medium empfindlich ist das Licht. Wenn mit RB Medium arbeiten, halten die BSC Licht ausgeschaltet. - EINdd 3 ml RB Medium zu dem Zellpellet. Übertragen Sie die Zellen wieder in eine Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte. Nach 24 Stunden wiederholen Schritt 2.2.
- 3 ml RB-Medium, ergänzt mit IWP2, purmorphamine und SB431542 (5 & mgr; M jeweils). Übertragen Sie die Zellen wieder in eine Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte. Nach 2 Tagen wiederholen Schritt 2.2.
- Resuspendieren der Zellen in 3 ml Medium, RB und in ein gelatinebeschichteten Platte, damit die Zellen zu befestigen.
Anmerkung: In diesem Stadium können auch Zellen in Suspension gehalten werden. Um mit statischen Suspensionskultur fortzusetzen, übertragen Sie die Zellen wieder in eine ultra-niedrige Befestigungsplatte. - Ändern Sie das Medium mit 3 ml RB Medium nach 2 Tagen. Die Kulturen beginnt am nächsten Tag zu schlagen. Ändern Sie den Medium alle 3 - 4 Tage mit RB Medium.
3. Differenzierung von hPSCs als Sphäroiden in einer Suspension Bioreactor
- Starten Sie experimentieren mit undifferenzierten Sphäroiden Kulturd in statischen Suspension für mindestens 3 Passagen (siehe Abschnitt 1.3.1). In 10 uM ROCK-Inhibitor Y-27632 und bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Entfernen Zellen aus Inkubator und übertragen alle Sphäroiden in einen 15-ml-Röhrchen 5 ml Pipette. Waschen Sie die gut mit 1 ml hES-Medium alle verbleibenden Sphäroiden zu sammeln und auf den gleichen 15-ml-Röhrchen hinzufügen. Lassen Sie die Zellen für 5 min bis Sphäroiden sedimentiert haben eine lose Pellet zu bilden (nicht schleudern). Den Überstand aspirieren, achten Sie darauf, keine Sphäroiden zu nehmen.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml PBS. Lassen Sie für 5 min bis Sphäroiden sedimentiert haben eine lose Pellet zu bilden (nicht schleudern). Überstand entfernen und mit 0,5 ml 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA. Inkubieren der Zellen für 4 - 5 min bei 37 ° C.
- Entfernen Zellen aus dem Inkubator und 1 ml hES-Medium. Mit Hilfe einer Pipette p1,000 distanzieren die Zellen in einzelne Zellen, die Zellen zählen unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer. Resuspendieren bis 2 x 10 5 VIABle Zellen / ml in konditioniertem Medium mit 100 ng / ml bFGF supplementiert und 10 uM ROCK-Inhibitor Y-27632.
- Übertragen Sie 100 ml Zellsuspension in die silikonisierte Bioreaktor Kolben mit 1 Pendel (siehe Abschnitt 1.2.5). Beginnen Sie mit 35 Umdrehungen pro Minute Rühren und nach 24 Stunden Anstieg auf 40 Umdrehungen pro Minute.
- Nach 48 Stunden beenden Rühren 5 - 10 min, bis alle Sphäroiden auf den Boden des Kolbens angesiedelt haben. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums mit konditionierten Medium mit 100 ng / ml bFGF ergänzt. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 24 Stunden bis zum Tag 5.
Anmerkung: In diesem Stadium undifferenzierten Sphäroide mit einer durchschnittlichen Größe von 175 ± 25 & mgr; m gebildet werden sollte. - Stop Rühren während 5 - 10 min, bis alle Sphäroide zum Boden des Kolbens abgesetzt haben. Übertragen alle Sphäroide zu einer 50-ml-Röhrchen in einer minimalen Menge an Medium (weniger als 50 ml). Entsorgen Sie alle restlichen Medium im Bioreaktor Kolben sorgfältig sichergestellt keine Sphäroiden im Behälter verbleiben.
- leave 5 - 10 min, bis alle Sphäroiden am unteren Rand des 50-ml-Röhrchen abgesetzt haben und entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne die lose Zellpellet zu stören. Waschen mit 25 ml PBS mit Calcium und Magnesium oder RB Medium, dann lassen Sie erneut für 5 - 10 min, bis alle Sphäroiden am unteren Rand des 50-ml-Röhrchen wieder angesiedelt haben, um eine lose Pellets bilden.
- Überstand vorsichtig entfernen und 40 ml RB-Medium mit 12 & mgr; M CHIR99021, 10 & mgr; M Rock-Inhibitor und 0,1% Polyvinylalkohol (PVA), ergänzt hinzuzufügen. Resuspendieren der Sphäroiden und übertragen alle Zellen zurück in den Bioreaktor Kolben. In Medium das Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten. Neustart Rühren bei 40 rpm für 24 Stunden.
Hinweis: RB Medium empfindlich ist das Licht. Wenn mit RB Medium halten die BSC in Licht Arbeitsmodus ausgeschaltet. - Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3,8.
- Überstand vorsichtig entfernen und 40 ml RB-Medium mit 0,1% PVA ergänzt hinzufügen. Resuspendieren der Sphäroiden und übertragen alle Zellen zurück zu ter Bioreaktor Kolben. In Medium das Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten. Neustart Rühren bei 40 rpm für 24 Stunden.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3,8.
- Überstand vorsichtig entfernen und 40 ml RB-Medium mit IWP2, purmorphamine und SB431542 (5 & mgr; M jeweils) ergänzt hinzuzufügen. Resuspendieren der Sphäroiden und übertragen alle Zellen zurück in den Bioreaktor Kolben. In Medium das Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten. Neustart Rühren bei 40 Upm für 2 Tage.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3,8.
- Den Überstand sorgfältig entfernen und nur 40 ml RB Medium hinzufügen. Resuspendieren der Sphäroiden und übertragen alle Zellen zurück in den Bioreaktor Kolben. In Medium das Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten. Starten Sie Rühren bei 40 Umdrehungen pro Minute. 72 Stunden später - Beating Sphäroiden sollte 48 beobachtet werden.
- Ändern die Hälfte des Mediums alle 3 - 4 Tage mit RB Medium nur durch Anhalten des Rührens während 5 - 10 min, bis alle Sphäroide zum Boden des Behälters abgesetzt haben. Vorsichtig 50 ml Medium entfernen, ohne die Sphäroiden zu stören und Töully mit 50 ml frischem RB Medium zu ersetzen.
4. Differenzierung von hPSCs Kulturen nicht Angepasst an Single Cell Passagierung Verwendung
Anmerkung: Dieser Ansatz ist für die schnelle Differenzierung einer hohen Anzahl von HPSC Leitungen besonders nützlich , ohne auf Einzelzellkultivierungstechniken anpassen zu müssen, enorm arbeitsintensive und zeitraubender Prozess. Diese Technik ist anwendbar auf Zelllinien, die sehr empfindlich gegenüber enzymatischer Zelldissoziation sind, wie beispielsweise neu eingerichteten HPSC Linien.
- Starten Sie experimentieren mit hPSCs auf MEF kultiviert (wie in Abschnitt 1.3.2), die etwa 70 sind - konfluenten 80%. Entfernen Sie alle differenzierten Kolonien das Stereomikroskop in der BSC mit.
- Entfernen Sie Medium und 0,5 ml Dissoziationslösung (DS). Inkubieren für 0,5 bis 1 min bis MEF-Zellen wurden zusammengetrieben und die Ränder der hPSCs Kolonien deutlich werden. Schnell DS entfernen und 0,75 ml Kollagenase Typ IV (1 mg / ml) hinzufügen.
- bebrütendie Zellen für 5 bis 15 min bei 37 ° C. Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop während der Inkubationszeit, und wenn ganze Kolonien beginnen abzuheben und zu lösen, entfernen Kollagenase und 1,5 ml hES-Medium.
Hinweis: Wenn nach 15 Minuten die meisten Kolonien noch angebracht werden, um die Zellen zu Inkubator zurückgestellt. Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop alle 5 min. Seien Sie nicht vorsichtig, um die Zellen in Kollagenase für mehr als 30 Minuten zu verlassen. Wenn es viele schwebende Kolonien in der Kollagenase-Lösung sind, entfernen Sie nicht die Kollagenase; fügen Sie einfach 1 ml hES-Medium. - Mit Hilfe einer p1,000 Pipette vorsichtig pipettieren Kolonien als ganze Kolonien zu lösen. Sie nicht die Kolonien in kleine Stücke brechen. Übertragen Sie die Zellen in einen 15-ml-Röhrchen 5 ml Pipette. Waschen Sie die gut mit 1 ml hESC Medium alle verbleibenden Zellen zu sammeln, um das gleiche Rohr hinzuzufügen. Lassen Sie für 5 Minuten, bis alle Kolonien sedimentiert haben (nicht schleudern).
- Den Überstand sorgfältig entfernen und 2 ml hESC medi hinzufügenum mit 100 ng / ml bFGF ergänzt. Übertragen Sie die Zellen in eine Ultra-Low-Befestigungsplatte mit 5 ml Pipette (1 ml in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und 3 ml in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte). Inkubieren bei 37 ° C / 5% CO 2 für mindestens 6 h (maximal 12 h).
- Während dieser Zeit bereiten die erforderliche Anzahl von Laminin-beschichteten Vertiefungen / Platten für Schritt 4.7. Empfohlene Zellübertragungsverhältnisse sind 1 konfluenten Vertiefung einer 6-Well-Platte zu 2 Vertiefungen einer 24-Well-Platte (oder eine äquivalente Menge pro Fläche).
- Nach 6 Stunden, Transfer sorgfältig die Kolonie Aggregate in einen 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Pipette. Waschen Sie die Platte mit RB Medium alle verbleibenden Aggregate zu sammeln und auf den gleichen 15-ml-Röhrchen (0,5 ml pro Vertiefung für 24-Well und 1 ml pro Vertiefung für 6-Well-Platten) hinzuzufügen. Warten Sie 5 Minuten, bis die Aggregate Sediment, dann den Überstand vorsichtig absaugen. Achten Sie darauf, nicht die lose Pellet zu stören.
- 2 ml RB-Medium mit 12 & mgr; M CHIR99021 ergänzt und sorgfältig übertragenmit einer 5 ml Pipette auf Ihre Laminin beschichteten Vertiefungen vorgefertigtes (wie in Abschnitt 1.2.4), damit die Zellen zu befestigen.
- Nach 24 Stunden entfernen Sie vorsichtig das Medium in jeder Vertiefung und 1 ml RB Medium nur hinzufügen.
Hinweis: Einige der Aggregate wird nur sehr schwach an der Kulturplatte befestigt ist ; Daher ist es wichtig, keine großen Aggregate zu entfernen, die lose während des Mediums Änderungsverfahren kommen haben. Es ist jedoch wichtig, so viel von der kleinen Zelltrümmer wie möglich zu entfernen. - Nach 24 Stunden entfernen Sie vorsichtig das Medium und RB Medium mit IWP2, purmorphamine und SB431542 (5 & mgr; M jeweils) ergänzt hinzuzufügen.
- Ändern Sie das Medium nach 2 Tagen mit RB Medium nur. Die Zellen beginnen am nächsten Tag zu schlagen.
- Ändern Sie das Medium alle 3 - 4 Tage mit RB Medium nur.
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Representative Results
Um eine einfache Methode für die groß angelegte Differenzierung von Kardiomyozyten aus hPSCs zu etablieren, haben wir ein Protokoll , in dem Zellen zunächst mit einem WNT / β-Catenin - Aktivator (CHIR99021) 16 und anschließend mit Inhibitoren der WNT behandelt wurden / β- Catenin und transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) Bahnen (IWP2 16 und SB431542 17, jeweils) und schließlich ein Aktivator des sonic hedgehog (SHH) -Weg (purmorphamine) 17 (1A). In unserer Differenzierungsstrategie, etwa 50% der Sphäroiden (175 ± 25 & mgr; m Sphäroid Durchmesser Größe) gestartet 7 Tage nach Beginn der Differenzierung zu schlagen, die dann zu 100% von Tag 10. Interessanterweise erhöht, die dieses Protokoll verwenden, differenziert haben Sphäroiden beobachtet schlagen bis zu 60 Tage nach der Differenzierung Einführung 18 fortzusetzen. Bevölkerungsstudien an dissoziierten Sphäroidendurch Durchflusscytometrie untersucht , zeigte , dass mehr als 90% der Bevölkerung kardiales Troponin T positive (cTnT +) Zellen am Tag 15, enthalten sind , während weniger als 12% der Zellen positiv für glatten Muskel und Endothelzellen Marker waren (3,1% von Willibrand Factor (vWF +), 8,4% alpha Glattmuskelaktin-positiv (Asma +)) 18. Bis heute hat die statische Suspension Differenzierung Protokoll auf 5 hESC und 4 hiPSC Linien mit einer Leistung getestet wurde und von etwa 90% der resultierenden Sphäroiden aus jeder Zeile zu schlagen, die eine hohe Reproduzierbarkeit dieses Protokolls zwischen verschiedenen HPSC Linien (Abbildung 1B) zeigt.
Um eine integrierte Plattform für groß angelegte Produktion von menschlichen Kardiomyozyten zu entwickeln, wandten wir unsere statische Suspension Differenzierungsstrategie zu einer gerührten Suspension Bioreaktor (2A). Die Differenzierung Sphäroiden zeigte ein ähnliches Verhalten im Bioreaktor environment wie in dem statischen System (Abbildung 2B) und ca. 100% der Sphäroide wurden beobachtet an Tag schlagen 10 zu 18. Immunostaining in Abschnitten von 30 bei Tag gesammelt Sphäroide schlagen Antikörper gegen cTnT und dem kardialen Transkriptionsfaktor NKX2-5 unter Verwendung zeigten und zytoplasmatische Expression dieser Proteine, bzw. (2C). Die Gesamtausbeute an Zellen in der dynamischen Suspensionskultur betrug etwa 90 bis 100.000.000 Zellen in 100 ml Arbeitsvolumen nach 15 Tagen der Differenzierung Kultur. Damit der Fall ist, kann die Kardiomyozyten Ausbeute auf etwa 54 bis 90.000.000 Zellen erreichen (mit der beobachteten 60 bis 90% Differenzierungs efficacy) von 20 Millionen Ausgangs hPSCs, in der Expansionsphase als einzelne Zellen hPSCs inokuliert. Wir untersuchten zusätzlich die elektrophysiologischen Eigenschaften von differenzierten Kardiomyozyten mit der Single-Cell-Patch-Clamp-Methode. Beating Sphäroiden aus dem Bioreaktor-Kulturen warendistanzierte in aufgezeichnet einzelnen Zellen am Tag 30 und Aktionspotentiale auf den repräsentativen Zellen die ganze Zelle Patch-Clamp-Technik. Die Daten zeigten die Anwesenheit der drei wichtigsten kardialen Zelltypen (atrial-, nodal- und ventrikulären-ähnlichen Zellen) in der Population von Einzelzellen 18.
Für die beiden Differenzierungstechniken , die oben erwähnt wurde , müssen hPSCs zu feeder frei und / oder Einzelzellsuspensionskultur 19-21 angepasst werden. Einige HPSC Linien sind jedoch sehr empfindlich auf enzymatische Zelldissoziationsmedium und zeigen eine signifikante Lebensfähigkeit der Zellen Verlust nach der Dissoziation, wie sie in neu gegründeten hiPSC Linien beobachtet werden. Darüber hinaus, wenn mit großen Kohorten von Linien arbeiten, die alle Kultur Feeder-frei und Single-Cell-Anpassung wäre enorm arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Zu adressieren wurden diese Probleme, undifferenzierten Sphäroide mit undifferenzierten Zellaggregate (3A) ersetzt.Unsere Daten zeigen, dass diese modifizierte Technik, schlagen Cluster 7 Tage nach der Differenzierung Einleitung erschien. Die Reproduzierbarkeit dieser modifizierten Version wurde 42 hiPSC Linien bestätigt Verwendung, wobei alle getesteten Linien erzeugt im Durchschnitt mehr als 60% cTnT + Zellen am Tag 15 für jedes Experiment durchgeführt (Abbildung 3B). Immunostaining unter Verwendung von Antikörpern gegen cTnT und NKX2-5 in dissoziierter schlagen Cluster zeigte und zytoplasmatische Expression, bzw. (3C).
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Kardiomyozytendifferenzierung von hPSCs in Static Aussetzung und repräsentative Daten. (A) Experimentelles Design von hPSCs Differenzierung zu Kardiomyozyten in statischen Federungssystem. (B) Bewertung der Effizienz vonkardiale Differenzierung wird durch Zählen der Anzahl des Schlagens Sphäroide (%) gemessen. Sehen Sie hier die Mittelwerte von mindestens drei Differenzierungsexperimente von jeweils 5 hESC und 4 hiPSC Linien 18. Gesamtdurchschnitt von Sphäroiden aus allen Linien beträgt ca. 90% zu schlagen. Fehlerbalken stellen SD (n = 3). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Gesamtschema von Kardiomyozyten Differenzierung von hPSCs in Dynamic Suspension und repräsentative Daten. (A) Experimentelles Design von hPSCs Differenzierung zu Kardiomyozyten in dynamischen Federungssystem. RI: Rock - Hemmer (B) Phasenkontrastbild von Tag 5 Sphäroiden (Vertreter rRGEBNIS von Royan H5 hESC Linie). Maßstabsbalken 200 & mgr; m (C) Immunfärbung von hESC abgeleiteten schlagen Sphäroiden am Tag 30 für Nkx2.5 und cTnT geschnitten. Maßstabsbalken 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Gesamtschema von Kardiomyozyten Differenzierung von hPSCs Kulturen nicht Angepasst an Single Cell Passagierung verwenden. (A) Experimentelle Gestaltung von hPSCs Differenzierung zu Kardiomyozyten mit Kulturen , die nicht auf einzelne Zelle Passagierbarkeit angepasst. (B) Die Durchflusszytometrie Analyse von dissoziierten Aggregate zeigen im Durchschnitt mehr als 60% cTnT + Zellen in 42 getestet hiPSC Linien. (C) Immunostaining dissoziierter Kardiomyozyten, abgeleitet vonhiPSCs für Nkx2.5 und cTnT (repräsentatives Ergebnis 646-4 hiPSC Linie). Maßstabsbalken 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Kardiomyozyten aus hPSCs abgeleitet sind eine äußerst attraktive Quelle für den Einsatz in der menschlichen Krankheit Modellierung, Wirkstoff-Screening / Toxizitätstests und vielleicht in der Zukunft, regenerative Therapien. Eine der Haupthürden, um diese Zellen jedoch verwendet wird, ist die Fähigkeit, genug hochwertigem Material für ihre wirksame Verwendung zur Verfügung zu stellen. Mit unserem beschriebenen Protokoll, bieten wir eine Methode, die diese Beschränkung überwindet.
Vor kurzem synthetische kleine Moleküle spezifische Signalwege beteiligt in Kardiogenese Targeting wurden beschrieben Herzdifferenzierung 16,17,22,23 zu verbessern. Diese werden nun als Alternative zur rekombinanten Zytokine und Serum verwendet wird, enthält viele undefinierte Faktoren und zeigt Chargenvariation. Der Hauptvorteil eines kleinen Moleküls Protokoll, andere als seine Spezifität ist, dass es preiswert und Komponentenfaktoren ist in der Regel eine längere Haltbarkeit im Vergleich zu Medium, das Cytokine oder Wachstumsfaktoren. Da die kleinen in wiesenen Protokoll verwendet Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht Mittel sind, sind sie strukturell und funktionell definiert und kann leicht durch die Zellmembran diffundieren 24,25.
Bisher sind verschiedene Verfahren wurden hPSCs angewendet, um robuste, skalierbare Differenzierungstechniken zu schaffen; jedoch wurden die meisten dieser Methoden etabliert als 2D und kleine statische Kulturen, die schlechte Skalierbarkeit und Homogenität bieten kann. Techniken wie Zwangs Aggregation, Mikro-Drucktechnologien und Mikroträgerkulturen 26-29 jetzt in Gebrauch kommen, aber trotz einiger Fortschritte in diesem Bereich sind diese Verfahren noch weit von der Zellzahlen für den Einsatz in Hoch erforderlich Bereitstellung -Demand Systeme. Limited oder unbewiesen Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit, sowie die hohen Kosten aufgrund der Notwendigkeit für teure Medien (mTeSR1 oder StemPro-34) oder Mikroträger sowohl für Expansion von hPSCs und deren gerichtete Differenzierung zu cardiomyocytes 30,31, sind die Nachteile dieser Verfahren in hohen Durchsatz hPSCs Technologien.
In dieser Studie haben wir eine einfache, robuste und skalierbare Protokoll für die Herstellung von HPSC abgeleitete Kardiomyozyten berichtet. Die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls hat sich mit mehr als 40 verschiedene HPSC Linien validiert, die umfangreichste Validierung bisher berichtet. Im Vergleich zu früher berichteten Suspension Protokolle, zeigt dieses Verfahren große Vorteile in Bezug auf Skalierbarkeit, Reproduzierbarkeit, Erschwinglichkeit, Effizienz und Funktionalität der erzeugten Kardiomyozyten. Der Erfolg unserer Differenzierung Protokoll ist gründlich abhängig von der hohen Qualität der hPSCs für Studie verwendet. Daher ist es von entscheidender Bedeutung jeder Zeile Karyotyp und die hohe und nachhaltige Expression von Pluripotenz Marker durch Immunfärbung und PCR zu überprüfen, bevor das Experiment zu starten. Insbesondere, wenn die Zellen in dem Bioreaktor Kultivierung ist es entscheidend hPSCs zu verwenden, die mit B habeneen mindestens drei Passagen auf Einzelzellebene agierten vor Beginn der Differenzierung. In unseren Protokolle haben wir Sphäroide mit einer durchschnittlichen Größe von 175 ± 25 & mgr; m verwendet, die nach 5 Tagen Sphäroide wurden. Der Tag, der die Sphäroide diese Größenbeschränkung erfüllen, können in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der einzelnen HPSC Linien variieren; daher ist es wichtig, dass die Größe, die mehr als der Tag des Wachstums, der in Betracht gezogen wird.
Dieses Protokoll kann auch geeignet für empfindliche Zelllinien und großen Kohorten von HPSC Linien zu werden manipuliert werden. Zwar sind in diesem Protokoll Ergebnisse in Kardiomyozyten hoch angereichertem, Reinheit kann durch die Kombination der Differenzierung Protokoll mit einem metabolischen Auswahlmethode wie Lactat angereicherte Medium 32 verbessert werden. Zusätzlich zur Verbesserung der Reifung und Funktionalität der abgeleitete Kardiomyozyten in diesem Protokoll beschrieben ist, kann durch die Erzeugung von dreidimensionalen, ausgerichtet kardialen angewendet werdenGeweben 33. Eine der Beschränkungen dieses Protokolls ist es, dass bestimmte Subtypen von Kardiomyozyten sind nicht speziell erzeugt werden, einfach eine Mischung von atrialer, ventrikulärer und Lymphknotenzellen. Weitere Untersuchungen in diesem Bereich benötigt wird, um die Differenzierung Protokolle zu entwickeln, die hoch angereichertes Subtyp-spezifischen Kardiomyozyten in großem Maßstab produzieren kann. Obwohl einige kleine Protokolle bisher entwickelt worden sind, müssten die Methoden rigoros scale-up getestet werden soll , 34 möglich , zu gewährleisten.
Die Entwicklung solcher integrierten Plattformen können als einen wichtigen Schritt in Richtung der Kommerzialisierung von HPSC abgeleitete Kardiomyozyten Technologien für klinische, pharmazeutische, Tissue Engineering und in vitro - Organ- / organoiden Entwicklungsanwendungen in Betracht gezogen werden.
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Disclosures
Das Victor Chang Cardiac Research Institute beteiligt sich nicht an, noch duldet es, die Zerstörung menschlicher Embryonen für die Forschung. Sein Beitrag zu dieser Studie beschränkte sich auf die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen zu arbeiten.
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
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