Abstract
Maximera nyttan av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) för forskning, sjukdom modellering, farmaceutiska och kliniska tillämpningar kräver robusta metoder för storskalig produktion av funktionella celltyper, inklusive cardiomyocytes. Här visar vi att den tidsmässiga manipulation av WNT, TGF-β, och SHH signalvägar leder till effektiv cardiomyocyte differentiering av encelliga passe hPSC linjer i både statiska suspensionen och omrörd suspension bioreaktorsystem. Att använda denna strategi resulterade i ~ 100% slå sfäroider konsekvent innehållande> 80% kardiellt troponin T-positiva celler efter 15 dagars odling, validerade i flera hPSC linjer. Vi rapporterar också om en variant av detta protokoll för användning med cellinjer för närvarande inte anpassade till encelliga passage, vars framgång har verifierats i 42 hPSC linjer. Kardiomyocyter som genereras med hjälp av dessa protokoll uttrycker härstamning specifika markörer och visa förväntas electrophysiological funktionaliteter. Vår protokoll presenterar en enkel, effektiv och robust plattform för storskalig produktion av mänskliga hjärtmuskelceller.
Introduction
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), har förmågan till självförnyelse och förmåga att differentiera till celler av de tre embryonala groddblad 1,2. På grund av dessa egenskaper, hPSCs ger en värdefull och obegränsad källa för generering och skalbar produktion av sjukdomsrelevanta celltyper för att modellera den mänskliga sjukdomen 3-5, för hög genomströmning drogscreening och toxicitetsanalyser 6,7 och potentiellt för kliniska tillämpningar 8 . Generation av kardiomyocyter från hPSCs ger möjlighet att specifikt undersöka mekanismerna för komplexa mänskliga hjärt-kärlsjukdomar och deras möjliga behandlingar, tidigare utanför ramen för vår förmåga på grund av bristen på relevanta djurmodeller och / eller tillgången till drabbade primära vävnader.
Alla de ovan nämnda tillämpningarna av hPSCs necessitate produktionen av massiva mängder av höganrikat och funktionella hjärtmuskelceller. Således, en effektiv, reproducerbar och skalbar in vitro hjärt differentiering protokoll som lämpar sig för flera hPSC linjer är avgörande att det finns. Konventionella cardiomyocyte differentiering protokoll har använt olika strategier såsom embryoid kropp bildning 9, co-odlingstekniker 10, induktion med cocktails av cytokiner 11 och protein överföringsmetoder 12. Trots framsteg inom dessa tekniker, de flesta fortfarande lider av dålig effektivitet, kräver dyra tillväxtfaktorer, eller erbjuder begränsad universalitet när du försöker använda flera hPSC linjer. Hittills har dessa utmaningar sätta gränser för produktionen av hPSC-härledda kardiomyocyter för cellterapi studier i djurmodeller, samt inom läkemedelsindustrin för läkemedelsutveckling 13. Därför är utvecklingen av robusta och prisvärda tekniker för stor-Scale produktion av funktionella hPSC-härledda kardiomyocyter i skal odlingssystem skulle i hög grad underlätta deras kommersiella och kliniska tillämpningar.
I detta manuskript, rapporterar vi utvecklingen av en kostnadseffektiv och integrerad hjärtdifferentieringssystem med hög effektivitet, reproducerbarhet och tillämpbarhet till hESCs och hiPSCs genereras från en mängd olika källor och odlingsmetoder, bland annat en metod för storskalig produktion av högt anrikade populationer av hPSC-härledda kardiomyocyter med användning av en bioreaktor. Dessutom har vi optimerat detta protokoll för hPSC linjer som inte är anpassade till feeder fri och / eller enkelcellkultur, såsom nybildade hiPSCs eller stora kohorter av hPSC linjer som är relevanta för analys av sjukdomsmekanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av odlingsmedier, Beläggning av cellodlingsplattor och underhåll av odifferentierade hPSCs
- Beredning av media
Obs! Sterilisera media med en 0,22 um filtreringsanordning och förvara vid 4 ° C i skydd mot ljus i upp till fyra veckor. Reagensnamn, leverantörer och katalognummer listas i Material tabell.- För musen Embryonala fibroblasts (MEF) Medium, kombinera 445 ml DMEM, 50 ml fetalt bovint serum (FBS) och 5 ml cellodlingsmedium (t.ex., Glutamax).
- För hESC Medium, kombinera 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout Serum Byte (KO-SR), 5 ml cellkulturmedia, 5 ml MEM minimalt essentiellt aminosyror lösning och 0,5 ml 55 mM β-merkaptoetanol.
VARNING: β-merkaptoetanol är giftig. Undvik inandning, förtäring och hudkontakt. - För RPMI-B27 (RB) Medium, kombinera 475 ml RPMI 1640, 10 ml B27 minusinsulin, 5 ml cellkulturmedia, 5 ml MEM minimalt essentiellt aminosyror lösning, 5 ml penicillin / streptomycin och 0,5 ml 55 mM β-merkaptoetanol.
- För Dissociation Solution (DS), kombinera 10 ml 0,05% trypsin, 4 ml KO-SR, 1 ml kollagenas typ IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM och 20 | j, l CaCl2 (1 M).
- För Feeder-cellkonditionerat medium, tillsätt 15 ml hESC medium (utan bFGF) till en T75-flaska med kon fl uent matarceller (MEF eller humana förhudsfibroblaster) som tidigare har inaktiverats genom behandling med antingen mitomycin C eller genom bestrålning. Harvest konditionerat medium efter 24 timmar och ersätta med färsk hESC medium. Celler kan användas i upp till två veckor.
- Beläggning av cellodlingsplattor
- ECM Gel Coating:
- Vid köp, tina ECM gel extrakt vid 4 ° C tills den är i ett jämnt konsekvent flytande tillstånd, enligt tillverkarens anvisningar. Späd vid ett förhållande1: 2 i kallt KO-DMEM-medium, delprov och förvara vid -20 ° C.
Obs: Under framställningen av ECM gel, hålla alla material som krävs för användning i aliquotting och beläggningsproceduren kallt. Koncentrationen av ECM gel varierar med batchnummer. Se till att koncentrationen noteras på portioner. Alikvoter kan hållas vid -20 ° C i upp till 6 månader. - Tina en ECM gel alikvot vid 4 ° C. När tinade, tillsätt kallt KO-DMEM-medium för en slutkoncentration av 0,34 mg / ml. Pipettera väl och tillsätt 0,75 ml per en brunn i en 6-brunnsplatta. Inkubera under 1 h vid 37 ° C.
- Vid köp, tina ECM gel extrakt vid 4 ° C tills den är i ett jämnt konsekvent flytande tillstånd, enligt tillverkarens anvisningar. Späd vid ett förhållande1: 2 i kallt KO-DMEM-medium, delprov och förvara vid -20 ° C.
- Mitotiskt inaktiverat Mouse embryonala Fibroblast Feeder Cell (MEF) Beläggning
Obs.: Beredning av MEF matarceller har beskrivits tidigare 14- Belägga en 6-brunnars cellodlingsplatta med Attachment Factor (AF) eller 0,1% gelatin (se steg 1.2.3) vid RT under 5 min (0,75 ml per en brunn i en 6-brunnsplatta).Ta bort och lämna plattan i biosäkerhet skåpet (BSC) för att torka.
- Tina MEF genom att överföra en fryst ampull till en 37 ° C vattenbad under ca 2-3 min.
- Lägga 7 ml MEF medium till en 15 ml rör. När flaskan med celler tinas långsamt överföra innehåll till 15 ml röret. Centrifugera vid 300 xg under 4 minuter. Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i MEF medium.
- Räkna celler och plattan 1 x 10 6 celler per 6 brunnar (~ 1,7 x 10 5 celler / brunn). Överför till en 37 ° C / 5% CO2 inkubator och tillåta cellerna att fästa O / N innan användning.
- Gelatin Beläggning:
- Lös 1 g gelatinpulver i ultrarent vatten till en 0,1% (vikt / volym) lösning. Inkubera i 15 min vid 37 ° C sedan autoklavera lösningen vid 121 ° C under 15 min. När den kyls, tillfoga till det nödvändiga antalet brunnar (0,75 ml per en brunn i en 6-brunnars platta) och inkubera under 15 min vid 37 ° C.
- Lös 1 g gelatinpulver i ultrarent vatten till en 0,1% (vikt / volym) lösning. Inkubera i 15 min vid 37 ° C sedan autoklavera lösningen vid 121 ° C under 15 min. När den kyls, tillfoga till det nödvändiga antalet brunnar (0,75 ml per en brunn i en 6-brunnars platta) och inkubera under 15 min vid 37 ° C.
- Laminin Coating:
- Tina laminin (1 mg / ml) vid 4 ° C tills de tinat. Till 5 pl laminin lösningen, tillsätt 1 ml kall PBS. Pipettera väl sedan lägga till önskat antal brunnar (0,75 ml per en brunn i en 6-brunnars platta) och inkubera under 1 h vid 37 ° C.
- Silicon Beläggning av Spinner Flask ryta:
- Tvätta en 100 ml spinnerflaska (med ett glas pendel) med destillerat vatten med en rengöringsborste för att avlägsna damm och / eller kultur rest. Fyll med 70% etanol och efter 30 minuter skölj med destillerat vatten. Tillsätt 5 M NaOH och lämna O / N.
- Ta NaOH-lösning och skölj kolven under rinnande vatten i fem minuter. Fyll kolven med en M HCl och låt stå i 15 minuter. Skölj kolven med rinnande vatten under 5 min, sedan två gånger med dubbeldestillerat vatten för att fullständigtta bort alla spår av HCl. Låt kolven torka helt i BSC.
- Tillsätt 1,5 ml silikonisering lösning till kolven och rotera horisontellt för att täcka alla ytor. Upprepa samma procedur för glas pendeln.
- Värm den belagda kolv i en torr ugn vid 100 ° C under 1 h eller låt torka O / N vid RT. Vid uppvärmning i en ugn, låt svalna till rumstemperatur under 30-60 min.
- Skölj kolven 3 gånger med avjoniserat vatten i 15 minuter vardera, sedan sterilisera i autoklav i 121 C i 20 minuter.
- ECM Gel Coating:
- Underhåll av Odifferentierade hPSCs
Obs: För vart och ett av de protokoll som beskrivs, om inte annat angivits, cellerna odlas och odlas i brunnarna i 6-brunnsodlingsplattor och volymer kommer att ges lämplig för detta format.- hPSCs Odlade som diverse sfäroider i en statisk Suspension System
Obs: Celler som används i dessa steg bör redan anpassas tillsingle-cellkultur. 15- Inled experimentet med hPSCs odlas på ECM-gel i en 6-brunnars odlingsplatta vid ca 70 - 80% sammanflytning. Ta bort eventuella differentierade kolonier med hjälp av stereo i BSC. Tillsätt 10 ^ M ROCK inhibitor Y-27632 och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
Anmärkning: För att ta bort differentierade kolonier, använd en pipettspets för att lossa och ta försiktigt bort alla differentierade delar manuellt under stereomikroskop. Var noga med att inte ta bort odifferentierade kolonier. - Ta bort celler från inkubator och aspirera medium. Tvätta cellerna med 1 ml PBS, ta bort och lägga 0,5 ml cell dissociation enzym. Inkubera cellerna i 4-5 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 1 ml hESC medium och skörda cellerna med användning av en cellskrapa. Dissociera cellerna i enstaka celler med användning av en p1,000 pipett. Räkna livskraftiga celler med användning av trypanblått och en hemocytometer.
- Resuspendera celler till 2 x 10 5 livskraftig cElls / ml i feeder-cellkonditionerat medium kompletterat med 100 ng / ml bFGF och 10 pM ROCK-inhibitor Y-27632. Överför celler till extremt låga fästplattor med hjälp av en 5 ml pipett (3 ml per brunn av 6-brunnar).
- Efter 2 dagar, försiktigt bort celler från inkubatorn och aspirera halv av mediet (ca 1,5 ml). Ersätt med färskt konditionerat medium kompletterat med 100 ng / ml bFGF.
- Ändra hälften av mediet varje dag med konditionerat medium kompletterat med 100 ng / ml bFGF till dag 5. Nu, antingen ytterligare kulturceller, passage för fortsatt odifferentierade kultur (steg 1.3.1.2 - 5), eller använda för hjärtdifferentiering (Avsnitt 2 ). Om du fortsätter kultur, passageceller var 4 - 8 dagar.
- Inled experimentet med hPSCs odlas på ECM-gel i en 6-brunnars odlingsplatta vid ca 70 - 80% sammanflytning. Ta bort eventuella differentierade kolonier med hjälp av stereo i BSC. Tillsätt 10 ^ M ROCK inhibitor Y-27632 och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- hPSCs Odlade på matarceller och passe Använda kollagenas typ IV
- Innan passage hPSCs, avlägsna eventuella differentierade kolonier med hjälp av stereo i BSC. Aspirera mediet och tvätta cellerna med 1 mlPBS per brunn. Ta tillsätt sedan 0,75 ml kollagenas typ IV (1 mg / ml) och inkubera vid 37 ° C under 5 - 15 min, såsom krävs för att ha kanter kolonierna börjar att lossna.
- Aspirera kollagenas och tillsätt 1 ml hESC medium per brunn. Lösgöra kolonier till små kluster med hjälp av en cellskrapa, sedan överföra cellerna med användning av en p1,000 pipett till ett 15 ml rör. Var noga med att inte bryta upp kluster i små bitar.
- Tvätta väl med en ml hESC medium för att samla eventuella kvarvarande celler och tillsätt 15 ml rör. Centrifugera vid 100 x g under 2 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i hESC medium kompletterat med 100 ng / ml bFGF.
- Ta en MEF belagda plattan från inkubatorn och aspirera MEF mediet. Överföra celler i ett förhållande mellan 1: 3 och 1:10, som är lämpligt. Ändra mediet dagligen med färska hESC medium kompletterat med 100 ng / ml bFGF. Passageceller var 4 - 8 dagar.
- hPSCs Odlade som diverse sfäroider i en statisk Suspension System
2. Differentiation av hPSCs som sfäroider i en statisk Suspension System
- Börja experiment med dag 5 odifferentierade sfäroider som framställts i avsnitt 1.3.1.
Obs: I detta skede bör den genomsnittliga storleken på sfäroider vara 175 ± 25 nm. Ett minimum av 50 sfäroider ska användas när du startar en differentieringsexperiment. - Transfer sfäroider i en 15 ml rör med hjälp av en 5 ml pipett. Tvätta väl med en ml RB-medium för att samla in eventuella kvarvarande sfäroider och lägg till samma 15 ml rör. Låt cellerna i 5 minuter tills sfäroider har sediment att bilda en lös pellet (Centrifugera inte). Aspirera supernatanten, försiktigt så att inte vidta några sfäroider.
- Tillsätt 3 ml RB-medium kompletterat med 12 iM CHIR99021. Överföra celler tillbaka in en brunn i en 6-brunnars ultralåg fästplatta. Efter 24 timmar, upprepa steg 2,2.
Obs: RB mediet är ljuskänslig. När du arbetar med RB medium, hålla BSC ljus avstängd. - endd 3 ml RB medel till cellpelleten. Överföra celler tillbaka in en brunn i en 6-brunnars ultralåg fästplatta. Efter 24 timmar, upprepa steg 2,2.
- Tillsätt 3 ml RB-medium kompletterat med IWP2, purmorphamine och SB431542 (5 ^ M vardera). Överföra celler tillbaka in en brunn i en 6-brunnars ultralåg fästplatta. Efter 2 dagar upprepa steg 2,2.
- Resuspendera cellerna i 3 ml RB-medium och överför till en gelatin-belagda plattan för att tillåta cellerna att fästa.
Obs: I detta skede kan cellerna också hållas i suspension. För att fortsätta med statisk suspensionsodling, överföra celler till en extremt låg fästplatta. - Ändra mediet med 3 ml RB-medium efter 2 dagar. Kulturerna kommer att börja slå nästa dag. Ändra mediet var 3 - 4 dagar med RB medium.
3. Differentiering av hPSCs som sfäroider i en omrörd suspension Bioreactor
- Börja experimentera med odifferentierade sfäroider kulturd i statiskt suspension i minst 3 passager (Se avsnitt 1.3.1). Tillsätt 10 ^ M ROCK inhibitor Y-27632 och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Ta bort celler från inkubatorn och överföra alla sfäroider i en 15 ml rör med hjälp av en 5 ml pipett. Tvätta väl med en ml hESC medium för att samla eventuella kvarvarande sfäroider och lägg till samma 15 ml rör. Låt cellerna i 5 minuter tills sfäroider har sediment att bilda en lös pellet (Centrifugera inte). Aspirera supernatanten, försiktigt så att inte vidta några sfäroider.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 1 ml PBS. Låt stå i 5 min tills sfäroider har sediment att bilda en lös pellet (Centrifugera inte). Avlägsna supernatanten och tillsätt 0,5 ml 0,05% trypsin plus 0,53 mM EDTA. Inkubera cellerna i 4-5 min vid 37 ° C.
- Avlägsna celler från inkubatorn och tillsätt 1 ml hESC medium. Med användning av en p1,000 pipett dissociera cellerna till enstaka celler, räkna cellerna med hjälp av trypanblått och en hemocytometer. Resuspendera till 2 x 10 5 VIABle celler / ml i konditionerat medium som kompletterats med 100 ng / ml bFGF och 10 pM ROCK-inhibitor Y-27632.
- Överför 100 ml av cellsuspensionen i silikon bioreaktor kolven med en pendel (se avsnitt 1.2.5). Börja med 35 rpm omrörning och efter 24 timmar ökade till 40 rpm.
- Efter 48 h, stopp omrörning under 5-10 min tills alla sfäroiderna har bosatt sig till botten av kolven. Ersätta hälften av mediet med konditionerad medium kompletterat med 100 ng / ml bFGF. Upprepa samma process varje 24 timmar till dag fem.
Obs: I detta skede bör odifferentierade sfäroider med en genomsnittlig storlek på 175 ± 25 nm bildas. - Stoppa omrörning under 5 - 10 min tills alla sfäroiderna har bosatt sig till botten av kolven. Överför alla sfäroider till en 50 ml rör i en minimal mängd medium (mindre än 50 ml). Kasta eventuellt kvarvarande medium i bioreaktorn kolven noggrant se några sfäroider kvar i kärlet.
- leave i 5 - 10 min tills alla sfäroiderna har bosatt sig på botten av den 50 ml rör sedan försiktigt bort supernatanten utan att störa den lösa cellpelleten. Tvätta med 25 ml PBS med kalcium och magnesium eller RB medium, sedan lämna igen i 5 - 10 min tills alla sfäroiderna har bosatt sig på botten av den 50 ml rör för att återigen bilda en lös pellet.
- Försiktigt bort supernatanten och tillsätt 40 ml RB-medium kompletterat med 12 iM CHIR99021, 10 iM Rock inhibitor och 0,1% polyvinylalkohol (PVA). Resuspendera sfäroiderna och överföra alla celler tillbaka till bioreaktorn kolven. Lägg medium för att göra den totala volymen 100 ml. Starta omrörning vid 40 varv per minut under 24 h.
Obs: RB mediet är ljuskänslig. När man arbetar med RB mediet hålla BSC i ljuset avstängd läge. - Upprepa steg från 3,7 till 3,8.
- Försiktigt bort supernatanten och tillsätt 40 ml RB-medium kompletterat med 0,1% PVA. Resuspendera sfäroiderna och överföra alla celler tillbaka till than bioreaktor kolv. Lägg medium för att göra den totala volymen 100 ml. Starta omrörning vid 40 varv per minut under 24 h.
- Upprepa steg från 3,7 till 3,8.
- Försiktigt bort supernatanten och tillsätt 40 ml RB-medium kompletterat med IWP2, purmorphamine och SB431542 (5 ^ M vardera). Resuspendera sfäroiderna och överföra alla celler tillbaka till bioreaktorn kolven. Lägg medium för att göra den totala volymen 100 ml. Starta omrörning vid 40 varv per minut under 2 dagar.
- Upprepa steg från 3,7 till 3,8.
- Försiktigt bort supernatanten och tillsätt 40 ml RB-medium bara. Resuspendera sfäroiderna och överföra alla celler tillbaka till bioreaktorn kolven. Lägg medium för att göra den totala volymen 100 ml. Starta omrörning vid 40 rpm. Seger sfäroider bör observeras 48-72 timmar senare.
- Ändra hälften av mediet var 3: e - 4 dagar med RB-medium enbart genom att stoppa omrörningen under 5 - 10 min tills alla sfäroiderna har bosatt sig till botten av kärlet. Försiktigt bort 50 ml medium utan att störa sfäroiderna och carefUlly ersätta med 50 ml färskt RB medium.
4. Differentiering av hPSCs Använda kulturer inte anpassade till Single Cell Aging
Obs! Detta tillvägagångssätt är speciellt användbar för snabb differentiering av ett stort antal hPSC linjer utan att behöva anpassa sig till encelliga odlingstekniker, en oerhört arbetskrävande och tidskrävande process. Denna teknik är tillämpbar på cellinjer som är mycket känsliga för enzymatisk cell dissociation, såsom nybildade hPSC linjer.
- Börja experimentera med hPSCs odlade på MEF (som i avsnitt 1.3.2) som är cirka 70 - 80% sammanflytande. Ta bort eventuella differentierade kolonier med hjälp av stereo i BSC.
- Avlägsna mediet och tillsätt 0,5 ml Dissociation Solution (DS). Inkubera 0,5-1 min tills MEF celler har avrundats uppåt och kanter hPSCs kolonier blir klar. Snabbt bort DS och tillsätt 0,75 ml kollagenas typ IV (1 mg / ml).
- inkuberacellerna i 5 - 15 min vid 37 ° C. Kontrollera cellerna under mikroskop under inkubationstiden, och när hela kolonier börjar att lyfta av och lossa, ta bort kollagenas och tillsätt 1,5 ml hESC medium.
Obs: Om efter 15 minuter de flesta av kolonierna är fortfarande sitter, sätta cellerna tillbaka till inkubatorn. Kontrollera cellerna under mikroskop var 5 min. Var noga med att inte lämna cellerna i kollagenas för mer än 30 minuter. Om det finns många flytande kolonier i kollagenas lösning, inte ta bort kollagenas; bara tillsätt 1 ml hESC medium. - Med hjälp av en p1,000 pipett försiktigt pipettera kolonier att lösgöra som hela kolonier. Bryt inte kolonierna i små bitar. Överföra celler till ett 15 ml rör med hjälp av en 5 ml pipett. Tvätta brunnen med 1 ml hESC medium för att samla in eventuella kvarvarande celler för att lägga till samma rör. Låt stå i 5 min tills alla kolonier har sedimenterat (Centrifugera inte).
- Försiktigt bort supernatanten och tillsätt 2 ml hESC medium kompletterat med 100 ng / ml bFGF. Överföra celler till en ultra-låg fastsättningsplatta med användning av 5 ml pipett (1 ml i varje brunn i en 24-brunnars platta och 3 ml i varje brunn i en 6-brunnsplatta). Inkubera vid 37 ° C / 5% CO2 under minst 6 h (max 12 tim).
- Under denna tid, förbereda det nödvändiga antalet laminin-belagda brunnar / plattor för steg 4,7. Rekommenderad cellöverföringsförhållandena är ett sammanflytande brunn i en 6-brunnars platta till 2 brunnar i en 24-brunnars platta (eller ekvivalent mängd per ytarea).
- Efter sex timmar, noggrant överföra koloni aggregaten i ett 15 ml rör med 5 ml pipett. Tvätta plattan med RB-medium för att samla eventuella kvarvarande aggregat och tillsätt till samma 15 ml rör (0,5 ml per brunn för 24-brunns och 1 ml per brunn för 6-brunnars plattor). Vänta 5 min tills aggregat sediment, sedan försiktigt aspirera supernatanten. Var noga med att inte störa den lösa pelleten.
- Tillsätt 2 ml RB-medium kompletterat med 12 iM CHIR99021 och noggrant överföramed en 5 ml pipett till dina förberedda laminin belagda brunnar (som i avsnitt 1.2.4) för att tillåta cellerna att fästa.
- Efter 24 timmar, försiktigt bort mediet i varje brunn och tillsätt 1 ml RB-medium bara.
Obs: En del av aggregaten kommer att ha endast fäst mycket svagt till odlingsplattan; Därför är det viktigt att inte avlägsna eventuella stora aggregat som kan ha lossnat under medel förfarande förändring. Det är emellertid viktigt att avlägsna så mycket av den lilla cellrester som möjligt. - Efter 24 timmar, försiktigt bort mediet och tillsätt RB medium kompletterat med IWP2, purmorphamine och SB431542 (5 ^ M vardera).
- Ändra mediet efter 2 dagar med endast RB medium. Celler kommer att börja slå nästa dag.
- Ändra mediet var 3 - 4 dagar med endast RB medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att fastställa en enkel metod för storskalig differentiering av hjärtmuskelceller från hPSCs, skapade vi ett protokoll där cellerna behandlades initialt med en WNT / β-catenin aktivator (CHIR99021) 16 och därefter med hämmare av WNT / β- catenin och transformerande tillväxtfaktor-β (TGF-β) vägar (IWP2 16 och SB431542 17, respektive) och slutligen en aktivator av sonic hedgehog (SHH) vägen (purmorphamine) 17 (Figur 1A). I vår differentiering strategi, ungefär 50% av sfäroiderna (175 ± 25 nm sfäroid diameter storlek) började slå 7 dagar efter påbörjad differentiering, som sedan ökas till 100% dag 10. Intressant användning av detta protokoll, differentierade sfäroider har observerats att fortsätta slå upp till 60 dagar efter differentiering initiering 18. Populationsstudier på dissocierade sfäroiderundersöktes genom flödescytometri visade att på dag 15, mer än 90% av befolkningen innehöll cardiac troponin T positiv (cTnT +) celler, medan mindre än 12% av cellerna var positiva för glatt muskulatur och endotelceller markörer (3,1% von Willibrand Factor (vWF +), 8,4% alfa glatt muskulatur aktin-positiva (Asma +)) 18. Hittills har den statiska suspensionen differentiering protokoll testats på fem hESC och 4 hiPSC linjer, med utgångar vilket resulterar i cirka 90% av slå sfäroider från varje rad, som visar hög reproducerbarhet av detta protokoll mellan olika hPSC linjer (Figur 1B).
För att utveckla en integrerad plattform för storskalig produktion av mänskliga hjärtmuskelceller, tillämpade vi vår statisk suspensions differentiering strategi till en omrörd suspension bioreaktor (Figur 2A). De differentierande sfäroider visade liknande beteende i bioreaktorn eILJÖ som i det statiska systemet (Figur 2B) och ungefär 100% av sfäroider observerades att slå på dag 10 18. Immunfärgning i sektioner av slå sfäroider som insamlats på dag 30 med användning av antikroppar mot cTnT och hjärttranskriptionsfaktor NKX2-5, visade cytoplasmisk och nukleär expression av dessa proteiner, respektive (Figur 2C). Det totala utbytet av celler i det dynamiska suspensionskultur var cirka 90 - 100 miljoner celler i 100 ml arbetsvolym efter 15 dagar av differentiering kultur. Med detta är fallet, kan den cardiomyocyte utbyte nå upp till ungefär 54 till 90.000.000 celler (med den observerade 60-90% differentiering effekt) från 20 miljoner startande hPSCs ympade in i hPSCs expansionsfasen som enskilda celler. Vi undersökte dessutom de elektrofysiologiska egenskaperna hos differentierade cardiomyocytes med hjälp av encelliga patch clamp-metoden. Slå sfäroider från bioreaktorn kulturerna vardissocieras till enskilda celler på dag 30 och aktionspotentialer som registreras på representativa celler genom att använda hela cell patch-clamp-tekniken. Data visade närvaron av de tre huvudsakliga hjärtcelltyper (atrial-, nodal- och ventrikulära-liknande celler) i populationen av enskilda celler 18.
För de två differentierings tekniker som nämns ovan, hPSCs behöver anpassas till feeder-fria och / eller enkelcellsuspensionskultur 19-21. Vissa hPSC linjer är dock mycket känsliga för enzymatisk cell dissociation och visar betydande cellviabiliteten förlust efter dissociation, såsom kan observeras i nystartade hiPSC linjer. Dessutom, när man arbetar med stora grupper av linjer, anpassa alla till matarfria och encelliga kultur skulle vara oerhört arbetskrävande och tidskrävande. Att ta itu med dessa frågor, var odifferentierade sfäroider ersattes med odifferentierade cellaggregat (Figur 3A).Våra data visar att användningen av denna modifierade teknik, verkade slå kluster 7 dagar efter differentiering inletts. Reproducerbarheten av denna modifierade version bekräftades med hjälp av 42 hiPSC linjer, där alla testade linjer som genereras i genomsnitt mer än 60% cTnT + celler genom dag 15 för varje experiment (figur 3B). Immunfärgning med hjälp av antikroppar mot cTnT och NKX2-5 i dissocierade slå kluster visade cytoplasmisk och nukleär uttryck, respektive (Figur 3C).
Figur 1. Schematisk bild av cardiomyocyte Differentiering från hPSCs i statisk Suspension och representativa uppgifter. (A) Experimentell design av hPSCs differentiering till kardiomyocyter i statisk suspensionssystemet. (B) Utvärdering av effektiviteten avhjärtdifferentiering mäts genom att räkna antalet slå sfäroider (%). Här visas är medeltal av åtminstone 3 differentieringsexperiment från var och en av 5 hESC och 4 hiPSC linjerna 18. Totalt genomsnitt slå sfäroider från alla linjer är ungefär 90%. Felstaplar representerar SD (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Övergripande Schematisk bild av Cardiomyocytes Differentiering från hPSCs i Dynamic Suspension och representativa uppgifter. (A) Experimentell design av hPSCs differentiering till kardiomyocyter i dynamiskt upphängningssystem. RI: Rock-hämmare (B) Fas kontrastbild av dag 5 sfäroider (representant result från Royan H5 hESC linje). Skala bar 200 m (C) immunfärgning av hESC härrör ledande sfäroider sektionerade vid dag 30 för Nkx2.5 och cTnT. Skala bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Totalt Schematisk bild av Cardiomyocytes Differentiering från hPSCs använder kulturer inte anpassade till Single Cell Aging. (A) Experimentell utformning av hPSCs differentiering till kardiomyocyter som använder kulturerna inte är anpassade till en enda cell passaging. (B) Flödescytometrianalys av dissocierade aggregat visar i genomsnitt mer än 60% cTnT + celler i 42 testade hiPSC linjer. (C) Immunfärgning av dissocierade kardiomyocyter härledda frånhiPSCs för Nkx2.5 och cTnT (Representant resultat 646-4 hiPSC linje). Skala bar 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kardiomyocyter härledda från hPSCs är en mycket attraktiv källa för användning i mänsklig modellering sjukdom, screening test drog / toxicitet och, kanske i framtiden, regenerativ behandlingar. En av de stora hindren för att använda dessa celler är emellertid förmågan att ge tillräckligt material av hög kvalitet för deras effektiva användning. Med vår beskrivna protokollet, erbjuder vi en metod som övervinner denna begränsning.
Nyligen har syntetiska små molekyler riktade mot särskilda signalvägar som är involverade i kardiogenes beskrivits för att förbättra hjärtdifferentiering 16,17,22,23. Dessa används nu som ett alternativ till rekombinanta cytokiner och serum, som innehåller många odefinierade faktorer och visar satsvariation. Den största fördelen med en liten molekyl protokoll, andra än dess specificitet, är att det är billigt och komponentfaktorer har i allmänhet en förlängd hållbarhet i jämförelse med media innehållande cytokiner eller tillväxtfaktorer. Som de små molekyler som används i vår rapporterade protokollet är lågmolekylära medel, de är strukturellt och funktionellt definierade och kan diffundera lätt genom cellmembranet 24,25.
Hittills har olika metoder använts för hPSCs för att etablera robusta, skalbara differentieringsteknik; De flesta av dessa metoder har fastställts som 2D och småskaliga statiska kulturer, som kan erbjuda svaga skalbarhet och homogenitet. Tekniker såsom tvångs aggregering, teknik mikro-tryckning och mikro-bärare kulturer 26-29 nu kommer i bruk, men trots vissa framsteg på detta område, dessa metoder är fortfarande långt från att ge cell antal som krävs för deras användning i hög -demand system. Begränsad eller obevisade reproducerbarhet och skalbarhet, och de höga kostnader på grund av behovet av dyra media (mTeSR1 eller StemPro-34) eller mikrobärare för både utbyggnad av hPSCs och deras riktade differentiering till cardiomyocytes 30,31, är nackdelarna med att använda dessa metoder i hög kapacitet hPSCs teknologier.
I denna studie har vi rapporterat en enkel, robust och skalbar protokoll för produktion av hPSC-härledda kardiomyocyter. Reproducerbarheten av detta protokoll har validerats med mer än 40 olika hPSC linjer, den mest omfattande validering som hittills rapporterats. Jämfört med tidigare rapporterade upphängningsprotokoll, visar denna metod stora fördelar när det gäller skalbarhet, reproducerbarhet, överkomliga priser, effektivitet och funktionalitet cardiomyocytes genereras. Framgången för vår differentiering protokollet är ordentligt beroende på den höga kvaliteten på de hPSCs används för studier. Därför är det viktigt att kontrollera varje rads karyotyp och den höga och ihållande uttryck av pluripotens markörer genom immunfärgning och PCR innan försöket. Särskilt då odling av celler i bioreaktorn är det avgörande att använda hPSCs som har Been passe vid enkelcellnivån i minst tre passager före starten av differentiering. I våra protokoll har vi använt sfäroider med en genomsnittlig storlek på 175 ± 25 nm, vilket var sfäroider genererade efter 5 dagar. Dagen som sfäroiderna möta denna storleksbegränsning kan variera beroende på tillväxten av enskilda hPSC linjer; därför är det viktigt att storleken, mer än dagen för tillväxt, tas i beaktande.
Detta protokoll också kan manipuleras för att bli lämplig för känsliga cellinjer och stora kohorter av hPSC linjer. Även detta protokoll resulterar i höganrikat kardiomyocyter, kan renhet förbättras genom att kombinera differentieringsprotokoll med en metabolisk urvalsmetod såsom laktat-berikade mediet 32. Dessutom kan förbättringar i mognad och funktionaliteten hos de härledda kardiomyocyter som beskrivs i detta protokoll skall tillämpas av generering av tredimensionella, i linje med hjärtvävnader 33. En av begränsningarna i detta protokoll är att vissa subtyper av kardiomyocyter inte specifikt genereras, helt enkelt en blandning av atrial, ventrikulära och nodal celler. Det behövs ytterligare analys av detta fält för att utveckla differentieringsprotokoll som kan producera höganrikat subtyp specifika kardiomyocyter i stor skala. Även om vissa småskaliga protokoll har utvecklats hittills, skulle metoder måste noggrant testas för att säkerställa uppskalning är möjlig 34.
Utveckling av sådana integrerade plattformar kan betraktas som ett viktigt steg mot kommersialisering av hPSC härledda kardiomyocyter teknik för klinisk, läkemedel, vävnadsteknik, och in vitro orgel / organoid applikationsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Victor Chang Cardiac Research Institute inte engagera sig i, inte heller tolererar, förstörelsen av mänskliga embryon för forskning. Dess bidrag till denna studie var begränsad att arbeta med mänskliga inducerade pluripotenta stamceller.
Författarna förklarar de har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
