Abstract
Trofoblast kök hücreleri (TSCs) memeli gelişiminin ilk hücre kaderi karar bir sonucu olarak ortaya çıkar. Onlar kendini yenilemek ve plasentanın fetal kısmına hücre popülasyonu veren yükselişi kök vivo eşdeğer trofoblast soy tüm alt içine ayırt etmek yeteneğini koruyarak, in vitro kültüre edilebilir. Bu nedenle, TSCs in vitro ekstra embriyonik hücre kaderi kararı karşısında plasental gelişim ve embriyonik incelemek için eşsiz bir model sunuyoruz. itibaren blastosist aşamasına gelen DNA metilasyonu ve histon modifikasyonları oluşan ayrı bir epigenetik bariyer sıkıca her iki soy ayırır. Burada, tam aşırı ifadesi fare embriyonik fibroblastlar trofoblast anahtar düzenleyiciler Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ve geçici bu soy engeli aşmak için bir protokol açıklar. uyarılmış trofoblast kök hücreler kendini yenilemek mümkün ve türetilmiş trofoblast kök hücreleri blastokist hemen hemen aynıdır imorfoloji, işaretleyici gen ifadesi ve metilasyon motifinin n terimleri. In vitro ve in vivo deneylerde Fonksiyonel bu hücrelerin trofoblast soy polyploid trofoblast dev hücrelerin üretilmesi ve blastosist enjekte edildiğinde plasentayı kimerize boyunca ayırt etmek mümkün olduğunu onaylayın. somatik doku trofoblast kök hücrelerin uyarılması, bu ekstra-embriyonik soyunun genetik ve epigenetik özelliklerini incelemek için yeni yollar açar ve ilgili embriyo zarar vermeden trofoblast kök hücre hatları üretme imkanı sunuyor.
Introduction
Son zamanlarda, kök hücreler dönüşüm trofoblast fare embriyonik kök hücre çeşitli yaklaşımlar karşılaştıran bir çalışma, tüm analiz sistemleri, soy dönüşüm eksik kaldığını ortaya koymuştur. Bunun yerine bu yüzden trofoblast kök denilen uyarılmış trofoblast kök hücreler (iTSCs) hücre benzeri hücreler kökenli 1 hücre kaderi bir hafıza istinat oluşturulmuştur. Burada, ITSC nesil farklı bir yaklaşım izledi. Fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) 2 pluripotent kök hücrelerin doğrudan indüklenmesi benzer şekilde, iTSCs doğrudan farklılaşmış somatik dokudan dönüştürüldü. İlk olarak, biz MEFS aşırı eksprese zaman TSC kaderi uyaran 12 aday faktörleri belirledi. Daha sonra, faktör Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ITSC indüksiyonu 3 için gerekli ve yeterli olduğu tespit edilmiştir. Eş zamanlı olarak, başka bir grubu, bağımsız olarak iTSCs halinde MEFS dönüştürmek için yeterli olması Tfap2c, Gata3 ve Eomes bulundu. Bununla birlikte, buÇalışma, transgen ekspresyonu için gereken zamanın büyük ölçüde daha uzun ETS2 transdiferansiasyon kokteyl 4'ten olmadığı zaman, farklı dönüşüm kinetik gösteren, çalışmamızda karşılaştırılır.
Uyarılmış ve blastosist türetilmiş trofoblast kök hücre kültürü içeren geleneksel fetal sığır serumu (FBS), büyüme inaktive MEF'ler 5,6 salgılanan faktörler varlığında dayanır. ITSC İndüksiyon sırasında, bu faktörler transgenlerin tam kombinasyon yoktur ve transdiferansiyonun geçiren değildir MEF'ler, tarafından sağlanır. Ancak, bir kez bireysel ITSC kolonileri onlar büyüme inaktive MEFS tarafından öngörülmekte olan medya, gerek alt kültür. Orada kaynaktan, iTSCs kültürlenmiş ve standart protokollere göre blastosist türetilmiş TSCs gibi tedavi olabilir. Not, hücre kültürü yemekleri jelatinleştirmeden olmadan Tanaka et al. 5, rutin kültür TSCs ve iTSCs aksine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare deneyleri, hayvan koruma ve yerel kurumsal hayvan bakım komiteleri (Landesamt fuer Natur, Çevre und Verbraucherschutz, Kuzey Ren-Vestfalya [onay kimlik numarası onayı ile anlaşarak Alman hukukuna göre yapılmıştır: 84-02.04.2013 AZ .A428]).
1. Medya Hazırlık
- Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), penisilin / streptomisin (1x): 293T orta hazırlayın.
- DMEM,% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), 1 x esansiyel olmayan amino asitler, penisilin / streptomisin (1x): MEF orta hazırlayın.
- TS orta hazırlayın (ağırlık / FGF4 / heparin o): Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) 1640,% 20 (h / h) FBS (kök hücre kültürü dereceli), penisilin / streptomisin (1x), L-glutamin (2 mM ), sodyum piruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0.1 mM).
- kök hücre (RPMI 1640,% 20 (h / h) FBS: FGF4 / heparin (TH + F4H) TS orta hazırlayınKültür derecesi), penisilin / streptomisin (1x), L-glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0.1 mM), 25 ng / ml FGF4 / ml heparin 1 ug.
Not: FGF4 ve heparin, doğrudan kullanımdan hemen önce ortama ilave edilir. - FGF4 / heparin (TS-CM + F4H) TS-CM Hazırlama:% 70, MEF-durumunu TS ortamı +% 30 taze hazırlanmış TS ortamı + 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml heparin.
Not: FGF4 ve heparin, doğrudan kullanımdan hemen önce ortama ilave edilir. - Transfeksiyon ortamı hazırlayın: İleri DMEM,% 2 (v / v) FBS (hücre kültürü dereceli kök), L-glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (1x).
- Virüs üretimi orta hazırlayın: İleri DMEM,% 5 (h / h) FBS (hücre kültürü dereceli kök), L-glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (1x).
2. Fare Embriyonik fibroblast Derivasyon
- 129S2SV kadın ve homozigot erkek R26 :: rtTA fareler (suşu adı ağırlık kullanarak set zamanlı çiftleşmelerin; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Ve servikal dislokasyon ile E 13.5 kurban fareler üzerinde standart protokollere 8'e göre birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) izole eder. Bundan sonra, MEF medyada bir 150 mm tabağına bir embriyodan plaka hücreleri.
- Birincil MEF kültürleri 150 mm tabaklar üzerinde konfluense ulaştıktan sonra, 10 mi, PBS ile iki kez yıkama hücreleri ve 4 ml% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu ekleyin. 37 ° C'de inkübatör içinde 4 dakika - 3 yemekler inkübe edin.
- Kuluçka kontrolünden sonra ters bir mikroskop (10X lens kullanarak) ile çanak ayrılmış hücreler eğer. trypsinization durdurmak ve bir 50 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu toplamak için MEF medya 5 ml ekleyin.
- Havuz hücre çeşitli yemekler süspansiyon ve 50 ml konik tüp içine toplamak. 200 x g'de 3 dakika 10 ° C santrifüjleyin hücre süspansiyonu.
- % 10 (hac / hac), dimetil sülfoksid ihtiva eden FBS içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın. Daha fazla kullanım için parçalar halinde MEFS dondurun.
Not: Alternatif olarak, yaban TYP kullanınE birincil MEFS; Bununla birlikte, rtTA ifade ek lentiviral vektör (Maherali ve ark., 9 ile tarif FUdeltaGW-rtTA plasmidi kullanılarak, örneğin), diğer lentiviral vektörleri ile birlikte transdüse edilmesi gerekmektedir. - MEF-klimalı TS ortamı hazırlanması
Not: Ön dönüşüm deneyleri, MEF-klimalı (CM) TS medya (bölüm 6'da açıklanan) Bireysel ITSC hatlarının alt kültür için gerekli olan, hazırlıklı olmak vardır.- Plaka yemekleri istenilen sayıda MEF ortamda 150 mm çanak başına 1 x 10 7 mitotik inaktive MEFS. 9 Gy dozda γ-ışıması ile MEFS inaktive.
Not: 150 mm tabak başına verimi yaklaşık 60 mi CM taşımaktadır. - kaplama, aspirat gün sonra ve MEF orta atmak ve geri 37 ° C'de inkübatör içine MEFS ve yer yemekleri mitotik inaktive her yemeğin üzerine taze (FGF4 / heparin olmadan) TS orta hazırlanmış 20 ml ekleyin.
- inkübasyondan sonra,mitotik inaktive MEF'ler üç gün TS ortamı, 50 ml konik tüp içinde ortam toplanır. 0.2 um'lik bir filtreden orta filtre edin ve 2.6.4 devam edin. CM bir başka üretim hattının hazırlanması için taze bir TH ortamı 20 ml CM değiştirin.
Not: Mitotik inaktive MEF'ler üç kereye kadar CM hazırlanması için de kullanılabilir. - Kısım -20 ° C'de 50 ml konik tüp ve deposuna süzüldü CM 35 mi kadar gerekli. Çözündükten sonra, en fazla bir ay boyunca 4 ° C 'de% 70, TS-CM elde etmek için ve mağaza taze hazırlanmış TH ortamı 15 ml ekleyin.
- Plaka yemekleri istenilen sayıda MEF ortamda 150 mm çanak başına 1 x 10 7 mitotik inaktive MEFS. 9 Gy dozda γ-ışıması ile MEFS inaktive.
293T Hücreleri 3. lentiviral Vektör Üretimi
Not: Tüm adımlar Biyogüvenlik Seviye 2 lisanslı laboratuvar alanı yürütülmektedir.
- Önceki dönüşüm deneyleri, aşırı ifadesi Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2 ve mCherry bağımlı doksisiklin (DOK) için lentiviral vektörler hazırlamak. Her bir lentivirüs için, ko-transfeksiyonu 293T hücreleri kullanılarakBir ambalaj plazmid ve VSV-G ifade eden zarf plazmid (plazmid bilgi için malzemeler Tablo bakınız) ile birlikte ilgili lentiviral transferi vektör.
Not:. Yararlı bilgiler için virüs üretimi Gavrilescu ark 10 bakınız ilgili. o retrovirüs üretimini tarif rağmen, 293T hücreleri ve plazmid DNA kalitesi ile ilgili genel yorumlar da lentivirüs üretimi için doğrudur.
DİKKAT: lentiviral vektörler ve iş ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri alınması gereken bir Biyogüvenlik Seviye 2 tesislerinde yapılmalıdır. - Kat poli-L-lisin (100 ug / ml) çözeltisi, 5 ml yemekler kapsayan ve hafifçe eşit kaplama çözeltisi dağıtmak sallayarak çözeltisi ile beş, 100 mm'lik tabaklar. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde yemekler yerleştirin. 30 dakika soluklu kaplama çözümden sonra ve bir kez PBS ile bulaşıkları yıkayın.
- 10 ml 293T hücre medya çanak başına plaka 7 x 10 6 293T hücreleri, sWirl yemekler eşit 37 ° C'de geri inkübatör içine hücreleri ve yer yemekleri dağıtmak için.
- Ertesi sabah, transfeksiyon ortamı, 5 ml büyüme ortamı değiştirin. geri 37 ° C'de inkübatör içine klorokin çözeltisi (25 mM) ve yer yemekleri 1,000x stokunun 6 ul ekleyin.
- Bu arada, transfeksiyon karışımı hazırlandı:
- Her lentiviral vektör için iki 5 ml reaksiyon tüpleri hazırlayın, A ve B etiketli
- 2x HEPES Ekle 600 ul tüp A. tuz (HBS) tamponlu
- 18.5 mikrogram Lentivector DNA ve 9,25 mg psPAX2 ve pMD2.G. ve 9.25 mikrogram ile tüp B karışımı 61.5 ul CaCl2 çözeltisi (2 M), Steril kültür notu H 2 O ile 600 ul ses seviyesini ayarlamak
- vorteks ederken tüp B damla bilge tüp A dan çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika için transfeksiyon karışımı inkübe edin.
- çok dikkatli transfeksiyon karışımı ekleyin 100 mm çanak hazırlanan 293T hücrelere damla damla. bir6 saat için fter 5 orta kaldırmak ve virüs üretim ortamının 10 ml ile değiştirin. 37 ° C'de geri kuvöz içine yemekleri yerleştirin.
Not: kaldırma ve 293T hücreleri kolayca çanak ayırmak beri orta değiştirirken dikkatli olun. klorokin uzun süreli maruz kalma hücrelerine toksik olduğu Orta değişiklik transfeksiyon sonra 5-6 saat çok önemlidir. - Ertesi sabah, dikkatli bir şekilde çıkarın ve orta atmak ve virüs üretim ortamının 7 ml ile değiştirin.
- Ertesi sabah, virüs ihtiva eden ortam ilk parti hasat edilir. Aspire 15 ml konik tüp içinde orta ve toplamak. Yine, hücreler üzerine virüs üretim ortamının 7 ilave edin. İkinci parti ertesi gün hasat edilene kadar mağaza buzdolabında orta virüs içeren.
- Ertesi sabah 15 ml ilk parti ihtiva eden konik bir tüp ekleyerek virüs içeren ortam ikinci parti aspire. 293T hücreleri artık atılabilir. Filtre 0.45 um sur yoluyla orta virüs içerenfactant içermeyen selüloz asetat -Membran filtresi. Alikot filtre, virüs ihtiva eden daha başka kullanım için 80 ° C 'de orta ve depolar.
Not: Virüs üretimi de 6 oyuklu tabaklarda gerçekleştirilebilir. buna göre hacimleri ve hücre sayıları küçültün.
4. Fibroblast İletimi 4 Faktörler ve mCherry Kontrol Vektör
Not: Tüm adımlar, Biyolojik Güvenlik Seviye 2 tesiste gerçekleştirilmektedir.
- Deneysel anahat şematik bir temsili. Şekil 1'e bakın primer rtTA-MEF'ler bir kısım Çözülme ve MEF ortam 2 ml toplam hacim içinde 6 oyuklu çanak oyuk başına 3.33 x 10 5 hücre plaka. en az 3 kuyu hazırlayın ve 4 faktör (4F) mCherry ve kontrol, onları etiketlemek.
Not: rtTA ifade lentiviral vektör Aşama 4.2 sırasında Lentivector kokteyline ilave edilir Alternatif olarak, vahşi tip MEF'ler kullanılabilir. - hücreler takip eden günlük tam cryopre eldeservation sırasıyla İletimi ortamı, 0.6 ml (4F), 0.9 mi (MCherry) ve 1 ml (kontrol) ile üç 6-Wells MEF ortamı değiştirin. Oda sıcaklığında PLV-teto-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets ve -mCherry virüsünün tek bir kısım Çözülme ve de 4F her bir virüs içeren süpernatan 100 ul (Tfap2c, Gata3, Eomes ETS2) ekleyin.
Not: vahşi tip MEF'ler durumunda, 100 ul preplated ortamın hacmini azaltmak ve buna ek olarak 4F karışımı içeren süpernatant FUdeltaGW-rtTA virüsünün 100 ul ilave edin. - de mCherry ile etiketlenmiş için MCherry virüs içeren ortam 100 ul ekle. her kuyuya 8 ug / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ekleyin. 37 ° C'de inkübatör içinde çanak yerleştirin ve virüs içeren süpernatan ile MEF'ler O / N inkübe edin.
Not: vahşi tip MEF'ler durumunda, 100 ul preplated ortamın hacmini azaltmak ve buna ek olarak FUdeltaGW-rtTA virüs içeren süpernatan 100 ul ilave edin. - Ertesi sabah, dikkatlice çıkarınvirüs içeren ortam ve 2 ml PBS ile üç kez yıkanır. Son olarak, (FGF4 / heparin olmadan) TS medya 2 ml ekleyin.
Not: kalıt aktarımlı MEF'ler doğrudan ITSC İndüksiyon deneyleri için kullanılan ya da daha fazla kullanım için dondurulabilir.
5. Fibroblast ITSC Dönüştürme
Not: Tüm adımlar Biyogüvenlik Seviye 2 lisanslı laboratuvar alanı yürütülmektedir.
- 4 dakika - 2 mi, PBS ile ve 0.5 ml tripsin / EDTA solüsyonu 3 inkübatörde inkübe ekledikten sonra iki kez kalıt MEFS yıkayın. hücrelerin düzgün ayrılması için bir ters mikroskop altında bakın.
- 1 ml TS orta ekleyerek tripsin inaktive. 200 x g'de 3 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu aktarın. Süpernatantı atın ve 2 ml TS ortamda hücrelerin tekrar süspansiyon. hücreleri saymak için untransduced kontrol örneği kullanın.
- Levha 4F-MEF'ler, MCherry-MEF'ler ve 2 x 10 5 yoğunluğunda untransduced kontrol MEF'ler her10 mi TS 100 mm hücre kültür çanağı başına hücre ortamı 2 ug / ml Dox (TS ortamı + FGF4 / heparin + DOX) ihtiva etmektedir.
- Alternatif olarak, küçük yemekler transdiferansiyonun gerçekleştirin. Buna göre istenilen çanak boyutu, ölçek hacmine cm2 başına 3.6 x 10 3 hücre Plate.
- Sonraki gün, transdüksiyon verimliliği hesaplamak için MCherry proteininin ifadesini izlemek (10X objektif ve kırmızı floresans uyarma için uygun olan bir filtre kullanılarak) Epifloresans mikroskop kullanılarak.
Not: İletimi verimliliği% 100'e yakın olmalıdır. artan hücre ölümü transgen indüksiyondan sonra belirgin ise, bu virüs titresi çok yüksek olduğu anlamına gelir. Transdüksiyon, virüs ihtiva eden ortam daha düşük bir miktarı ile tekrar edilmelidir. - Şimdi değişim medya andan itibaren tüm yemekleri kaplama gün sonra 10 kadar her gün üzerinde. Bundan sonra, Dox (TS ortamı + FGF4 / heparin olmadan) TS ortam hücreleri beslenir.
- ters bir mikroskop monitör için kullanılmasıgörünümü kadar 3 hafta boyunca 4F çanak (Şekil 2B ve C bakın) 'alanlar transdiferansiye'. Bu tür koloniler iki kontrol yemekleri (mCherry MEFS ve untransduced MEFS) görünür olmamalıdır.
Bireysel ITSC Hatları 6. İzolasyonu
Not: Aşama 6.3 için bir doku kültürü kapağı gerekli değildir. Bakteriyel kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için% 70 etanol ile inverted mikroskop aşağı silinmesi tavsiye edilir. Bireysel ITSC kolonileri gün 21 ve transdiferansiyonun 28 gün arasında izole edilebilir.
- 96 U-alt sıra çanak 12 kuyu içine% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu 40 ul ekle ve buz üzerinde çanak yerleştirin.
- koloni izolasyonu, 4F-MEF transdiferansiasyon çanak aspire orta önce. 10 ml PBS ile bir kez hücreler yıkanır. Yine, ters bir mikroskop altında 10 ml PBS ekleyin ve yer çanak.
- c, ayrı ayrı koloniler 40 ul ayarlanmış bir 100 ul pipet asansör kullanarakpipet ile onları ircling ve kayan koloni aspire. bir koloni devri hücreleri hazırlanan 96-iyi çanak bir kuyunun içine her. emilmesinden sonra 12 koloniler 5 dakika için 37 ° C inkübatörde 96 gözlü tabak yerleştirin.
- TS-CM ortamı (% 30 taze TS ortamı +% 70 CM + FGF4 / heparin) hazırlanmış 500 ul ile 24-iyi çanak bir kuyuya birkaç kez ve transfer hücre süspansiyonu aşağı yukarı pipetleme hücreleri ayırmak.
- Ertesi gün, ölü hücrelerin çıkarılması için yeni TS-CM ortamı ile orta yerine. her gün orta değiştirin.
- Parlak sınırları ile epitel kolonilerin görünümü için Monitör (Şekil 2'ye bakınız). koloniler görünür sonra, kültür% 70 konfluent kadar veya en fazla bir hafta ve yavaş yavaş daha yemekler genişletmek. Bundan sonra, serum içeren ortamda veya serumsuz tanımlanmış ortam 3,5,11 standart protokollere göre niyetli TSCs gibi kültür hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4F transgen ifadesi aktive çanak, hücreler hızla morfolojisi (Şekil 2A ve B karşılaştırın) değiştirin. Gün etrafında 14-21 farklı transdiferensiye alanlar (iki örnek Şekil 2B ve C olarak verilmiştir) ortaya çıkar. Bu birincil koloniler tipik TSC morfolojisi eksikliği; ancak onlar sıkı kenarları ve iyi niyetli bir TSCs son derece anımsatan parlak sınırları ile alt-kültür, karakteristik epitel morfoloji ortaya (Şekil 2B) kez. Trofoblast transkripsiyonu için pozitif 4F-iTSCs leke CDX2 ve Tfap2c (Şekil 2E) faktörleri. Bu ITSC hatları şimdi in vitro ya da in vivo analiz sonraki için, yani, in vitro olarak farklılaşma tahlilleri ya da plasental Kimerizasyonda deneyler kullanılabilir.
Şekil ITSC Dönüşüm MEF 1. Timeline. ITSCs içine MEFS transdiferansiyonun grafiksel gösterimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ITSC Dönüşüm MEF sırasında Şekil Morfoloji 2. Temsilcisi Değişiklikleri.
RtTA-MEF'ler (A) Photomicrograph. Transdiferansiye 4F-MEFS (B) Photomicrograph. Bir transdiferensiye alan Örnek, kırmızı vurgulanır. (C) 4F-MEFS on gün Ortodoks indüksiyon sonrası transdiferansiyonun gün 21 üzerinde bir transdiferensiye kolonisinin Örnek 2. alt kültür için uygun alan kırmızı vurguladı. Alt kültürden sonra 4F-iTSCs (D) Photomicrograph. Tüm ölçek çubukları 100 mikron göstermektedir. Görüntüler t edildi10X lens ve faz kontrast kullanılarak ters bir mikroskop Aken. Transkripsiyon karşı (E) İmmünfloresan boyama 4F-iTSCs içinde CDX2 ve Tfap2c faktörleri. Çekirdekler Hoechst ile boyandı. Ölçek çubukları 100 mikron göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan 4 faktörü (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) esaslı transdiferansiasyon protokolü sadakatle oluşturmak fare embriyonik fibroblastlar gelen iTSCs dönüştürülmüş güvenilir bir yöntem sunmaktadır. Dahası, yöntem olmasına rağmen embriyonik fibroblastlar 3 ile karşılaştırıldığında verimlilik bir damla ile, aynı zamanda doğum sonrası kuyruk fibroblastlar için geçerlidir. Genel olarak, birincil fibroblast kaliteli transdiferansiasyon sonuçları ve bakım kritik bir faktör erken geçiş hücreleri (geçit üç iki) kullanmak için alınmalıdır olduğunu.
Bu protokolün gücü transgen ekspresyonunun geçici kontrol sağlar doksisiklin indüklenebilir vektörleri kullanılmasıdır. Bu transgen ifade bağımsız TSC kaderi muhafaza endojen transkripsiyon faktörü ağını aktive istikrarlı ITSC hatları, üretilmesini sağlar. Bu embriyonik kök hücreleri TSC kaderin indüksiyonu açıklayan daha önce yayınlanmış protokollere aksine olan bir metot ThaBugüne kadar t, sadece tam olarak Yeniden programlanan trofoblast kök hücre benzeri hücreler 1 elde edilir.
Ancak, burada açıklanan protokol bilinen bir sınırlama zor transdiferansiasyon verimliliğini tahmin etmek yapım ortaya çıkan transdiferansiye kolonilerin değişken sayısıdır. Tek lentiviral vektörler transdüksiyon etkinliği, başlangıç hücre nüfusunun çoğalması miktarını ve transdiferansiasyon esnasında hücre ölümü miktarı: Bu sınırlamalar nedeniyle transdiferansiasyon sonuç için önemli olan birkaç derece değişken faktörlere bulunmaktadır. Bazı durumlarda transdiferensiye altında ITSC kolonileri ortaya başarısız. Bu durumda, ortam ve reaktifler ITSC üretiminde kullanılmadan önce, gerçek bir TSC kültürüne destek özellikleri için test edilmelidir. Buna ek olarak, 4F transdüksiyon hücre ölümüne transgen sentezleme kurşun çok yüksek miktarlarda bulunabildiğinden, titre edilebilir. Bireysel ITSC l Genel olarak, alt-kültürleme olarakines biraz pratik gerektirir. ITSCs alt kültürü ile zorluklar meydana durumunda tek bir izole koloniler, alternatif olarak büyüme etkisizleştirilmiş besleyici% 50 hücre yoğunluğu ile yemekleri kaplama olabilir, (yani., Alt kültürlenmiş hücreler kendini yenileme korumak için başarısız yerine kendiliğinden ayırt) hücreler hücre büyümesi ve bağlanmasını desteklemek. ITSC hatları daha sonra yavaş yavaş sonraki Pasajlanması sırasında besleyiciler sütten edilebilir. Teksas orta sadece ITSC / TSC hatları kurulmuş destekler beri notun, biz, tanımlanmış Teksas orta koşulları kullanılarak iTSCs doğrudan dönüştürme MEFS başarılı olamadı.
Şimdiye kadar, fibroblastlardan ITSC indüksiyon protokolü sadece murin hücreleri için kurulur. Bu nedenle, şu anda, diğer türler için bu protokolü adapte, insan ya da diğer model sistemleri ITSC hatlarının türetme sağlamak için büyük bir ilgi çekici olacaktır. Ayrıca, ITSC dönüşüm fibroblast kesin mekanizmalarının analizi doğasına yeni bir bakış açısı sunacaknormal ve patolojik gelişim sırasında hücre kaderi tayin ilkelerini anlamak ekstra embriyonik soy bariyer ve yardım karşı somatik evi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
