Abstract
Trofoblasten stamceller (TSC: er) uppstår som en konsekvens av den första cellen öde beslut i däggdjurens utveckling. De kan odlas in vitro, att behålla möjligheten att själv-förnyelse och att differentiera till alla undertyper av trofoblasten härstamning, vilket motsvarar den in vivo stamcellspopulationen som ger upphov till den fetala delen av moderkakan. Därför TSC: er erbjuder en unik modell för att studera placental utveckling och embryonala kontra extra-embryocell öde beslut in vitro. Från blastocyststadiet och framåt, en distinkt epigenetisk barriär som består av DNA-metylering och histon ändringar skiljer tätt båda linjerna. Här beskriver vi ett protokoll för att helt övervinna denna härstamning barriär genom transient överuttryck av trofoblasten nyckelregulatorer Tfap2c, Gata3, Eomes och ETS2 i murina embryonala fibroblaster. De inducerade trofoblasten stamceller kan själv förnya och är nästan identiska med blastocyst härledda trofoblasten stamceller in gäller morfologi, markör genuttryck och metylering mönster. Funktionell in vitro och in vivo-analyser bekräftar att dessa celler kan differentiera längs trofoblasten härstamning generera polyploid trofoblasten jätteceller och chimerizing moderkakan vid injicering i blastocyster. Induktion av trofoblasten stamceller från somatisk vävnad öppnar nya vägar för att studera genetiska och epigenetiska egenskaperna hos denna extra embryonala härstamning och erbjuder möjligheten att generera trofoblaster stamcellslinjer utan att förstöra respektive embryo.
Introduction
Nyligen har en studie som jämförde flera metoder för mus embryonala stamceller att trofoblasten stamceller konvertering visade att i alla analyserade system, förblev härstamning konvertering ofullständig. Istället för inducerade trofoblasten stamceller (iTSCs) så kallade trofoblaster stamcellsliknande celler har genererats behåller ett minne av cellöde ursprungs 1. Här följde vi en annan strategi av ITSC generation. I likhet med den direkta induktion av pluripotenta stamceller från mus embryonala fibroblaster (MEF) 2, iTSCs har direkt omvandlats från differentierad somatisk vävnad. Först identifierade vi 12 kandidat faktorer som inducerar TSC öde när överuttryckt i MEF. Senare har de faktorer Tfap2c, Gata3, Eomes och ETS2 identifierats att vara nödvändig och tillräcklig för ITSC induktion 3. Samtidigt fann en annan grupp oberoende Tfap2c, Gata3 och Eomes att vara tillräcklig för att omvandla MEFs till iTSCs. Men i detStudien är den tid som krävs för transgen expression betydligt längre jämfört med vår studie, vilket tyder på olika konverterings kinetik, när ETS2 är frånvarande från transdifferentiering cocktail 4.
Konventionell fetalt bovint serum (FBS) innehållande odling av inducerade och blastocyst härledd trofoblasten stamceller förlitar sig på närvaron av faktorer som utsöndras av tillväxt-inaktiverat MEF 5,6. Under ITSC induktion, är dessa faktorer som tillhandahålls av MEF, som saknar hela kombinationen av transgener och inte genomgår transdifferentiering. Men när enskilda ITSC kolonier subodlades, de kräver media, som har konditionerats av tillväxtinaktive MEF. Därifrån kan iTSCs odlas och behandlas som blastocyst härrör TSC: er enligt standardprotokoll. Notera, till skillnad från al. Tanaka et 5, vi rutinmässigt kultur TSC: er och iTSCs utan gelatinecellodlingsskålar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mus experiment utfördes enligt den tyska lagen om djurskydd och i samförstånd med godkännande av de lokala institutionella djurvård utskott (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [godkännande ID-nummer: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Beredning av media
- Förbereda 293T-medium: Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), 10% (volym / volym) FBS, L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), penicillin / streptomycin (1 x).
- Förbereda MEF medium: DMEM, 10% (volym / volym) FBS, L-glutamin (2 mM), 1x icke-essentiella aminosyror, penicillin / streptomycin (1 x).
- Förbereda TS medium (w / o FGF4 / heparin): Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640, 20% (volym / volym) FBS (stamcellsodlingsgrad), penicillin / streptomycin (1x), L-glutamin (2 mM ), natriumpyruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0,1 mM).
- Förbereda TS medium med FGF4 / heparin (TS ^ F4H): RPMI 1640, 20% (volym / volym) FBS (stamcellsodlingsgrad), penicillin / streptomycin (1x), L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 ^ g / ml heparin.
Obs: FGF4 och heparin tillsätts direkt till mediet omedelbart före användning. - Förbereda TS-CM med FGF4 / heparin (TS-CM + F4H): 70% MEF konditionerade TS medium + 30% nyberedd TS medium + 25 ng / ml FGF4, 1 ^ g / ml heparin.
Obs: FGF4 och heparin tillsätts direkt till mediet omedelbart före användning. - Förbereda Transfektion medium: Advanced DMEM, 2% (v / v) FBS (stamcellsodlingsgrad), L-glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (1 x).
- Förbereda Virus-produktionsmedium: Advanced DMEM, 5% (volym / volym) FBS (stamcellsodlingsgrad), L-glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (1 x).
2. Murina embryonala Fibroblast Härledning
- Ställ tidsinställda parningar med hjälp av vikt 129S2SV honor och homozygot manliga R26 :: rtTA möss (stam namn, B6.Cg-Gt (Rosa) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). På E13.5 offer möss genom cervikal dislokation och isolera primära murina embryonala fibroblaster (MEF) i enlighet med standardprotokoll 8. Därefter tallrik celler från ett embryo på en 150 mm skål i MEF media.
- När primär MEF kulturerna når konfluens på 150 mm skålar, tvätta cellerna två gånger med 10 ml PBS och tillsätt 4 ml 0,05% trypsin / EDTA-lösning. Inkubera rätter för 3-4 minuter i inkubator vid 37 ° C.
- Efter inkubation kontrollera om celler lossnat från skålen med ett inverterat mikroskop (med en 10X objektiv). Tillsätt 5 ml MEF medier för att stoppa trypsinisering och samla cellsuspension i ett 50 ml koniskt rör.
- Pool cellsuspensionen från flera rätter och samla upp i 50 ml koniska rör. Centrifugera cellsuspensionen under 3 min vid 200 xg och 10 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i FBS innehållande 10% (volym / volym) dimetylsulfoxid. Frysa MEF i portioner för vidare användning.
Obs: Du kan även använda vild type primära MEF; emellertid en ytterligare lentivirala vektor som uttrycker rtTA behöver transduceras tillsammans med de andra lentivirala vektorer (till exempel med hjälp av FUdeltaGW-rtTA plasmiden beskriven av Maherali et al. 9). - Framställning av MEF-rade TS-medium
Obs: Före konvertering experiment har MEF konditionerade (CM) TS media skall framställas, vilket krävs för subkultur av individuella ITSC linjer (som beskrivs i avsnitt 6).- Platta 1 x 10 7 mitotiskt inaktiverade MEF per 150 mm skål i MEF medium på önskat antal rätter. Inaktivera MEFs efter γ-bestrålning med en dos av 9 Gy.
Obs: Avkastningen per 150 mm skål är ca 60 ml av CM. - Dagen efter plätering, aspirera och kasta MEF medium och tillsätt 20 ml nygjord TS medium (utan FGF4 / heparin) på varje maträtt av mitotiskt inaktiverade MEF och göra rätter tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C.
- efter inkuberingTS medium för tre dagar på mitotiskt inaktiverade MEF, samla medium i 50 ml koniska rör. Filtermediet genom ett 0,2 pm filter och fortsätter med 2.6.4. Byt CM med 20 ml färskt TS-medium för framställning av en ytterligare sats av CM.
Obs: mitotiskt inaktiverade MEF kan användas för CM beredning upp till tre gånger. - Alikvot 35 ml filtrerat CM i 50 ml koniska rör och förvara vid -20 ° C tills de behövs. Efter upptining, tillsätt 15 ml nyberedd TS-medium för att erhålla 70% TS-CM och förvara vid 4 ° C i upp till en månad.
- Platta 1 x 10 7 mitotiskt inaktiverade MEF per 150 mm skål i MEF medium på önskat antal rätter. Inaktivera MEFs efter γ-bestrålning med en dos av 9 Gy.
3. Lentiviral Vector Produktionen i 293T-celler
Obs: Alla steg utförs i laboratorielokaler licensieras till biosäkerhetsnivå 2.
- Före konvertering experiment förbereda lentivirala vektorer för doxycyklin (DOX) beroende överuttryck av Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2 och mCherry. För varje lentivirus, co-transfektera 293T-celler med hjälp avrespektive lentivirala överföringsvektor tillsammans med en packande plasmiden och en VSV-G uttrycker kuvert plasmid (för plasmid information hänvisas till Materials tabell).
Obs! Användbar information om virusproduktion se Gavrilescu et al 10.. Även om det beskriver retrovirus produktion, allmänna kommentarer om kvaliteten på 293T-celler och plasmid-DNA är sanna för lentivirus produktion också.
VARNING: Lämpliga säkerhetsåtgärder behöver vidtas, när man arbetar med lentivirala vektorer och arbetet måste utföras i en biosäkerhetsnivå 2 anläggning. - Coat fem 100 mm skålar med poly-L-lysin (100 ug / ml) lösning genom att täcka skålarna med 5 ml lösning och försiktigt vaggande för att jämnt fördela beläggningslösning. Placera skålarna tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C under 30 min. Efter 30 min aspirera beläggningslösningen och skölj rätter en gång med PBS.
- Plate 7 x 10 6 293T celler per skål i 10 ml 293T-cellmedia, sWirl rätter att jämnt fördela celler och placera rätter tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C.
- Nästa morgon, byt odlingsmedium med 5 ml transfektion medium. Tillsätt 6 | il av en 1,000x lager av klorokin-lösning (25 mM) och placera rätter tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C.
- Samtidigt förbereder transfektion blandning:
- För varje lentivirusvektor förbereda två 5 ml reaktionsrör, märkta A och B.
- Lägg 600 pl 2x HEPES saltlösning (HBS) till röret A.
- I rör B mix 61,5 ^ il CaCl2-lösning (2 M), med 18,5 | j, g lentivector DNA och 9,25 | ig psPAX2 och 9,25 | ig av pMD2.G. Justera volymen till 600 | al med sterilt odlingsgrad H 2 O.
- Lägg lösningen från rör B droppvis till röret A under virvling. Inkubera transfektion blandningen under 15 min vid RT.
- Lägg transfektion blandning noga släppa klokt att de preparerade 293T celler på 100 mm skål. enfter 5-6 timmar bort medium och ersätta med 10 ml virusproduktionsmedium. Placera rätter tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C.
Obs: Var försiktig när du tar bort och byter ut mediet eftersom 293T-celler lossnar lätt från skålen. Mediumbyte 5-6 h efter transfektion är avgörande, eftersom långvarig exponering för klorokin är toxisk för cellerna. - Följande morgon, försiktigt bort och kasta medium och ersätta med 7 ml virusproduktionsmedium.
- Följande morgon skörda den första omgången av virusinnehållande medium. Aspirera medium och samla i en 15 ml koniska rör. Återigen, tillsätt 7 ml virusproduktionsmedium på cellerna. Store virusinnehållande medium i kylskåpet tills den andra omgången skördas följande dag.
- Nästa morgon aspirera den andra omgången av virusinnehållande medium tillsätta den till 15 ml koniska rör som innehåller den första omgången. 293T-celler kan nu kasseras. Filtervirusinnehållande medium genom ett 0,45 | im surfactant fria cellulosaacetat -membran filter. Alikvot filtrerades, virusinnehållande medium och förvara vid -80 ° C för vidare användning.
Anmärkning: Virusproduktion kan också utföras i 6-brunnars skålar. Skala ned volymer och cellantal i enlighet därmed.
4. Fibroblast Transduktion med 4 Faktorer och mCherry kontrollvektor
Notera: Alla steg utförs i en biosäkerhetsnivå 2 anläggning.
- För en schematisk representation av den experimentella kontur se Figur 1. Tina en alikvot av primära rtTA-MEF och plattan 3,33 x 10 5 celler per brunn i en 6-brunnsskål i en total volym av 2 ml MEF medier. Bered minst 3 brunnar och märka dem med 4 faktorer (4F), mCherry och kontroll.
Obs: Alternativt kan vildtyp MEF användas när en rtTA uttrycker lentivirusvektorn läggs till lentivector cocktail under steg 4,2. - Följande dag efter cellerna återhämtat sig helt från cryoprebevarande, ersätta MEF media i de tre 6-brunnar med 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) och 1 ml (kontroll) av Transduction media, respektive. Tina en alikvot av PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -Ets och -mCherry virus vid RT och tillsätt 100 | il av varje virusinnehållande supernatanten (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) in i 4F väl.
Obs: Vid vildtyp MEF, minska volymen i pläterad media med 100 pl och dessutom tillsätt 100 pl FUdeltaGW-rtTA virus innehållande supernatant till 4F mix. - Tillsätt 100 pl av mCherry virusinnehållande media till brunnen märkt med mCherry. Lägg polybren till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml i varje brunn. Placera skålen tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C och inkubera MEFs O / N med virusinnehållande supernatant.
Obs: Vid vildtyp MEF, minska volymen i pläterad media med 100 pl och dessutom tillsätt 100 pl FUdeltaGW-rtTA virusinnehållande supernatant. - Nästa morgon, försiktigt bortvirusinnehållande media och tvätta tre gånger med 2 ml PBS. Slutligen, tillsätt 2 ml TS medium (utan FGF4 / heparin).
Obs: Omvandlade MEF kan antingen användas direkt för ITSC induktionsexperiment eller frysas för vidare användning.
5. Fibroblast till ITSC Omvandling
Obs: Alla steg utförs i laboratorielokaler licensieras till biosäkerhetsnivå 2.
- Tvätta omvandlade MEF två gånger med 2 ml PBS och efter tillsats av 0,5 ml trypsin / EDTA-lösning inkubera dem i inkubatorn för 3-4 minuter. Kontrollera under ett inverterat mikroskop för korrekt lösgöring av cellerna.
- Inaktivera trypsin genom att tillsätta 1 ml TS medium. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera under 3 min vid 200 x g. Kassera supernatanten och resuspendera cellerna i 2 ml TS medium. Använd otransducerade kontrollprovet för att räkna cellerna.
- Platt 4F-MEF, mCherry-MEF och otransducerade kontroll MEFs vardera vid en densitet av 2 x 10 5celler per 100 mm cellodlingsskål i 10 ml TS-medium innehållande 2 pg / ml DOX (TS medium + FGF4 / heparin + DOX).
- Alternativt, utföra transdifferentiering på mindre rätter. Plate 3,6 x 10 3 celler per cm2 på önskad maträtt storlek, skala volymen.
- Nästa dag, med hjälp av en epifluorescensmikroskop (med en 10X objektiv och ett filter som lämpar sig för röd fluorescens excitation) övervaka uttryck av mCherry protein för att uppskatta omvandlingseffektivitet.
Obs: Transduktion effektivitet ska vara nära 100%. Om ökad celldöd är märkbar efter transgen induktion innebär detta att virustiter var för hög. Transduktion bör upprepas med minskad mängd av virusinnehållande medium. - Från och med nu på förändring media på alla rätter varannan dag till dag 10 efter plätering. Därefter, mata celler med TS medium utan DOX (TS medium + FGF4 / heparin).
- Med ett inverterat mikroskop monitor förutseende "transdifferentiated områden" (se figur 2B och C) på 4F skålen för upp till 3 veckor. Sådana kolonier bör inte vara synlig på de två kontrollskålarna (mCherry-MEF och otransducerade MEF).
6. Isolering av individuella ITSC Lines
Obs: För steg 6,3 krävs inte en vävnadsodling huva. Det rekommenderas att torka av inverterat mikroskop med 70% etanol för att minimera risken för bakterieangrepp. Individuella ITSC kolonier kan isoleras mellan dagarna 21 och 28 dagar från transdifferentiering.
- Tillsätt 40 pl av 0,05% trypsin / EDTA-lösning i 12 brunnar i en 96 U-botten och skålen och placera skålen på is.
- Innan koloniisolering, aspirera medium på 4F-MEF transdifferentiering maträtt. Tvätta cellerna en gång med 10 ml PBS. Återigen, tillsätt 10 ml PBS och plats skålen under ett inverterat mikroskop.
- Med hjälp av en 100-l pipett inställd på 40 pl lyfta individuella kolonier, genom circling dem med pipettspetsen och aspire den flytande kolonin. Överför celler från en koloni var i en brunn av det beredda 96-bra maträtt. Efter plocka 12 kolonier placera 96-brunnsskål i inkubator vid 37 ° C under 5 min.
- Dissociera cellerna genom pipettering upp och ned flera gånger och överföra cellsuspension i en brunn på en 24-brunnars skål med förberedda 500 pl TS-CM-medium (30% färskt TS medium + 70% CM + FGF4 / heparin).
- Följande dag ersätta mediet med färskt TS-CM-medium för att avlägsna döda celler. Ändra mediet varannan dag.
- Övervaka uppkomsten av epitelceller kolonier med ljusa gränser (se Figur 2). När kolonier visas kultur tills 70% sammanflytande eller upp till en vecka och gradvis expandera på större rätter. Från och med nu, kulturceller som bona fide TSC: er, enligt standardprotokoll i serum innehållande media eller i serumfritt, definierat medium 3,5,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På skålen där transgen expression av 4F är aktiverad, celler ändras snabbt morfologi (jämför Figur 2A och B). Omkring dag 14 - 21 distinkta transdifferentiated områden framträda (två exempel ges i figur 2B och C). Dessa primära kolonier saknar typiska TSC morfologi; men när de är subodlas, karakteristisk epitel morfologi med snäva kanter och ljusa gränser mycket påminner om bona fide TSC: er framträder (figur 2D). 4F-iTSCs fläck positivt för trofoblaster transkriptionsfaktorer Cdx2 och Tfap2c (figur 2E). Dessa ITSC linjer kan nu användas för efterföljande in vitro eller in vivo analyser, differentiering dvs in vitro-analyser eller placental chimärisering experiment.
Figur 1. Tidslinje MEF till ITSC konvertering. Grafisk representation av transdifferentiering av MEF i iTSCs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa Förändringar i morfologi Under MEF till ITSC konvertering.
(A) Mikrofoto av rtTA-MEF. (B) Mikrofoto av transdifferentiated 4F-MEF. Exempel på en transdifferentiated område, markerade i rött. (C) Exempel 2 i en transdifferentiated koloni på dag 21 av transdifferentiering efter tio dagar DOX induktion i 4F-MEF. Område som lämpar sig för under odling markeras med rött. (D) Mikrofoto av 4F-iTSCs efter sub-odling. Alla skala staplar indikerar 100 pm. Bilder var tAken på ett inverterat mikroskop med hjälp av en 10X objektiv och faskontrast. (E) Immunofluorescens färgning mot transkriptionsfaktorer Cdx2 och Tfap2c i 4F-iTSCs. Kärnor färgas med Hoechst. Skalstrecken anger 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4 faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) baserad transdifferentiering Protokollet presenteras här ger en tillförlitlig metod för att generera troget konverterade iTSCs från mus embryonala fibroblaster. Vidare är metoden också tillämplig för postnatala svans fibroblaster, även om med en droppe i effektivitet jämfört med embryonala fibroblaster 3. I allmänhet är kvaliteten på primära fibroblaster en kritisk faktor för transdifferentiering resultatet och försiktighet bör iakttas för att använda tidiga passageceller (passage 2-3).
Styrkan i detta protokoll är användningen av doxycyklin-inducerbara vektorer, som möjliggör tidsstyrning av transgen expression. Detta möjliggör generering av stabila ITSC linjer som aktiverar den endogena transkriptionsfaktorn nätverk, upprätthålla TSC öde oberoende av transgen expression. Detta är i motsats till tidigare publicerade protokoll, beskriver induktionen av TSC öde från embryonala stamceller, en metod that hittills ger endast ofullständigt omprogrammeras trofoblasten stamceller-liknande celler 1.
Men det är en känd begränsning av det protokoll som beskrivs här varierande antal nya transdifferentiated kolonier, vilket gör det svårt att förutsäga transdifferentiering effektivitet. Dessa begränsningar beror på flera mycket varierande faktorer som är avgörande för transdifferentiering resultatet: transduktion effektivitet i de enskilda lentivirusvektorer, mängden spridning av utgångscellpopulationen, och mängden celldöd under transdifferentiering. Under vissa omständigheter transdifferentiated ITSC kolonier inte dyka upp. I det här fallet media och reagens bör testas för sin förmåga att stödja äkta TSC kultur, innan deras användning i ITSC generation. Dessutom kan transduktion med 4F titreras, eftersom alltför höga halter av transgen expression leder till celldöd. I allmänhet under odling av enskilda ITSC lines kräver lite övning. I händelse av att problem med subkultur av iTSCs inträffar (dvs.., Sub-odlade celler misslyckas med att upprätthålla självförnyelse och i stället spontant differentiera), enstaka isolerade kolonier kan alternativt pläterade på disk med 50% celldensitet tillväxtinaktiv feeder celler för att stödja tillväxt och vidhäftning av celler. De ITSC linjer kan sedan gradvis avvänjas från matare under efterföljande passage. Notera, vi inte lyckas direkt omvandla MEF i iTSCs använder definierade TX mediumförhållanden, eftersom TX-medium endast stöder etablerade ITSC / TSC linjer.
Hittills har protokollet för ITSC induktion från fibroblaster endast fastställts för murina celler. Därför kommer det nu att vara av stort intresse att anpassa detta protokoll för andra arter och möjliggöra härledning av ITSC linjer från människa eller andra modellsystem. Vidare kommer analys av de exakta mekanismerna för fibroblaster till ITSC konvertering erbjuda nya insikter i naturenav somatiska kontra extra embryonala härstamning barriären och underlätta förståelsen principer determinering under normal och patologisk utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
