Summary
Ce protocole décrit un colorant technique de transfert de chargement fluorescent scalpel qui mesure la communication intercellulaire par les canaux des jonctions lacunaires. Gap communication intercellulaire jonctionnelle est un processus cellulaire majeur par lequel l'homéostasie tissulaire est maintenue et la perturbation de cette signalisation cellulaire a des effets néfastes sur la santé.
Abstract
Ce protocole décrit un scalpel chargement fluorescent transfert de colorant par la technique (SL-DT) qui mesure la communication intercellulaire par des canaux de jonction d'intervalle, ce qui est un processus important intercellulaire par lequel l'homéostasie tissulaire est maintenue. Interruption de l' écart de jonction communication intercellulaire (GJIC) par des substances toxiques, des toxines, des médicaments, etc. a été liée à de nombreux effets néfastes sur la santé. De nombreuses maladies génétiques humaines basée ont été liées à des mutations dans les gènes des jonctions lacunaires. La technique SL-DT est un test fonctionnel simple pour l'évaluation simultanée de GJIC dans une grande population de cellules. L'essai comprend des cellules de pré-chargement avec un colorant fluorescent en perturbant brièvement la membrane cellulaire avec une lame de scalpel, dans une population de cellules. Le colorant fluorescent est alors autorisé à traverser à travers des canaux de jonction à fente des cellules voisines pendant un temps désigné. L'essai est ensuite terminée par l'addition de formaline aux cellules. La propagation du fluocolorant rescent par une population de cellules est évaluée avec un microscope à épifluorescence et les images sont analysées avec un certain nombre de progiciels morphométriques qui sont disponibles, y compris les logiciels libres trouvés sur le domaine public. Ce test a également été adapté pour les études in vivo en utilisant des tranches de tissu à partir de divers organes des animaux traités. Dans l' ensemble, le dosage SL-DT peut servir un large éventail de besoins pharmacologiques et toxicologiques in vitro, et peut être potentiellement adapté pour haut débit de mise en place des systèmes avec fluorescence automatisé d' imagerie et d' analyse au microscope pour élucider plusieurs échantillons dans un temps plus court.
Introduction
L'objectif global de cette méthode est de fournir une technique simple, complète et relativement peu coûteux pour évaluer la toxicité potentielle de composés. Ceci est une méthode in vitro qui peut être utilisé dans de multiples lignées cellulaires. Standard des laboratoires de biologie cellulaire équipés de microscopes à épifluorescence peuvent effectuer des recherches en utilisant ce test.
Notre connaissance de base des fonctions cellulaires a été très dépendante de tests biologiques in vitro, et est devenu un élément essentiel dans les évaluations toxicologiques des produits pharmaceutiques, des polluants de l' environnement, et les contaminants alimentaires nés. Malheureusement, il n'y a pas un seul système in vitro dans des essais biologiques qui peuvent globalement répondre aux demandes de toutes les évaluations toxicologiques. Beaucoup des essais in vitro sont conçus et optimisés pour évaluer ainsi que d' évaluer un critère biochimique ou moléculaire spécifique. Ceux-ci sont très souvent combinés dans un haut débit mis en place afin de refléter une perturbation d'uncertaine voie de transduction du signal, comme l' œstrogène-récepteur de signalisation 1. Cette stratégie a eu beaucoup de succès, mais le nombre étendu de voies de signalisation impliquées dans l'expression des gènes rend la tâche de choisir une voie de signalisation spécifique pour évaluer assez complexe. Hauts protocoles par-mis sont actuellement développés et utilisés pour mesurer simultanément de nombreuses voies de signalisation, qui a été une approche pour surmonter certaines des limites des analyses uniques. Cependant, toutes les voies de signalisation ont été incorporées avec succès dans des approches plus globales, ainsi que de nouvelles voies de signalisation sont constamment découvert que complique encore plus ce processus d'évaluation. Utilisation des numéros de vastes approches in vitro, particulièrement élevé par-mis des systèmes, pour les évaluations toxicologiques complètes sont également très coûteux et ne sont pas propices à la plupart enquêteur unique dirigé des projets de recherche.
GJIC est un tig de processushtly contrôlée par des changements dans la tension, la concentration de calcium, le pH, l' équilibre d'oxydoréduction, réglementées par les grandes voies de signalisation intracellulaire de transduction et les interactions avec la membrane et du cytosquelette protéines 2,3. Ainsi, l'inhibition de GJIC peut refléter différents types de stress cellulaire, la perturbation des différentes fonctions cellulaires, ou perturbations de différentes voies de transduction du signal. Une autre approche pour surmonter l'utilisation des limitées bioessais de transduction du signal est de tirer profit des phénomènes biologiques que beaucoup, sinon la plupart, les voies de transduction du signal sont en outre modulés par les systèmes coopératifs de signalisation intercellulaires par les canaux des jonctions lacunaires 4-8. Bien que les systèmes de signalisation intercellulaires sont aussi nombreux et sous contrôle des voies multiples, la signalisation intracellulaire par le biais des canaux de jonction de brèche est finalement fonction des canaux étant ouverts, partiellement fermés, ou complètement fermés. Ceci permet d'obtenir un point d'extrémité qui peut être facilement mesurée en utilisant diversesdans les systèmes d'essais biologiques in vitro 7. Considérant que le point de consigne homéostatique d'un tissu nécessite des canaux ouverts, déterminer l'effet de composés sur les jonctions lacunaires communication intercellulaire (GJIC) est une approche plus globale pour déterminer les effets toxiques potentiels de composés 4,8. En substance, ce phénomène biologique essentiel qui joue un rôle central dans la coordination de multiples événements de transduction de signaux contrôlant l'expression génique permet une évaluation générale des effets toxiques. Ainsi, des essais biologiques qui évaluent GJIC sont un excellent point de départ pour évaluer le potentiel toxique des composés.
Les techniques les plus utilisées pour évaluer les étendues GJIC sont basés sur le préchargement des cellules avec une sonde fluorescente, puis de contrôler la migration du colorant à partir de la cellule ou des cellules de charge des cellules adjacentes. Techniques de préchargement le colorant ont impliqué microinjection 9, gratter chargement 10, et les esters méthyliques des sondes 11 10. Plutôt que de l'éraflure plus invasive, la méthode scalpel de chargement de ce rapport implique un rouleau doux d'un scalpel avec une lame ronde à travers une monocouche de cellules qui minimisent les dommages invasive (figure 1). Les avantages de cette technique sont l'évaluation toxicologique d'une population de cellules plutôt que des cellules individuelles de l'essai de micro-injection. En outre, la simplicité de ce test permet la détection rapide de multiples plaques en un temps court alors que les méthodes utilisant des techniques et des techniques qui utilisent des esters méthyliques des sondes fluorescentes microinjection sont beaucoup plus de temps et nécessite le niveau de compétence considérablement plus élevé.
Bien qu'il n'y ait pas de méthode unique pour répondre à tous les besoins de l'étude GJIC; le dosage SL-DT est un test simple, relativement peu coûteux et polyvalent qui peutrépondre à de nombreux besoins pour les évaluations initiales des toxicités des différents composés. Les principaux avantages comprennent: la simplicité, aucun besoin particulier de l'équipement ou les compétences qui sont nécessaires pour d'autres méthodes telles que la microinjection, la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) test et activation locale moléculaires essais de sonde fluorescente, une évaluation rapide et simultanée de GJIC dans un grand nombre de cellules, propice à un haut débit mis en place avec la fluorescence automatisé imagerie par microscopie et l' analyse, ainsi que sa capacité d' adaptation pour les études in vivo.
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Protocol
Le protocole de cette étude a été approuvée par le Comité d'utilisation des National Institutes of Health Sciences du Japon, qui est l' endroit où les expériences in vivo ont été réalisées, des soins et des animaux pour assurer que les rats ont été traités avec humanité et en tenant compte de la réduction de la souffrance.
1. SL-DT bioessai
- Seed 3 x 10 5 cellules épithéliales de foie de rat WB-F344 SUR DES 35 diamètre des plaques de culture mm contenant Eagles modifiés moyenne plus 5% de sérum de veau fœtal, et la culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, l' humidité relative de 100% (RH), 5% CO 2.
- La culture des cellules jusqu'à ce qu'elles atteignent 100% de confluence (typiquement, de 2 jours) et effectuent le traitement expérimental désiré des cellules telles que décrites ci-dessous.
- Mener des expériences d'intervention Dose
- Ajouter 10 pi et 20 pi d'une solution à 2 mM de phénanthrène dans 100% d'acétonitrile et 4 pi, 6 pi et 8 pi d'une solution à 20 mM stock de phenanthrène dans 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pour chaque volume ajouté de solution de stock.
- Ajouter 4 pi, 6 pi 8 pi, 10 pi et 20 pi d'une solution à 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pour chaque volume ajouté de solution d'acétonitrile pour servir de contrôle du véhicule.
- Incuber les plaques pendant 15 min dans un incubateur réglé à 37 ° C, 100% HR et 5% de CO 2.
- Passez à l'étape 1.3.
- Conduite Temps Expériences de réponse
- Ajouter 7 ul d'une mM de solution mère 20 du phénanthrène à 100% d' acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pour chaque point de temps ( à savoir, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
- Ajouter 7 pi de 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pour chaque point de temps pour servir de contrôle du véhicule.
- Incuber les plaques pour chaque fois p désignémixte dans un incubateur à 37 ° C, 100% HR et 5% de CO 2.
- Passez à l'étape 1.3.
- Mener des expériences Temps de récupération
- Ajouter 7 ul d'une solution 20 mM dans du phénanthrène à 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pendant 15 min.
- Ajouter 7 ul d'acétonitrile à 100% pour trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pendant 15 min pour servir de contrôle du véhicule.
- Décanter le milieu contenant soit du phénanthrène ou de l'acétonitrile et de rinçage 3 fois chacun avec 3 ml de tampon phosphate salin (PBS).
- Ajouter 2 ml de milieu de croissance frais à chaque plaque et on incube pendant les temps de récupération désirées ( par exemple, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) , dans un incubateur à 37 ° C, 100 % d' humidité relative et à 5% de CO 2.
- Passez à l'étape 1.3.
- Les expériences de conduite du Mécanisme
- Ajouter l'inhibiteur de la transduction du signal, à savoir
- Ajouter 5 ul d'acétonitrile à 100% pour trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pendant 15 min pour servir de contrôle du véhicule.
- Ajouter 7 ul d'une solution 20 mM dans du phénanthrène à 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance ainsi que le D609 pendant 15 minutes supplémentaires.
- Ajouter 7 ul d'acétonitrile à 100% pour trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance, plus le 100% d'acétonitrile pendant 15 minutes supplémentaires pour servir de contrôle du véhicule.
- Passez à l'étape 1.3.
- Mener des expériences d'intervention Dose
- Jeter le milieu de culture soit en versant doucement sur le support ou par aspiration sous vide.
Remarque: Eliminer le milieu de culture contenant des déchets dangereux de façon appropriée. - Rincer les cellules trois fois avec 3 ml de PBS et soit décanter ou aspirez between rinçages.
- Introduire à la pipette 1 ml de 1 mg / ml de Lucifer Yellow colorant dissous dans du PBS (LY) dans chaque plaque de cellule.
- Précharger le colorant dans les cellules en douceur laminer une lame chirurgicale # 20 en acier avec un bord arrondi dans une population de cellules dans trois zones différentes de la plaque.
- Commencez par placer le scalpel perpendiculaire (90 °) et 5 mm du bord de la plaque de culture, puis rouler le scalpel sous cet angle perpendiculaire à environ un angle de 15 ° (voir Figure 1).
Note: Ceci est réalisé en pinçant le scalpel entre l'index et le pouce. Utiliser la gravité pour permettre au scalpel pour passer doucement des 90 ° à 15 ° positions (comme la lame arrondie roule simplement sur les cellules). Cette motion laissera une ligne d'indentation notable visuellement.
- Commencez par placer le scalpel perpendiculaire (90 °) et 5 mm du bord de la plaque de culture, puis rouler le scalpel sous cet angle perpendiculaire à environ un angle de 15 ° (voir Figure 1).
- Incuber les cellules avec la solution LY pendant 3 min à température ambiante.
- Décanter ou aspirer le LY et rincer trois fois avec 3 ml de PBS pour éliminer tous les extracellular colorant pour éliminer extracellulaire fluorescence de fond.
- Ajouter 0,5 ml de solution à 10% de formaline tamponnée au phosphate pour fixer les cellules.
Remarque: Après la fixation dans le formol, sécher à l'air les cellules et les stocker dans l'obscurité pendant jusqu'à deux ans avec photoblanchiment minimum du colorant LY. Lorsque cela est nécessaire, réhydrater avec une solution de formol à 10% pour visualiser le front du colorant fluorescent. - Afficher les cellules fixées à l'aide d'un microscope à épifluorescence équipé d'un cube dichroïque pour les pics d'excitation / d'émission de 428/536 nm, à un grossissement de 200X. Aligner toutes les plaques de telle sorte que la ligne d'entaille est parallèle au champ de vision horizontal.
Remarque: Un cube FITC dichroïque fonctionne bien.- Capturez l'image avec une caméra CCD et un logiciel de support.
- Ouvrez le logiciel de support pour la caméra CCD et d'utiliser les paramètres d'exposition automatique. Utilisez le bouton "capture" d'acquérir numériquement l'image. Enregistrez l'image sous .tif fichiers en utilisant le bouton "Enregistrer".
2. Adaptation de la SL-DT Assay au foie Tissue
- Retirez environ un cm tranche du lobe gauche du foie 2 x 2 à partir d' un 5 semaines, mâle Fischer 344 rats en utilisant des ciseaux de dissection et le placer sur une matière plastique pesez plaque recouverte de gaze humide 12.
- Introduire à la pipette 0,5 ml d'une solution de PBS contenant 1 mg / ml chacun jaune lucifer et de la rhodamine-dextrane (RD) sur la surface de la tranche de foie dans la matière plastique plateau de pesée.
Remarque: La RD est un colorant qui ne peuvent pas traverser les canaux de jonction gap et marquera les cellules qui ont été chargés. - Faire trois à cinq incisions d'environ 1 cm de long sur la surface de la tranche de foie qui a la solution de colorant dans la plaque pesez avec une lame tranchante, puis ajouter un colorant supplémentaire suffisant pour remplir les incisions.
- Incuber le tissu pendant 3 min à température ambiante sur le plateau de pesée en plastique.
- Rinçage trois fois avec 5 ml de PBS.
- Fixer le ove de tissurnight dans 30 ml de 10% de tampon phosphate formol dans un tube à centrifuger conique de 50 ml dans l'obscurité à la température ambiante.
- Le lendemain, lavez les tranches avec de l' eau, couper le tissu autour de l'incision avec la dissection des ciseaux dans 1 x 1 x 0,5 cm 3 bandes et ensuite utiliser des techniques standard pour intégrer les tranches dans de la paraffine 13.
- Section des tranches perpendiculaires à la ligne d'incision à l' épaisseur de 5 pm et stocker les échantillons dans l'obscurité jusqu'à ce que prêt à être visualisés en utilisant des techniques de coupes standards avec un microtome 13.
- Utilisez un microscope à épifluorescence équipé d'un appareil photo numérique CCD de visualiser et de capturer les images des fronts de colorant fluorescent selon l'article 1.10 7.
3. Quantifier GJIC
- Mesurer la propagation de colorant fluorescent en utilisant un package morphométrique de logiciel (par exemple, ImageJ).
- Cliquez sur l'onglet "Fichier" puis cliquez sur "ouvrir" pour ouvrir laimage enregistrée.
- Cliquez sur l'outil "main libre" dans la barre d'outils Tab pour tracer le contour du front de colorant.
- Cliquez sur l'onglet "Analyse" puis cliquez sur "Mesure".
Remarque: Cela va générer une valeur de zone dans une feuille de calcul, qui peut être copié dans d'autres programmes de la feuille de propagation si désiré.
- L'utilisation d'un programme de feuille de calcul, le calcul de la fraction de la commande (FOC) en divisant le domaine de la propagation de colorant dans la plaque expérimentale par la zone le colorant a voyagé dans la plaque de commande en utilisant l'équation suivante:
A e = superficie de la propagation du colorant dans les cellules exposées à une variable expérimentale, telles que les cellules traitées avec un produit chimique à la dose ou la durée spécifique
A c = surface de la propagation de colorant dans le contrôle, qui sont des cellules traitées avec le véhicule utilisé pour dissoudre le produit chimique d'intérêt
Remarque: Pour déterminer l'effet du véhicule,Ae serait le domaine de la diffusion du colorant dans les cellules traitées par le véhicule et A c serait le domaine de la diffusion du colorant dans les cellules non traitées par le véhicule. L'effet du véhicule doit être de préférence inférieure à 10%.
- Capturez l'image avec une caméra CCD et un logiciel de support.
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Representative Results
Interruption de GJIC a été largement utilisé comme un biomarqueur pour identifier des composés toxiques au niveau épigénétique non génotoxique de contrôle du gène qui induit des effets néfastes sur la santé 14. Par exemple, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des contaminants omniprésents dans l'environnement , mais varient dans leurs toxicités épigénétiques en fonction de leurs structures moléculaires 15. Les HAP de faible poids moléculaire se trouvent généralement à des concentrations relativement plus élevées que les HAP de poids moléculaire plus élevé dans de nombreux environnements divers tels que les sédiments contaminés de la rivière à celle de la fumée de cigarette 15,16. Phénanthrène est un exemple d'une HTAP de bas poids moléculaire qui possèdent trois cycles benzéniques avec une poche angulaire appelée la région de la baie. La figure 2 est une série d'images SL-DT de cellules épithéliales hépatiques de rat WB-F344 traités avec des doses croissantes de phénanthrène. Noter la diminution de la migration of le colorant fluorescent, jaune Lucifer, avec des doses croissantes. Les zones des images numérisées peuvent être déterminées en tant que fraction de la commande (FOC). La commande de la figure 2 sont des cellules traitées avec le solvant que l'HTAP a été dissous dans, à savoir l' acétonitrile. Typiquement, les expériences SL-DT sont effectuées en double ou en triple pour chaque essai avec un minimum de trois essais indépendants pour chaque paramètre expérimental, ce qui serait une dose dans cette expérience. Les valeurs de FOC peuvent alors être en moyenne, analyse statistique, puis graphiquement (voir Figure 3).
Des expériences similaires sont également régulièrement menées pour établir le temps pour l'inhibition induite par la substance toxique de GJIC, et la période de temps nécessaire pour récupérer de cette inhibition induite par la substance toxique de GJIC après que les cellules sont transférées dans un milieu exempt de substances toxiques. La figure 4 montre à la fois la réponse temporelle et la récupération de l' inhibition par le phénanthrène (Phe). Le dosage SL-DT peut également être utilisé pour déterminer les mécanismes sous - jacents par lesquels Toxique et les toxines dysréguler GJIC 4,16. Ceci est réalisé en cellules pré-incubation avec un inhibiteur pharmaceutique d'une voie de signalisation sélectionnée avant l'addition de l'agent toxique ou d'une toxine qui dysregulates GJIC. Si la substance toxique ou une toxine plus dysregulates GJIC en présence d'un produit pharmaceutique sélectionné qui bloque une voie de signalisation, cette voie est déterminé à être une voie réglementaire de GJIC, alors que ces voies peuvent être exclues si le toxique continue à dysréguler GJIC. La figure 5 illustre ce principe , dans lequel le 1-méthylanthracène (1-méthoxyéthyle), un autre trois HAP annelé qui inhibe GJIC, mais pas en présence D609, qui est un inhibiteur spécifique de la phosphatidylcholine assez C spécifique au phosphatidylinositol (PC-PLC). Ainsi, PC-PLC est jugé en tant que l'enzyme de signalisation candidat impliqué dans l'inhibition 1-MeA induite par des GJIC. Le rôle du PC-PLC a été validé avec futres expérimentation 4,16. Dans l'ensemble, les essais SL-DT sont tout à fait propice pour commencer le processus des réseaux de signalisation de cartographie impliqués dans les mécanismes de la façon dont les substances toxiques et les toxines inhibent (dysréguler) GJIC. Cette approche peut également être utilisée pour dépister les produits naturels qui peuvent bloquer une substance toxique ou une toxine du dérèglement de GJIC. Par exemple, le resvératrol, un antioxydant trouvé dans des concentrations élevées dans le vin et des produits d' arachide rouge peut empêcher 1-MeA d'inhiber GJIC (Figure 6).
Le dosage SL-DT a été adapté à des coupes de tissu provenant d' animaux, en particulier dans le foie 17. L' acide perfluorooctanoïque (PFOA) est un acide gras fluoré 8-carbone qui est un polluant environnemental persistant connu pour induire des cancers du foie 12,17. En utilisant la technique SL-DT APFO a été montré inhiber GJIC dans une étude in vitro F344rat WB-système de modèle de foie 18. Une in vivo étude de suivi dethermine que l' APFO a également inhibé GJIC dans le foie des rats F344 traités avec l' APFO, validant ainsi le système in vitro de modèles 12,17. La figure 7 sont des images fluorescentes à partir de cette expérience , suivi montrant la propagation du colorant dans les tissus hépatiques de rats traités avec le véhicule et le PFOA.
Figure 1: image de bande dessinée de l'étape scalpel colorant de chargement. Une illustration montrant que le processus scalpel de chargement consiste à rouler la lame plutôt que de trancher horizontalement à travers les cellules à réduire au minimum les dommages aux cellules.
Figure 2: des images microscopiques fluorescentes représentatives du colorant propage par les jonctions lacunaires. les cellules épithéliales WB-F344 foie de rat ont été traités pendant 15 min avec defroissement doses de phénanthrène, un PAH répandue trouve dans l'environnement. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Courbe dose de cellules épithéliales WB-F344 foie de rat phénanthrène traité réponse. Les zones de SL-DT images ont été calculées et ensuite rapporté comme une fraction de la commande, qui sont des cellules traitées avec le véhicule (acétonitrile). Chaque point de donnée représente une moyenne de trois expériences indépendantes et les barres d'erreur sont les écarts-types à la limite de confiance de 95% pour chaque dose après un temps d'exposition 15 min. Une fonction logistique à quatre paramètres a été utilisé pour ajuster la ligne à travers les points de données. S'il vous plaît click ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Le temps et le temps courbe des cellules épithéliales WB-F344 foie de rat phénanthrène traité réponse de récupération. Après inhibition totale de la GJIC après 10 minutes d'exposition, le milieu contenant du phénanthrène (Phe) a été commuté Phe-Free milieu puis les cellules ont été contrôlées pour la récupération de l'inhibition. Les zones de SL-DT images ont été calculées et ensuite rapporté comme une fraction de la commande, qui sont des cellules traitées avec le véhicule (acétonitrile). Chaque point de donnée représente une moyenne de trois expériences indépendantes et les barres d'erreur sont les écarts-types à la limite de confiance de 95%. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 5: Inhibition de GJIC par 1-méthylanthracène dépend de phosphatidylcholine phospholipase spécifique C. 1-méthylanthracène (1-MeA) est une HTAP répandue trouvé dans l'environnement. Le panneau de gauche représentent les cellules traitées avec le véhicule (acétonitrile, 0,35% v / v). Le panneau central représente les cellules épithéliales WB-F344 foie de rat traités pendant 15 minutes avec 70 uM 1-MeA. Le panneau de droite représente les cellules prétraitées première pendant 20 minutes avec 50 uM D609, un inhibiteur spécifique de la phosphatidylcholine phospholipase C, suivi par l'addition de 70 uM de 1-méthoxyéthyle pendant 15 minutes supplémentaires. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6: Le resvératrol a empêché l'inhibition de GJIC par 1-méthylanthracène. Le panneau de gauche représentent les cellules traitées avec le véhicule (acétonitrile, 0,35% v / v). Le resvératrol est un antioxydant trouvé dans le vin et arachide produits rouges. Le panneau central représente les cellules traitées pendant 15 min avec 70 uM 1-MeA. Le panneau de droite représente les cellules prétraitées première pendant 20 minutes avec 50 uM de resvératrol, suivie par l'addition de 70 uM de 1-méthoxyéthyle pendant 15 minutes supplémentaires. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Ex vivo SL-DT tests de GJIC en tranches de foie de mâles F-344 rats. Le panneau de gauche représente une tranche de tiss du foieue d'un rat traité avec le contrôle du véhicule, le diméthylsulfoxyde, pendant 24 heures. Le panneau de droite représente une tranche de tissu de foie d'un rat après administration intrapéritonéale de 100 mg / kg d'acide perfluorooctanoïque (PFOA) après 24 h. PFOA, un contaminant environnemental répandue, est une tumeur promotion proliférateurs de peroxysomes qui induit une hépatomégalie et a démontré pour bloquer les jonctions lacunaires en utilisant un modèle in vitro. L'incision chargé de colorant a été fait sur des tranches de foie à partir du véhicule et les animaux PFOA traités, qui ont ensuite été fixés, rognées et sectionnés. Reproduit de Environmental Health Perspectives 12. Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le dosage SL-DT est une technique simple et polyvalent dans la mesure GJIC, mais il y a plusieurs problèmes critiques qui devraient être pris en compte dans la conception de protocoles expérimentaux appropriés. Pour des mesures robustes de GJIC utilisant le test SL-DT il doit y avoir une bonne répartition de colorant de LY à travers les jonctions lacunaires des cellules. Au minimum, un délai suffisant doit être choisie pour assurer que le colorant se propage par huit ou plusieurs rangées de cellules à partir des cellules de scalpel chargé dans les deux sens. De plus, pour la facilité de la mesure de la distance que le colorant a migré à partir des cellules de scalpel chargé de sélectionner un facteur d'agrandissement qui assure la diffusion du colorant des plaques de commande remplit 70 à 90% du champ de vision. Pour les cellules épithéliales hépatiques de rat WB-F344, trois minutes d'incubation avec la solution LY est suffisante pour que le front de colorant se déplacer au-delà de quatre rangées de cellules, et un grossissement de 200X est optimal. Les cellules sont cultivées sur des plaques de 35 mm de diamètre, ce qui est tout à fait amendable à loading du colorant dans les cellules avec un scalpel. Cependant, les cellules peuvent être cultivées dans des petits godets, mais l'utilisation d'un scalpel est impossible, en particulier dans des plaques à 96 puits de culture. Pour les petits puits, utilisez un petit bord à bout rond de coupe qui peut tenir dans le puits, et encore, utiliser une action de roulement. Cette action de laminage est une étape critique car il est peu invasive et fournit une ligne très propre de chargement qui empêche les cellules de se déchirer et de créer un écart acellulaire typique du procédé de grattage d'origine. Alternativement, une aiguille d'acupuncture peut être utilisé dans lequel une petite torsion de l'aiguille fait un bon travail de colorant de charge dans les cellules.
D'autres types cellulaires peuvent être utilisés dans ce dosage. Cependant, la sélection de cellules et de comprendre le rôle des GJIC dans un type cellulaire particulier est importante dans la formulation des hypothèses appropriées ainsi que la conception des expériences. La première et la plus évidente étape consiste à élaborer des conditions de culture cellulaire dans lequel les jonctions gap fonctionnels sont expressed. Dans les types de cellules bien différenciées, qui remplissent des fonctions métaboliques spécifiques, les jonctions lacunaires jouent généralement un rôle dans la coordination des voies métaboliques entre les cellules contiguës. types de cellules bien différenciées ont limité, le cas échéant, les capacités prolifératives et les canaux jouent probablement un rôle métabolique spécifique de tissu qui dépend souvent de la morphologie et de la disposition spécifique des cellules. Par exemple, les myocytes cardiaques sont des cellules allongées où les jonctions lacunaires sont principalement alignés sur les disques intercalés, utilisant ainsi la méthode SL-DT nécessiterait l'alignement des cellules, ce qui peut être fait dans un plat rainuré. Ainsi, un examen minutieux doit être faite pour chaque type de cellule. Des études avec des cultures de cellules neuronales ne sont généralement pas confluentes et nécessitent également des points de contact spécifiques, ce qui rend l'utilisation des SL-DT essais de GJIC inappropriée et alternatif doit être utilisé.
Dans les types de cellules prolifératives, telles que des cellules souches et progénitrices précoces, GJIC joue un rôle plus importantdans la coordination de la cellule des événements qui contrôlent l'expression des gènes régulant les événements de signalisation mitogenes. Les cellules épithéliales du foie de rat WB-F344 utilisés dans ce protocole tombe dans cette catégorie. Gènes Gap de jonction sont essentiels au cours du développement des tissus et de l' entretien 19-21. Bien que les canaux des jonctions lacunaires sont exprimées et formées sur toutes les surfaces de la membrane plasmique des cellules, les cellules proliférantes sont très sensibles à des facteurs de croissance, qui inhibent GJIC. considérations critiques pour types de cellules prolifératives sont généralement orientés plus à la composition des médias. Les facteurs de croissance sont souvent en excès, en particulier dans un milieu indéfini contenant du sérum de veau foetal, et les jonctions gap des cellules peuvent être dans un état fermé. La meilleure façon d'établir GJIC dans ces cellules est de réduire ou supprimer les niveaux de sérum pendant 4 à 24 heures avant l'expérimentation, bien que 24 heures serait trop longue pour les cellules sans sérum comme ils Apoptose. Les cellules épithéliales WB-F344 foie utilisées pour les expériences présentées dans le tson journal ne sont pas trop sensibles au sérum sans avoir besoin de réduire les taux sériques. En revanche, les expériences en utilisant une lignée de cellules de souris C10 doit être dépourvu de sérum premier à établir GJIC 22. Bien que les taux sériques varient entre les deux types de cellules, de façon intéressante, les cellules C-10 ont répondu de manière très similaire aux isomères méthyliques d'anthracène 22,23.
Autres considérations pour des résultats de qualité comprennent la réalisation d'expériences à des doses non cytotoxiques. Les cellules doivent être contrôlées par microscopie à contraste de phase afin de déterminer les caractéristiques morphologiques saines attendues du type de cellule avant et après le traitement. Afin d'assurer que les effets d'un composé sur la fonction écart de jonction est pas due à une réponse cytotoxique générale, les essais de cytotoxicité pour chaque composé doit être fait en même temps et de la dose utilisée dans l'essai SL-DT. Mener des expériences pour déterminer si un effet inhibiteur d'un composé sur GJIC est réversible est également une bonne expérience pour au moins deux raisons. Mocomposés st testés inhibent réversiblement GJIC, mais s'il n'y a pas de reprise de GJIC, alors cytotoxicité pourraient être un facteur et d'autres tests seraient nécessaires. Toutefois, si GJIC est rétabli alors la dose et le temps testé étaient probablement pas cytotoxique. Il y a des implications biologiques pour l'inhibition réversible de GJIC. Les effets néfastes sur la santé de nombreuses substances toxiques et les toxines environnementales et alimentaires d'origine est un processus réversible. Par conséquent, la compréhension de cette réversibilité au niveau moléculaire est important. Si un composé inconnu ne réversiblement inhibe pas GJIC, les implications pour la santé d'un organisme pourrait être tout à fait différent de la plupart des autres agents et doit faire partie des calculs de risque.
Détermination de la dose et du temps impliqué dans l'inhibition de la GJIC est un processus itératif. Pour gagner du temps et de l'argent pour les fournitures de culture, la meilleure approche est de commencer à une dose élevée, qui dépend de la solubilité et le temps (généralement une heure, comme la plupart d'inhibitionse produit en moins de 15 min), puis réduire le temps et de la dose de moitié en un processus sage étape jusqu'à ce qu'il n'y a pas d'effet. S'il n'y a pas d'inhibition à une dose élevée à une heure, puis le double de la période de temps dans un processus sage étape. Les premières expériences peuvent être effectuées sur une seule plaque. Une fois que les estimations et les doses de temps générales sont établies, puis des études plus approfondies peuvent être efficacement conçus avec des tailles d'échantillon appropriées pour des analyses statistiques. Une caractéristique de la conception expérimentale serait d'utiliser la dose et du temps qui atteignent 75 à 100% d'inhibition. De toute évidence, les interprétations finales des résultats seront un facteur des paramètres ci-dessus. Toutefois, en déterminant d' abord un effet biologique, même si la dose et le temps peuvent ne pas être pertinents in vivo, les doses établies peuvent jouer un rôle dans des situations d'expositions professionnelles, ou aux populations générales exposées à d' autres facteurs qui affectent également GJIC avec additif potentiel ou des effets synergiques.
L'inhibition de la GJIC par la plupart des composés est généralement pas très variable et deux à trois répétitions (chaque répétition serait une plaque de culture ou bien) est suffisante pour générer des courbes de réponse dose et du temps. Toutefois, si la variabilité est élevé, plusieurs répétitions seraient nécessaires pour obtenir une valeur exacte pour une variable dépendante d'un procès indépendant donné. Bien sûr, au moins trois essais indépendants doivent être faites pour les analyses statistiques.
La simplicité de cet essai et l'évaluation des populations importantes dimensions de la cellule est un avantage pour de nombreuses applications. Ceci est particulièrement utile dans de nombreuses évaluations toxicologiques. Cependant, il existe des limitations des essais SL-DT, ce qui peut dépendre de plusieurs facteurs. La première est de savoir si cette technique est appropriée pour les cellules en cours d'étude. Cet essai ne fonctionnerait pas bien pour les cellules qui ne parviennent pas à haute confluence avec des contacts sporadiques tout au long de la plaque de culture ou bien. D'autres techniques, telles que la microinjection devraient être considered. En variante, le dosage SL-DT peut être modifié. Le succès dans des cellules individuelles de chargement a été réalisé avec une aiguille d'acupuncture, ce qui nécessite une légère action de torsion lors du chargement du colorant 7. La propagation du colorant serait radiale dans des situations plus confluentes ou amorphe par la culture cellulaire avec des contacts de cellules sporadiques. L'addition de la rhodamine dextrane (RD, 1 mg / ml) à la solution de colorant LY est recommandée pour les expériences où l'identification des cellules chargées serait difficile sans un marqueur (par exemple, RD). RD est trop grande pour traverser les canaux des jonctions lacunaires, identifiant ainsi les cellules qui ont été chargés. RD peut aussi être utilisé dans tout essai SL-DT, mais le scalpel laisse une empreinte sur le fond de la boîte d'identification, où les cellules sont chargées. Le dosage SL-DT est également peu propice à la mesure des changements dans GJIC entre les différents types de cellules comme la charge de colorant ne serait pas de discrimination entre les types de cellules. Encore une fois microinjection est la méthode de choix, mais la méthode aiguille d'acupuncture might également fonctionner si l'on peut cibler une cellule spécifique à l'aide d'un microscope.
Le dosage de la coopération métabolique est une autre méthode pour mesurer GJIC. Cette méthode a été l' un des premiers bioessai normalisé pour GJIC 24. Dans cet essai, des cellules V79 de hamster chinois de type sauvage (6-thioguanine sensibles) et des cellules 6-thioguanine résistantes ont été co-cultivées à des densités élevées, dans lequel la 6-thioguanine (6-TG), les cellules résistantes ne métabolise pas la 6-TG à un métabolite toxique, conférant ainsi la résistance. Co-culture avec les 6-TG cellules sensibles se traduit par le transfert du métabolite toxique au travers des jonctions lacunaires entraînant la mort de la cellule où l'inhibition de résultats GJIC dans le sauvetage de la 6-TG cellules résistantes, en empêchant le transfert du toxique métabolite 6-TG des cellules sensibles à la 6-TG. Bien que l'avantage de ce test est qu'il est peu invasive, un inconvénient majeur est qu'il nécessite une semaine pour l'achèvement, ce qui rend la dose et du temps étendue des évaluations dépendantes de toxiéquarris ainsi que des études mécanistes, etc. impraticables pour l' évaluation de nombreux produits chimiques.
Le dosage SL-DT est pas propice à des études mécanistes qui doivent suivre la migration des colorants à travers différents types de cellules, dans lequel microinjection est la méthode préférée. En variante, les cellules peuvent être préchargées avec l'ester méthylique de colorants fluorescents. Le chargement du colorant est une fonction d'estérases méthyliques intracellulaires qui hydrolysent le colorant lipophile dans sa forme la plus hydrophile, piégeant ainsi le colorant dans les cellules. Ceci est une façon moins invasive pour précharger la sonde fluorescente, mais la façon la plus commune pour mesurer la communication intercellulaire où toutes les cellules sont préchargés par cette méthode est le test de FRAP 11. L'avantage de FRAP est à nouveau la capacité d'évaluer les jonctions lacunaires dans des cellules individuelles, ce qui est excellent pour les études mécanistes. Cependant l'inconvénient de FRAP réside dans: l'incapacité de mesurer des populations de cellules pour les évaluations toxicologiques,la nécessité de cytomètres microscopes / laser sophistiqués et très coûteux, la nécessité d'une expertise technique hautement qualifiée, est modérément invasive parmi les radicaux libres produits par le laser, et pas propice à un débit élevé.
Plus récemment, une autre technique a été développée; l'activation locale de la méthode moléculaire sonde fluorescente (LAMP) 25, qui est basé sur une nouvelle génération de fluorophores coumarine en cage. Similaire à l'essai FRAP, toutes les cellules sont pré-chargés avec des colorants contenant un ester méthylique, cependant, ces colorants deviennent fluorescentes lors de l'illumination localisée ultérieure par lasers avec une faible dose de lumière ultraviolette, qui produit probablement ERO nettement inférieurs à ceux FRAP. Encore une fois, cet essai a les mêmes limites de l'analyse de la FRAP. D'autres progrès récents pour mesurer GJIC sont les préchargement et parachute techniques, qui impliquent également l'utilisation de colorants ester fluorescent méthyle. La technique de précharge consiste à suspendreles cellules pré-chargés avec une sonde fluorescente ainsi que les homologues déchargés et sont ensuite étalées et on les laisse former une monocouche confluente. La propagation du colorant peut alors être observée avec un microscope à épifluorescence 26. Dans l'essai de parachute, les cellules préchargés avec la sonde fluorescente sont superposées sur une monocouche de cellules non chargées, et la propagation du colorant est observée avec un microscope à épifluorescence 27. Là encore, les techniques ci-dessus sont techniquement plus difficile pour les analyses à haut débit et doit être immédiatement plaqué à confluence et nécessite un décalage dans le temps pour la réimplantation des cellules.
Dans l' ensemble, le dosage SL-DT est une technique relativement peu coûteuse, simple et polyvalent qui utilise des équipements, tels que les incubateurs CO 2 de cellules de culture, des armoires de biosécurité et microscope à épifluorescence, on trouve généralement dans la plupart des laboratoires de culture cellulaire. Avec un minimum d'expérience de nombreuses plaques peuvent être traitées en une journée, ce qui est propice fou le criblage de composés pour la toxicité, ainsi que pour les produits naturels qui préviennent ou inversent les effets des substances toxiques et des toxines. En outre, l'adaptation de ce test pour un débit élevé en utilisant des analyses de la robotique, des systèmes d'imagerie et d'analyse de la microscopie par fluorescence automatisées auront le potentiel pour dépister un grand nombre de substances toxiques et des toxines.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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