Abstract
Trophoblast stamceller (TSC-ene) oppstår som en konsekvens av den første cellen skjebne avgjørelse i pattedyr utvikling. De kan dyrkes in vitro, beholder evnen til å fornye seg selv og til å differensiere i alle undergrupper av trophoblast avstamning, tilsvarende in vivo stamcelle befolkningen gir opphav til foster del av morkaken. Derfor TSC-ene tilbyr en unik modell for å studere placenta utvikling og embryonale versus ekstra-embryonale celle skjebne beslutning in vitro. Fra blastocyststadiet og utover, en distinkt epigenetisk barriere som består av DNA metylering og histonmodifikasjonene tett skiller begge linjene. Her beskriver vi en protokoll for å fullt ut overvinne denne avstamning barriere ved forbigående over uttrykk for trophoblast viktige regulatorer Tfap2c, Gata3, Eomes og ETS2 i murine embryonale fibroblaster. De induserte trophoblast stamceller er i stand til å fornye seg selv, og er nesten identisk med blastocyst avledet trophoblast stamceller in gjelder morfologi, men da genekspresjon og metylering mønster. Funksjonelt in vitro og in vivo-analyser bekrefter at disse cellene er i stand til å differensiere langs linjen trophoblast generer polyploid trophoblast kjempeceller og chimerizing placenta når de injiseres inn i blastocyster. Induksjon av trophoblast stamceller fra somatisk vev åpner nye veier for å studere genetiske og epigenetiske kjennetegn ved denne ekstra-embryonale avstamning og tilbyr muligheten til å generere trophoblast stamcellelinjer uten å ødelegge den respektive embryo.
Introduction
Nylig har en studie som sammenlignet flere tilnærminger av mus embryonale stamceller til trophoblast stamceller konvertering avslørte at i alle analyserte systemer, forble avstamning konvertering ufullstendig. I stedet for å induserte trophoblast stamceller (iTSCs) såkalte trophoblast stamcelle-lignende celler har blitt generert beholder en hukommelse av cellen skjebne opprinnelse 1. Her fulgte vi en annen tilnærming av iTSC generasjon. I likhet med den direkte induksjon av pluripotente stamceller fra muse embryonale fibroblaster (MEFs) 2, har iTSCs vært direkte konvertert fra differensiert somatisk vev. Først identifiserte vi 12 kandidat faktorer som induserer TSC skjebne når overexpressed i MEFs. Senere har de faktorene Tfap2c, Gata3, Eomes og ETS2 blitt identifisert til å være nødvendig og tilstrekkelig for iTSC induksjon tre. Samtidig, en annen gruppe uavhengig funnet Tfap2c, Gata3 og Eomes å være tilstrekkelig til å konvertere MEFs inn iTSCs. Men i såStudien er den tiden som kreves for transgene uttrykk vesentlig lengre enn vår studie, som viser forskjellige konverteringskinetikk, når ETS2 er fraværende fra transdifferensiering cocktail fire.
Konvensjonell føtalt bovint serum (FBS) inneholdende kultur av indusert og blastocyst avledet trophoblast stamceller er avhengig av tilstedeværelse av faktorer som utskilles av vekst-inaktivert MEFs 5,6. Under iTSC induksjon, er disse faktorene leveres av MEFs, som mangler den fullstendige kombinasjonen av transgener og ikke gjennomgår transdifferensiering. Men når enkelte iTSC kolonier er sub-kultivert, de krever media, som har blitt forbehandlet av vekst inaktivert MEFs. Derfra kan iTSCs dyrkes og behandlet som blastocyst avledet TSC-ene i henhold til standard protokoller. Av notatet, i motsetning til al. Tanaka et fem, vi rutinemessig kultur TSC-ene og iTSCs uten gelatinecellekultur retter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus Forsøkene ble utført i henhold til den tyske loven om dyrevern og etter avtale med godkjennelse av de lokale institusjonelle Animal Care komiteer (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [godkjenning ID nummer: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Media Forberedelse
- Forbered 293T medium: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), penicillin / streptomycin (1x).
- Forbered MEF Medium: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-glutamin (2 mM), 1 x ikke-essensielle aminosyrer, penicillin / streptomycin (1x).
- Forbered TS medium (w / o FGF4 / heparin): Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (stamcellekulturkvalitet), penicillin / streptomycin (1x), L-glutamin (2 mM ), natriumpyruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0,1 mM).
- Forbered TS medium med FGF4 / heparin (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) FBS (stamcellekulturkvalitet), penicillin / streptomycin (1x), L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 pg / ml heparin.
Merk: FGF4 og heparin blir tilsatt direkte i media umiddelbart før bruk. - Forbered TS-CM med FGF4 / heparin (TS-CM + F4H): 70% MEF kondisjonerte TS medium + 30% nylaget TS medium + 25 ng / ml FGF4, 1 mikrogram / ml heparin.
Merk: FGF4 og heparin blir tilsatt direkte i media umiddelbart før bruk. - Forbered Transfeksjon medium: Advanced DMEM, 2% (v / v) FBS (stamcellekulturkvalitet), L-glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (1x).
- Forbered Virus-produksjon medium: Avansert DMEM, 5% (v / v) FBS (stamcelle kultur klasse), L-glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (1x).
2. Murine Embryonic fibroblast Derivation
- Sett timet parringer ved hjelp vekt 129S2SV hunner og homozygot mannlige R26 :: rtTA- mus (stamme navn, B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA-* M2) Jae / J 7). På E13.5 offer mus ved halshugging og isolere primære murine embryonale fibroblaster (MEFs) i henhold til standard protokoller 8. Deretter plate celler fra ett embryo på et 150 mm rett i MEF media.
- Når primær MEF kulturer nå konfluens på 150 mm skåler, vask celler to ganger med 10 ml PBS og tilsett 4 ml 0,05% trypsin / EDTA løsning. Inkuber retter for 3-4 min i inkubator ved 37 ° C.
- Etter inkubasjon sjekke om celler løsrevet fra fatet ved hjelp av en omvendt mikroskop (med en 10X objektiv). Tilsett 5 ml MEF media for å stoppe trypsinering og samle cellesuspensjonen i et 50 ml konisk rør.
- Pool cellesuspensjon fra flere retter og samles opp i 50 ml konisk tube. Sentrifuger cellesuspensjonen i 3 minutter ved 200 xg og 10 ° C.
- Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i FBS inneholdende 10% (volum / volum) dimetylsulfoksyd. Fryse MEFs i porsjoner for videre bruk.
Merk: Du kan også bruke wild type primære MEFs; imidlertid en ytterligere lentiviral vektor som uttrykker rtTA må transdusert sammen med de andre lentivirale vektorer (for eksempel ved hjelp av FUdeltaGW-rtTA-plasmidet beskrevet av Maherali et al. 9). - Utarbeidelse av MEF kondisjonerte TS medium
Merk: Før konvertering forsøk er MEF-condition (CM) TS media for å være forberedt, noe som er nødvendig for subkultur av individuelle iTSC linjer (beskrevet i kapittel 6).- Plate 1 x 10 7 mitotisk inaktiv MEFs per 150 mm skål i MEF medium på ønsket antall retter. Inaktivere MEFs av γ-bestråling med en dose på 9 Gy.
Merk: Avkastningen per 150 mm parabolen er omtrent 60 ml CM. - Dagen etter plating, aspirer og kast MEF medium og tilsett 20 ml nylagde TS medium (uten FGF4 / heparin) på hver tallerken av mitotisk inaktivert MEFs og sted retter tilbake i inkubator ved 37 ° C.
- etter inkubasjonTS medium for tre dager på mitotisk inaktiv MEFs, samle medium i 50 ml koniske rør. Filtrer medium gjennom et 0,2 mikrometer filter og fortsett med 2.6.4. Erstatte CM med 20 ml frisk TS medium for fremstilling av en ytterligere batch av CM.
Merk: mitotisk inaktiverte MEFs kan anvendes for fremstilling CM opptil tre ganger. - Delmengde 35 ml filtrert CM i 50 ml koniske rør og oppbevar ved -20 ° C inntil nødvendig. Etter tining, tilsett 15 ml nylaget TS medium for å oppnå 70% TS-CM og oppbevares ved 4 ° C i opptil en måned.
- Plate 1 x 10 7 mitotisk inaktiv MEFs per 150 mm skål i MEF medium på ønsket antall retter. Inaktivere MEFs av γ-bestråling med en dose på 9 Gy.
3. Lentiviral Vector Produksjonen i 293T celler
Merk: Alle trinn utføres i laboratoriet plass lisensiert til biosikkerhetsnivå 2.
- Før konvertering eksperimenter, forberede lentiviral vektorer for doksycyklin (DOX) avhengige over-uttrykk for Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2 og mCherry. For hver lentivirus, co-transfektere 293T celler ved hjelp avrespektive lentiviral overføring vektor sammen med en innpakning plasmid og en VSV-G uttrykker konvolutt plasmid (for plasmid informasjon se Materials Table).
Merk: For nyttig informasjon om virusproduksjon referere til Gavrilescu et al 10.. Selv om den beskriver retrovirus produksjon, generelle vurderinger av kvaliteten på 293T celler og plasmid DNA er sant for lentivirus produksjon også.
FORSIKTIG: Passende sikkerhetstiltak må tas, når du arbeider med lentiviral vektorer og arbeidet må utføres i et biosikkerhetsnivå 2 anlegg. - Coat fem 100 mm skåler med poly-L-lysin (100 ug / ml) oppløsning ved å dekke retter med 5 ml av oppløsning og å riste å fordele beleggoppløsning. Plasser retter tilbake i inkubatoren ved 37 ° C i 30 minutter. Etter 30 minutter aspirate beleggoppløsning og skyll retter en gang med PBS.
- Plate 7 x 10 6 293T celler per fatet i 10 ml 293T-celle media, sWirl retter for å fordele celler og plassere retter tilbake i inkubatoren ved 37 ° C.
- Neste morgen, erstatte vekstmedium med 5 ml av transfeksjon medium. Tilsett 6 ul av en 1,000x lager av klorokin-oppløsning (25 mM) og plassere retter tilbake i inkubatoren ved 37 ° C.
- I mellomtiden, forberede transfeksjon blanding:
- For hver lentiviral vektor fremstille to 5 ml reaksjonsrørene, merket A og B.
- Legg 600 ul av 2x HEPES bufret saltvann (HBS) til røret A.
- I tube B mix 61,5 mL CaCl 2-løsning (2 M), med 18,5 mikrogram lentivector DNA og 9,25 mikrogram psPAX2 og 9,25 mikrogram pMD2.G. Juster volumet til 600 ml med steril kultur klasse H 2 O.
- Legg løsning fra rør B dråpevis til rør En stund virvling. Inkuber transfeksjon blandingen i 15 minutter ved RT.
- Legg transfeksjon blanding nøye slippe lurt å oppkjørte 293T celler på 100 mm fatet. ENfter 5-6 timers fjerne medium og erstatte med 10 ml virusproduksjon medium. Plasser retter tilbake i inkubatoren ved 37 ° C.
Merk: Vær forsiktig når du tar ut og setter medium siden 293T celler lett løsner fra fatet. Mellom endring 5-6 timer etter transfeksjon er avgjørende, ettersom langvarig eksponering for klorokin er toksisk for cellene. - Følgende morgen, forsiktig fjerne og kast medium og erstatte med 7 ml virusproduksjon medium.
- Følgende morgen høste den første batch av virusholdig medium. Aspirer medium og samles i en 15 ml konisk tube. Igjen, legge 7 ml virusproduksjon medium på cellene. Oppbevares virusholdig medium i kjøleskapet til den andre parti er høstet neste dag.
- Den neste morgen Aspirer den andre parti av virusinneholdende medium å tilsette det til 15 ml konisk rør inneholdende den første batch. 293T celler kan nå kastes. Filtervirusinneholdende medium gjennom et 0,45 um suraktivt middel fritt celluloseacetat -membrane filter. Delmengde filtreres, virusholdig medium og oppbevar ved -80 ° C for videre bruk.
Merk: Virusproduksjon kan også utføres i 6-brønners skåler. Skalere ned volumer og celle tall tilsvarende.
4. Fibroblast Transduksjon med 4 Faktorer og mCherry kontroll Vector
Merk: Alle trinn utføres i en biologisk sikkerhetsnivå to anlegg.
- For en skjematisk fremstilling av den eksperimentelle omrisset se figur 1. Tin opp en delmengde av primær rtTA-MEFs og plate 3,33 x 10 5 celler per brønn i en 6-brønners skål i et totalvolum på 2 ml av MEF media. Forbered minst 3 brønner og merke dem med 4 faktorer (4F), mCherry og kontroll.
Merk: Alternativt kan villtype MEFs benyttes, når en rtTA uttrykker lentiviral vektor tilsettes til lentivector cocktail under trinn 4.2. - Den påfølgende dagen etter celler fullt restituert fra cryoprebevaring, erstatte MEF media i de tre 6-brønner med 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) og 1 ml (kontroll) av Transduction media, henholdsvis. Tine en alikvot av PLV-Teto-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -Ets og -mCherry virus ved romtemperatur og tilsett 100 ul av hver virusholdige supernatant (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) i 4F brønnen.
Merk: Ved villtype MEFs, redusere volumet av forhåndsbelagte media med 100 mL og i tillegg legge til 100 mL av FUdeltaGW-rtTA- virus supernatant til 4F mix. - Tilsett 100 ul mCherry virusholdig medium til den godt merket med mCherry. Legg polybren til en endelig konsentrasjon på 8 ug / ml i hver brønn. Sett formen tilbake i inkubatoren ved 37 ° C og inkuberes MEFs O / N med virusinneholdende supernatant.
Merk: Ved villtype MEFs, redusere volumet av forhåndsbelagte media med 100 mL og i tillegg legge til 100 mL av FUdeltaGW-rtTA- virusholdig supernatant. - Neste morgen, fjern forsiktigvirusinneholdende medium og vaskes tre ganger med 2 ml PBS. Til slutt, tilsett 2 ml TS media (uten FGF4 / heparin).
Merk: omsatte MEFs kan enten brukes direkte for iTSC induksjons eksperimenter eller fryses for senere bruk.
5. Fibroblast til iTSC Conversion
Merk: Alle trinn utføres i laboratoriet plass lisensiert til biosikkerhetsnivå 2.
- Vask transduced MEFs to ganger med 2 ml PBS og etter å ha lagt 0,5 ml trypsin / EDTA løsning inkuber dem i inkubatoren i 3-4 min. Sjekk under et invertert mikroskop for riktig avløsning av cellene.
- Inaktivere trypsin ved å tilsette 1 ml TS medium. Overfør cellesuspensjonen til en 15 ml konisk rør og sentrifuger i 3 minutter ved 200 x g. Kast supernatanten og resuspender cellene i 2 ml TS medium. Bruk untransduced kontrollprøven for å telle cellene.
- Plate 4F-MEFs, mCherry-MEFs og untransduced kontroll MEFs hver ved en tetthet på 2 x 10 5celler pr 100 mm cellekulturskål i 10 ml TS medium inneholdende 2 ug / ml DOX (TS medium + FGF4 / heparin + DOX).
- Alternativt utføre transdifferensiering på mindre retter. Plate 3,6 x 10 3 celler per cm 2 på ønsket rett størrelse, skala volum tilsvarende.
- Den neste dag, ved hjelp av en epifluorescens mikroskop (ved hjelp av et 10X objektiv og et filter egnet for rød fluorescens-eksitasjon) overvåke ekspresjon av mCherry protein for å estimere transduksjon effektivitet.
Merk: Transduksjon effektivitet bør være nær 100%. Dersom økt celledød er tydelig etter transgenet induksjon betyr dette at Virustiteret var for høy. Transduksjon bør gjentas med redusert mengde av virusinneholdende medium. - Fra nå av endring media på alle rettene annenhver dag til dag 10 etter plating. Deretter mate celler med TS medium uten DOX (TS medium + FGF4 / heparin).
- Ved hjelp av en invertert mikroskop monitor forutseendet 'transdifferentiated områder' (se figur 2B og C) på 4F parabolen for opptil 3 uker. Slike kolonier bør ikke være synlig på de to kontroll retter (mCherry-MEFs og untransduced MEFs).
6. Isolering av Individuelle iTSC Lines
Merk: For trinn 6.3 kreves ikke en vev kultur hette. Det anbefales å tørke ned invertert mikroskop med 70% etanol for å minimere sjansene for bakteriell forurensning. Individuelle iTSC kolonier kan isoleres mellom dager 21 og 28 dager etter transdifferensiering.
- Legg 40 mL av 0,05% trypsin / EDTA-løsning i 12 brønner på en 96 U-bunn godt fatet og sett formen på is.
- Før koloni isolasjon, aspirer medium på 4F-MEF transdifferensiering parabolen. Vask cellene en gang med 10 ml PBS. Igjen, tilsett 10 ml PBS og sted fatet under en invertert mikroskop.
- Ved hjelp av en 100-mL pipette satt til 40 ul løfte individuelle kolonier, ved circling dem med pipettespissen og aspirering av flytende kolonien. Overføre celler fra en koloni som hver inn i en brønn av den fremstilte 96-brønners skål. Etter å plukke 12 kolonier plassere 96-brønners skål i inkubator ved 37 ° C i 5 minutter.
- Dissosiere celler ved å pipettere opp og ned flere ganger, og overføre cellesuspensjonen i en brønn av en 24-brønners skål med preparerte 500 mL av TS-CM-medium (30% TS friskt medium + 70% CM + FGF4 / heparin).
- Den følgende dag erstatte mediet med friskt TS-CM medium for å fjerne døde celler. Endre medium annenhver dag.
- Monitor for utseendet av epitel kolonier med lyse grenser (se figur 2). Når kolonier vises, kultur inntil 70% sammenflytende eller i opptil én uke og gradvis utvide på større retter. Fra nå av kultur celler som bona fide TSC-ene, i henhold til standard protokoller i serumholdig medium eller i serumfritt, definert media 3,5,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På fatet hvor transgen ekspresjon av det 4F er aktivert, celler raskt endre morfologi (sammenlign figur 2A og B). Rundt dag 14 - 21 distinkte områder transdifferentiated fremstå (to eksempler er gitt i figur 2B og C). Disse primære kolonier mangler typisk TSC morfologi; men når de er under kultivert, karakteristisk epitelial morfologi med tette kanter og lyse grenser sterkt minner om bona fide TSC-ene kommer ut (figur 2D). 4F-iTSCs flekken positive for trophoblast transkripsjon faktorer Cdx2 og Tfap2c (figur 2E). Disse iTSC linjene kan nå brukes for etterfølgende in vitro eller in vivo-analyser, dvs. in vitro differensieringsanalyser eller placentale chimerization eksperimenter.
Figur 1. Tidslinje av MEF til iTSC Conversion. Grafisk fremstilling av transdifferensiering av MEFs inn iTSCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative Endringer i morfologi Under MEF til iTSC konvertering.
(A) mikrofotografi av rtTA-MEFs. (B) Mikroskopbilde av transdifferentiated 4F-MEFs. Eksempel på en transdifferentiated område, merket med rødt. (C) eksempel 2 i en transdifferentiated koloni på dag 21 av transdifferensiering etter ti dager DOX induksjon i 4F-MEFs. Område egnet for sub-dyrking uthevet i rødt. (D) Mikroskopbilde av 4F-iTSCs etter sub-dyrking. Alle skala barer indikerer 100 mikrometer. Bilder var tAken på et invertert mikroskop ved hjelp av et 10X objektiv og fasekontrast. (E) Immunofluorescens farging mot transkripsjonsfaktorer Cdx2 og Tfap2c i 4F-iTSCs. Kjerner er farget med Hoechst. Skala barer indikerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den 4-faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) basert transdifferensiering protokoll som presenteres her gir en pålitelig metode for å generere trofast konvertert iTSCs fra mus embryonale fibroblaster. Videre er metoden også for post-natal hale fibroblaster, selv med en nedgang i effektivitet sammenlignet med embryonale fibroblaster 3. Generelt, kvaliteten på primær fibroblaster er en kritisk faktor for transdifferensiering utfall og omsorg bør tas for å bruke tidlige passasje cellene (passasje 02:58).
Styrken av denne protokollen er bruken av doxycycline-induserbare vektorer, noe som gjør det mulig for tidsmessig styring av transgene uttrykk. Dette muliggjør generering av stabile iTSC linjer som aktiverer den endogene transkripsjonsfaktor nettverk, opprettholde TSC skjebne uavhengig av transgene uttrykk. Dette er i motsetning til tidligere publiserte protokoller, som beskriver induksjon av TSC skjebne fra embryonale stamceller, en fremgangsmåte that til dags dato gir bare ufullstendig omprogrammerte trophoblast stamcelleliknende celler 1.
Imidlertid er en kjent begrensning av protokollen som er beskrevet her er variabelt antall nye transdifferentiated kolonier, noe som gjør det vanskelig å forutsi den transdifferensiering effektivitet. Disse begrensningene skyldes flere høyt variable faktorer, som er avgjørende for den transdifferensiering resultat: transduksjon effektiviteten av de enkelte lentivirale vektorer, mengden av spredning av utgangscellepopulasjon, og mengden av celledød i løpet av transdifferensiering. Under visse omstendigheter transdifferentiated iTSC kolonier klarer å dukke opp. I dette tilfellet er mediet og reagenser testes for deres evne til å støtte ekte TSC kultur, før deres anvendelse i iTSC generasjon. I tillegg kan transduksjon med 4F kan titreres, ettersom altfor store mengder av transgene ekspresjon fører til celledød. Generelt, sub-dyrkning av individuell iTSC lines krever litt øvelse. I det tilfelle at vanskeligheter med sub-kultur av iTSCs forekomme (f.eks., Sub-dyrkede celler mislykkes i å opprettholde selvfornyelse og i stedet spontant skille), enkle isolerte kolonier kan alternativt belagt på kjøkkentøy med 50% celletetthet på vekst inaktivert mater celler for å understøtte vekst og festing av celler. De iTSC linjer kan deretter gradvis avvent fra brett under påfølgende aging. Av notatet, har vi ikke lykkes i direkte konvertering MEFs inn iTSCs bruker definerte TX mellom forhold, siden TX medium bare støtter etablert iTSC / TSC linjer.
Så langt er den protokoll for iTSC induksjon fra fibroblaster bare etablert for murine celler. Derfor vil det nå være av stor interesse for å tilpasse denne protokollen til andre arter og aktivere avledning av iTSC linjer fra menneske eller andre modellsystemer. Videre vil analyse av de nøyaktige mekanismene for fibroblast å iTSC konvertering gi ny innsikt i naturenav somatiske versus ekstra-embryonale avstamning barriere og hjelp til å forstå prinsippene i celle skjebne besluttsomhet under normal og patologisk utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
