Abstract
영양막 줄기 세포 (의 TSC)는 포유 동물 발달에서 제 1 셀의 운명 결정의 결과로서 발생한다. 그들은 자기 갱신과 태반의 태아 부분에 세포 인구주는 상승 줄기 생체에 해당 영양막 세포 계보의 모든 하위 유형으로 분화 할 수있는 능력을 유지, 체외에서 배양 할 수있다. 따라서,의 TSC는 체외에서 여분의 배아 세포 운명 결정 대 태반 개발 및 배아를 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이후 배반포 단계에서 DNA 메틸화와 히스톤 수정 구성된 별개의 후생 유전 학적 장벽은 단단히 두 계통을 분리한다. 여기, 우리는 완전히 과발현 쥐의 배아 섬유 아세포에서 영양막 세포 키 규제 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2의 과도하여이 혈통의 장벽을 극복 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유도 영양막 세포의 줄기 세포는 자기 갱신 할 수 있습니다 및 파생 영양막 세포의 줄기 세포를 배반포 거의 동일하다 내가형태, 마커 유전자 발현과 메틸화 패턴 N 조건. 생체 외 및 생체 내 분석 기능은 이러한 세포는 영양막 세포의 혈통이 배수체 영양막 세포 거대 세포를 생성하고 포배에 주입하면 태반을 chimerizing 따라 차별화 할 수 있는지 확인합니다. 체세포 조직에서 영양막 줄기 세포의 유도는이 엑스트라 배아 혈통 유전자 및 후생 유전 학적 특성을 연구하는 새로운 길을 열고 각각의 배아를 파괴하지 않고 영양막 줄기 세포주를 생성하기위한 가능성을 제공한다.
Introduction
최근 줄기 세포 변환을 영양막하는 마우스 배아 줄기 세포의 여러 가지 접근 방식을 비교하는 연구는 모든 분석 시스템에서, 혈통 전환이 불완전 남아 있음을 밝혔다. 대신 그래서 영양막 줄기라고 유도 영양막 줄기 세포 (iTSCs)의 세포 유사 세포가 기원 한 세포의 운명의 메모리 유지 생성되었다. 여기, 우리는 ITSC 세대의 다른 접근 방식을 따랐다. 쥐 배아 섬유 아세포 (MEFs에) (2)로부터 다 능성 줄기 세포의 직접 유도와 유사하게, iTSCs 직접 분화 된 체세포 조직에서 변환되었다. 첫째, 우리는 MEFs에에서 과발현 때 TSC의 운명을 유도 (12) 후보 요인을 확인했다. 나중에, 요소 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2는 ITSC 유도 3 필요하고 충분한 것으로 확인되었다. 동시에, 다른 그룹은 독립적으로 iTSCs에 MEFs에 변환 할 충분한 것으로 Tfap2c, GATA3 및 Eomes를 발견했다. 그러나,에 그연구는 유전자 발현을 위해 필요한 시간이 상당히 길어 Ets2는 분화 칵테일 4에없는 경우에는, 다른 전환 반응 속도를 나타내는 연구와 비교된다.
유도 배반포 영양막 유래 줄기 세포의 배양을 포함하는 종래의 소 태아 혈청 (FBS)을 성장 비활성화 MEFs에 5,6- 분비 인자의 존재에 의존한다. ITSC 유도하는 동안, 이러한 요인은 유전자의 전체 조합이 부족 분화가 진행되지 않습니다 MEFs에 의해 제공됩니다. 그러나 한 번 개인 ITSC 식민지 그들은 성장 비활성화 MEFs에 의해 미리 조정 된 미디어를 필요로 계대 배양합니다. 거기부터 iTSCs 배양 및 표준 프로토콜에 따라 배반포 유래의 TSC처럼 취급 할 수 있습니다. 참고로, 세포 배양 접시를 겔화없이 다나카 등. (5) 우리가 일상적으로 배양의 TSC와 iTSCs 대조적.
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Protocol
모든 마우스 실험 동물의 보호와 지역 기관 동물 관리위원회 (Landesamt FUER 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz, 노르 트라 인베스트 팔렌 [승인 ID 번호의 승인을 계약의 독일 법에 따라 수행 하였다 : 84-02.04.2013 AZ .A428).
1. 미디어 준비
- 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 10 % (V / V) FBS, L- 글루타민 (2 mM)을 피루브산 나트륨 (1 mM)을 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X) 293T 매체를 준비한다.
- DMEM, 10 % (V / V) FBS, L- 글루타민 (2 mM)을, 1X 비 필수 아미노산, 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X) MEF 매체를 준비한다.
- TS 매체를 준비 (w / FGF4 / 헤파린 O) : 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 1640, 20 % (v / v)의 FBS (줄기 세포 배양 등급), 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 배), L- 글루타민 (2 mM의 b), 나트륨 피루 베이트 (1 mM)을 2- 메르 캅토 에탄올 (0.1 mm)이다.
- 줄기 세포 (RPMI 1640, 20 % (V / V) FBS : FGF4 / 헤파린 (TS + F4H)와 TS 배지를 준비배양 등급), 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X), L- 글루타민 (2 mM)을 피루브산 나트륨 (1 mM)을 2- 메르 캅토 에탄올 (0.1 mM)을 25 NG / ㎖ FGF4 / ㎖의 헤파린을 1 μg의.
참고 : FGF4 및 헤파린 직접 사용하기 직전에 미디어에 추가됩니다. - FGF4 / 헤파린 (TS-CM + F4H)와 TS-CM을 준비 : 70 % MEF 에어컨 TS 매체 + 30 % 갓 준비 TS 매체 + 25 NG / ㎖ FGF4, 1 μg의 / ㎖ 헤파린.
참고 : FGF4 및 헤파린 직접 사용하기 직전에 미디어에 추가됩니다. - 형질 매체 준비 : 고급 DMEM, 2 % (v / v)의 FBS를 (세포 배양 학년 줄기), L- 글루타민 (2 mM)을, 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 배).
- 바이러스 생산 배지 준비 : 고급 DMEM, 5 % (v / v)의 FBS를 (세포 배양 학년 줄기), L- 글루타민 (2 mM)을, 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 배).
2. 쥐 배아 섬유 아세포 유도
- 129S2SV 여성과 동형 접합 남성 R26 :: rtTA 마우스 (주 이름 중량 사용하여 설정 시간이 초과 교배, B6.Cg-GT는 (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) 재 / J 7). 자궁 전위에 의해 E13.5 희생 마우스에서 표준 프로토콜 8 항에 기본 쥐의 배아 섬유 아세포 (MEFs에)를 분리. 그 후, MEF 미디어에서 150mm 접시에 하나의 배아에서 플레이트 세포.
- 차 MEF 문화가 150mm 요리에 포화 상태에 도달하면, 10 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어 4 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 인큐베이터에서 4 분 - 3 요리를 품어.
- 배양 검사 후에 도립 현미경 (10 배의 렌즈를 사용)를 사용하여 접시로부터 분리 된 세포의 경우. 트립신을 중지하고 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 수집하기 위해 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다.
- 풀 세포의 여러 요리에서 서스펜션과 50 ML 원뿔 튜브에 수집합니다. 200 XG에 3 분 10 ° C에 대한 원심 분리기 세포 현탁액.
- 10 % (v / v)의 디메틸 설폭 사이드를 포함 FBS에서 상층 액과에 resuspend 세포 펠렛을 폐기하십시오. 더 사용 분취에서 MEFs에 동결.
참고 : 또는, 야생 일반을 사용전자 주 MEFs에; 그러나, rtTA 발현 추가 렌티 바이러스 벡터 (Maherali 등. (9)에 의해 기재된 FUdeltaGW-rtTA 플라스미드 등을 사용하여) 다른 렌티 바이러스 벡터와 함께 형질 도입 될 필요가있다. - MEF 에어컨 TS 매체의 제조
참고 : 이전에 변환 실험에, MEF 에어컨 (CM) TS 미디어 (6 절에 설명) 개인 ITSC 라인의 배양을 위해 요구되는 준비 할 수있다.- 접시 요리의 원하는 수에 MEF 매체에 150mm 접시 당 1 × 10 7 mitotically 불 활성화 MEFs에. 9 Gy의의 복용량 γ-조사에 의해 MEFs에를 비활성화.
참고 : 150mm 접시 당 수율이 약 60 ml의 CM의입니다. - 도금, 흡인 후 하루는 MEF 매체를 폐기하고 다시 37 ° C에서 인큐베이터에 MEFs에 장소 요리 mitotically 불 활성화 된 각각의 접시에 갓 (FGF4 / 헤파린없이) TS 매체를 제조 20 ㎖를 추가합니다.
- 배양 후mitotically 불 활성화 MEFs에에 3 일 동안 TS 매체는 50 ML 원뿔 튜브 매체를 수집합니다. 0.2 μm의 필터를 통해 매체를 필터링 및 2.6.4를 진행합니다. CM의 또 다른 배치의 준비를위한 신선한 TS 매체의 20 ml의 CM를 교체합니다.
주 : Mitotically 비활성화 된 MEFs는 3 회까지 CM의 제조에 사용될 수있다. - 분취 액을 -20 ℃에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브 저장소로 여과 CM 35 mL로 필요할 때까지. 해동 후, 최대 한 달 동안 4 ℃에서 70 %의 TS-CM을 얻기 위해 저장 갓 제조 TS 배지 15 mL로 추가한다.
- 접시 요리의 원하는 수에 MEF 매체에 150mm 접시 당 1 × 10 7 mitotically 불 활성화 MEFs에. 9 Gy의의 복용량 γ-조사에 의해 MEFs에를 비활성화.
293T 세포 3. 렌티 바이러스 벡터 생산
참고 : 모든 단계 바이오 안전성 레벨 2에 라이센스 실험실 공간에서 수행된다.
- 이전 변환 실험에 과발현 Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2 및 mCherry의 의존 독시 싸이클린 (DOX)에 대한 렌티 바이러스 벡터를 준비합니다. 각 렌티 들어, 공동 트랜의 293T 세포는를 사용하여포장 플라스미드 및 VSV-G 표현 봉투 플라스미드 (플라스미드 정보 자료 표 참조)과 함께 각각의 렌티 바이러스 전이 벡터.
참고 :. 도움이되는 정보를 바이러스 생산 Gavrilescu 등 10 참조 관련. 이 레트로 바이러스 생산을 설명하지만, 293T 세포 및 플라스미드 DNA의 품질에 대한 일반적인 설명도 렌티 바이러스 생산 마찬가지이다.
주의 : 렌티 바이러스 벡터 및 작업 작업을 할 때 적절한 안전 조치가 취해질 필요는 바이오 안전성 수준이 시설에서 수행되어야한다. - 코트 폴리 -L- 라이신 (100 μg의 / ml) 용액에 5 ml의 요리를 덮고 부드럽게 균일하게 코팅 솔루션을 배포하는 락에 의해 솔루션 오 100mm 요리. 30 분 동안 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 30 분 대기음 코팅 용액 후 PBS로 한번 요리를 씻어.
- 10 ml의 293T 세포 미디어 접시 당 플레이트 (7) × 10 (6) 293T 세포이야WIRL 요리 균등하게 37 ° C에서 다시 인큐베이터로 세포 및 장소 요리를 배포합니다.
- 다음날 아침, 형질 매체의 5 ㎖로 성장 매체를 교체합니다. 다시 37 ° C에서 인큐베이터에 클로로퀸 용액 (25 mM)을 제자리 요리의 1000 배 주식의 6 μl를 추가합니다.
- 한편, 형질 감염 혼합물을 제조한다 :
- 각 렌티 바이러스 벡터 두 5 ㎖ 반응 관을 제조, A와 B로 표시된
- 배 HEPES의 추가 600 μL 튜브 A에 식염수 (HBS)를 버퍼
- 18.5 μg의 lentivector의 DNA와 9.25 μg의 psPAX2 및 pMD2.G.의 9.25 μg의와 튜브 B 믹스 61.5 μL 염화칼슘 2 용액 (2 M) 멸균 문화 학년 H 2 O. 600 μL에 볼륨을 조절
- 텍싱 동안 튜브 B 드롭 현명한 튜브 (A)에에서 솔루션을 추가합니다. RT에서 15 분 동안 형질 전환 혼합물을 인큐베이션.
- 매우 신중하게 형질 전환 혼합물을 추가 100mm 접시에 준비된 293T 세포에 현명한 놓습니다. 에이6 시간을 따고 5는 매체를 제거하고 바이러스 생산 배지 10 ㎖로 교체합니다. 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 요리를 놓습니다.
참고 : 제거 및 293T 세포가 쉽게 접시에서 분리하기 때문에 매체를 교체 할 때주의해야합니다. 클로로퀸에 장기간 노출이 세포에 독성이 있기 때문에 중간 변경 형질 전환 후 5 ~ 6 시간은 매우 중요하다. - 다음 날 아침, 조심스럽게 제거하고 중간 삭제하고 바이러스 생산 배지의 7 ㎖로 교체합니다.
- 다음 아침 바이러스 함유 매체의 제 1 배치를 수확. 대기음 15 ML 원뿔 튜브 중간 수집합니다. 다시, 세포에 바이러스 생산 배지의 7 ml에 추가 할 수 있습니다. 두 번째 배치는 다음 날 수확 때까지 보관 냉장고에 매체 바이러스 함유.
- 다음날 아침 15 ml의 첫번째 배치를 포함하는 원뿔 튜브를 추가 바이러스 함유 매체의 두 번째 배치를 대기음. 293T 세포는 이제 버려 질 수있다. 필터 0.45 μm의 쉬르 통해 매체 바이러스 함유factant없는 셀룰로오스 아세테이트 -membrane 필터. 나누어지는 필터링, 바이러스 함유 추가로 사용하기 위해 -80 ° C에서 매체 및 저장합니다.
주 : 바이러스 생산은 6 웰 접시에서 수행 될 수있다. 이에 따라 볼륨과 세포 수를 확장 할 수 있습니다.
4. 섬유 아세포 형질 도입 4 요소와 mCherry 제어 벡터
참고 : 모든 단계는 바이오 안전성 수준이 시설에서 수행된다.
- 실험 개요의 개략도를 들어. 그림 1 참조 주 rtTA - MEFs에의 한 나누어지는을 해동 및 MEF 매체의 2 ML의 총 부피에 6 잘 요리 잘 당 3.33 × 10 5 세포를 접시. 적어도 3 개의 우물을 준비하고 4 요소 (4 층) mCherry 및 제어,로 레이블을 붙입니다.
참고 : rtTA 발현하는 렌티 바이러스 벡터 단계 4.2 동안 lentivector 칵테일에 추가 될 때 또는 야생형 MEFs에가, 사용할 수 있습니다. - 세포 후 다음 날 완전히 cryopre에서 회복보전은 각각 전달 매체의 0.6 ㎖ (4 층), 0.9 ㎖ (mCherry) 1 ㎖ (제어)와 세 6 우물에 MEF 매체를 교체합니다. RT에서 PLV-TETO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -ets 및 -mCherry 바이러스 중 하나 나누어지는을 해동하고 잘 4 층에 각각의 바이러스 함유 상층 액 100 ㎕ (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2)를 추가합니다.
참고 : 야생형 MEFs에의 경우, 100 μL에 의해 예비 도금 미디어의 볼륨을 줄이고 추가로 4 층 믹스에 뜨는을 포함 FUdeltaGW-rtTA 바이러스의 100 μl를 추가합니다. - 잘 mCherry 표지에 mCherry 바이러스 함유 매체의 100 μl를 추가합니다. 각 웰에 8 μg / ML의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 접시를 놓고 바이러스를 함유 상층 액과 MEFs에 O / N을 품어.
참고 : 야생형 MEFs에의 경우, 100 μL에 의해 예비 도금 미디어의 볼륨을 줄이고 추가 FUdeltaGW-rtTA 바이러스 함유 상층 액 100 μl를 추가합니다. - 다음날 아침, 조심스럽게 제거바이러스 함유 매체와 PBS 2 ㎖로 3 회 세척한다. 마지막으로, (FGF4 / 헤파린없이) TS 미디어 2 ㎖를 추가합니다.
참고 : 형질 MEFs에가 직접 ITSC 유도 실험에 사용하거나 추가 사용을 위해 얼 수있다.
5. 섬유 아세포 ITSC 변환에
참고 : 모든 단계 바이오 안전성 레벨 2에 라이센스 실험실 공간에서 수행된다.
- 4 분 - 2 ml의 PBS와 0.5 ml의 트립신 / EDTA 용액을 3 인큐베이터에서 그들을 품어 추가 한 후 두 번 형질 MEFs에 씻으십시오. 세포의 적절한 분리를위한 거꾸로 현미경으로 확인합니다.
- 1 ML의 TS 배지를 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다. 200 X g에서 3 분 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다. 뜨는을 취소하고 2 ML의 TS 배지에서 세포를 재현 탁. 세포를 계산하기 위해 untransduced 제어 샘플을 사용합니다.
- 플레이트 4 층 - MEFs에, mCherry-MEFs에 2 × 105의 밀도에서 untransduced 제어 MEFs에 각각10 ㎖의 TS에서 100mm 세포 배양 접시에 세포 당 2 μg의 매체 / ㎖ DOX (TS 배지 +를 FGF4 / 헤파린 + DOX)을 함유.
- 또한, 작은 접시에 분화를 수행합니다. 따라서 원하는 접시 크기, 규모 볼륨 cm 2 당 3.6 × 10 3 세포를 플레이트.
- 다음날, 형질 도입 효율을 추정하기 위해 mCherry 단백질의 발현을 모니터링 (a 10X 렌즈 및 적색 형광 여기에 적합한 필터 사용) 표면 형광 현미경.
참고 : 형질 도입 효율이 100 %에 가까워 야합니다. 증가 된 세포 사멸을 유도 한 후 트랜스 분명한 경우이 바이러스 역가가 너무 높은 것을 의미한다. 전달 바이러스 함유 배지의 감소 된 양을 반복해야합니다. - 지금 변화 미디어의 모든 요리 도금 후 10 일까지 매일합니다. 그 후, DOX (TS 매체 + FGF4 / 헤파린)없이 TS 매체와 세포를 공급.
- 거꾸로 현미경의 모니터를 사용하여외관 최대 3 주 동안 4 층 접시에 (그림 2B와 C 참조) '지역 transdifferentiated'가. 이러한 식민지는 두 제어 요리 (mCherry-MEFs에와 untransduced MEFs에)에 표시되지해야합니다.
개인 ITSC 라인 6. 분리
주의 : 단계 6.3 조직 배양 후드는 필요하지 않다. 세균 오염의 가능성을 최소화하기 위해 70 %의 에탄올로 거꾸로 현미경을 닦아하는 것이 좋습니다. 개인 ITSC의 식민지 일 21 분화 28 일 사이에 분리 할 수있다.
- 96 U-하단에 잘 접시 12 우물에 0.05 % 트립신 / EDTA 용액 40 μl를 추가하고 얼음에 접시를 놓습니다.
- 콜로니 분리, 4F-MEF의 분화 접시에 흡인 매체 전에. 10 ml의 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 다시 거꾸로 현미경 하에서 10 ml의 PBS를 추가하고 장소 접시.
- C에 의해 개별 식민지를 40 μL로 설정 100 μL 피펫을 리프트 사용피펫 팁을 ircling 및 부동 식민지를 흡입. 한 식민지의 전송 세포 제조 된 96 웰 접시의 잘 하나에 각. 수확 후 12 콜로니를 5 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 96 잘 접시를 놓습니다.
- TS-CM 매체 (30 % 신선한 TS 매체 + 70 % CM + FGF4 / 헤파린)의 준비 500 μL와 24 잘 요리 잘 하나에 여러 번 전송 세포 현탁액을 위해 아래로 pipetting에 의해 세포를 떼어 놓다.
- 다음 날은 죽은 세포를 제거하는 신선한 TS-CM 매체와 매체를 교체하십시오. 매일 매체를 변경합니다.
- 밝은 경계 상피 식민지의 모습을 모니터 (그림 2 참조). 식민지가 표시되면, 문화 70 % 합류 할 때까지 또는 최대 일주일 점차 큰 요리에 확장합니다. 지금부터, 혈청 함유 미디어 또는 무 혈청, 정의 미디어 3,5,11 표준 프로토콜에 따라 선의의 TSC로 배양 세포.
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Representative Results
4 층의 유전자 발현이 활성화 접시에서 세포를 신속하게 형태를 (그림 2A와 B를 비교)로 변경합니다. 하루의 주위에 14-21 별개의 transdifferentiated 영역 (두 가지 예는 그림 2B와 C에 나와있다) 등장. 이 차의 식민지는 전형적인 TSC 형태 부족; 그러나 그들은 단단한 가장자리와 선의의 TSC의 매우 연상시키는 밝은 경계 계대 배양, 특성 상피 형태 나타난다 (그림 2D) 일단. 영양막 세포의 전사에 대한 긍정적 인 4F-iTSCs 얼룩은 CDX2와 Tfap2c (그림 2E)을 요인. 이러한 ITSC 라인은 현재 시험 관내 또는 생체 내 분석에 대한 후속 즉 체외 분화 검정 또는 태반 키메라 실험에 사용될 수있다.
그림 ITSC 전환에 MEF 1. 타임 라인. iTSCs에 MEFs에의 분화의 그래픽 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ITSC 전환에 MEF 동안 그림 형태론 2. 대표 변경.
rtTA - MEFs에의 (A) 현미경 사진. transdifferentiated 4 층 - MEFs에의 (B) 현미경 사진. transdifferentiated 영역의 예는 빨간색으로 강조. (C) 4 층 - MEFs에있는 10 일 DOX 유도 후 분화의 21 일에 transdifferentiated 식민지의 예 2. 서브 배양에 적합한 지역은 빨간색으로 강조. 서브 배양 후 4 층 - iTSCs의 (D) 현미경 사진. 모든 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이미지는 t이었다10 배 렌즈와 위상차를 이용하여 역 현미경 AKEN. 전사에 대하여 (E) 면역 형광 염색법은 4 층 - iTSCs에서 CDX2와 Tfap2c 요인. 핵 훽스트으로 염색된다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 4 인자 (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2)를 기반으로 분화 프로토콜은 충실하게 생성 마우스 배아 섬유 아세포에서 iTSCs을 변환 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 또한, 상기 방법은 비록 배아 섬유 아세포 (3)에 비해 효율의 저하로도 산후 테일 섬유 아세포에 적용된다. 일반적으로, 기본 섬유 아세포의 분화 품질 결과 및 치료의 중요한 요소가 초기 통로 세포 (통로 3-2)를 사용하여 수행되어야한다.
이 프로토콜의 강도는 유전자 발현의 시간 제어를 허용 독시사이클린 - 유도 성 벡터를 사용하는 것이다. 이는 유전자 발현 독립적 TSC 운명을 유지 내생 전사 인자를 활성화 네트워크 안정 ITSC 라인의 생성을 가능하게한다. 이것은 줄기 세포의 운명 TSC의 유도를 설명하기 이전에 발행 프로토콜 대조적이다 방법 그쪽현재까지 t은 불완전 재 프로그램 영양막 세포의 줄기 세포 유사 세포 (1)를 산출한다.
그러나, 여기에 기술 된 프로토콜의 알려진 한계가 곤란 분화 효율을 예측하게 부상 transdifferentiated 콜로니 가변 개수이다. 하나의 렌티 바이러스 벡터의 형질 도입 효율, 출발 세포 집단의 증식 량 및 분화 중에 세포사의 양은 이러한 한계 때문에 분화 결과에 중요한 몇 가지 매우 가변적 요소한다. 어떤 상황이 transdifferentiated에서 ITSC 식민지가 등장하지 못한다. 이 경우 미디어 및 시약은 ITSC 세대에서의 사용하기 전에, 정품 TSC 문화를 지원하기 위해 자신의 능력을 테스트해야합니다. 또한, 4 층으로 전달은 세포 사멸에 대한 유전자 발현 리드 너무 많은 양 때문에, 적정 할 수있다. 개별 ITSC (L)의 일반, 하위 배양에서아이 네스는 연습이 필요합니다. iTSCs 서브 배양 어려움이 발생하는 경우 단일 절연 콜로니 대안 성장 비활성화 공급의 50 %의 세포 밀도로 접시에 플레이 팅 될 수있다 (예., 계대 배양 세포는자가 재생 (self-renewal)을 유지하지 못하는 대신 자연 분화) 세포는 세포의 성장과 첨부 파일을 지원합니다. ITSC 라인은 서서히 이후의 계대 동안 피더에서 투약 할 수있다. TX 매체만을 ITSC / TSC 라인을 설립 지원하므로 참고로, 우리는 정의 TX 매체 iTSCs 조건을 이용하여 직접 변환을 MEFs에 성공하지 않았다.
지금까지, 섬유 아세포에서 ITSC 유도하기위한 프로토콜은 쥐 세포 확립된다. 따라서, 지금은 다른 종에이 프로토콜을 적응하고 사람이나 다른 모델 시스템에서 ITSC 라인의 유도를 가능하게 큰 관심이 될 것입니다. 또한, ITSC 변환 섬유 아세포의 정확한 기전의 분석은 자연에 새로운 통찰력을 제공 할 것이다정상 및 병적 개발하는 동안 세포 운명 결정의 원리를 이해 여분의 배아 계보 장벽 및 지원 대 체세포의.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
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