Abstract
Trophoblast Stammzellen (TSZ) entstehen als Folge der ersten Zellschicksal Entscheidung in Säugetierentwicklung. Sie können in vitro kultiviert werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu halten und in alle Subtypen des Trophoblasten lineage, äquivalent zu der in vivo zu differenzieren , um den fetalen Teils der Plazenta - Zellpopulation stammen führt. Deshalb bieten TSCs ein einzigartiges Modell Entwicklung der Plazenta und embryonale gegen außer embryonale Zellschicksal Entscheidung in vitro zu studieren. Von der Blastozysten-Stadium ab, eine deutliche bestehend epigenetische Barriere von DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen trennt eng beide Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll um alle Funktionen der Linie Barriere durch transiente Überexpression von trophoblast Schlüsselregulatoren überwinden Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 in murinen embryonalen Fibroblasten. Die trophoblast induzierten Stammzellen sind in der Lage selbst zu erneuern und sind nahezu identisch abgeleitet trophoblast Stammzellen Blastozyste in Bezug auf die Morphologie, Marker Genexpression und Methylierungsmuster. Funktionelle in vitro und in vivo - Assays bestätigen , daß diese Zellen entlang der Trophoblast lineage Erzeugung polyploid Trophoblasten Riesenzellen und chimerizing die Plazenta , wenn sie in Blastozysten injiziert zu differenzieren können. Die Induktion von Trophoblast Stammzellen aus somatischen Gewebe eröffnet neue Wege genetischen und epigenetischen Merkmale dieser extraembryonale Linie zu studieren und bietet die Möglichkeit, trophoblast Stammzelllinien ohne Zerstörung des jeweiligen Embryo zu erzeugen.
Introduction
Vor kurzem wurde eine Studie mehrere Ansätze von embryonalen Maus-Stammzellen zu vergleichen Stammzellen Umwandlung in Trophoblasten hat ergeben, dass in allen untersuchten Systemen Linie Umwandlung unvollständig geblieben. Anstelle von induzierten Trophoblasten Stammzellen (iTSCs) so Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen genannt wurden generiert 1 einem Speicher des Zellschicksals Herkunftshalte. Hier verfolgen wir einen anderen Ansatz der ITSC Generation. Ähnlich wie bei der direkten Induktion von pluripotenten Stammzellen , die aus murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) 2, haben iTSCs wurde von differenzierten somatischen Gewebe direkt umgesetzt. Zunächst identifizierten wir 12 Kandidaten Faktoren induzieren TSC Schicksal, wenn sie in MEFs überexprimiert. Später, die Faktoren Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 wurden für die ITSC Induktion 3 notwendig und ausreichend zu sein , identifiziert. Gleichzeitig fand eine andere Gruppe unabhängig Tfap2c, Gata3 und Eomes ausreichend, um MEFs zu konvertieren in iTSCs. Jedoch, dassStudie, die Zeit für die Transgen - Expression erforderlich ist , deutlich länger im Vergleich zu unserer Studie verschiedene Umwandlungskinetik anzeigt, wenn Ets2 vom transdifferentiation Cocktail 4 abwesend ist.
Herkömmliche fötalem Rinderserum (FBS) enthält Kultur induziert und Blastozysten abgeleitet Trophoblast Stammzellen beruht auf der Anwesenheit von Faktoren , die durch Wachstumsinaktivierten MEFs sezerniert 5,6. Während der Induktions ITSC werden diese Faktoren durch MEFs vorgesehen, die die vollständige Kombination von Transgenen fehlt und die nicht transdifferentiation laufen. Sobald jedoch einzelne ITSC Kolonien sind subkultiviert, benötigen sie Medien, die durch das Wachstum-inaktivierten MEF vorkonditioniert wurde. Von da an iTSCs können nach Standardprotokollen wie Blastozysten abgeleitet TSCs kultiviert und behandelt werden. Bemerkenswert ist , im Gegensatz zu Tanaka et al. 5, wir routinemßig Kultur TSCs und iTSCs ohne Gelatinieren Zellkulturschalen.
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Protocol
AZ 84-02.04.2013: Alle Maus-Experimente wurden mit der Zustimmung der lokalen institutionellen Tierpflegegremien (Landes fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [Zulassungs ID-Nummer nach dem deutschen Gesetz des Tierschutzes und im Einvernehmen durchgeführt .A428]).
1. Medienvorbereitung
- Bereiten 293T-Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin / Streptomycin (1x).
- Bereiten MEF Medium: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, Penicillin / Streptomycin (1x).
- Bereiten TS-Medium (w / o FGF4 / Heparin): Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (Stammzellkultur-Qualität), Penicillin / Streptomycin (1x), L-Glutamin (2 mM ), Natriumpyruvat (1 mM), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM).
- Bereiten Sie TS-Medium mit FGF4 / Heparin (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) FBS (StammzellKulturqualität), Penicillin / Streptomycin (1x), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 & mgr; g / ml Heparin.
Anmerkung: FGF4 und Heparin werden direkt in die Medien unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. - Vorbereitung TS-CM mit FGF4 / Heparin (TS-CM + F4H): 70% MEF Anlage TS Medium + 30% frisch hergestellten TS-Medium + 25 ng / ml FGF4, 1 & mgr; g / ml Heparin.
Anmerkung: FGF4 und Heparin werden direkt in die Medien unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. - Bereiten Sie Transfektionsmediums: Erweiterte DMEM, 2% (v / v) FBS (Stammzellkulturqualität), L-Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1x).
- Bereiten Sie Virus-Produktionsmedium: Erweiterte DMEM, 5% (v / v) FBS (Stammzellkulturqualität), L-Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1x).
2. murine embryonale Fibroblasten-Ableitung
- Set timed Paarungen wt 129S2SV Frauen mit und homozygote männlichen R26 :: rtTA Mäuse (Stamm Name; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Am E13.5 Opfer Mäuse durch Genickbruch und zu isolieren primären murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) nach Standardprotokollen 8. Danach Platte Zellen aus einem Embryo auf einem 150-mm-Schale in MEF-Medien.
- Sobald primäre MEF Kulturen Konfluenz auf 150-mm-Schalen erreichen, waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml PBS und 4 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung. Inkubieren Geschirr für 3 bis 4 min in den Inkubator bei 37 ° C.
- Nach der Inkubation zu überprüfen, ob Zellen von der Schale abgelöst einem inversen Mikroskop (mit einem 10fach-Objektiv) verwendet wird. 5 ml MEF Medien Trypsinierung zu stoppen und Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen sammeln.
- Pool Zellsuspension aus mehreren Gerichten und sammeln in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge Zellsuspension für 3 min bei 200 xg und 10 ° C.
- Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in FBS, enthaltend 10% (v / v) Dimethylsulfoxid. Frieren MEFs in Aliquots für die weitere Verwendung.
Hinweis: Alternativ können Sie auch Wildtype primäre MEFs; jedoch muss eine zusätzliche lentiviralen Vektor exprimierenden rtTA zusammen mit den anderen lentiviralen Vektoren transduziert werden (zum Beispiel unter Verwendung des FUdeltaGW-rtTA Plasmid durch Maherali et al. 9). - Herstellung von MEF Anlage TS - Medium
Hinweis: Vor der Umwandlung Experimente, MEF Anlage (CM) TS Medien vorbereitet werden muss, die für die Subkultur der einzelnen ITSC Linien erforderlich ist (beschrieben in Abschnitt 6).- Plate 1 x 10 7 mitotisch inaktivierten MEF pro 150 - mm - Schale in MEF Medium auf gewünschte Anzahl an Gerichten. Inaktivieren MEFs durch γ-Bestrahlung mit einer Dosis von 9 Gy.
Hinweis: Die Ausbeute pro 150 mm Schale ca. 60 ml CM ist. - Der Tag nach der Plattierung, absaugen und MEF Medium verwerfen und 20 ml hinzufügen frisch TS-Medium hergestellt (ohne FGF4 / Heparin) auf jede Schale von mitotisch inaktivierten MEF und Ort Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C.
- Nach InkubationTS-Medium für drei Tage auf mitotisch inaktivierten MEF, sammeln Medium in 50 ml konischen Röhrchen. Filtermedium durch ein 0,2-um-Filter und fahren Sie mit 2.6.4. Ersetzen CM mit 20 ml frischem Medium TS zur Herstellung einer weiteren Charge von CM.
Hinweis: Mitotisch inaktivierten MEF für CM Vorbereitung bis zu drei Mal verwendet werden. - Aliquotieren 35 ml gefiltertes CM in 50 ml konischen Röhrchen und bei -20 ° C bis benötigt. Nach dem Auftauen 15 ml frisch hergestellten TS-Medium um 70% TS-CM und lagern bei 4 ° C zu erhalten, für bis zu einem Monat.
- Plate 1 x 10 7 mitotisch inaktivierten MEF pro 150 - mm - Schale in MEF Medium auf gewünschte Anzahl an Gerichten. Inaktivieren MEFs durch γ-Bestrahlung mit einer Dosis von 9 Gy.
3. Lentivirale Vector Produktion in 293T-Zellen
Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt.
- Vor der Umwandlung Experimente, lentivirale Vektoren für die Doxycyclin (DOX) abhängig Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 und mCherry vorzubereiten. Für jede Lentiviren, Co-transfizieren mit 293T-Zellen diejeweiligen lentiviralen Transfervektor zusammen mit einem Verpackungs Plasmid und einem VSV-G-exprimierenden Plasmid Hülle (für Informationen Plasmid zu den Materialien siehe Tabelle).
Hinweis: Für hilfreiche Informationen in Bezug auf die Produktion Virus Gavrilescu beziehen et al . 10. Obwohl es Retro Produktion beschreibt auch, allgemeine Bemerkungen in Bezug auf Qualität von 293T-Zellen und Plasmid-DNA sind wahr für Lentiviren Produktion.
VORSICHT: Geeignete Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden müssen, wenn sie mit lentiviralen Vektoren und Arbeit Arbeit hat in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt werden. - Coat fünf 100 mm-Schalen mit Poly-L-Lysin (100 & mgr; g / ml) Lösung, die durch Abdecken der Gerichte mit 5 ml der Lösung und Schaukel sanft Beschichtungslösung gleichmäßig verteilen. Die Schalen werden wieder in den Inkubator bei 37 ° C für 30 min. Nach 30 absaugen Beschichtungslösung min und spülen Geschirr einmal mit PBS.
- Tafel 7 x 10 6 293T Zellen pro Schale in 10 ml 293T-Zellmedien, swirl Gerichte gleichmäßig Zellen und Platz Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C zu verteilen.
- Am nächsten Morgen, Wachstumsmedium mit 5 ml Transfektionsmediums ersetzen. In 6 ul einer 1,000x Lager von Chloroquin-Lösung (25 mM) und Platz Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C.
- Inzwischen bereiten Transfektionsgemischs:
- Für jeden lentiviralen Vektor zwei 5 ml Reaktionsgefäße herzustellen, die mit A und B.
- In 600 ul 2x HEPES-gepufferte Salzlösung (HBS) auf das Rohr A.
- In Rohr B - Mix 61,5 ul CaCl 2 - Lösung (2 M), mit 18,5 ug lentivector DNA und 9,25 ug psPAX2 und 9,25 ug pMD2.G. Stellen Sie die Lautstärke auf 600 & mgr; l mit sterilem Kulturqualität H 2 O.
- In Lösung von Rohr B tropfenweise zu Rohr A während verwirbelt. Inkubieren Transfektion Mischung 15 min bei RT.
- In Transfektionsgemischs fallen sehr sorgfältig weise auf die vorbereiteten 293T-Zellen auf der 100-mm-Schale. EINfter 5 bis 6 h entfernen Medium und ersetzen mit 10 ml Virus-Produktionsmedium. Platzieren Geschirr wieder in den Inkubator bei 37 ° C.
Hinweis: Seien Sie vorsichtig beim Entfernen und Ersetzen Medium, da leicht 293T-Zellen aus der Schale lösen. Medienwechsel 5-6 Stunden nach der Transfektion ist von entscheidender Bedeutung, da längere Exposition gegenüber Chloroquin auf die Zellen toxisch ist. - Am nächsten Morgen, sorgfältig entfernen und zu entsorgen Medium und mit 7 ml Virus-Produktionsmedium ersetzen.
- Am nächsten Morgen ernten die erste Charge von virushaltigen Medium. Absaugen Medium und sammeln sich in einem 15 ml konischen Röhrchen. Wieder 7 ml Virus-Produktionsmedium auf die Zellen hinzufügen. Shop virushaltige Medium im Kühlschrank, bis die zweite Partie am folgenden Tag geerntet wird.
- Am nächsten Morgen die zweite Charge von virushaltige Medium absaugen es zu den 15 ml konischen Röhrchen, das die erste Partie Zugabe. 293T-Zellen können nun verworfen. Filter virushaltige Medium durch einen 0,45 & mgr; m surfactant freie Celluloseacetat -Membran Filter. Aliquot filtriert, virushaltige Medium und bei -80 ° C zur weiteren Verwendung.
Anmerkung: Die Virusproduktion kann auch in 6-Well-Platten durchgeführt werden. Nach unten skalieren Volumen und Zellzahlen entsprechend.
4. Fibroblast Transduction mit 4 Faktoren und mCherry Steuervektor
Hinweis: Alle Schritte werden in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt.
- Für eine schematische Darstellung der experimentellen Umriss siehe Abbildung 1. Auftauen eine aliquote Menge von primären rtTA-MEFs und 3,33 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well - Platte in einem Gesamtvolumen von 2 ml MEF Medien plattieren. Bereiten Sie mindestens 3 Vertiefungen und beschriften mit 4 Faktoren (4F), mCherry und Kontrolle.
Hinweis: Alternativ können Wildtyp-MEFs verwendet werden, wenn ein rtTA exprimierenden lentiviralen Vektor zur lentivector Cocktail während 4,2 Schritt hinzugefügt wird. - Am folgenden Tag, nachdem die Zellen vollständig von cryopre erholtservation Ersetzen MEF Medien in den drei 6-wells mit 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) und 1 ml (Kontrolle) von Transduction Medien, respectively. Tauen Sie eine aliquote Menge von PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets und -mCherry Virus bei RT und fügen 100 ul jeder Virus enthaltenden Überstand (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) in den 4F gut.
Hinweis: Bei Wildtyp-MEFs, reduzieren Volumen von vorplattiertes Medien von 100 & mgr; l und fügen Sie zusätzlich 100 ul FUdeltaGW-rtTA Virus auf das 4F Mischung enthaltende Überstand. - 100 l mCherry virushaltigen Medien auf die gut mit mCherry gekennzeichnet. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / ml in jede Vertiefung. Die Schale wieder in den Inkubator bei 37 ° C und Inkubation MEFs O / N mit virushaltigen Überstand.
Hinweis: Bei Wildtyp-MEFs, reduzieren Volumen von vorplattiertes Medien von 100 & mgr; l und fügen Sie zusätzlich 100 ul FUdeltaGW-rtTA virushaltige Überstand. - Am nächsten Morgen, sorgfältig entfernenvirushaltigen Medien und wasche dreimal mit 2 ml PBS. Schließlich 2 ml TS-Medien (ohne FGF4 / Heparin).
Anmerkung: Transduzierte MEFs kann entweder direkt zur ITSC Induktionsexperimente verwendet werden, oder zur weiteren Verwendung eingefroren.
5. Fibroblast zu ITSC Conversion
Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt.
- Waschen Sie transduzierten MEFs zweimal mit 2 ml PBS und nach Zugabe von 0,5 ml Trypsin / EDTA-Lösung sie im Inkubator inkubieren 3-4 min. Überprüfen Sie unter einem inversen Mikroskop für die ordnungsgemäße Ablösung der Zellen.
- Inactivate Trypsin von 1 ml Medium TS Zugabe. Übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren für 3 min bei 200 x g. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 2 ml TS-Medium. Verwenden Sie die untransduzierten Kontrollprobe, die Zellen zu zählen.
- Platte 4F-MEFs, mCherry-MEFs und untransduzierten Steuer MEFs jeweils in einer Dichte von 2 x 10 & sup5 ;Zellen pro 100 mm Zellkulturschale in 10 ml TS-Medium, enthaltend 2 & mgr; g / ml dox (TS-Medium + FGF4 / Heparin + DOX).
- Alternativ führen transdifferentiation auf kleinere Gerichte. Platte 3,6 x 10 3 Zellen pro cm 2 auf gewünschte Schale Größe, Umfang Volumen entsprechend.
- Am nächsten Tag, ein Epifluoreszenz-Mikroskop (mit einem 10fach-Objektiv und einen Filter geeignet für rote Fluoreszenzanregung) überwachen die Expression von mCherry Protein um Transduktionseffizienz zu schätzen.
Hinweis: Transduktionswirksamkeit sollte auf 100% betragen. Wenn erhöhte Zelltod nach Transgen Induktion offensichtlich ist bedeutet dies, dass Virus-Titer zu hoch war. Transduktion sollte mit verringerter Menge an Virus-haltigem Medium wiederholt werden. - Von nun an Wechselmedien auf allen Plattierung jeden zweiten Tag bis zum Tag 10 nach der Gerichte. Danach füttern Zellen mit TS-Medium ohne DOX (TS-Medium + FGF4 / Heparin).
- Unter Verwendung eines invertierten Mikroskops Monitor fürAussehen von 'transdifferentiated Gebiete "auf 4F Schale (auf 2B und C beziehen) für bis zu 3 Wochen. Solche Kolonien sollten sich nicht auf die beiden Kontrollschalen (mCherry-MEFs und untransduzierten MEF) sichtbar sein.
6. Isolierung einzelner ITSC Linien
Hinweis: Für Schritt 6.3 eine Gewebekultur Haube ist nicht erforderlich. Es wird empfohlen, den inversen Mikroskop mit 70% Ethanol abzuwischen, um die Chancen auf eine bakterielle Kontamination zu minimieren. Einzel ITSC Kolonien können zwischen den Tagen 21 und 28 Tagen nach der Transdifferenzierungs isoliert werden.
- In 40 ul 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung in 12 Vertiefungen einer 96-U-Boden-Well-Platte und die Schale auf dem Eis.
- Vor Kolonieisolierung, aspirieren Medium auf 4F-MEF transdifferentiation Gericht. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml PBS. Wieder, 10 ml PBS und Ort Schale unter einem inversen Mikroskop.
- Mit einer 100-ul-Pipette auf 40 ul eingestellt einzelnen Kolonien Lift, durch circling sie mit der Pipettenspitze und dem schwimmenden Kolonie Absaugen. Transfer Zellen einer Kolonie jeweils in eine Vertiefung der vorbereiteten Schale mit 96 Vertiefungen. Nach dem Pflücken 12 Kolonien platzieren Schale mit 96 Vertiefungen in den Inkubator bei 37 ° C für 5 min.
- Distanzieren Zellen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals und Transfer Zellsuspension in eine Vertiefung einer Schale mit 24 Vertiefungen mit vorbereiteten 500 ul TS-CM-Medium (30% Frisch TS-Medium + 70% CM + FGF4 / Heparin).
- Am folgenden Tag ersetzen Medium mit frischem TS-CM-Medium toten Zellen zu entfernen. Ändern Medium jeden zweiten Tag.
- Monitor für Auftreten von epithelialen Kolonien mit hellen Grenzen (siehe Abbildung 2). Sobald Kolonien erscheinen, Kultur bis 70% konfluent oder für bis zu einer Woche und nach und nach größere Gerichte erweitern auf. Von nun an Kulturzellen als bona fide TSCs, nach Standardprotokollen in serumhaltigen Medien oder in serumfreiem, definiertem Medium 3,5,11.
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Representative Results
Auf der Schale , wo die transgene Expression des 4F aktiviert wird, ändern sich Zellen schnell Morphologie (2A und B vergleichen). Um Tag 14-21 verschiedene transdifferentiated Bereiche entstehen (zwei Beispiele in 2B und C angegeben sind). Diese primären Kolonien fehlen typische TSC Morphologie; aber sobald sie subkultiviert, charakteristisch epitheliale Morphologie mit engen Kanten und helle Grenzen erinnert stark an bona fide TSCs entsteht (2D). 4F-iTSCs Fleck positiv für trophoblast Transkriptionsfaktoren Cdx2 und Tfap2c (Abbildung 2E). Diese ITSC Leitungen können nun für die anschließende in vitro verwendet werden oder in vivo - Analysen, dh in vitro Differenzierungsassays oder Plazenta Chimärisierung Experimenten.
Abbildung 1. Timeline von MEF zu ITSC Conversion. Grafische Darstellung von transdifferentiation von MEF in iTSCs. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Veränderungen der Morphologie Während MEF zu ITSC Conversion.
(A) Mikroskopische Aufnahme rtTA-MEFs. (B) : Mikroskopische Aufnahme transdifferentiated 4F-MEFs. Beispiel einer transdifferentiated Bereich, rot markiert. (C) Beispiel 2 einer transdifferentiated Kolonie am Tag 21 von transdifferentiation nach zehn Tagen Dox Induktion in 4F-MEFs. Die Umgebung geeignet für Unter Kultivierung rot hervorgehoben. (D) : Mikroskopische Aufnahme von 4F-iTSCs nach Subkultivierung. Alle Maßstabsbalken zeigen an 100 & mgr; m. Bilder wurden taken auf einem inversen Mikroskop ein 10fach-Objektiv und Phasenkontrast mit. (E) Immunfluoreszenzfärbung gegen den Transkriptionsfaktoren Cdx2 und Tfap2c in 4F-iTSCs. Nuclei sind mit Hoechst gefärbt. Maßstabsbalken zeigen an 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das 4-Faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) auf der Basis transdifferentiation Protokoll hier vorgestellten bietet eine zuverlässige Methode treu zu erzeugen umgewandelt iTSCs von embryonalen Maus-Fibroblasten. Ferner ist das Verfahren auch für die postnatale tail Fibroblasten, allerdings mit einem Rückgang der Effizienz 3 embryonale Fibroblasten im Vergleich zu. Im allgemeinen Qualität der primären Fibroblasten ist ein kritischer Faktor transdifferentiation Ergebnis und Sorgfalt sollte frühen Passage-Zellen (Passage zwei vor drei) zu verwenden, genommen werden.
Die Stärke dieses Protokolls ist die Verwendung von Doxycyclin-induzierbaren Vektoren, die für die zeitliche Steuerung der Expression des Transgens ermöglichen. Dies ermöglicht die Erzeugung stabiler ITSC Linien, die die endogene Transkriptionsfaktor Netzwerk aktivieren, die Aufrechterhaltung TSC Schicksal unabhängig von Transgen-Expression. Dies steht im Gegensatz zu zuvor veröffentlichten Protokollen, beschreibt die Induktion von TSC Schicksal aus embryonalen Stammzellen, ein Verfahren That bis heute ergibt nur unvollständig reprogrammierten Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen 1.
Jedoch ist eine bekannte Einschränkung des hier beschriebene Protokoll die variable Anzahl von Schwellen transdifferentiated Kolonien, was es schwierig macht, die transdifferentiation Effizienz vorhersagen. Diese Einschränkungen sind durch mehrere stark variable Faktoren, die für die Transdifferenzierungsergebnis kritisch sind: die Transduktionseffizienz der einzelnen lentiviralen Vektoren, die Menge der Proliferation der Ausgangszellpopulation, und die Menge an Zelltod während transdifferentiation. Unter bestimmten Umständen transdifferentiated scheitern ITSC Kolonien entstehen. In diesem Fall Medien und Reagenzien sollten auf ihre Fähigkeit zur Unterstützung der echten TSC Kultur getestet werden, vor ihrem Einsatz in ITSC Generation. Zusätzlich Transduktion mit dem 4F kann, da zu hohe Mengen an Transgen-Expression führt zu Zelltod titriert werden. Im allgemeinen Subkultivierung einzelner ITSC lines erfordert einige Übung. In dem Fall , dass Schwierigkeiten bei der Subkultur von iTSCs auftreten (dh., Versagen Unter kultivierten Zellen selbst zu erneuern und stattdessen spontan differenzieren zu halten), einzelne isolierte Kolonien alternativ auf Gerichte mit 50% Zelldichte von Wachstum inaktivierten Feeder plattiert werden kann Zellwachstum und die Anbindung von Zellen zu unterstützen. Die ITSC Linien dann werden allmählich von Feeder während der nachfolgenden Passagierbarkeit entwöhnt. Zu beachten ist, gelang es uns nicht in direkt MEFs in iTSCs mit definierten TX Medium Bedingungen, Umwandlung seit TX Medium ITSC / TSC Linien etabliert unterstützt nur.
Bisher ist das Protokoll für die ITSC Induktion von Fibroblasten nur für murine Zellen etabliert. Daher wird es jetzt von großem Interesse sein, dieses Protokoll auf andere Arten, sich anzupassen und Ableitung von ITSC Linien aus menschlichen oder anderen Modellsystemen ermöglichen. Des weiteren Analyse der genauen Mechanismen der Fibroblasten wird ITSC Umwandlung neue Einblicke in die Natur zu bieten hatdes somatischen gegen extraembryonalen Linie Barriere und Hilfe bei der Prinzipien der Zellschicksal Bestimmung während der normalen und pathologischen Entwicklung zu verstehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
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