Summary
Este protocolo describe una técnica de transferencia de carga de tintes fluorescentes bisturí que mide la comunicación intercelular a través de canales brecha de la salida. Brecha de comunicación intercelular de la unión es un proceso celular importante mediante el cual se mantiene la homeostasis del tejido y la interrupción de esta señalización celular tiene efectos adversos para la salud.
Abstract
Este protocolo describe un bisturí de carga fluorescente de transferencia de colorante técnica (SL-DT) que mide la comunicación intercelular a través de canales de salida brecha, que es un proceso intercelular importante por el cual se mantiene la homeostasis del tejido. La interrupción de la unión brecha de comunicación intercelular (GJIC) por agentes tóxicos, toxinas, drogas, etc. se ha relacionado con numerosos efectos adversos para la salud. Muchas enfermedades humanas basadas en la genética se han relacionado con mutaciones en genes brecha de la salida. La técnica de SL-DT es un ensayo funcional simple para la evaluación simultánea de GJIC en una gran población de células. El ensayo implica las células pre-carga con un colorante fluorescente perturbando brevemente la membrana celular con una hoja de bisturí a través de una población de células. Se deja entonces que el colorante fluorescente para atravesar a través de canales de unión brecha a las células vecinas para un tiempo designado. El ensayo se termina entonces por adición de formalina a las células. La propagación de la fluorescent tinte a través de una población de células se evaluó con un microscopio de epifluorescencia y las imágenes se analizaron con cualquier número de paquetes de software que están disponibles morfométricas, incluyendo paquetes de software libre que se encuentran en el dominio público. Este ensayo también se ha adaptado para estudios in vivo utilizando rodajas de tejido de diferentes órganos de animales tratados. En general, el ensayo de SL-DT puede servir a una amplia gama de necesidades farmacológicas y toxicológicas in vitro, y puede ser potencialmente adaptada para sistemas de configuración de alto rendimiento con fluorescencia automatizado de imágenes y análisis de microscopía para dilucidar más muestras en un tiempo más corto.
Introduction
El objetivo general de este método es proporcionar una técnica sencilla, completa y relativamente barato para evaluar la toxicidad potencial de los compuestos. Este es un enfoque in vitro que puede ser utilizado en múltiples líneas celulares. laboratorios de biología celular estándar equipadas con microscopios de epifluorescencia pueden conducir búsquedas utilizando este ensayo.
Nuestro conocimiento básico de las funciones celulares ha sido dependiente de bioensayos in vitro altamente, y se ha convertido en un componente esencial en las evaluaciones toxicológicas de los productos farmacéuticos, los contaminantes ambientales y contaminantes de los alimentos nacido. Desafortunadamente, no existe un único sistema de bioensayo in vitro que puede satisfacer integralmente las demandas de todas las evaluaciones toxicológicas. Muchos ensayos in vitro están diseñados y optimizados para evaluar, así como evaluar un criterio de valoración bioquímica o molecular específico. Estos se combinan muy a menudo en un alto rendimiento creado para reflejar una perturbación de unadeterminada vía de transducción de señales, tales como la señalización del receptor de estrógeno 1. Esta estrategia ha tenido bastante éxito, pero el gran número de vías de transducción de señales implicadas en la expresión de genes que hace que la tarea de elegir una vía de señalización específica para evaluar bastante complejo. Los altos protocolos a través de-puestos están siendo desarrollados y utilizados para medir simultáneamente numerosas vías de señalización, que ha sido un enfoque para superar algunas de las limitaciones de los ensayos individuales actualmente. Sin embargo, no todas las vías de señalización se han incorporado con éxito en enfoques más amplios, además de nuevas vías de señalización están siendo constantemente descubierto que complica aún más este proceso de evaluación. El uso extenso número de enfoques in vitro, particularmente alto rendimiento de procesamiento de sistemas, para las evaluaciones toxicológicas completas también son muy caros y no son propicias para la mayoría solo investigador dirigido proyectos de investigación.
GJIC es un proceso tightly controlado por los cambios en el voltaje, la concentración de calcio, el pH, equilibrio redox, regulados por las principales vías de transducción de señales intracelulares y las interacciones con la membrana y las proteínas del citoesqueleto 2,3. Por lo tanto, la inhibición de GJIC puede reflejar diferentes tipos de estrés celular, la interrupción de las diferentes funciones celulares, o perturbaciones de diferentes vías de transducción de señales. Otro enfoque para superar el uso de bioensayos limitados de transducción de señales es para tomar ventaja de los fenómenos biológicos que muchos, si no la mayoría, las vías de transducción de señales se modulan aún más por los sistemas de señalización intercelular de cooperación a través de canales de unión brecha 4-8. Aunque los sistemas de señalización intercelular también son numerosos y bajo el control de vía múltiple, la señalización intercelular a través de canales de salida brecha es en última instancia una función de los canales de ser abierto, parcialmente cerrada o completamente cerrada. Esto proporciona un punto final que se puede medir fácilmente utilizando diversosen los sistemas de bioensayo in vitro 7. Teniendo en cuenta que el punto de ajuste homeostático de un tejido requiere canales abiertos, para determinar el efecto de los compuestos sobre la brecha ocasiones la comunicación intercelular (GJIC) es un enfoque más amplio para determinar los posibles efectos tóxicos de los compuestos 4,8. En esencia, este fenómeno biológico fundamental que desempeña un papel central en la coordinación de múltiples eventos de transducción de señales que controlan la expresión de genes permite una amplia evaluación de los efectos tóxicos. Por lo tanto, los bioensayos que evalúan la GJIC son un excelente punto de partida para evaluar el potencial tóxico de compuestos.
Los más extensas técnicas utilizadas para evaluar GJIC se basan en la precarga de las células con una sonda fluorescente y luego el control de la migración del colorante de la célula de carga o células a las células adyacentes. Las técnicas para precargar el colorante han implicado microinyección 9, raspar de carga 10, y metil ésteres de las sondas 11 10. En lugar de la raspadura más invasivo, el método de bisturí de carga de este informe implica un rollo suave de un escalpelo con una cuchilla redonda a través de una monocapa de células que reduzcan al mínimo el daño invasiva (Figura 1). Las ventajas de esta técnica son la evaluación toxicológica de una población de células en lugar de células individuales del ensayo de microinyección. Además, la simplicidad de este ensayo permite la detección rápida de múltiples placas en un corto tiempo mientras que los métodos que utilizan técnicas de microinyección y técnicas que usan ésteres metílicos de sondas fluorescentes son que consume mucho más tiempo y requieren considerablemente más alto nivel de habilidad.
Aunque no existe un método único para satisfacer todas las necesidades de estudiar la GJIC; el ensayo SL-DT es un ensayo simple, bastante barato y versátil que puedesatisfacer muchas de las necesidades de las evaluaciones iniciales de la toxicidad de diversos compuestos. Las principales ventajas son: simplicidad, no hay necesidad especial para el equipo o las habilidades que se requieren para otros métodos tales como la microinyección, la recuperación de fluorescencia después de photobleaching ensayo (FRAP) y la activación local de ensayos de sondas fluorescentes moleculares, una evaluación rápida y simultánea de GJIC en un gran número de células, que conduzca a un alto rendimiento de la configuración con fluorescencia automatizado de formación de imágenes de microscopía y análisis, así como su capacidad de adaptación para los estudios in vivo.
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Protocol
El protocolo de este estudio fue aprobado por el Cuidado de Animales y el Aprovechamiento de los Institutos Nacionales de Ciencias de la Salud de Japón, que es donde los experimentos in vivo se realizaron, para asegurar que las ratas fueron tratadas con humanidad y respeto por aliviar el sufrimiento.
1. SL-DT Bioensayo
- Seed 3 10 5 WB-F344 células epiteliales de hígado de rata Onto 35 placas de cultivo de diámetro mm x contienen Eagles Modificado Medio más suero bovino fetal al 5%, y cultivar las células en una incubadora a 37 ºC, 100% de humedad relativa (RH), 5% CO 2.
- Cultivar las células hasta que llegan a 100% de confluencia (típicamente, 2 días) y llevar a cabo el tratamiento experimental deseado de las células como se describe a continuación.
- Lleven a cabo experimentos de dosis de respuesta
- Añadir 10 l y 20 l de una solución 2 mM de stock de fenantreno en 100% de acetonitrilo y 4 l, 6 l, y 8 l de una solución madre 20 mM de phenanthrene en 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento para cada volumen añadido de la solución madre.
- Añadir 4 l, 6 l, 8 l, 10 l y 20 l de una solución 100% de acetonitrilo para tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento para cada volumen añadido de solución de acetonitrilo para servir como el control del vehículo.
- Incubar las placas durante 15 minutos en una incubadora a 37 ° C, 100% de humedad relativa y 5% de CO 2.
- Continúe en el paso 1.3.
- Conducta Tiempo experimentos de respuesta
- Añadir 7 l de una solución madre 20 mM de fenantreno en 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento para cada punto de tiempo (es decir, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
- Añadir 7 l de 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento para cada punto de tiempo para servir como el control del vehículo.
- Incubar las placas para cada tiempo p designadomixto en una incubadora a 37 ° C, 100% de humedad relativa y 5% de CO2.
- Continúe en el paso 1.3.
- Lleven a cabo experimentos de tiempo de recuperación
- Añadir 7 l de una solución madre 20 mM de fenantreno en 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento durante 15 min.
- Añadir 7 l de 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento durante 15 min para servir como el control del vehículo.
- Decantar el medio que contiene el fenantreno o acetonitrilo y enjuague 3x cada uno con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Añadir 2 ml de medio de crecimiento fresco a cada placa y se incuba durante los tiempos de recuperación deseado (es decir, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) en una incubadora a 37 ° C, 100 % HR y 5% de CO 2.
- Continúe en el paso 1.3.
- Los experimentos Mecanismo de Conducta
- Añadir el inhibidor de la transducción de señales, es decir,
- Añadir 5 l de 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento durante 15 min para servir como el control del vehículo.
- Añadir 7 l de una solución madre 20 mM de fenantreno en 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento más el D609 para un 15 min adicionales.
- Añadir 7 l de 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contienen 2 ml de medio de crecimiento más el 100% de acetonitrilo durante 15 min adicionales para servir como el control del vehículo.
- Continúe en el paso 1.3.
- Lleven a cabo experimentos de dosis de respuesta
- Descartar el medio de cultivo por cualquiera suavemente vertiendo el medio o por succión al vacío.
Nota: Eliminar el medio de cultivo que contiene residuos peligrosos adecuadamente. - Enjuagar las células tres veces cada uno con 3 ml de PBS y, o bien decantación o aspirado between enjuaga.
- Pipetear 1 ml de 1 mg / ml de Lucifer Yellow colorante disuelto en PBS (LY) en cada placa de células.
- Precargar el medio de contraste en las células rodando suavemente una hoja de acero quirúrgico # 20 con un borde redondeado a través de una población de células en tres áreas diferentes de la placa.
- Comience colocando el bisturí perpendicular (90 ° de ángulo) y 5 mm desde el borde de la placa de cultivo, y luego rodar el bisturí desde este ángulo perpendicular a aproximadamente un ángulo de 15 ° (véase la Figura 1).
Nota: Esto se logra apretando el bisturí entre el dedo índice y el pulgar. Utilizar la gravedad para permitir que el bisturí para ir suavemente desde los 90 ° a 15 ° posición (como la hoja redondeada simplemente rueda sobre las células). Este movimiento dejará una línea de muesca visualmente perceptible.
- Comience colocando el bisturí perpendicular (90 ° de ángulo) y 5 mm desde el borde de la placa de cultivo, y luego rodar el bisturí desde este ángulo perpendicular a aproximadamente un ángulo de 15 ° (véase la Figura 1).
- Se incuban las células con la solución de LY durante 3 min a temperatura ambiente.
- Decantar o aspirar el LY y enjuagar tres veces con 3 ml de PBS para recoger todos extracellular teñir para eliminar la fluorescencia de fondo extracelular.
- Añadir 0,5 ml de solución de formalina tamponada con fosfato 10% para fijar las células.
Nota: Después de la fijación en formol, el aire seco de las células y almacenar en la oscuridad durante un máximo de dos años con photobleaching mínima del colorante LY. Cuando se requiera, rehidratar con solución de formalina al 10% para visualizar el frente de colorante fluorescente. - Ver las células fijadas usando un microscopio de epifluorescencia equipado con un cubo dicroico para los picos de excitación / emisión de 428/536 nm con un aumento de 200X. Alinear todas las placas de manera que la línea de indentación es paralela al campo de visión horizontal.
Nota: Un cubo FITC dicroico funciona bien.- Capturar la imagen con una cámara CCD y el software de soporte.
- Abra el software de soporte para la cámara CCD y el uso de los ajustes de exposición automática. Usa el botón de "captura" para adquirir digitalmente la imagen. Guarda la imagen como archivos .tif utilizando el botón "Guardar".
2. Adaptación de la SL-DT Ensayo de tejido hepático
- Eliminar aproximadamente un cm rebanada 2 x 2 del lóbulo izquierdo del hígado de una a 5 semanas de edad, utilizando macho Fischer 344 ratas tijeras de disección y colocarlo en un plástico pesan plato cubierto con una gasa húmeda 12.
- Pipetear 0,5 ml de una solución de PBS que contiene 1 mg / ml cada uno de amarillo lucifer y rodamina-dextrano (RD) sobre la superficie de la rodaja de hígado en el plástico pesan placa.
Nota: La RD es un colorante que no pueden atravesar los canales de salida brecha y marcará las células que fueron cargados. - Hacer tres a cinco incisiones de aproximadamente 1 cm de largo en la superficie de la rodaja de hígado que tiene la solución de colorante en la placa de pesaje con una hoja afilada y luego añadir colorante adicional suficiente para llenar las incisiones.
- Incubar el tejido durante 3 minutos a temperatura ambiente en el plástico pesan placa.
- Enjuague tres veces con 5 ml de PBS.
- Fijar el tejido ovedejarían de en 30 ml de 10% de formalina tamponada con fosfato en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Al día siguiente, lavar las rodajas con agua, recortar el tejido alrededor de la incisión con tijeras de disección en 1 x 1 x 0,5 cm 3 tiras y luego usar técnicas estándar para incrustar las rebanadas en parafina 13.
- Sección las rebanadas perpendiculares a la línea de incisión para espesor de 5 micras y almacenar las muestras en la oscuridad hasta que esté listo para obtener imágenes utilizando técnicas estándar de seccionamiento con un micrótomo 13.
- Utilizar un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara digital CCD para visualizar y capturar las imágenes de los frentes de tinte fluorescente de acuerdo a la sección 1.10 7.
3. Cuantificación de la GJIC
- Medir la propagación colorante fluorescente utilizando un paquete de software de morfometría (por ejemplo, ImageJ).
- Haga clic en la ficha "Archivo" y haga clic en "abrir" para abrir elsalvado imagen.
- Haga clic en la "Herramienta de mano libre" en la barra de herramientas Tab para trazar el contorno de la frente de colorante.
- Haga clic en la pestaña "Analizar" y haga clic en "Medida".
Nota: Esto generará un valor de área en una hoja de cálculo, que puede ser copiado en otros programas de hoja de cálculo, si se desea.
- Utilizando un programa de hoja de cálculo, calcular la fracción de la control (FOC) dividiendo el área de la propagación colorante en la placa experimental por el área del colorante viajó en la placa de control utilizando la siguiente ecuación:
A e = área de la propagación de colorante en las células expuestas a una variable experimental, tales como las células tratadas con un producto químico en una dosis o tiempo específico
A c = área de la propagación de colorante en el control, que son las células tratadas con el vehículo usado para disolver el producto químico de interés
Nota: Para determinar el efecto del vehículo,A e sería el área de la propagación de colorante en las células tratadas por el vehículo y A c sería la zona de la propagación de colorante en las células no tratadas por el vehículo. El efecto del vehículo debería ser preferiblemente menor que 10%.
- Capturar la imagen con una cámara CCD y el software de soporte.
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Representative Results
Interrupción de la GJIC se ha utilizado ampliamente como un biomarcador para la identificación de compuestos tóxicos en el nivel no genotóxico, epigenética de control del gen que induce efectos adversos para la salud 14. Por ejemplo, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son contaminantes ubicuos del entorno, pero varían en sus toxicidades epigenéticos como una función de sus estructuras moleculares 15. Los HAP de menor peso molecular se encuentran normalmente en concentraciones relativamente altas que los HAP de mayor peso molecular en muchos ambientes diversos como los sedimentos fluviales contaminadas a la de 15,16 humo del cigarrillo. Fenantreno es un ejemplo de un PAH de bajo peso molecular que poseen tres anillos de benceno con un bolsillo angular llamada la región de la bahía. La Figura 2 es una serie de imágenes SL-DT de células epiteliales de hígado de rata WB-F344 tratadas con dosis crecientes de fenantreno. Tenga en cuenta la disminución en la migración of el colorante fluorescente, amarillo Lucifer, con dosis crecientes. Las áreas de las imágenes escaneadas se pueden determinar como una fracción de la de control (FOC). El control de la Figura 2 están las células tratadas con el disolvente que el PAH se disolvió en, a saber acetonitrilo. Típicamente experimentos SL-DT se realizan por duplicado o triplicado para cada ensayo con un mínimo de tres ensayos independientes para cada parámetro experimental, lo que sería una dosis en este experimento. Los valores FOC entonces se pueden promediar, analizados estadísticamente y, a continuación representan gráficamente (ver Figura 3).
Experimentos similares también se llevan a cabo de forma rutinaria para establecer el tiempo para la inhibición inducida por agente tóxico de GJIC, y el período de tiempo necesario para recuperarse de esta inhibición tóxica inducida de GJIC después de que las células se transfieren a un medio libre de agente tóxico. La figura 4 muestra tanto el tiempo de respuesta y la recuperación de la inhibición por fenantreno (Phe). El ensayo SL-DT también se puede utilizar para determinar los mecanismos subyacentes por los cuales tóxico y toxinas dysregulate GJIC 4,16. Esto se hace por las células pre-incubación con un inhibidor de la farmacéutica de una vía de señalización seleccionado antes de la adición de la sustancia tóxica o toxina que dysregulates GJIC. Si la sustancia tóxica o toxina ya no dysregulates GJIC en presencia de un farmacéutico seleccionado que bloquea una vía de señalización, a continuación, esta vía se determina que es una vía de regulación de GJIC, mientras que tales vías pueden descartarse si el tóxico sigue dysregulate GJIC. La Figura 5 demuestra este principio en el que 1-metilantraceno (1-MEA), otros tres PAH anillado que inhibe la GJIC, pero no en la presencia de D609, que es un inhibidor bastante específico de fosfatidilcolina fosfolipasa C específica (PC-PLC). De este modo, PC-PLC se resolvió en una enzima de señalización candidato implicado en la inhibición inducida por 1 y los AMUMA de GJIC. El papel de la PC-PLC ha sido validado con fexperimentación ás 4,16. En general, los ensayos de SL-DT son muy propicio para comenzar el proceso de redes de señalización de mapeo que participan en los mecanismos de cómo las sustancias tóxicas y toxinas inhiben (dysregulate) GJIC. Este enfoque también se puede utilizar para la detección de productos naturales que pueden bloquear una sustancia tóxica o toxina de dysregulating GJIC. Por ejemplo, el resveratrol, un antioxidante encontrado en altas concentraciones en el vino y los productos de maní puede prevenir rojos 1 y los AMUMA de la inhibición de GJIC (Figura 6).
El ensayo SL-DT ha sido adaptado a cortes de tejido de animales, particularmente en el hígado 17. El ácido perfluorooctanoico (PFOA) es un ácido graso fluorado 8-carbono que es un contaminante ambiental persistente conocido para inducir cánceres de hígado 12,17. Utilizando la técnica de SL-DT PFOA ha demostrado inhibir la GJIC en un BM-F344rat sistema modelo in vitro de hígado 18. Un in vivo seguimiento det estudioermined que el PFOA también inhibió la GJIC en el hígado de ratas F344 tratadas con PFOA, validando así el sistema de modelo in vitro 12,17. Figura 7 son imágenes fluorescentes de este experimento de seguimiento que muestran la propagación colorante en los tejidos del hígado de ratas tratadas con el vehículo y el PFOA.
Figura 1: Imagen de la historieta de la etapa de bisturí colorante de carga. Una ilustración que muestra que el proceso de bisturí de carga consiste en enrollar la lámina en lugar de horizontalmente cortar a través de las células de minimizar el daño celular.
Figura 2: Imágenes microscópicas fluorescentes representativas del colorante se extendió a través de uniones. células epiteliales WB-F344 de hígado de rata se trataron durante 15 min con enarrugar dosis de fenantreno, un PAH prevalente encontrado en el medio ambiente. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Curva de respuesta a la dosis de células epiteliales WB-F344 de hígado de rata tratados con fenantreno. Áreas de imágenes SL-DT se calcularon y luego informaron como una fracción de la de control, que fueron las células tratadas con el vehículo (acetonitrilo). Cada punto de datos es un promedio de tres experimentos independientes y las barras de error son las desviaciones estándar en el límite de confianza del 95% para cada dosis después de un tiempo de exposición de 15 minutos. Una función logística de cuatro parámetros se utilizó para ajustar la línea a través de los puntos de datos. Por favor click aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El tiempo y el tiempo de recuperación de la curva de respuesta de las células epiteliales WB-F344 de hígado de rata tratados con fenantreno. Después de la completa inhibición de GJIC después de 10 min de exposición, el fenantreno medio que contiene (Phe) se cambió a Phe-Free medio y luego se monitorizaron las células para la recuperación de la inhibición. Áreas de imágenes SL-DT se calcularon y luego informaron como una fracción de la de control, que fueron las células tratadas con el vehículo (acetonitrilo). Cada punto de datos es un promedio de tres experimentos independientes y las barras de error son las desviaciones estándar en el límite de confianza del 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5: La inhibición de GJIC por 1-metilantraceno depende de fosfatidilcolina fosfolipasa específica C. 1-metilantraceno (1-MEA) es un PAH prevalente encontrado en el medio ambiente. El panel de la izquierda representan las células tratadas con el vehículo (acetonitrilo, 0,35% v / v). El panel central representa las células epiteliales WB-F344 de hígado de rata tratados durante 15 minutos con 70 mM 1-AMA. El panel de la derecha representan células pretratadas primero durante 20 minutos con 50 D609 mu M, un inhibidor de la fosfolipasa C específica fosfatidilcolina, seguido por la adición de 70 mM 1-MeA para un 15 min adicionales. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6: El resveratrol impidió la inhibición de GJIC por 1-metilantraceno. El panel de la izquierda representan las células tratadas con el vehículo (acetonitrilo, 0,35% v / v). El resveratrol es un antioxidante que se encuentra en el vino y los productos de maní rojos. El panel central representa las células tratadas durante 15 minutos con 70 mM 1-AMA. El panel de la derecha representa células pretratadas primero durante 20 minutos con 50 mM resveratrol seguido de la adición de 70 mM 1-MeA para un 15 min adicionales. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: ensayos ex vivo SL-DT de GJIC en cortes de hígado de sexo masculino ratas F-344. El panel de la izquierda representa una rebanada de TISS hígadoue de una rata tratada con el control del vehículo, sulfóxido de dimetilo, durante 24 horas. El panel de la derecha representa una rebanada de tejido hepático de una rata después de la administración intraperitoneal de 100 mg / kg de ácido perfluorooctanoico (PFOA) después de 24 hr. PFOA, un contaminante del medio ambiente prevaleciente, es un proliferador de peroxisomas promotor de tumores que induce hepatomegalia y demostró para bloquear los cruces brecha utilizando un modelo in vitro. El colorante cargado incisión se realiza en cortes de hígado desde el vehículo y los animales tratados PFOA, que luego fueron corregidos, recortado y seccionados. Reproducido de Environmental Health Perspectives 12. Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El ensayo SL-DT es una técnica sencilla y versátil en la medición de la GJIC, pero hay varios problemas críticos que deben ser explicados en el diseño de protocolos experimentales apropiados. Para las mediciones robustas de GJIC utilizando el ensayo de SL-DT tiene que haber un tinte de propagación de la LY a través de uniones de las células. Como mínimo, un tiempo adecuado se debe seleccionar para asegurar que el tinte se propaga a través de ocho o más filas de células a partir de las células de bisturí cargado en ambas direcciones. También, para la facilidad de la medición de la distancia que el colorante migra de las células de bisturí cargado, seleccionar un factor de aumento que asegura la propagación de tinte de las placas de control llena de 70 a 90% del campo de visión. Para las células epiteliales de hígado de rata WB-F344, tres minutos de incubación con la solución LY es suficiente para que el frente de colorante para moverse más allá de cuatro filas de las celdas, y una ampliación de 200X es óptima. Las células se cultivan en placas de 35 mm de diámetro, que es bastante amendable a loading de colorante en las células con un bisturí. Sin embargo, las células pueden ser cultivadas en pozos pequeños, pero el uso de un bisturí no es posible, en particular en placas de cultivo de 96 pocillos. Para los pozos pequeños, utilice un pequeño borde de corte con punta de asaltos que puede caber en el pozo, y otra vez, utilizar una acción de rodadura. Esta acción móvil es un paso fundamental, ya que es mínimamente invasiva y ofrece una línea muy limpia de la carga que impide que las células se rasgue y creando una gran brecha libre de células típicas del método original de raspado. Alternativamente, una aguja de acupuntura se puede utilizar en la que un pequeño giro de la aguja hace un buen trabajo de colorante de carga en las células.
Otros tipos de células pueden ser utilizadas en este ensayo. Sin embargo, la selección de células y la comprensión de los papeles de GJIC en un tipo celular particular es importante en la elaboración de hipótesis apropiados y el diseño de los experimentos. El primero y más obvio paso es desarrollar condiciones de cultivo celular en el que las uniones comunicantes son funcionales expresSED. En tipos de células bien diferenciadas, que realizan funciones metabólicas específicas, las uniones comunicantes suelen desempeñar un papel en la coordinación de las vías metabólicas entre células contiguas. tipos de células bien diferenciadas se han limitado, si las hay, las capacidades proliferativas y los canales probablemente juegan un papel metabólico específico de tejido que a menudo depende de la morfología y la disposición específica de las células. Por ejemplo, los miocitos cardiacos son células alargadas, donde las uniones comunicantes son predominantemente alineados en los discos intercalados, por lo tanto con el método de SL-DT requeriría la alineación de las células, que se pueden hacer en una placa de ranurado. Por lo tanto, las consideraciones cuidadosas deben hacerse para cada tipo de célula. Los estudios con cultivos de células neuronales por lo general no son confluentes y también requieren puntos de contacto específicos, lo que hace que el uso de los ensayos de GJIC no apropiado y alternativo SL-DT debe ser utilizado.
En tipos de células proliferativas, tales como células madre y progenitoras tempranas, GJIC juega un papel más críticoen la coordinación de la señalización celular eventos que controlan la expresión génica regulación de eventos mitogénicos. Las células epiteliales de hígado de rata WB-F344 utilizados en este protocolo entra en esta categoría. Genes brecha de la salida son críticos durante el desarrollo de los tejidos y el mantenimiento 19-21. Aunque los canales de unión brecha se expresan y forman en todas las superficies de la membrana plasmática de células, las células proliferativas son muy sensibles a factores de crecimiento, que inhiben la GJIC. consideraciones críticas para tipos de células proliferativas son por lo general orientadas más a la composición de los medios. Los factores de crecimiento son a menudo en exceso, particularmente en un medio definido que contiene suero bovino fetal, y uniones de hendidura de las células pueden estar en un estado cerrado. La manera más fácil de establecer la GJIC en estas células es reducir o eliminar los niveles séricos de 4 a 24 horas antes de la experimentación, a pesar de las 24 horas sería demasiado largo para las células sin suero como lo harían apoptose. Las células epiteliales hepáticas WB-F344 utilizados para los experimentos presentados en tsu papel no son demasiado sensibles al suero sin necesidad de reducir los niveles de suero. Por el contrario, los experimentos utilizando una línea celular de ratón C10 deben ser primer suero privados para establecer GJIC 22. Aunque los niveles de suero varían entre los dos tipos de células, de manera interesante, las células C-10 respondieron de manera muy similar a los isómeros de metilo de antraceno 22,23.
Otras consideraciones para resultados de calidad incluyen la realización de los experimentos con dosis no citotóxicas. Las células deben ser verificados con el microscopio de contraste de fase para determinar las características morfológicas sanos esperados del tipo de células antes y después del tratamiento. Para asegurar que los efectos de un compuesto sobre la función brecha de la salida no se debe a una respuesta citotóxica en general, los ensayos de citotoxicidad para cada compuesto se debe hacer al mismo tiempo y dosis utilizada en el ensayo de SL-DT. La realización de experimentos para determinar si un efecto inhibidor de un compuesto sobre GJIC es reversible es también un buen experimento para al menos dos razones. Messt compuestos ensayados inhiben de forma reversible la GJIC, pero si no hay recuperación de la GJIC, a continuación, podrían ser citotoxicidad se requeriría un factor y más pruebas. Sin embargo, si la GJIC se restablece entonces la dosis y el tiempo de prueba probablemente no eran citotóxicos. Hay implicaciones biológicas para la inhibición reversible de la GJIC. Los efectos adversos para la salud de muchas sustancias tóxicas y toxinas ambientales y transmitidas por los alimentos es un proceso reversible. Por lo tanto la comprensión de esta reversibilidad a nivel molecular es importante. Si un compuesto desconocido no reversible inhibe la GJIC, entonces las consecuencias para la salud de un organismo podría ser bastante diferente de la mayoría de los otros agentes y debe ser parte de los cálculos de riesgo.
La determinación de la dosis y el tiempo implicado en la inhibición de GJIC es un proceso iterativo. Para ahorrar tiempo y dinero para los suministros de cultivo, el mejor enfoque es comenzar con una dosis alta, que depende de la solubilidad y el tiempo (normalmente una hora, ya que la mayoría de inhibiciónse produce en menos de 15 min), y luego reducir el tiempo y la dosis a la mitad en un proceso prudente paso hasta que no hay ningún efecto. Si no hay inhibición a una dosis alta en una hora, luego doblar el período de tiempo en un proceso prudente paso. Los experimentos iniciales se pueden realizar en una sola placa. Una vez establecidas las estimaciones de tiempo y dosis generales, a continuación, los estudios más detallados se pueden diseñar de manera eficiente con el tamaño de las muestras adecuadas para análisis estadísticos. Una característica de diseño experimental sería el uso de la dosis y el tiempo que llegan a la inhibición 75 a 100%. Obviamente, las interpretaciones final de los resultados serán un factor de los parámetros anteriores. Sin embargo, mediante la determinación de primera un efecto biológico, incluso si la dosis y el tiempo pueden no ser relevante in vivo, las dosis establecidas pueden desempeñar un papel en situaciones de exposición ocupacional, o para las poblaciones generales expuestos a otros factores que también afectan GJIC con aditivo potencial o efectos sinérgicos.
La inhibición de GJIC por la mayoría de los compuestos normalmente no es muy variable y dos y cincuenta y ocho repeticiones (cada réplica sería una placa de cultivo o bien) es suficiente para generar dosis y el tiempo curvas de respuesta. Sin embargo, si la variabilidad es alta, entonces se necesitarían más repeticiones para obtener un valor preciso para una variable dependiente dada de un ensayo independiente. Por supuesto, al menos tres ensayos independientes necesitan ser hechas para los análisis estadísticos.
La simplicidad de este ensayo y la evaluación de los tamaños significativos de la población de células es una ventaja para muchas aplicaciones. Esto es particularmente útil en muchas evaluaciones toxicológicas. Sin embargo, existen limitaciones de los ensayos de SL-DT, que pueden depender de varios factores. Una es si esta técnica es apropiada para que se estudian las células. Este ensayo no funcionaría bien para células que no llegan a alta confluencia con contactos esporádicos a lo largo de la placa de cultivo o bien. Las técnicas alternativas, tales como la microinyección deben ser considered. Alternativamente, el ensayo SL-DT puede ser modificado. El éxito en células individuales de carga se ha logrado con una aguja de acupuntura, que requiere una ligera acción de torsión al cargar el tinte 7. La difusión de tinte sería radial en situaciones más confluentes o amorfos a través de cultivo celular con células contactos esporádicos. Se recomienda la adición de rodamina dextrano (RD, 1 mg / ml) a la solución de colorante LY para experimentos en los que la identificación de las células cargadas sería difícil sin un marcador (por ejemplo, RD). RD es demasiado grande para atravesar los canales de unión brecha, identificando así que se cargaron las células. RD también se puede utilizar en todo ensayo SL-DT, pero el bisturí deja una muesca en la parte inferior de la placa de identificación en el que se cargan las células. El ensayo también SL-DT no es propicio para la medición de cambios en GJIC entre diferentes tipos de células como la carga de colorante no discriminar entre tipos de células. Una vez más la microinyección es el método de elección, pero el método MIG aguja de acupunturaTambién HT trabajar si se puede apuntar a una celda específica usando un microscopio.
El ensayo de la cooperación metabólica es otro método para medir la GJIC. Este método fue uno de los primero bioensayo estandarizado para GJIC 24. En este ensayo, las células V79 de hámster chino de tipo salvaje (6-tioguanina y minúsculas) y células de 6-tioguanina-resistentes fueron co-cultivan a altas densidades en el que 6-tioguanina (6-TG) células resistentes no metabolizar 6-TG a un metabolito tóxico, lo que confiere resistencia. Co-cultivo con las 6-TG sensibles células da como resultado la transferencia del metabolito tóxico a través de uniones que resulta en la muerte celular, donde la inhibición de la GJIC en el rescate de 6-TG células resistentes mediante la prevención de la transferencia de la tóxico metabolito 6-TG de las células sensibles a 6-TG. Aunque una ventaja de este ensayo es que es mínimamente invasiva, una desventaja importante es que requiere una semana para la terminación, lo que hace que las evaluaciones dependientes extensa dosis y el tiempo de toxitrozas, así como estudios de mecánica, etc. poco prácticas para la evaluación de muchos productos químicos.
El ensayo SL-DT no es propicio para estudios mecanísticos que necesitan para rastrear la migración de los colorantes a través de diferentes tipos de células, en el que la microinyección es el método preferido. Alternativamente, las células se pueden precargar con el éster de metilo de los tintes fluorescentes. La carga del colorante es una función de esterasas intracelulares metilo que hidrolizan el colorante lipófilo en su forma más hidrófila, atrapando así el colorante en las células. Esta es una forma menos invasiva para precargar la sonda fluorescente, pero la manera más común para medir la comunicación intercelular, donde todas las células se cargan previamente por este método es el ensayo FRAP 11. La ventaja de FRAP es una vez más la capacidad de evaluar las uniones comunicantes en las células individuales, lo cual es excelente para los estudios sobre el mecanismo. Sin embargo, la desventaja de FRAP se encuentra en: la imposibilidad de medir las poblaciones de células para las evaluaciones toxicológicas,la necesidad de citómetros de microscopios / láser sofisticados y muy caro, la necesidad de conocimientos técnicos altamente cualificados, es moderadamente invasiva de los radicales libres producidos por el láser, y no es propicio para un alto rendimiento.
Más recientemente otra técnica se ha desarrollado; la activación local del método molecular sonda fluorescente (LAMP) 25, que se basa en una nueva generación de fluoróforos cumarina enjaulados. Al igual que en el ensayo FRAP, todas las células se cargan previamente con colorantes que contiene un éster de metilo, sin embargo, estos colorantes se convierten fluorescente tras la iluminación localizada posterior por rayos láser con una pequeña dosis de luz ultravioleta, que probablemente produce ROS significativamente más bajos que FRAP. Una vez más, este ensayo tiene las mismas limitaciones del ensayo FRAP. Otros avances recientes para medir la GJIC son las técnicas de precarga y paracaídas, que también implican el uso de tintes fluorescentes de tipo éster de metilo. La técnica de precarga implica suspenderlas células precargadas con sonda fluorescente junto con los homólogos en vacío y luego se colocan en placas y se dejan para formar una monocapa confluente. La difusión del colorante a continuación, se puede observar con un microscopio de epifluorescencia 26. En el ensayo de paracaídas, las células precargadas con la sonda fluorescente se superponen sobre una monocapa de células sin carga, y la difusión del colorante se observa con un microscopio de epifluorescencia 27. Una vez más, las técnicas anteriores son técnicamente más difícil para los análisis de alto rendimiento, y debe ser plateado inmediatamente a cerca de la confluencia y requiere un lapso de tiempo para la reinserción de las células.
En general, el ensayo de SL-DT es una técnica relativamente barato, simple y versátil que utiliza equipos, tales como incubadoras de CO 2 de células de cultivo, cabinas de seguridad biológica y microscopio de epifluorescencia, que típicamente se encuentran en la mayoría de los laboratorios de cultivo celular. Con experiencia mínima muchas placas se pueden procesar en un día, lo que es propicio fo el cribado de compuestos para la toxicidad, así como de los productos naturales que previenen o revierten los efectos de las sustancias tóxicas y toxinas. Además, la adaptación de este ensayo para un alto rendimiento analiza usando robótica, con sistemas automatizados de formación de imágenes y análisis de microscopía de fluorescencia tendrá el potencial para detectar un gran número de sustancias tóxicas y toxinas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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