Abstract
خلايا الأرومة الغاذية الجذعية (TSCS) النافذة تنشأ نتيجة للأول قرار مصير خلية في التنمية الثدييات. أنها يمكن تربيتها في المختبر، والإبقاء على القدرة على وعلى التمايز إلى جميع أنواع فرعية من سلالة الأرومة الغاذية، أي ما يعادل في الجسم الحي الجذعية السكان الخلية مما أدى إلى الجزء الجنين من المشيمة تجديد الذات. لذلك، TSCs تقدم نموذجا فريدا لدراسة تطور المشيمة والجنينية مقابل خارج الجنينية قرار مصير الخلايا في المختبر. من مرحلة الكيسة الأريمية فصاعدا، حاجز جينية مميزة تتكون من الحامض النووي وهيستون التعديلات يفصل بإحكام على حد سواء الأنساب. هنا، نحن تصف بروتوكول للتغلب على هذا الحاجز بشكل كامل النسب التي كتبها عابر الإفراط في التعبير من الأرومة الغاذية المنظمين الرئيسيين Tfap2c، Gata3، Eomes وEts2 في الخلايا الليفية الجنينية في الفئران. الخلايا الجذعية المستحثة الأرومة الغاذية قادرة على تجديد الذات وتكاد تكون متطابقة إلى الكيسة المستمدة خلايا الأرومة الغاذية الجذعية طحيث ن من التشكل، التعبير الجيني علامة ونمط مثيلة. وظيفية في المختبر، وفي المقايسات فيفو تأكيد أن هذه الخلايا قادرة على التفريق على طول نسب الأرومة الغاذية توليد الخلايا العملاقة الأرومة الغاذية المتعددة الصبغيات وchimerizing المشيمة عند حقنه في الكيسات الأريمية. تحريض خلايا الأرومة الغاذية الجذعية من الأنسجة الجسمية يفتح آفاقا جديدة لدراسة الخصائص الجينية وجينية من هذه النسب من خارج الجنينية وتوفر إمكانية لتوليد خطوط الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية دون تدمير الجنين منها.
Introduction
في الآونة الأخيرة، فقد كشفت دراسة مقارنة عدة طرق من الفأرة الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأرومة الغاذية تحويل الخلايا الجذعية التي في جميع الأنظمة تحليلها، ظل تحويل النسب غير مكتملة. بدلا من خلايا الأرومة الغاذية الجذعية المستحثة (iTSCs) يسمى الأرومة الغاذية الجذعية تم إنشاء خلايا تشبه الخلايا الإبقاء على ذكرى مصير خلية من أصل 1. هنا، نحن اتباع نهج مختلف من جيل ITSC. على غرار تحريض مباشر من الخلايا الجذعية المحفزة من الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFS) 2، iTSCs تم تحويلها مباشرة من الأنسجة الجسمية متباينة. أولا، حددنا 12 عاملا مرشح حمل TSC مصير عندما overexpressed في MEFS. في وقت لاحق، وقد تم تحديد العوامل Tfap2c، Gata3، Eomes وEts2 ضرورية وكافية لتحريض ITSC 3. في وقت واحد، ومجموعة أخرى وجدت بشكل مستقل Tfap2c، Gata3 وEomes أن تكون كافية لتحويل MEFS إلى iTSCs. ومع ذلك، في هذاالدراسة، والوقت المطلوب للتعبير التحوير وقتا أطول بكثير مقارنة دراستنا، مشيرا إلى حركية تحويل مختلفة، عندما Ets2 غائبة عن transdifferentiation كوكتيل 4.
التقليدية مصل بقري جنيني (FBS) التي تحتوي على ثقافة الكيسة الخلايا الجذعية المشتقة الأرومة الغاذية التي يسببها وتعتمد على وجود عوامل التي يفرزها MEFS المعطل نمو 5،6. خلال تحريض ITSC، يتم توفير هذه العوامل التي MEFS، التي تفتقر إلى مجموعة كاملة من الجينات المحورة ولا يخضعون transdifferentiation. ومع ذلك، المستعمرات ITSC مرة واحدة الفردية هي شبه مثقف، فإنها تتطلب وسائل الإعلام، والتي تم شروطا مسبقة قبل MEFS المعطل النمو. من هناك على، يمكن iTSCs يكون مثقف وتعامل مثل الكيسة المستمدة TSCs وفقا لبروتوكولات موحدة. وتجدر الإشارة، على النقيض من تاناكا وآخرون. 5، ونحن بشكل روتيني ثقافة TSCs وiTSCs دون الهيلمة أطباق زراعة الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على الماوس وفقا للقانون الألماني لحماية الحيوان وبالاتفاق مع موافقة من لجان رعاية الحيوان المؤسسي المحلي (Landesamt الامناء الناطور، UMWELT اوند Verbraucherschutz، شمال الراين وستفاليا [رقم الموافقة: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. إعداد وسائل الإعلام
- إعداد 293T المتوسطة: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM)، 10٪ (ت / ت) FBS، L-الجلوتامين (2 ملم)، البيروفات الصوديوم (1 ملم)، البنسلين / الستربتومايسين (1X).
- إعداد المتوسطة MEF: DMEM، و 10٪ (ت / ت) FBS، L-الجلوتامين (2 ملم)، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1X والبنسلين / الستربتومايسين (1X).
- إعداد TS المتوسطة (ث / س FGF4 / الهيبارين): معهد الحديقة التذكارية روزويل المتوسطة (RPMI) 1640، 20٪ (ت / ت) FBS (الخلايا الجذعية الثقافة الصف)، البنسلين / الستربتومايسين (1X)، L-الجلوتامين (2 مم )، البيروفات الصوديوم (1 ملم)، 2-المركابتويثانول (0.1 ملم).
- إعداد TS المتوسطة مع FGF4 / الهيبارين (TS + F4H): RPMI 1640، 20٪ (ت / ت) FBS (الخلايا الجذعيةثقافة الصف)، البنسلين / الستربتومايسين (1X)، L-الجلوتامين (2 ملم)، البيروفات الصوديوم (1 ملم)، 2-المركابتويثانول (0.1 ملم)، 25 نانوغرام / مل FGF4، 1 ميكروغرام / مل الهيبارين.
وأضاف FGF4 والهيبارين مباشرة إلى وسائل الإعلام مباشرة قبل الاستعمال: ملاحظة. - إعداد TS-CM مع FGF4 / الهيبارين (TS-CM + F4H): 70٪ مكيفة MEF TS المتوسطة + 30٪ الطازجة TS المتوسطة + 25 نانوغرام / مل FGF4، 1 ميكروغرام / مل الهيبارين.
وأضاف FGF4 والهيبارين مباشرة إلى وسائل الإعلام مباشرة قبل الاستعمال: ملاحظة. - إعداد ترنسفكأيشن المتوسطة متقدم DMEM، 2٪ (ت / ت) FBS (الخلايا الجذعية الثقافة الصف)، L-الجلوتامين (2 ملم)، البنسلين / الستربتومايسين (1X).
- إعداد المتوسطة إنتاج الفيروسات: المتقدم DMEM، 5٪ (ت / ت) FBS (الخلايا الجذعية الثقافة الصف)، L-الجلوتامين (2 ملم)، البنسلين / الستربتومايسين (1X).
2. الفئران الجنينية الخلايا الليفية اشتقاق
- مجموعة التزاوج توقيت باستخدام وزن 129S2SV الإناث والذكور متماثل الفئران R26 :: rtTA (اسم السلالة، B6.Cg-GT (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) جاي / J 7). على الفئران التضحية E13.5 خلع عنق الرحم وعزل الخلايا الليفية الأولية الفئران الجنينية (MEFS) وفقا لبروتوكولات موحدة 8. بعد ذلك، وخلايا لوحة من جنين واحد على طبق 150 ملم في وسائل الإعلام MEF.
- مرة واحدة الثقافات MEF الأولية تصل confluency على أطباق 150 مم، وغسل خلايا مرتين مع 10 مل برنامج تلفزيوني وإضافة 4 مل 0.05٪ حل التربسين / EDTA. احتضان الأطباق ل3-4 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
- بعد دخول الحضانة إذا خلايا منفصلة من الطبق باستخدام مجهر مقلوب (باستخدام عدسة 10X). إضافة 5 مل من وسائل الاعلام MEF لوقف trypsinization وجمع تعليق خلية في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- تعليق خلية تجمع من عدة أطباق وجمع إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 x ج و 10 درجة مئوية.
- تجاهل طاف والخلايا بيليه resuspend في FBS تحتوي على 10٪ (ت / ت) سلفوكسيد ثنائي ميثيل. تجميد MEFS في قسامات لاستخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم الطرق والجسور البريةMEFS الأساسي الإلكترونية؛ ومع ذلك، ناقلات lentiviral إضافي معربا عن rtTA يحتاج إلى transduced مع ناقلات lentiviral الأخرى (على سبيل المثال استخدام البلازميد FUdeltaGW-rtTA التي وصفها Maherali وآخرون. 9). - إعداد المتوسطة TS MEF مكيفة
ملاحظة: قبل التجارب التحويل، لابد من إعداد MEF مكيفة (CM) TS وسائل الإعلام، وهو مطلوب للثقافة فرعية من خطوط ITSC الفردية (كما هو موضح في القسم 6).- لوحة 1 × 10 7 MEFS المعطل ميتوتيكلي في 150 طبق ملم في المتوسط MEF على العدد المرغوب فيه من الأطباق. تعطيل MEFS التي كتبها جاما-التشعيع مع جرعة من 9 غراي.
ملاحظة: العائد لكل 150 طبق مم حوالي 60 مل من CM. - في اليوم التالي والطلاء، ونضح وتجاهل المتوسطة MEF وإضافة 20 مل الطازجة TS المتوسطة (بدون FGF4 / الهيبارين) على كل طبق من ميتوتيكلي MEFS وأطباق مكان المعطل العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
- بعد تفرخTS المتوسطة لمدة ثلاثة أيام على MEFS المعطل ميتوتيكلي، وجمع المتوسطة في أنابيب مخروطية 50 مل. تصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.2 ميكرون، والمضي قدما 2.6.4. استبدال سم مع 20 مل من المتوسط TS جديدة لإعداد دفعة إضافية من سم.
ملاحظة: ميتوتيكلي يمكن استخدامها MEFS المعطل لإعداد CM تصل إلى ثلاثة أضعاف. - قسامة 35 مل من CM تصفيتها إلى 50 مل أنابيب مخروطية ومخزن في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. بعد ذوبان الجليد، إضافة 15 مل من المتوسط TS الطازجة من أجل الحصول على 70٪ TS-CM وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
- لوحة 1 × 10 7 MEFS المعطل ميتوتيكلي في 150 طبق ملم في المتوسط MEF على العدد المرغوب فيه من الأطباق. تعطيل MEFS التي كتبها جاما-التشعيع مع جرعة من 9 غراي.
3. Lentiviral ناقلات الإنتاج في خلايا 293T
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في الفضاء مختبر مرخص له السلامة الأحيائية المستوى 2.
- قبل التجارب التحويل، إعداد ناقلات lentiviral لالدوكسيسيكلين (دوكس) التي تعتمد على أكثر من التعبير عن Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2 وmCherry. لكل الفيروسة البطيئة، وخلايا 293T شارك في transfect باستخداممنها ناقلات نقل lentiviral جنبا إلى جنب مع البلازميد التعبئة والتغليف وVSV-G تعبير عن الظرف البلازميد (للعلم البلازميد الرجوع إلى الجدول المواد).
ملاحظة: للحصول على معلومات مفيدة حول إنتاج فيروس الرجوع إلى غافريلسكو وآخرون 10. على الرغم من أنه يصف إنتاج الفيروس الارتجاعي، التعليقات العامة بشأن نوعية الخلايا 293T وDNA البلازميد صحيحة لإنتاج الفيروسة البطيئة كذلك.
تنبيه: يجب أن تؤخذ تدابير السلامة المناسبة عند التعامل مع ناقلات lentiviral والعمل لابد من القيام بها في منشأة السلامة الأحيائية المستوى 2. - معطف خمسة 100 أطباق ملم مع بولي-L-ليسين (100 ميكروغرام / مل) حل من خلال تغطية الأطباق مع 5 مل من محلول وبلطف هزاز لتوزيعها بالتساوي حل الطلاء. وضع الأطباق مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة الحل نضح الطلاء وشطف الأطباق مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- لوحة 7 × 10 6 293T خلايا في طبق في 10 مل سائل الإعلام 293T خلية، قأطباق wirl لتوزيع بالتساوي الخلايا وأطباق مكان مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- في صباح اليوم التالي، تحل محل متوسط النمو مع 5 مل من المتوسط ترنسفكأيشن. إضافة 6 ميكرولتر من الأسهم 1،000x من حل الكلوروكين (25 ملم) وأطباق مكان مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- وفي الوقت نفسه، وإعداد خليط ترنسفكأيشن:
- لكل ناقلات lentiviral إعداد اثنين من 5 مل أنابيب رد فعل، وصفت A و B.
- إضافة 600 ميكرولتر من 2X HEPES مخزنة المالحة (HBS) لأنبوب أ.
- في مزيج أنبوب ب 61.5 ميكرولتر CaCl 2 الحل (2 م)، مع 18.5 ميكروغرام الحمض النووي lentivector و9.25 ميكروغرام psPAX2 و9.25 ميكروغرام من pMD2.G. ضبط مستوى الصوت إلى 600 ميكرولتر مع ثقافة عقيمة الصف H 2 O.
- إضافة حل من أنبوب B قطرة من الحكمة لأنبوب وبينما vortexing ل. احتضان خليط ترنسفكأيشن لمدة 15 دقيقة في RT.
- إضافة خليط ترنسفكأيشن بعناية فائقة قطرة من الحكمة أن الخلايا 293T مستعدة على طبق 100 ملم. اfter 5-6 ساعة إزالة المتوسطة واستبدالها مع 10 مل من متوسطة إنتاج الفيروس. وضع الأطباق مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: كن حذرا عند إزالة واستبدال المتوسطة منذ خلايا 293T تنفصل بسهولة من الطبق. متوسط التغير 5-6 ساعة بعد ترنسفكأيشن أمر بالغ الأهمية، لأن التعرض لفترات طويلة للالكلوروكين غير سامة للخلايا. - في صباح اليوم التالي، وإزالة بعناية وتجاهل المتوسطة واستبدالها مع 7 مل من متوسطة إنتاج الفيروس.
- في صباح اليوم التالي حصاد الدفعة الأولى من المتوسطة التي تحتوي على الفيروس. نضح المتوسط وجمع في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. مرة أخرى، إضافة 7 مل من متوسطة إنتاج الفيروس في الخلايا. مخزن الفيروس تحتوي على المتوسط في الثلاجة حتى يتم حصاد الدفعة الثانية في اليوم التالي.
- في صباح اليوم التالي نضح الدفعة الثانية من متوسطة تحتوي على فيروس إضافته إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على الدفعة الأولى. ويمكن الآن خلايا 293T يتم التخلص منها. تصفية الفيروسات التي تحتوي على المتوسطة من خلال سور 0.45 ميكرونخالية من factant خلات السليلوز فلتر -membrane. قسامة تصفيتها والمتوسطة ومخزن في -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى تحتوي على الفيروس.
ملاحظة: يمكن أيضا إنتاج الفيروسات أن يؤديها في أطباق 6 جيدا. تقليص كميات وأعداد الخلايا وفقا لذلك.
4. الخلايا الليفية تنبيغ مع 4 العوامل وmCherry مكافحة ناقلات الأمراض
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في منشأة السلامة الأحيائية المستوى 2.
- للحصول على تمثيل التخطيطي للمخطط تجريبي الرجوع إلى الشكل 1. أذاب قسامة واحدة من الأساسي rtTA-MEFS ولوحة 3.33 × 10 5 خلايا لكل بئر من صحن 6-جيدا في إجمالي حجم 2 مل من وسائل الاعلام MEF. إعداد لا يقل عن 3 آبار وتسمية لهم مع 4 عوامل (4F)، mCherry والسيطرة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، MEFS النوع البري يمكن استخدامها، وعندما يضاف إلى rtTA معربا عن ناقلات lentiviral إلى كوكتيل lentivector خلال خطوة 4.2. - في اليوم التالي بعد خلايا تعافى تماما من cryopreservation، تحل محل وسائل الإعلام MEF في ثلاثة 6 آبار مع 0.6 مل (4F)، 0.9 مل (mCherry) و 1 مل (السيطرة) من وسائل الإعلام تنبيغ، على التوالي. ذوبان الجليد قسامة واحدة من PLV-تيتو-Tfap2c، -Gata3، -Eomes، -Ets وفيروس -mCherry في RT وإضافة 100 ميكرولتر من كل طاف التي تحتوي على فيروس (Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2) في 4F جيدا.
ملاحظة: في حالة MEFS النوع البري، والحد من حجم وسائل الاعلام preplated 100 ميكرولتر وبالإضافة إلى إضافة 100 ميكرولتر من فيروس FUdeltaGW-rtTA تحتوي على طاف لمزيج 4F. - إضافة 100 ميكرولتر من mCherry وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس إلى وصفت بشكل جيد مع mCherry. إضافة polybrene إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل في كل بئر. وضع الطبق مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية، واحتضان MEFS O / N مع طاف التي تحتوي على الفيروس.
ملاحظة: في حالة MEFS النوع البري، والحد من حجم وسائل الاعلام preplated 100 ميكرولتر وبالإضافة إلى إضافة 100 ميكرولتر من FUdeltaGW-rtTA طاف التي تحتوي على الفيروس. - في صباح اليوم التالي، وإزالة بعنايةوسائل الإعلام التي تحتوي على فيروسات وغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. أخيرا، إضافة 2 مل من وسائل الاعلام TS (بدون FGF4 / الهيبارين).
ملاحظة: MEFS Transduced يمكن أن تستخدم إما مباشرة للتجارب الحث ITSC أو تجميدها لاستخدامها مرة أخرى.
5. الخلايا الليفية إلى تحويل ITSC
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في الفضاء مختبر مرخص له السلامة الأحيائية المستوى 2.
- غسل MEFS transduced مرتين مع 2 مل برنامج تلفزيوني وبعد إضافة محلول 0.5 مل التربسين / EDTA احتضان لهم في الحاضنة لمدة 3-4 دقيقة. الاختيار تحت المجهر المقلوب للانفصال السليم للخلايا.
- تعطيل التربسين بإضافة 1 مل TS المتوسطة. نقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 × ز. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 2 مل TS المتوسطة. استخدام نموذج السيطرة untransduced لحساب الخلايا.
- لوحة 4F-MEFS، mCherry-MEFS والسيطرة MEFS untransduced كل في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5خلية لكل 100 ملم صحن زراعة الخلايا في 10 مل TS تحتوي المتوسطة 2 ميكروغرام / مل دوكس (TS المتوسطة + FGF4 / الهيبارين + دوكس).
- بدلا من ذلك، نفذ transdifferentiation على أطباق أصغر. لوحة 3.6 × 10 3 خلايا لكل سم 2 على المطلوب حجم الطبق، وحجم حجم وفقا لذلك.
- في اليوم التالي، وذلك باستخدام المجهر epifluorescence (باستخدام عدسة 10X ومرشح مناسب لإثارة مضان الحمراء) مراقبة التعبير عن بروتين mCherry من أجل تقدير كفاءة ترنسدوكأيشن.
ملاحظة: يجب أن تكون الكفاءة تنبيغ ما يقرب من 100٪. إذا زاد موت الخلايا غير واضح بعد تحريض التحوير وهذا يعني أن عيار الفيروس كان مرتفعا جدا. يجب أن تتكرر تنبيغ مع انخفاض كمية متوسطة تحتوي على الفيروس. - من الآن على وسائل الإعلام التغيير على كافة الأطباق كل يوم حتى يوم 10 بعد الطلاء. بعد ذلك، تغذية الخلايا مع TS المتوسطة دون دوكس (TS المتوسطة + FGF4 / الهيبارين).
- باستخدام جهاز المجهر المقلوب لظهور "transdifferentiated المناطق" (راجع الشكل 2B و C) على طبق 4F لمدة تصل إلى 3 أسابيع. وينبغي لهذه المستعمرات لا تكون مرئية على أطباق السيطرة اثنين (mCherry-MEFS وMEFS untransduced).
6. عزل خطوط ITSC الفردية
ملاحظة: للحصول على خطوة 6.3 غير مطلوب نسيج الثقافة هود. فمن المستحسن أن يمسح أسفل المجهر المقلوب مع 70٪ من الإيثانول لتقليل فرص التلوث الجرثومي. المستعمرات ITSC الفردية يمكن أن تكون معزولة بين أيام 21 و 28 يوما من transdifferentiation.
- إضافة 40 ميكرولتر من 0.05٪ حل التربسين / EDTA إلى 12 بئرا من طبق بشكل جيد 96 U-القاع، ووضع الطبق على الجليد.
- قبل عزل مستعمرة والمتوسطة نضح على 4F-MEF طبق transdifferentiation. غسل خلايا مرة واحدة مع 10 مل برنامج تلفزيوني. مرة أخرى، إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني وطبق مكان تحت مجهر مقلوب.
- باستخدام ماصة 100 ميكرولتر المقرر ان 40 ميكرولتر تنقشع المستعمرات الفردية، التي جircling لهم مع طرف ماصة والشفط مستعمرة العائمة. نقل الخلايا من مستعمرة واحدة كل في جانب واحد من استعداد طبق 96-جيدا. بعد اختيار مكان 12 المستعمرات طبق 96-جيدا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- فصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات وتعليق خلية نقل إلى بئر واحدة من طبق 24-جيدا مع 500 ميكرولتر مستعدة للTS-CM المتوسطة (30٪ جديد TS المتوسطة + 70٪ سم + FGF4 / الهيبارين).
- في اليوم التالي محل المتوسطة مع الطازجة المتوسطة TS-CM لإزالة الخلايا الميتة. تغيير المتوسط كل يوم.
- مراقبة لظهور مستعمرات الظهارية مع الحدود مشرق (انظر الشكل 2). بمجرد ظهور المستعمرات والثقافة حتى 70٪ متموجة أو لمدة تصل إلى واحد وتدريجيا التوسع في أطباق أكبر حجما. من الآن فصاعدا، وخلايا الثقافة باعتبارها حسن النية TSCs، وفقا لبروتوكولات موحدة في وسائل الإعلام المصل يحتوي أو في والإعلام خالية من المصل محددة 3،5،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
على الطبق حيث يتم تنشيط التعبير التحوير من 4F، والخلايا بسرعة تغيير مورفولوجيا (قارن الشكل 2A وباء). حول يوم 14 - تنشأ 21 منطقة transdifferentiated مميزة (يتم إعطاء مثالين في الشكل 2B و C). هذه المستعمرات الأولية تفتقر TSC مورفولوجيا نموذجية. ولكن مرة واحدة هم دون مثقف، مورفولوجيا مميزة الظهارية مع حواف ضيقة وحدود مشرقة تذكرنا إلى حد كبير من TSCs الحسنة النية يظهر (الشكل 2D). 4F-iTSCs وصمة عار إيجابية للنسخ الأرومة الغاذية عوامل Cdx2 وTfap2c (الشكل 2E). ويمكن الآن هذه السطور ITSC أن تستخدم لاحقا في المختبر أو في تحليل الجسم الحي، أي فحوصات في المختبر التمايز أو التجارب chimerization المشيمة.
الشكل 1. الجدول الزمني للMEF إلى ITSC التحويل. التمثيل البياني للtransdifferentiation من MEFS إلى iTSCs. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التغييرات الممثل في علم الصرف خلال MEF إلى ITSC التحويل.
(أ) صورة مجهرية من rtTA-MEFS. (ب) صورة مجهرية من transdifferentiated 4F-MEFS. مثال على منطقة transdifferentiated، أبرزت باللون الأحمر. (C) مثال 2 من مستعمرة transdifferentiated في يوم 21 من transdifferentiation بعد عشرة أيام دوكس الاستقراء في 4F-MEFS. منطقة مناسبة لزراعة الفرعية مميزة باللون الأحمر. (د) صورة مجهرية من 4F-iTSCs بعد زراعة الفرعية. وتشير جميع الحانات مقياس 100 ميكرون. كانت الصور رأكين على مجهر مقلوب باستخدام عدسة 10X ومرحلة التباين. (E) تلطيخ المناعي ضد النسخ عوامل Cdx2 وTfap2c في 4F-iTSCs. هي ملطخة النوى مع هويشت. وتشير الحانات مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4 عامل (Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2) بروتوكول transdifferentiation مقرها المقدمة هنا يوفر طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد بأمانة تحويلها iTSCs من الخلايا الليفية الماوس الجنينية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة أيضا ينطبق على الخلايا الليفية الذيل بعد الولادة، على الرغم من انخفاض في كفاءة بالمقارنة مع الخلايا الليفية الجنينية 3. بشكل عام، ونوعية الخلايا الليفية الأساسية هي عامل حاسم في النتيجة transdifferentiation وينبغي الحرص على استخدام الخلايا مرور وقت مبكر (مرور 2-3).
قوة هذا البروتوكول هو استخدام ناقلات-الدوكسيسيكلين محرض، والتي تسمح للسيطرة الزمانية التعبير التحوير. وهذا يتيح للجيل خطوط ITSC مستقرة تفعيل الذاتية شبكة عامل النسخ، والحفاظ على TSC مصير مستقلة عن التعبير التحوير. هذا هو على النقيض من البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا، واصفا تحريض مصير TSC من الخلايا الجذعية الجنينية، وثا طريقةر حتى الآن ينتج فقط إعادة برمجة غير كامل الأرومة الغاذية الجذعية تشبه الخلايا خلايا 1.
ومع ذلك، وجود قيود معروفة من بروتوكول صفها هنا هو عدد متغير من المستعمرات transdifferentiated الناشئة، مما يجعل من الصعب التنبؤ كفاءة transdifferentiation. هذه القيود هي نتيجة لعدة عوامل متغيرة للغاية، والتي تعتبر حاسمة بالنسبة لنتيجة transdifferentiation: كفاءة تنبيغ من ناقلات lentiviral واحدة، ومقدار انتشار السكان خلية البداية، وكمية من موت الخلايا خلال transdifferentiation. في بعض الظروف transdifferentiated تفشل المستعمرات ITSC في الظهور. في هذه الحالة يجب أن يتم اختبار وسائل الإعلام والكواشف لقدرتها على دعم الثقافة TSC حقيقية، قبل استخدامها في توليد ITSC. بالإضافة إلى ذلك، تنبيغ مع 4F يمكن معاير، منذ كميات عالية جدا من التحوير التعبير يؤدي إلى موت الخلية. بشكل عام، زراعة الفرعية الفردية ITSC لإيناس يتطلب بعض الممارسة. في حال أن الصعوبات مع ثقافة فرعية من iTSCs تحدث (أي، تفشل الخلايا شبه مثقف للحفاظ على التجديد الذاتي وبدلا من ذلك تفرق بشكل عفوي)، مستعمرات معزولة واحدة يمكن مطلي بدلا من ذلك على الأطباق مع كثافة الخلية 50٪ من النمو المغذية المعطل خلايا لدعم النمو ومرفق من الخلايا. خطوط ITSC يمكن بعد ذلك مفطوم تدريجيا من مغذيات خلال الركض لاحق. من المذكرة، ونحن لم ننجح في MEFS تحويل مباشرة إلى iTSCs باستخدام الظروف المتوسطة TX محددة، منذ تكساس المتوسط فقط يدعم إنشاء ITSC خطوط / TSC.
وحتى الآن، يتم تأسيس بروتوكول لITSC تحريض من الخلايا الليفية فقط لخلايا الفئران. وبالتالي، سيكون من الآن اهتماما كبيرا للتكيف مع هذا البروتوكول إلى الأنواع الأخرى، وتمكين اشتقاق خطوط ITSC من أنظمة نموذج الإنسان أو غيرها. وعلاوة على ذلك، فإن تحليل آليات دقيقة من الخلايا الليفية إلى تحويل ITSC تقديم رؤى جديدة لطبيعةمن جسدي مقابل حاجز النسب خارج الجنينية والمساعدة في فهم مبادئ خلية تقرير مصير خلال التطور الطبيعي والمرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
