Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינת מודד תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער. תקשורת בין תאית גאפ junctional היא תהליך הסלולר עיקרי שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות מתוחזק שיבוש איתות התא הזה יש השפעות בריאותיות שליליות.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינה (SL-DT) טכניקת מודדת תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער, אורכת בין תאית עיקרית שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות נשמר. הפרעה של תקשורת בין תאית junctional הפער (GJIC) על ידי toxicants, רעלים, תרופות, וכו 'נקשר לנזקים בריאותיים רבים. מחל אנושיות גנטיות מבוסס רבות נקשרו מוטציות בגני צומת פער. טכניקת SL-DT היא assay שימושי פשוט עבור ההערכה סימולטני של GJIC ב אוכלוסייה גדולה של תאים. את assay כרוך תאים טרום העמסה עם צבע פלואורסצנטי ידי perturbing בקצרה קרום התא באמצעות להב סקלפל דרך אוכלוסייה של תאים. צבע פלואורסצנטי מותר אז לעבור דרך ערוצי צומת פער עם תאי שכנים במשך זמן מיועד. Assay הוא הסתיים אז על ידי תוספת של פורמלין אל התאים. ההתפשטות של fluoלצבוע rescent דרך אוכלוסייה של תאים נבחן עם מיקרוסקופ epifluorescence ואת התמונות מנותחות עם כל מספר של חבילות תוכנת morphometric זמינות, כוללים חבילות תוכנה חופשיות למצוא באתר הרשות הרבה. Assay זה גם הותאם ללימודי in vivo באמצעות בחתכי רקמה מאיברים שונים מחיות מטופלים. בסך הכל, assay SL-DT יכול לשרת מגוון רחב של במבחנה לצרכימים תרופתיים טוקסיקולוגית, והוא יכול להיות מותאם באופן פוטנציאלי למערכות הגדרת קצב העברת נתונים גבוהות עם הדמיה וניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי להבהיר יותר דגימות בתוך זמן קצר יותר.
Introduction
המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק טכניקה פשוטה, מקיפה וזולה יחסית להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של תרכובות. זוהי גישה במבחנה כי ניתן להשתמש שורות תאים מרובות. מעבדות ביולוגיה של התא תקן מצויד מיקרוסקופים epifluorescence יכול לערוך מחקר באמצעות assay.
הידע הבסיסי שלנו של תא פונקציות כבר תלוי מאוד bioassays במבחנה, הפך מרכיב חיוני בהערכות טוקסיקולוגית של תרופות, מזהמים סביבתיים, ומזהמים נולדים מזון. למרבה הצער, אין מערכת מבדק אחת במבחנה שיכולה לעמוד בדרישות מקיפות עבור כל ההערכות טוקסיקולוגית. רבי מבחני חוץ גופיית מתוכננים מותאמים להעריך וכן להעריך נקודות קצה ביוכימיים או מולקולריים ייחודית. אלה די קרובות משולבים תפוקה גבוהה להגדיר לשקף הפרעות שלמסלול הולכת אותות מסוימים, כגון קולטן אסטרוגן איתות 1. אסטרטגיה זו כבר די מוצלחת, אבל מספר הרב של מסלולי העברת אותות מעורבים ביטוי גנים הופך את המשימה של בחירת מסלול איתות ספציפית להעריך מורכב למדי. פרוטוקולים גבוהים דרך-לשים כיום מפותחים והשתמשו למדוד בו זמנית מסלולים רבים איתות, אשר כבר גישה כלשהו כדי להתגבר על כמה מן המגבלות של מבחני יחיד. עם זאת, לא כל מסלולי איתות שולבו בהצלחת גישות מקיפות יותר, פלוס מסלולי איתות חדשים מתגלים כל זמן זה מסבך עוד יותר תהליך הערכה זו. שימוש במספרים נרחבים של גישות במבחנה, גבוהה במיוחד דרך-לשים מערכות עבור ערכות טוקסיקולוגית מקיפות הם גם מאוד יקרות והם לא תורמים ביותר חוקר יחיד הוביל פרויקטים מחקריים.
GJIC הוא תהליך tightly בשליטת משינוי מתח, ריכוז סידן, pH, איזון חיזור, מוסדר על ידי מסלולים ואינטראקציות הולכת אותות תאיים גדולים עם חלבונים בממברנה ואת שלד התא 2,3. לכן, עיכוב של GJIC יכול לשקף סוגים שונים של מתח הסלולר, שיבוש תפקודים תאיים שונים, או הפרעות של מסלולי העברת אותות שונים. גישה נוספת כדי להתגבר על שימוש bioassays הולכת אות המוגבלות היא לנצל את התופעות הביולוגיות כי רבים, אם לא ביותר, מסלולי העברת אותות הם מווסתים עוד יותר על ידי מערכות איתות אינטר שיתופיות בערוצי צומת פער 4-8. בעוד שמערכות איתות אינטר תוכלנה למצוא שפע ותחת שליטת מסלול מרובה, האיתות אינטר בערוצי צומת פער היא בסופו של דבר פונקציה של הערוצים להיות פתח, סגורה חלקי או סגורה לחלוטין. זה מספק נקודת קצה שניתן למדוד בקלות באמצעות שוניםבמערכות מבדק במבחנה 7. בהתחשב בכך נקודת הסט ההומיאוסטטית של רקמות דורשת ערוצים פתוחים, קביעת השפעת התרכובות על תקשורת בין תאית junctional הפער (GJIC) הוא גישה כוללת יותר בקביעת השפעות רעילות פוטנציאליות של תרכובות 4,8. בעיקרו של דבר, תופעה ביולוגית קריטית זה שמשחק תפקיד מרכזי תיאום אירועים הולכים אותות מרובים שליטת ביטוי גנים מאפשרת הערכה רחבה של השפעות רעילות. לפיכך, bioassays כי להעריך GJIC מהווה נקודת התחלה מצוינת להעריך את הפוטנציאל הרעיל של תרכובות.
הטכניקות הנרחבות ביותר בשימוש על מנת להעריך GJIC מבוססות על preloading תאים עם בדיקת ניאון ולאחר מכן ניטור הנדידה לצבוע מהתא או התאים הטעונים לתאים סמוכים. טכניקות לטעון מראש לצבוע כללו microinjection 9, לגרד טעינת 10, ו מתיל אסטרים של חלליות 11 10. במקום השריטה פולשני יותר, השיטה טעינת אזמל דוח זה כרוך גליל עדין של אזמל עם להב עגול דרך בשכבה של תאים למזער נזק פולשנית (איור 1). היתרונות של שיטה זו הם הערכה טוקסיקולוגית של אוכלוסייה של תאים ולא תאים בודדים של assay microinjection. יתר על כן, את הפשטות של assay זה מאפשר זיהוי מהיר של הצלחות מרובות תוך זמן קצר ואילו שיטות שימוש בטכניקות microinjection וטכניקות המשתמשות אסטרים מתיל של בדיקות ניאון באופן משמעותי יותר זמן רב ודורשים משמעותי ברמת מיומנות גבוהה יותר.
למרות שאין שיטה אחת כדי לענות על כל הצרכים של לומדי GJIC; את assay SL-DT הוא assay פשוט, זול למדי תכליתי שיכוללפגוש רב של צרכי הערכות ראשוניות של רעילות של תרכובות שונות. יתרונות עיקריים כוללים: פשטות, אין צורך מיוחד עבור ציוד או מיומנויות שנדרשים שיטות אחרות כגון microinjection, שחזור פלורסנט לאחר photobleaching (FRAP) assay והפעלה מקומית של מבחני בדיקת ניאון מולקולריים, הערכה מהירה סימולטני של GJIC ב גדול מספר התאים, תורמת הגדרת קצב העברת נתונים גבוהות עם הדמיה וניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי, כמו גם ההסתגלות שלה ללימודי in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול עבור מחקר זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת ניצול של המכונים הלאומיים לבריאות למדעים של יפן, אשר שם את vivo בניסויים שנעשו, כדי להבטיח כי החולדות היו ליחס אנושי באשר להקלה של סבל.
1. SL-DT המבדק
- זרע 3 x 10 5 WB-F344 עכברוש כבד ותאי אפיתל על 35 מ"מ קוטר צלחות תרבות המכילות נשרים שונים בינוני פלוס 5% עוברי שור סרום, ותרבות התאים באינקובטור ב 37 ºC, 100% לחות יחסית (RH), 5% CO 2.
- התאים והתרבות עד שהם מגיעים 100 מפגש% (בדרך כלל, 2 ימים) ולנהל את הטיפול הניסיוני הרצוי של תאים כמתואר להלן.
- ניסויי מנת תגובה
- הוסף 10 μl ו 20 μl של פתרון המניות 2 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% ו -4 μl, 6 μl, ו -8 μl של פתרון המניה 20 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול עבור כל כרך נוסף של פתרון המניות.
- הוסף 4 μl, 6 μl, 8 μl, 10 μl, ו -20 μl של פתרון 100% של אצטוניטריל לשלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול עבור כל כרך נוסף של פתרון אצטוניטריל לשמש שליטה ברכב.
- דגירה צלחות במשך 15 דקות ב להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 100% לחות יחסית ו 5% CO 2.
- עבור לשלב 1.3.
- ניסויי תגובת התנהגות זמן
- להוסיף 7 μl של פתרון המניה 20 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול עבור כל נקודת זמן (כלומר, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 דק ').
- להוסיף 7 μl של אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול עבור כל נקודת זמן לשמש שליטה ברכב.
- דגירה צלחות עבור כל p השעה היעודהoint באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 100% לחות יחסית ו 5% CO 2.
- עבור לשלב 1.3.
- ניסויים Recovery Time
- להוסיף 7 μl של פתרון המניה 20 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול במשך 15 דקות.
- להוסיף 7 μl של אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול במשך 15 דקות כדי לשמש שליטה ברכב.
- למזוג המדיום המכיל גם את phenanthrene או אצטוניטריל ולשטוף 3x כל אחד עם 3 מ"ל של בופר פוספט (PBS).
- הוסף 2 מיליליטר של מדיום גידול טרי על כל צלחת לדגור על זמני התאוששות הרצויים (כלומר, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 דק ') באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 100 % RH ו 5% CO 2.
- עבור לשלב 1.3.
- ניסויי מנגנון ניהול
- מוסיפים את מעכבי הולכת אותות, כלומר
- הוסף 5 μl של אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול במשך 15 דקות כדי לשמש שליטה ברכב.
- להוסיף 7 μl של פתרון המניה 20 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול בתוספת D609 עבור 15 דקות נוספות.
- להוסיף 7 μl של אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול בתוספת אצטוניטריל 100% עבור 15 דקות נוספות כדי לשמש שליטה ברכב.
- עבור לשלב 1.3.
- ניסויי מנת תגובה
- מחק את מדיום התרבות או על ידי בעדינות ניגרת המדיום או על ידי יניקת ואקום.
הערה: השלך בינוני תרבות המכיל פסולת מסוכנת כראוי. - יש לשטוף את התאים שלוש פעמים כל אחד עם 3 מ"ל של PBS ואו למזוג או לשאוב between מי שטיפה.
- פיפטה 1 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל מומס לצבוע צהוב לוציפר PBS (LY) לתוך כל צלחת התא.
- טען מראש את הצבע לתוך התאים על ידי גלגול להב פלדה כירורגית 20 # עם קצה מעוגל בעדינות דרך אוכלוסיה של תאים בשלושה תחומים שונים של הצלחת.
- בגין על ידי הצבת האזמל בניצב (90 ° זווית) ו -5 מ"מ מהקצה של צלחת התרבות, ולאחר מכן לגלגל את האזמל מזווית בניצב זה לכ בזווית של 15 מעלות (ראה איור 1).
הערה: זו מושגת על ידי צובט את האזמל בין אצבע המורה לאגודל. השתמש הכבידה כדי לאפשר את האזמל ללכת בעדינות מן 90 ° עד 15 ° המיקום (כלהב מעוגל פשוט מתהפך התאים). תנועה זה תשאיר קו כניסה בולט ויזואלית.
- בגין על ידי הצבת האזמל בניצב (90 ° זווית) ו -5 מ"מ מהקצה של צלחת התרבות, ולאחר מכן לגלגל את האזמל מזווית בניצב זה לכ בזווית של 15 מעלות (ראה איור 1).
- דגירה התאים עם הפתרון LY עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- למזוג או לשאוב LY ולשטוף שלוש פעמים עם 3 מ"ל של PBS להסיר כל extracellular לצבוע לחסל קרינת רקע תאית.
- הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת פורמלין שנאגרו פוספט 10% כדי לתקן את התאים.
הערה: לאחר תיקון בפורמלין, אוויר יבש התאים ולאחסן בחושך במשך עד שנתיים עם photobleaching מינימלית של צבע LY. כאשר נדרש, רעננותם עם פתרון פורמלין 10% כדי להמחיש את חזית צבע פלואורסצנטי. - הצגת תאים קבוע באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מצויד קוביית dichroic עבור פסגות עירור / פליטה של 428/536 ננומטר בהגדלה של 200X. יישר כל הלוחות כך שהקו הזחה מקביל לשדה האופקי של חזון.
הערה: קוביית dichroic FITC עובד היטב.- ללכוד את התמונה עם מצלמת CCD ותוכנות תומכות.
- פתח את התוכנה התומכת עבור מצלמת CCD ו להשתמש בהגדרות חשיפה אוטומטית. השתמש בלחצן "ללכוד" לרכוש את התמונה באופן דיגיטלי. שמור את התמונה כפי .tif קבצים באמצעות כפתור "שמור".
הסתגלות 2. Assay SL-DT כדי רקמת הכבד
- הסר כ פרוס סנטימטר 2 x 2 מהאונה השמאלית של כבד מפני מספריים לנתיחת 5 בן שבוע, זכר פישר 344 עכברוש באמצעות ומניח אותו על פלסטיק לשקול מכוסה צלחת עם גזה רטובה 12.
- פיפטה 0.5 מ"ל של פתרון PBS המכיל 1 מ"ג / מ"ל כל אחד צהוב rhodamine-dextran לוציפר (RD) על פני השטח של הפרוסה בכבד פלסטיק לשקול צלחת.
הערה: RD הוא צבע כי לא יכול לעבור ערוצי צומת פער ויסמן התאים הועמסו. - לעשות שלושה עד חמישה חתכים כ 1 סנטימטר על פני השטח של הפרוסה הכבדה שיש לו את הפתרון לצבוע בצלחת לשקול עם להב חד ולאחר מכן להוסיף צבע נוסף מספיק כדי למלא את החתכים.
- דגירה הרקמה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר על פלסטיק לשקול צלחת.
- לשטוף שלוש פעמים עם 5 מ"ל של PBS.
- תקן את אובת הרקמותrnight ב 30 מ"ל של פורמלין שנאגרו פוספט 10% בתוך שפופרת צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל בחושך בטמפרטורת החדר.
- למחרת, לשטוף את פרוסות עם מים, לקצץ רקמות סביב החתך עם מספריים לנתח לתוך 1 x 1 x 0.5 ס"מ 3 רצועות ואז להשתמש בטכניקות מקובלות להטביע את הפרוסות 13 פרפין.
- סעיף הפרוס בניצב לקו החתך לעובי של 5 מיקרומטר ולאחסן את הדגימות בחושך עד מוכן להיות צלמו באמצעות טכניקות חתך רגילות עם 13 microtome.
- שימוש במיקרוסקופ epifluorescence מצויד במצלמה דיגיטלית CCD כדי לחזות ללכוד את התמונות של חזיתות צבע פלואורסצנטי לפי סעיף 1.10 7.
3. כימות GJIC
- מדוד את התפשטות צבע פלואורסצנטי באמצעות חבילת תוכנה morphometric (למשל, ImageJ).
- לחץ על הכרטיסייה "קובץ" ולאחר מכן לחץ "פתח" כדי לפתוח אתתמונה שמורה.
- הקישו על "כלי יד חינם" בלשונית כלי בר להתחקות אחר קווי המתאר של החלק הקדמי לצבוע.
- לחץ על הכרטיסייה "לנתח" ולאחר מכן לחץ על "מדוד".
הערה: זה יפיק ערך שטח בגיליון אלקטרוני, אשר ניתן להעתיק לתוך תוכניות בגיליון אלקטרוני אחרות, לפי צורך.
- באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים, לחשב את החלק היחסי של הביקורת (FOC) על ידי חלוקת השטח של התפשטות צבע בצלחת ניסיוני ע"י השטח לצבוע נסע בצלחת שליטה באמצעות המשוואה הבאה:
הודעת דואר = שטח של ההתפשטות לצבוע בתאים שנחשפו משתנים ניסוי, כגון תאים שטופלו כימיקל במינון מסוים או זמן
אזור c = של התפשטות לצבוע בבקרה, אשר הם תאים שטופלו רכב המשמש לפירוק כימי של עניין
הערה: כדי לקבוע את ההשפעה של הרכב,הודעת דואר יהיה באזור של ההתפשטות לצבוע בתאים שטופלו על ידי הרכב ו- C יהיה באזור של ההתפשטות לצבוע בתאים שלא טופלו על ידי הרכב. ההשפעה של הרכב רצוי להיות פחות מ -10%.
- ללכוד את התמונה עם מצלמת CCD ותוכנות תומכות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרעה של GJIC כבר נעשה שימוש נרחב כמו סמן ביולוגי לזיהוי תרכובות רעילות ברמה nongenotoxic, אפיגנטיים שליטה הגן שגורם להשפעות בריאותיות שליליות 14. לדוגמה, פחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAHs) הם מזהמים נפוצים של הסביבה אבל להשתנות רעילות אפיגנטיים שלהם כפונקציה של מבנים מולקולריים שלהם 15. PAHs המשקל מולקולרי הנמוך נמצא בדרך כלל בריכוזים גבוהים יחסית PAHs המשקל המולקולרי הגבוה בסביבות מגוונות רבות כגון משקעי נהר מזוהמים לזה של 15,16 עשן סיגריות. Phenanthrene הוא דוגמה של PAH משקל מולקולרי נמוך כי יש שלוש טבעות בנזן עם כיס זוויתי שנקרא באזור המפרץ. איור 2 הוא סדרה של תמונות SL-DT של תאי אפיתל כבד עכברוש WB-F344 שטופלו הגדלת מינון של phenanthrene. הערת ירידת o ההגירהf צבע פלואורסצנטי, לוציפר הצהוב, עם מינוני הגדלה. האזורים של תמונות סרוקות ניתן לקבוע כשבר בקרה (FOC). השליטה על איור 2 הם תאים שטופלו ממס כי PAH פורק ב, כלומר אצטוניטריל. בדרך כלל ניסויי SL-DT נעשים בשני עותקים או בשלושה עותקים עבור כל ניסוי עם מינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים עבור כל פרמטר הניסיון, אשר יהיה מנה בניסוי הזה. הערכים FOC אז יכול להיות בממוצע, ונותחו סטטיסטית, ולאחר מכן בגרף (ראה איור 3).
ניסויים דומים גם מתנהלים באופן שגרתי כדי לקבוע את זמן העיכוב נגרם toxicant של GJIC, ואת פרק הזמן הדרוש כדי להתאושש עיכוב toxicant נגרמת זו של GJIC לאחר התאים מועברים בינוני toxicant חינם. איור 4 מראה הוא את זמן התגובה והתאוששות העיכוב ידי phenanthrene (Phe). את assay SL-DT יכול לשמש גם כדי לקבוע את המנגנונים שבאמצעותם toxicant ורעלים dysregulate 4,16 GJIC. הדבר נעשה על ידי תאים טרום דוגר עם מעכב תרופות של מסלול איתות שנבחר לפני התוספת של toxicant או רעלן dysregulates GJIC. אם toxicant או רעלן כבר לא dysregulates GJIC בנוכחות של התרופות שנבחרו שחוסמת מסלול איתות, אז מסלול זה נקבע להיות למסלול רגולטורי מקוצר של GJIC, בעוד ניתן לשלול מסלולים כזו אם toxicant ממשיכה dysregulate GJIC. איור 5 מדגי עיקרון זה שבו 1-methylanthracene (1-MEA), עוד שלושה PAH טבעתי מעכבת GJIC, אבל לא בנוכחות D609, שהוא מעכב למדי ספציפי של C פוספוליפאז ספציפי phosphatidylcholine (PC-PLC). לפיכך, PC-PLC נשלטת בתור אנזים איתות מועמד מעורב 1-MEA-induced עיכוב של GJIC. תפקידו של PC-PLC יאומת עם further ניסויים 4,16. באופן כללי, המבחנים-DT SL הם תורמים די כדי להתחיל בתהליך של רשתות איתות מיפוי מעורבים המנגנונים של איך toxicants ורעלים לעכב (dysregulate) GJIC. גישה זו יכולה גם לשמש מסך עבור מוצרים טבעיים שיכולים לחסום toxicant או רעלן מ dysregulating GJIC. לדוגמא, רזברטרול, נוגד חמצון נמצא בריכוזים גבוהים במוצרי יין בוטנים אדומים יכול למנוע 1-MEA מ עיכוב GJIC (איור 6).
את assay SL-DT הותאם בחתכי רקמה מן החי, במיוחד בכבד 17. חומצה perfluorooctanoic (PFOA) היא חומצת שומן fluorinated 8-חמצני כי הוא מזהם סביבתי מתמיד ידוע לגרום סרטן הכבד 12,17. באמצעות טכניקת SL-DT PFOA הוצגה לעכב GJIC במערכת מודל כבד במבחנת WB-F344rat 18. Det מחקר in vivo ומעקבגם ermined כי PFOA עכבות GJIC ב כבדי חולדות F344 שטופלו PFOA, ובכך אימות במערכת מודל במבחנה 12,17. איור 7 הם תמונות פלורסנט מניסוי מעקב זה מראה את ההתפשטות לצבוע ברקמות כבדות של חולדות שטופלו הרכב PFOA.
איור 1: תמונת קריקטורה של שלב טעינת האזמל לצבוע. איור מראה כי תהליך הטעינה אזמל כרוך מתגלגל הלהב במקום לחתוך אופקית דרך תאים כדי למזער נזק לתאים.
איור 2: תמונות מיקרוסקופיות ניאון נציג של הצבע להתפשט דרך צומת פער. WB-F344 עכברוש כבד ותאי אפיתל טופלו במשך 15 דקות עם בקמטי מינונים של phenanthrene, PAH נפוצה נמצאת בסביבה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: עקומת מנת תגובה של תאי אפיתל כבד עכברוש phenanthrene שטופל WB-F344. תחומי תמונות SL-DT חושבו ומאז מדווחות כשבר של שליטה, שהיו בתאים שטופלו הרכב (אצטוניטריל). כל נקודת נתונים הוא ממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים ואת הסורגים שגיאה סטיות התקן על גבול ביטחון של 95% עבור כל מנה אחרי זמן חשיפה 15 דקות. פונקציה לוגיסטית ארבעה פרמטר שמשה כדי להתאים את הקו דרך נקודות נתונים. אנא CLI CK כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: עקומת תגובת התאוששות פעם האחרת של תאי אפיתל כבד עכברוש phenanthrene שטופל WB-F344. לאחר עיכוב מוחלט של GJIC לאחר 10 דקות של חשיפה, phenanthrene המכיל הבינוני (Phe) הועבר אל Phe-חינם בינוני ולאחר מכן התאים נוטרו להתאוששות מן העיכוב. תחומי תמונות SL-DT חושבו ומאז מדווחות כשבר של שליטה, שהיו בתאים שטופלו הרכב (אצטוניטריל). כל נקודת נתונים הוא ממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים ואת הסורגים שגיאה סטיות התקן על גבול ביטחון של 95%. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
her.within-page = "1"> 
איור 5: עיכוב של GJIC ידי 1-methylanthracene תלוי פוספוליפאז הספציפי phosphatidylcholine ג 1-methylanthracene (1-MEA) הוא PAH נפוץ נמצא בסביבה. הלוח השמאלי מייצג תאים שטופלו הרכב (אצטוניטריל, 0.35% v / v). הלוח המרכזי מייצג תאי אפיתל כבד עכברוש WB-F344 שטופלו במשך 15 דקות עם 70 מיקרומטר 1-MEA. הפאנל הימני מייצגים תאים pretreated הראשון במשך 20 דקות עם 50 D609 מיקרומטר, מעכב C פוספוליפאז ספציפיים phosphatidylcholine, ואחריו תוספת של 70 מיקרומטר 1-MEA עבור 15 דקות נוספות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
281fig6.jpg "/>
איור 6: Resveratrol מנע עיכוב של GJIC ידי 1-methylanthracene. הלוח השמאלי מייצג תאים שטופלו הרכב (אצטוניטריל, 0.35% v / v). Resveratrol הוא נוגד חמצון המצויים במוצרי יין בוטנים אדומים. הלוח המרכזי מייצג תאים שטופלו במשך 15 דקות עם 70 מיקרומטר 1-MEA. הפאנל הימני מייצג תאים pretreated הראשון במשך 20 דקות עם 50 מיקרומטר רזברטרול ואחריו תוספת של 70 מיקרומטר 1-MEA עבור 15 דקות נוספות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: Ex vivo מבחנים-DT SL של GJIC פרוסות כבדות מזכר F-344 חולדות. הפנל השמאלי מייצג פרוס Tiss הכבדהUE מ עכברוש שטופלו שליטה ברכב, sulfoxide דימתיל, למשך 24 שעות. הפאנל הימני מייצג פרוסת רקמת הכבד של חולדה לאחר מתן intraperitoneal של 100 מ"ג / ק"ג חומצה perfluorooctanoic (PFOA) לאחר 24 שעות. PFOA, זיהום סביבתי הרווחת, הוא proliferator peroxisome קידום הגידול שגורם hepatomegaly והפגינו לחסום צמתים הפער באמצעות מודל חוץ גופית. לצבוע טעון החתך נעשה על פרוסות כבדות מרכב החיות שטופלו PFOA, אשר תוקנו ואז, גזוז מחולק. לשכפל מ לבריאות הסביבה פרספקטיבות 12. בר סולם = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
את assay SL-DT הוא טכניקה פשוטה תכליתית במדידת GJIC, אבל יש כמה חששות קריטיים כי יש היוו בעיצוב פרוטוקולי ניסוי מתאימים. עבור מדידות חזקות של GJIC באמצעות assay SL-DT שחייבת להיות התפשטות צבע טובה של LY דרך צומת פער של התאים. לכל הפחות, זמן נאות יש לבחור כדי להבטיח כי הצבע מתפשט דרך שמונה או יותר שורות של תאי מתאי טעון האזמל בשני הכיוונים. כמו כן, עבור וקלות המדידה של המרחק כי לצבוע הגר מתאי טעון האזמל, בחר גורם הגדלה זה מבטיח את התפשטות הצבע של צלחות המלאות ממלאת 70 עד 90% של שדה הראייה. עבור תאי WB-F344 עכברוש הכבד אפיתל, שלוש דגירה דקה עם פתרון LY מספיקה לחזית לצבוע לנוע מעבר לארבע שורות תאים, וכן גדלה של 200X היא אופטימלית. התאים גדלים על צלחות בקוטר 35 מ"מ, שהוא amendable די loading לצבוע לתוך התאים עם אזמל. עם זאת, תאים ניתן לגדל בארות קטנות, אבל השימוש של אזמל אינו אפשרי, במיוחד ב 96 צלחות תרבות גם. עבור בארות קטנות, להשתמש חיתוך קצה עגול שקצו קטן שיכול להשתלב היטב, ושוב, להשתמש פעולה מתגלגלת. פעולה מתגלגלת זהו צעד קריטי כפי שהוא פולשנית ומספק קו מאוד נקי של טעינה שמונע את התאים מן הנקרעת ויצירת פער תא ללא גדולותים טיפוסית של שיטת הגירוד המקורית. לחלופין, מחט דיקור ניתן להשתמש בה טוויסט קטן של המחט עושה עבודה יפה של צבע טעינה לתוך התאים.
ניתן להשתמש בתא-סוגים אחרים assay זה. עם זאת, בחירה של תאים והבנת תפקידי GJIC ב לסוג תא מסוים היא חשובה מסגור שערות מתאימות ואת העיצוב של הניסויים. הצעד הראשון והברור ביותר הוא לפתח תנאי תרבית תאים בו צומת פער פונקציונליים הן הבעהSED. בסוגי תאים היטב בדיל, הממלאים תפקידים מטבוליים ספציפיים, צומת פער בדרך כלל לשחק תפקיד בתיאום מסלולים מטבוליים בין תאים רציפים. סוגי תאים היטב בדיל מוגבלים, אם בכלל, יכול שגשוג ואת הערוצים כנראה לשחק תפקיד מטבולי רקמות ספציפי כי לעתים קרובות תלוי מורפולוגיה הסדר ספציפי של תאים. לדוגמה, myocytes לב הם תאים מאורכים שבו צמתים הפער מיושרים בעיקר על דיסקים intercalated, ובכך בשיטת SL-DT ידרוש יישור התאים, אשר יכול להיעשות בצלחת מחורץ. לפיכך, שיקולים זהירים חייבים להתבצע על כל סוג תא. מחקרים עם בתרביות תאים עצביות הם בדרך כלל לא ומחוברים וגם דורשים נקודות קשר מסוימות, מה שהופך את השימוש של מבחני GJIC SL-DT ההולם והאלטרנטיבי חייבים לשמש.
בסוגי תאי שגשוג, כגון גזע ובתאים מוקדמים, GJIC משחק תפקיד קריטי יותרבתיאום תא איתות אירועים השולטים ביטוי גני ויסות אירועי mitogenic. לתאי האפיתל WB-F344 עכברוש הכבד בשימוש בפרוטוקול זה נופל לקטגוריה זו. גני צומת גאפ הם קריטיים במהלך פיתוח רקמות ותחזוקה 19-21. למרות ערוצי צומת פער מבוטאים וצמו כל המשטחים הממברנה של התא, תאי שגשוג רגישים מאוד גורמי גדילה, אשר מעכבים GJIC. שיקולים קריטיים עבור סוגי תאי שגשוג בדרך כלל מכוונים יותר להרכב של התקשורת. גורמי גדילה הם לעתים קרובות העולה, במיוחד במדיום מוגדר המכיל סרום שור עובר, ואת צמתי הפער 'התאים עשויות להיות במצב סגור. הדרך הקלה ביותר להקים GJIC בתאים אלה היא להפחית או להסיר את הרמות בסרום במשך 4 עד 24 שעות לפני הניסויים, למרות 24 שעות תהיינה ארוכות מדי עבור תאים ללא סרום כפי שהם היו apoptose. תאי אפיתל הכבדים WB-F344 המשמשים ניסויים שהוצגו tהנייר שלו אינו רגיש יתר על מידת סרום ללא צורך להפחית את הרמות בסרום. לעומת זאת, ניסויים באמצעות שורת תאי עכבר C10 חייבים להיות משולל בסרום ראשון להקים 22 GJIC. למרות שרמות בסרום להשתנות בין שני סוגי התאים, מעניין, תאי C-10 הגיבו באופן דומה מאוד איזומרים מתיל של anthracene 22,23.
שיקולים נוספים לקבלת תוצאות איכותיות כוללים עורכי הניסויים במינונים שאינם ציטוטוקסיות. תאים צריכים להיבדק עם מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לקבוע תכונות מורפולוגיות בריאות הצפויה של סוג התא לפני ואחרי הטיפול. כדי להבטיח כי ההשפעות של תרכובת על תפקוד צומת פער אינן נובעות תגובה ציטוטוקסיות כללית, מבחני cytotoxicity לכל מתחם צריכים להיעשות באותו הזמן ומינון בשימוש assay SL-DT. ניסויים כדי לקבוע אם השפעה מעכבת של תרכובת על GJIC הפיכה הוא גם ניסוי טוב לפחות שתי סיבות. מותרכובות רח נבדקות הפיך לעכב GJIC, אבל אם אין התאוששות של GJIC, אז cytotoxicity עלול להיות גורם ולביצוע בדיקות נוספות יידרשו. עם זאת, אם GJIC משוחזר אז המינון והזמן שנבדק היה כנראה לא ציטוטוקסיות. ישנן השלכות ביולוגיות עבור עיכוב הפיך של GJIC. ההשפעות הבריאותיות השליליות של רבים נישאים סביבתי ומזון toxicants ורעלים היא תהליך הפיך. לכן הבנת הפיכות זה ברמה המולקולרית חשובה. אם תרכובת לא ידועה לא הפיך לעכב GJIC, אז ההשלכות על בריאותו של האורגניזם יכול להיות שונה לגמרי מרוב סוכנים אחרים צריך להיות כחלק מחישובי הסיכון.
קביעת המינון והזמן הכרוך העיכוב של GJIC היא תהליך חוזר ונשנה. כדי לחסוך זמן וכסף עבור אספקת התרבות, הגישה הטובה ביותר היא להתחיל במינון גבוה, אשר תלוי מסיס זמן (בדרך כלל שעה, כמו רוב העיכובמתרחשת בתוך פחות מ -15 דקות), ולאחר מכן לצמצם את הזמן ואת המינון בחצי בתהליך צעד חכם עד אין השפעה. אם אין עיכוב במינון גבוה בשעה אחת, אז להכפיל את משך זמן תהליך צעד חכם. ניתן לעשות ניסויים ראשוניים על צלחת אחת. לאחר ערכות הזמן הכלליות ומינונים מבוססים, אז יותר מחקרים יסודיים יכולים להיות מתוכננים בצורה יעילה עם גודל מדגם מתאים עבור ניתוחים סטטיסטיים. תכונת עיצוב ניסיוני אחד תהיה להשתמש במינון והזמן המגיעות 75 עיכוב% 100. ברור, הפרשנויות הסופיות של תוצאות תהיינה גורם אחד מהפרמטרים לעיל. עם זאת, על ידי קביעת השפעה ביולוגית הראשון, גם אם המינון והזמן לא יכולים להיות רלוונטי in vivo, המינונים הוקמו יכולים לשחק תפקיד במצבים של חשיפות תעסוקתיות, או לאוכלוסיות כלליות חשופי גורמים אחרים המשפיעים אף הם GJIC עם תוסף פוטנציאל או תופעות סינרגיסטי.
העיכוב של Gיא"ה ידי רוב תרכובות בדרך כלל אינה משתנית מאוד ושניים עד שלושה משכפל (כל לשכפל תהיה צלחת תרבות או גם) מספיק כדי ליצור עקומות מינון תגובה וזמן. עם זאת, אם ההשתנות גבוהה אז יותר משכפלים יהיה צורך לקבל ערך מדויק עבור משתנה תלוי נתון במשפט אחד עצמאי. כמובן, לפחות שלושה ניסויים עצמאיים צריכים להיעשות עבור ניתוחים סטטיסטיים.
הפשטות של assay זה לבין הערכת גודל אוכלוסיית תא משמעותי יתרון עבור יישומים רבים. תכונה זו שימושית במיוחד בהערכות טוקסיקולוגית רבים. עם זאת, קיימות מגבלות של מבחני SL-DT, אשר יכול לסמוך על מספר גורמים. אחת הוא אם הטכניקה הזו מן ראויה נלמד התאים. assay זה לא יעבוד גם עבור תאים שאינם מגיעים confluency גבוהה עם אנשי קשר סדיר לאורך כל צלחת תרבות או כן. טכניקות חלופיות, כגון microinjection צריכות להיות שותףnsidered. לחלופין, assay SL-DT ניתן לשנות. הצלחה בתאי טעינה אחת הושגה עם מחט דיקור, מחייב פעולת פיתול קל בעת הטעינה לצבוע 7. התפשטות הצבע תהיה רדיאלי במצבים ומחוברים יותר או אמורפי באמצעות תרבית תאים עם אנשי קשר תא ספורדי. תוספת של dextran Rhodamine (RD, 1 מ"ג / מ"ל) לפתרון לצבוע LY מומלצת בניסויים שבהם זיהוי תאים טעון יהיה קשה בלי שום ציון (כגון RD). RD הוא גדול מכדי לעבור ערוצי צומת הפער, ובכך זיהוי שבו תאים הועמסו. RD יכול לשמש גם בכל assay SL-DT, אבל אזמל משאיר חריץ בחלק התחתון של המנה זיהוי שבו תאים נטענים. את assay SL-DT הוא גם לא תורם מדידת שינויי GJIC בין סוגים שונים של תאים כמו צבע הטעינה לא להפלות בין סוגי תאים. שוב microinjection היא השיטה של בחירה, אבל מיג שיטת מחט הדיקורגם HT לעבוד אם אפשר למקד לתא מסוים באמצעות מיקרוסקופ.
את assay שיתוף הפעולה מטבולית הוא שיטה אחרת למדידת GJIC. שיטה זו הייתה אחת המבדק הסטנדרטי הראשון עבור GJIC 24. ב assay זה, התאים V79 אוגר סיני wild-type (6-thioguanine רגיש) ותאי 6-thioguanine עמידים היו שיתוף תרבותי בצפיפויות גבוהות שבו 6-thioguanine (6-TG) תאים עמידים לא מעכלים 6-TG כדי מטבוליט רעיל, ובכך מקנה התנגדות. עמית תרבות עם תוצאות התאים הרגישות 6-TG בהעברת המטבוליט הרעיל דרך צומת פער וכתוצאה מכך למות תא שבו עיכוב של תוצאות GJIC בהצלת התאים עמידים 6-TG-ידי מניעת העברת המטבוליט 6-TG הרעיל מהתאים הרגישים 6-TG. למרות יתרון של assay זה הוא שזה פולשנית, חסרון עיקרי הוא בכך שהיא דורשת שבוע להשלמה, אשר מבצעת הערכות תלות מינון וזמן נרחבים של toxiרוכן כמו גם מחקרים מכניסטית, וכו מעשי להערכת כימיקלים רבים.
את assay SL-DT הוא לא תורם מחקרים מכניסטית שצריכים לעקוב אחר נדידת צבעים באמצעות תאים מסוגים שונים, בהם microinjection היא השיטה המועדפת. לחלופין, תאים יכולים להיות טעון מראש עם מתיל אסטר של צבעי ניאון. הטעינה של הצבע היא פונקציה של esterases מהתיל התאי כי hydrolyze לצבוע lipophilic לצורה שלה יותר הידרופילי, ובכך השמנה לצבוע בתאים. זוהי דרך פחות פולשנית כדי לטעון מראש את החללית פלורסנט, אך הדרך הנפוצה ביותר למדידת תקשורת בין תאית שבו כל התאים שנטענו מראש על ידי שיטה זו היא assay FRAP 11. היתרון של FRAP הוא שוב את היכולת להעריך צומת פער תאים בודדים, אשר מצוין מחקרים מכניסטית. עם זאת החיסרון של FRAP טמון: חוסר היכולת למדוד אוכלוסיות של תאים להערכות טוקסיקולוגית,צורך cytometers המיקרוסקופי מתוחכם מאוד יקר / ליזר, צורך מומחיות טכנית מיומנת, הוא פולשני בינוני מפני רדיקלים החופשיים המיוצרים על ידי הליזר, ולא תורם קצב העברת נתונים גבוהים.
לאחרונה טכניקה נוספת פותחה; ההפעלה המקומית של בדיקת ניאון מולקולרית (LAMP) שיטה 25, אשר מתבססת על דור חדש של fluorophores coumarin הדמוי בכלוב. בדומה assay FRAP, כל התאים מראש עם צבעים המכילים מתיל אסטר, לעומת זאת, הצבעים אלה הופכים ניאון על תאורת נקודות לאחר מכן על ידי לייזרים עם מנה קטנה של אור אולטרה סגול, אשר כנראה מייצרת ROS נמוך משמעותי מאשר FRAP. שוב, assay הזה יש אותן המגבלות של assay FRAP. הפיתוחים האחרונים אחרים למדידת GJIC הן טכניקות טעינה מוקדמת ו מצנח, אשר כללו גם השימוש בצבעים אסתר-ניאון מתיל. טכניקת הטעינה המוקדמת כרוכת השעייתהתאים מראש עם בדיקת ניאון יחד עם עמיתיהם פרקו והם אז מצופים מותר להקים monolayer ומחוברת. התפשטות לצבוע אז יכול להיות שנצפה עם מיקרוסקופ epifluorescence 26. ב assay המצנח, התאים מראש עם חללית פלורסנט הם כיסו על בשכבה של תאים פרקו, ואת ההתפשטות של הצבע הוא ציין עם מיקרוסקופ epifluorescence 27. שוב, הטכניקות לעיל מבחינה טכנית יותר מאתגרות עבור תפוקה גבוהה מנתח, וחייבת להיות מצופית מייד בנקודת המפגש קרוב דורשת לעתים חולפים זמן עבור והחיבור מחדש של תאים.
בסך הכל, assay SL-DT היא טכניקה זולה יחסית, פשוט צד המשתמשת ציוד, כגון חממות תרבית תאי CO 2, ארונות בטיחות ביולוגיים ו מיקרוסקופ epifluorescence, נמצאות בדרך כלל במעבדות תרבית התאים ביותר. עם ניסיון מינימאלי צלחות רבות ניתן לעבד יום, אשר הוא מסייע fאו הקרנת תרכובות רעילות כמו גם למוצרים טבעיים המונעים או להפוך את ההשפעות של toxicants ורעלים. כמו כן, התאמת assay זה תפוקה גבוהה מנתח באמצעות רובוטיקה, עם מערכות הדמיה וניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות יצטרך פוטנציאל מסך מספר רב של toxicants ורעלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
