Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoff-Transfertechnik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanäle misst. Gap junctions interzelluläre Kommunikation ist ein wichtiger zellulärer Prozess, durch den Gewebe-Homöostase aufrechterhalten wird und die Unterbrechung dieser Zellsignalisierung hat negative Auswirkungen auf die Gesundheit.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoffübertragung (SL-DT) Technik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanälen misst, das ein wichtiger interzellulären Prozess, durch den Gewebshomöostase gehalten wird. Unterbrechung der interzellulären Gap Junction - Kommunikation (GJIC) durch Noxen, Toxine, Drogen usw. zu zahlreichen negativen Auswirkungen auf die Gesundheit in Verbindung gebracht worden. Viele genetisch-bedingte Krankheiten wurden Mutationen in Gap Junction-Genen verbunden. Die SL-DT-Technik ist eine einfache Funktionstest für die simultane Beurteilung der GJIC in einer großen Population von Zellen. Der Assay beinhaltet Vorbelastung Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff kurz mit einer Skalpellklinge durch eine Population von Zellen, die Zellmembran gestört. Der Fluoreszenzfarbstoff wird dann für eine bestimmte Zeit zu benachbarten Zellen zu durchqueren, durch gap junction Kanäle erlaubt. Der Assay wird dann durch Zugabe von Formalin zu den Zellen beendet. Die Ausbreitung der Fluorescent Farbstoff durch eine Population von Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop beurteilt und die Bilder werden mit einer beliebigen Anzahl von morphologisch Softwarepakete analysiert, die verfügbar sind, einschließlich Pakete freie Software auf dem öffentlichen Bereich gefunden. Dieser Test wurde auch für in vivo - Studien unter Verwendung von Gewebeschnitten aus verschiedenen Organen von behandelten Tieren angepasst. Insgesamt kann der SL-DT - Test eine breite Palette von in - vitro - pharmakologischen und toxikologischen Bedürfnisse dienen, und kann möglicherweise für einen hohen Durchsatz Set-up - Systeme mit automatisierten Fluoreszenzmikroskopie Bildgebung und Analyse angepasst werden , um mehr Proben in kürzerer Zeit aufzuklären.
Introduction
Das Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache, umfassende und relativ kostengünstige Technik bereitzustellen, die potentiellen Toxizitäten von Verbindungen zu bewerten. Dies ist ein in vitro - Ansatz , die in mehreren Zelllinien verwendet werden kann. Standard-Zellbiologie Labors ausgestattet mit Epifluoreszenz Mikroskope können die Forschung mit diesen Test durchführen.
Unsere Grundkenntnisse in der Zellfunktionen hat sich auf in - vitro - Biotests stark abhängig gewesen und hat eine wesentliche Komponente in die toxikologische Bewertung von Arzneimitteln, Umweltschadstoffe und Essen geboren Verunreinigungen werden. Leider gibt es keine einzige in - vitro - Bioassay - System , das die Anforderungen für alle toxikologische Bewertungen umfassend erfüllen können. Viele in vitro - Assays sind entwickelt und optimiert sowie zu bewerten als eine spezifische biochemische oder molekulare Endpunkt bewerten. Diese sind ziemlich oft kombiniert in einem hohen Durchsatz eingerichtet, um eine Störung eines reflektierenbestimmten Signaltransduktionsweg, wie Östrogen-Rezeptor - 1 signalisiert. Diese Strategie ist recht erfolgreich, aber die umfangreiche Anzahl von Signaltransduktionswegen in Genexpression beteiligt macht die Aufgabe, einen spezifischen Signalweg des Wählens recht komplex zu beurteilen. Hochdurchsatz-Protokolle werden derzeit entwickelt und verwendet, um gleichzeitig zahlreiche Signalwege messen, die ein Ansatz gewesen einige der Beschränkungen der einzelnen Tests zu überwinden. Allerdings sind nicht alle Signalwege wurden erfolgreich in umfassendere Ansätze integriert, sowie neue Signalwege ständig entdeckt werden, dass weitere verkompliziert diesen Bewertungsprozess. Mit umfangreichen Anzahl von in - vitro - Ansätzen, besonders hohe Durchsatzsysteme für umfassende toxikologische Bewertungen sind auch sehr teuer und sind nicht förderlich für die meisten Einzel Ermittler führte Forschungsprojekte.
GJIC ist ein Prozess, WIG-htly gesteuert durch Veränderungen in der Spannung, Calciumkonzentration, pH - Wert, Redox - Gleichgewicht, 2,3 von bedeutenden intrazelluläre Signalübertragungswege und Interaktionen mit Membran und Zytoskelett Proteine reguliert. Somit Hemmung der GJIC können verschiedene Arten von zellulärem Stress, Störung von verschiedenen zellulären Funktionen reflektieren oder Störungen verschiedener Signaltransduktionswege. Ein weiterer Ansatz , um die Nutzung der begrenzten Signaltransduktion Biotests zu überwinden , ist die Vorteile der biologischen Phänomene zu nehmen , dass viele, wenn nicht die meisten, Signaltransduktionswege werden durch kooperative Systeme interzelluläre Signalübertragung moduliert durch gap junction Kanäle 4-8. Obwohl interzellulären Signalsystemen auch zahlreich sind und unter mehreren Stoffwechselweg Steuerung, ist die interzelluläre Signalübertragung durch Gap Junction Kanäle letztlich eine Funktion der Kanäle geöffnet wird, teilweise geschlossene oder ganz geschlossen. Dies stellt einen Endpunkt, der leicht gemessen werden kann unter Verwendung verschiedenerIn - vitro - Bioassay - Systeme 7. Bedenkt man, dass die Homöostase Sollwert eines Gewebes offene Kanäle erfordert, um die Wirkung der Verbindungen auf die interzelluläre Kommunikation über Gap junctions Bestimmung (GJIC) ist ein umfassender Ansatz in 4,8 potentiellen toxischen Wirkungen von Verbindungen zu bestimmen. Im Wesentlichen diese kritische biologische Phänomen, das eine zentrale Rolle spielt mehrere Signaltransduktionsereignissen bei der Koordinierung der Expression Steuerung Gen ermöglicht eine umfassende Bewertung der toxischen Wirkungen. So Biotests, die GJIC sind ein ausgezeichneter Ausgangspunkt beurteilen das toxische Potenzial von Verbindungen zu bewerten.
Die umfangreichsten verwendeten Techniken GJIC zur Beurteilung basieren auf Zellen mit einer fluoreszierenden Sonde und dann die Überwachung der Migration des Farbstoffs aus der beladenen Zelle oder Zellen zu benachbarten Zellen Vorbelastung. Techniken , um den Farbstoff vorzubelasten haben beteiligten Mikroinjektions 9, Scrape Loading 10, und Methylester der Sonden 11 10. Anstatt die mehr invasive schaben, das Skalpell Ladeverfahren dieses Berichts beinhaltet eine sanfte Rolle eines Skalpells mit einer runden Klinge durch eine Monoschicht von Zellen , die invasive Schaden (Abbildung 1) zu minimieren. Die Vorteile dieser Technik sind die toxikologische Beurteilung einer Population von Zellen, anstatt einzelne Zellen des Mikroinjektionsassay. Darüber hinaus ermöglicht die Einfachheit dieses Tests für die schnelle Detektion von mehreren Platten in kurzer Zeit während Methoden Mikroinjektionstechniken und Techniken, die Methylester von Fluoreszenzsonden verwenden wesentlich zeitaufwendig und erfordern eine wesentlich höhere Fähigkeitsniveau.
Zwar gibt es keine einzige Methode, die Bedürfnisse aller GJIC des Studiums zu erfüllen; SL-DT-Test ist eine einfache, relativ kostengünstig und vielseitig Test, der kannviele der Anforderungen für die erste Bewertung der Toxizitäten verschiedener Verbindungen erfüllen. Hauptvorteile sind: Einfachheit, keine besondere Notwendigkeit für die Ausrüstung oder Fähigkeiten, die für andere Verfahren, wie Mikroinjektion, fluoreszierende Erholung nach Photobleaching (FRAP) -Assay und lokale Aktivierung von molekularem fluoreszierenden Sonden-Assays, eine schnelle und gleichzeitiger Beurteilung von GJIC in einem großen erforderlichen Anzahl der Zellen, förderlich für eine hohe Durchsatzaufbau mit automatisierten Fluoreszenzmikroskopie - Bildgebung und Analyse sowie seine Anpassungsfähigkeit für in vivo - Studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Protokoll für diese Studie wurde von der Animal Care and Utilization Ausschuss der National Institutes of Health Sciences of Japan zugelassen , was ist , wo die in - vivo - Experimente durchgeführt wurden, um sicherzustellen , dass die Ratten auf humane Weise und mit Bezug zur Linderung des Leidens behandelt wurden.
1. SL-DT Bioassay
- Seed 3 x 10 5 WB-F344 Rattenleber - Epithelzellen auf 35 mm Durchmesser - Kulturplatten Eagles enthaltend modifiziertes Medium plus 5% fötalem Rinderserum, und Kultur der Zellen in einem Inkubator bei 37 ºC, 100% relative Luftfeuchtigkeit (RH), 5% CO 2.
- Kultur die Zellen bis zum Erreichen von 100% Konfluenz (typischerweise, 2 Tage), und leiten die gewünschte experimentelle Behandlung der Zellen wie nachfolgend beschrieben.
- Führen Dosis-Wirkungs-Experimente
- Fügen Sie 10 & mgr; l und 20 & mgr; l einer 2 mM Vorratslösung von Phenanthren in 100% Acetonitril und 4 & mgr; l, 6 ul und 8 ul einer 20 mM Stammlösung von phenanThren in 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für jedes hinzugefügte Volumen der Vorratslösung.
- Hinzufügen 4 ul, 6 ul, 8 ul, 10 ul und 20 ul einer 100% igen Lösung von Acetonitril zu drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für jedes hinzugefügte Volumen Acetonitril-Lösung als Fahrzeugsteuerung zu dienen.
- Inkubieren Platten für 15 min in einem Inkubator bei 37 ° C, 100% RH und 5% CO 2 eingestellt.
- Gehen Sie zu Schritt 1.3 umgesetzt.
- Verhaltenszeitverhalten Experimente
- ADD 7 & mgr; l einer 20 mM Stammlösung von Phenanthren in 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für jeden Zeitpunkt (dh 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
- ADD 7 ul 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für jeden Zeitpunkt als die Fahrzeugsteuerung zu dienen.
- Die Platten für jede bestimmte Zeit point in einem Inkubator bei 37 ° C, 100% RH und 5% CO 2.
- Gehen Sie zu Schritt 1.3 umgesetzt.
- Führen Sie Zeitwiederfindungsversuche
- ADD 7 & mgr; l einer 20 mM Stammlösung von Phenanthren in 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für 15 min.
- ADD 7 ul 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für 15 min, wenn die Fahrzeugsteuerung zu dienen.
- Dekantiert, das Medium entweder das Phenanthren oder Acetonitril und spülen 3x mit je 3 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) enthält.
- 2 ml frischem Wachstumsmedium auf jeder Platte und Inkubation für den gewünschten Wiederherstellungszeiten (dh 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) in einem Inkubator bei 37 ° C, 100 % rF und 5% CO 2.
- Gehen Sie zu Schritt 1.3 umgesetzt.
- Verhaltensmechanismus Experimente
- Fügen Sie die Signaltransduktion Inhibitor, dh
- Zugabe von 5 & mgr; l 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für 15 min, wenn die Fahrzeugsteuerung zu dienen.
- ADD 7 & mgr; l einer 20 mM Stammlösung von Phenanthren in 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium plus der D609 für weitere 15 min.
- ADD 7 ul 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium plus 100% Acetonitril für weitere 15 min, wenn die Fahrzeugsteuerung zu dienen.
- Gehen Sie zu Schritt 1.3 umgesetzt.
- Führen Dosis-Wirkungs-Experimente
- Entsorgen Sie das Kulturmedium durch entweder sanft das Medium oder durch Vakuum-Saug-Abgießen.
Hinweis: Entsorgen Kulturmedium in geeigneter Weise gefährliche Abfälle enthalten. - Spülen Sie die Zellen dreimal mit je 3 ml PBS und entweder dekantieren oder absaugen between spült.
- Pipette 1 ml von 1 mg / ml Lucifer Yellow-Farbstoff in PBS (LY) in jede Zelle Platte gelöst.
- Preload den Farbstoff in die Zellen durch vorsichtiges ein # 20 chirurgische Stahlklinge mit einer abgerundeten Kante durch eine Population von Zellen in drei verschiedenen Bereichen der Platte rollen.
- Beginnen Sie mit dem Skalpell senkrecht (90 ° Winkel) und 5 mm vom Rand der Kulturplatte platzieren und dann rollen das Skalpell aus dieser senkrechten Winkel um einen Winkel von 15 ° (siehe Abbildung 1).
Hinweis: Dies wird erreicht, indem das Skalpell zwischen dem Zeigefinger und Daumen einklemmen. Verwenden Sie die Schwerkraft das Skalpell zu ermöglichen, sanft zu 15 ° Position aus den 90 ° zu gehen (wie die abgerundete Klinge einfach den Zellen rollt). Diese Bewegung wird eine optisch bemerkbar Einbuchtung Linie verlassen.
- Beginnen Sie mit dem Skalpell senkrecht (90 ° Winkel) und 5 mm vom Rand der Kulturplatte platzieren und dann rollen das Skalpell aus dieser senkrechten Winkel um einen Winkel von 15 ° (siehe Abbildung 1).
- Inkubieren der Zellen mit dem LY-Lösung für 3 min bei Raumtemperatur.
- Dekantieren oder die LY absaugen und spülen dreimal mit 3 ml PBS alle extrace zu entfernenllular Farbstoff auf extrazelluläre Hintergrundfluoreszenz zu beseitigen.
- 0,5 ml 10% phosphatgepufferter Formalinlösung die Zellen zu fixieren.
Hinweis: Nach dem in Formalin Fixierung Luft die Zellen trocknen und lagern im Dunkeln bis zu zwei Jahren mit mindestens Photobleichens des LY-Farbstoff. Bei Bedarf Rehydrierung mit 10% Formalin-Lösung den Fluoreszenzfarbstoff Vorderseite sichtbar zu machen. - Sehen Sie sich die fixierten Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem dichroitischen Würfel ausgestattet für die Anregung / Emissionsspitzen von 428/536 nm bei 200-facher Vergrößerung. Richten Sie alle Platten, so dass die Einbuchtung Linie auf die horizontale Sichtfeld ist parallel.
Hinweis: Ein FITC dichroitische Würfel gut funktioniert.- Nehmen Sie das Bild mit einer CCD-Kamera und Unterstützung von Software.
- Öffnen Sie die unterstützende Software für die CCD-Kamera und verwenden Sie die Einstellungen für die automatische Belichtung. Verwenden Sie die "Capture" -Taste, um das Bild digital zu erwerben. Speichern Sie das Bild als TIF-Dateien, die "Save" Taste.
2. Anpassung des SL-DT Assay auf Lebergewebe
- Entfernen Sie etwa eine 2 x 2 cm Scheibe von der linken Lappen der Leber von einem 5 - Wochen alten, männlichen Fischer 344 Ratten mit Dissektion Schere und legen Sie es auf einer Plastik weigh Platte 12 mit nassen Gaze abgedeckt.
- Pipette 0,5 ml einer PBS-Lösung, enthaltend 1 mg / ml jeweils von Lucifer Yellow und Rhodamin-Dextran (RD) auf die Oberfläche der Leber slice in der Kunststoffplatte wiegen.
Hinweis: Die RD ist ein Farbstoff, der nicht Gap Junction Kanäle durchqueren können und werden die Zellen markieren, die geladen wurden. - Machen Sie drei vor fünf Einschnitte etwa 1 cm lange auf der Oberfläche der Leber in Scheiben schneiden, die die Farbstofflösung im Wiegeplatte mit einer scharfen Klinge hat und dann fügen Sie zusätzliche Farbstoff ausreicht, um die Einschnitte zu füllen.
- Inkubieren des Gewebes für 3 min bei Raumtemperatur auf die Kunststoffplatte wiegen.
- Spülen dreimal mit 5 ml PBS.
- Befestigen Sie das Gewebe overnight in 30 ml 10% Phosphat-gepuffertem Formalin in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen in der Dunkelheit bei Raumtemperatur.
- Am folgenden Tag, waschen Sie die Scheiben mit Wasser, schneiden Gewebe um den Einschnitt mit einer Schere in 1 x 1 x 0,5 cm 3 Streifen und dann mit Standardtechniken seziert die Scheiben in Paraffin 13 einzubetten.
- Abschnitt die Scheiben senkrecht zur Schnittlinie zu einer Dicke von 5 um und lagern die Proben im Dunkeln , bis sie bereit Standard Schneidetechniken mit einem Mikrotom 13 mit abgebildet werden.
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenz - Mikroskop mit einer CCD - Digitalkamera ausgestattet , zu visualisieren und zu erfassen , die Bilder der Fluoreszenzfarbstoff Fronten gemäß Abschnitt 1.10 7.
3. Quantifizieren GJIC
- Messen Sie den Fluoreszenzfarbstoff Ausbreitung eines morphometrischen Software - Paket (zB ImageJ).
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei" und dann auf "Öffnen" die zu öffnengespeicherte Bild.
- Klicken Sie auf das "Free Hand-Werkzeug" in der Werkzeugleiste Tab den Umriss der Farbstofffront zu verfolgen.
- Klicken Sie auf "Analysieren" klicken und klicken Sie dann auf "Messen".
Hinweis: Dies wird eine Fläche Wert in einer Tabellenkalkulation erzeugen, die in andere Tabellenkalkulationsprogramme kopiert werden können, falls gewünscht.
- Mit Hilfe eines Tabellenkalkulationsprogramm, berechnen den Anteil der Regelung (FOC) durch den Bereich des Farbstoffs Ausbreitung in der experimentellen Platte dividiert durch die Fläche der Farbstoff in der Steuerplatte gereist, um die folgende Gleichung:
A e = Fläche des Farbstoffes Ausbreitung in Zellen zu einem experimentellen variable ausgesetzt, beispielsweise mit einer Chemikalie an einer bestimmten Dosis oder Zeit behandelten Zellen
A c = Fläche des Farbstoffes Ausbreitung in der Steuerung, die Zellen mit dem Träger behandelt werden verwendet , um die chemische interessierende aufzulösen
Hinweis: Um die Wirkung des Fahrzeugs zu bestimmen,A e würde der Bereich der Farbstoff Ausbreitung in Zellen , die durch das Fahrzeug und A c wäre der Bereich der Farbstoff Ausbreitung in Zellen durch das Fahrzeug nicht behandelt behandelt sein. Die Wirkung des Fahrzeugs sollte vorzugsweise weniger als 10%.
- Nehmen Sie das Bild mit einer CCD-Kamera und Unterstützung von Software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Unterbrechung der GJIC wurde als Biomarker zur Identifizierung von toxischen Verbindungen in der nicht genotoxisch, epigenetischer Ebene der Gen - Steuerung , die induziert schädliche Auswirkungen auf die Gesundheit 14 ausgiebig genutzt. Zum Beispiel sind polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAHs) ubiquitär Verunreinigungen der Umwelt , sondern unterscheiden sich in ihrer epigenetischen Toxizitäten als Funktion ihrer molekularen Strukturen 15. Die mit niedrigerem Molekulargewicht PAKs sind in der Regel bei relativ höheren Konzentrationen als die höheren Molekulargewicht PAHs in vielen unterschiedlichen Umgebungen wie kontaminierten Flusssedimente , die der Zigarettenrauch 15,16 gefunden. Phenanthren ist ein Beispiel für eine mit niedrigem Molekulargewicht PAH, die mit einem Winkel Tasche drei Benzolringe besitzen die Bucht Region genannt. Figur 2 ist eine Reihe von SL-DT Bilder von WB-F344 Rattenleber - Epithelzellen , behandelt mit Dosen von Phenanthren erhöhen. Beachten Sie die Abnahme der Migration of den Fluoreszenzfarbstoff, Lucifer Yellow, mit steigenden Dosen. Die Flächen der gescannten Bilder können als ein Bruchteil der Steuerung (FOC) bestimmt werden. Die Steuerung für 2 werden die Zellen mit dem Lösungsmittel behandelt , dass die PAH wurde aufgelöst in, nämlich Acetonitril. Typischerweise SL-DT Experimente werden doppelt oder dreifach für jeden Versuch mit einem Minimum von drei unabhängigen Versuchen für jeden experimentellen Parameter durchgeführt, die eine Dosis in diesem Experiment würde. Die Werte FOC können dann gemittelt werden, statistisch ausgewertet, und dann (siehe Abbildung 3) grafisch dargestellt.
Ähnliche Experimente sind auch von dieser durch toxische Substanzen induzierten Hemmung der GJIC zu erholen routinemäßig durchgeführt, die Zeit für toxische Substanzen induzierten Hemmung der GJIC, und die Zeitdauer zu schaffen erforderlich, nachdem die Zellen zu toxicant freies Medium übertragen werden. Abbildung 4 zeigt sowohl die Zeitverhalten und Erholung von Hemmung durch Phenanthren (Phe). Der SL-DT Assay kann auch durch die Giftstoff und Giftstoffe GJIC 4,16 dysregulate zugrunde liegenden Mechanismen verwendet werden , zu bestimmen. Dies wird durch Vorinkubieren Zellen mit einem pharmazeutischen Inhibitor eines ausgewählten Signalwegs vor der Zugabe des toxicant oder Toxin durchgeführt, die GJIC dysregulates. Wenn der toxicant oder Toxin nicht mehr dysregulates GJIC in Gegenwart eines ausgewählten pharmazeutischen blockiert ein Signalweg, dann ist dieser Weg bestimmt wird, ein regulatorisches Weg der GJIC zu sein, während solche Wege ausgeschlossen werden kann, wenn die toxicant GJIC zu dysregulate fortgesetzt. Figur 5 zeigt dieses Prinzip in der 1-Methylanthracen (1-MEA), weitere drei beringten PAH , die GJIC hemmt, aber nicht in Gegenwart von D609, die ein ziemlich spezifischer Inhibitor von Phosphatidylcholin spezifischer Phospholipase C (PC-PLC). Somit PC-PLC als Kandidat Signalisierungs Enzym in 1-MeA-induzierten Hemmung der GJIC beteiligt entschied. Die Rolle von PC-PLC wurde mit f validierteitere Experimentieren 4,16. Insgesamt sind die SL-DT-Assays recht förderlich, den Prozess der Zuordnung Signalisierungsnetze in den Mechanismen, wie Giften und Toxinen beteiligt zu beginnen hemmen (dysregulate) GJIC. Dieser Ansatz kann auch zum Screening für natürliche Produkte verwendet werden, die einen Giftstoff oder Toxin aus dysregulating GJIC blockieren kann. Verhindern kann , Hemmen GJIC (Abbildung 6) 1-MeA beispiels, Resveratrol, ein Antioxidationsmittel in hohen Konzentrationen in Rotwein und Erdnuss - Produkte gefunden.
Der SL-DT - Assay wurde auf Gewebeschnitten von Tieren, insbesondere in der Leber 17 angepasst. Perfluoroctansäure (PFOA) ist ein 8-Kohlenstoff - fluorierte Fettsäure, die eine persistente Umweltschadstoff bekannt ist , um Leberkrebs 12,17 induzieren. Verwendung der SL-DT - Technik wurde PFOA gezeigt GJIC in einem in vitro - WB-F344rat Lebermodell System 18 zu hemmen. Eine In - vivo - Follow-up - Studie determined dass PFOA auch 12,17 GJIC in der Leber von F344 - Ratten , behandelt mit PFOA, wodurch die Validierung der in vitro - Modellsystem inhibiert. 7 sind Fluoreszenzbilder von diesem Follow-up - Experiment zeigt den Farbstoff Ausbreitung in Lebergewebe von Ratten , die mit dem Fahrzeug und PFOA behandelt.
Abbildung 1: Cartoon Bild des Skalpells Farbstoffbeladung Schritt. Eine Darstellung zeigt, dass das Skalpell Ladevorgang die Klinge statt horizontal Schneiden durch die Zellen beinhaltet das Walzen als eine Zellschädigung zu minimieren.
Abbildung 2: Repräsentative Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen des Farbstoffs ausgebreitet durch gap junctions. WB-F344 Rattenleber Epithelzellen wurden für 15 min behandelt mit inKnittern Dosen von Phenanthren, fand eine weit verbreitete PAH in der Umwelt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Dosis - Wirkungskurve von Phenanthren behandelter WB-F344 Rattenleber - Epithelzellen. Bereiche der SL-DT Bilder wurden berechnet und dann als ein Bruchteil der Steuerung gemeldet, die mit dem Vehikel behandelt wurden Zellen (Acetonitril). Jeder Datenpunkt ist ein Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten und die Fehlerbalken sind die Standardabweichungen bei der 95% Vertrauensgrenze für jede Dosis nach 15 min Belichtungszeit. Ein Vier-Parameter wurde logistische Funktion verwendet, um die Linie durch die Datenpunkte zu passen. Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Zeit und Time - Recovery - Wirkungs - Kurve von Phenanthren behandelten WB-F344 Rattenleber Epithelzellen. Nach der vollständigen Hemmung der GJIC nach 10 min Exposition wurde das Medium enthaltend Phenanthren (Phe) bis Phe-freies Medium umgeschaltet und dann wurden die Zellen für die Wiederherstellung aus der Hemmung überwacht. Bereiche der SL-DT Bilder wurden berechnet und dann als ein Bruchteil der Steuerung gemeldet, die mit dem Vehikel behandelt wurden Zellen (Acetonitril). Jeder Datenpunkt ist ein Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten und die Fehlerbalken sind die Standardabweichungen bei der 95% Vertrauensgrenze. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
her.within-page = "1"> 
Abbildung 5: Hemmung der GJIC von 1-Methylanthracen ist abhängig von Phosphatidylcholin spezifischer Phospholipase C 1-Methylanthracen (1-MEA) ist eine weit verbreitete PAH in der Umwelt zu finden. Die linke Tafel repräsentieren Zellen, die mit dem Vehikel behandelt (Acetonitril, 0,35% v / v). Das mittlere Feld stellt WB-F344 Rattenleber epithelialen für 15 Minuten mit 70 & mgr; M 1-MeA behandelten Zellen. Die rechte Tafel repräsentieren Zellen vorbehandelt zuerst für 20 min mit 50 uM D609, einem Phosphatidylcholin-spezifischer Phospholipase C-Inhibitors, gefolgt von der Zugabe von 70 & mgr; M 1-MeA für weitere 15 min. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
281fig6.jpg "/>
Abbildung 6: Resveratrol verhindert die Hemmung der GJIC durch 1-Methylanthracen. Die linke Tafel repräsentieren Zellen, die mit dem Vehikel behandelt (Acetonitril, 0,35% v / v). Resveratrol ist ein Antioxidans in Rotwein und Erdnuss-Produkte gefunden. Das mittlere Feld steht für 15 Minuten mit 70 & mgr; M 1-MeA behandelten Zellen. Die rechte Tafel stellt Zellen zuerst für 20 min vorbehandelt mit 50 uM Resveratrol, gefolgt von der Zugabe von 70 & mgr; M 1-MeA für weitere 15 min. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Ex vivo SL-DT Assays GJIC in Leberschnitten von männlichen F-344 - Ratten. Die linke Abbildung stellt ein Stück Leber tissue aus einer Ratte mit der Fahrzeugsteuerung, Dimethylsulfoxid behandelt, für 24 Stunden. Im rechten Bereich eine Scheibe Lebergewebe von einer Ratte nach intraperitoneale Verabreichung von 100 mg repräsentiert / kg Perfluoroctansäure (PFOA) nach 24 Stunden. PFOA, ein weit verbreitetes Umweltkontaminante, ist ein Tumor Förderung Peroxisomenproliferator die Hepatomegalie und demonstriert induziert Gap Junctions zu blockieren , ein in vitro - Modell. Der Einschnitt geladen Farbstoff wurde auf die Leberscheiben aus dem Fahrzeug und PFOA behandelten Tieren durchgeführt, die dann behoben wurden, getrimmt und geschnitten. Übernommen aus Environmental Health Perspectives 12. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der SL-DT-Test ist eine einfache und vielseitige Technik in GJIC messen, aber es gibt mehrere kritische Bedenken, die berücksichtigt werden sollten geeignete experimentelle Protokolle in der Gestaltung. Für robuste Messungen von GJIC die SL-DT-Test dort verwendet, muss eine gute Farbstoff Ausbreitung des LY durch gap junctions der Zellen sein. Zumindest sollte eine ausreichende Zeit, um sicherzustellen, gewählt werden, dass der Farbstoff breitet sich durch acht oder mehrere Reihen von Zellen aus den Skalpell beladenen Zellen in beiden Richtungen. Auch für die Leichtigkeit der Messung der Entfernung, die der Farbstoff aus dem Skalpell beladenen Zellen migrierten, wählen einen Vergrößerungsfaktor, die der Farbstoff Ausbreitung der Steuerplatten füllt 70 bis 90% des Sichtfeld sicherstellt. Für die WB-F344 Rattenleber Epithelzellen, 3 Minuten Inkubation mit dem LY-Lösung ist ausreichend für die Farbstofffront über vier Zellenreihen zu bewegen, und ein 200-facher Vergrößerung ist optimal. Die Zellen werden auf 35 mm Durchmesser-Platten gezüchtet, was ziemlich abänderbar ist loading der Farbstoff in die Zellen mit einem Skalpell. Jedoch können Zellen in kleinen Vertiefungen gezüchtet werden, aber die Verwendung eines Skalpells ist nicht möglich, insbesondere in 96-Well-Kulturplatten. Für kleine Brunnen mit einem kleinen runden bestückte Schneidkante, die in die gut passen können, und wieder, eine rollende Aktion verwenden. Diese Rollbewegung ist ein entscheidender Schritt, da sie minimal invasiv ist und bietet eine sehr saubere Linie des Ladens, die die Zellen aus gerissen und die Schaffung einer großen zellfreien Lücke typisch für die ursprünglichen Schaben Methode verhindert. Alternativ kann eine Akupunkturnadel, bei dem werden verwendet, um eine kleine Verdrehung der Nadel ist eine schöne Aufgabe des Ladens Farbstoff in die Zellen.
Andere Zelltypen können in diesem Assay verwendet werden. Jedoch Auswahl von Zellen und das Verständnis der Rolle von GJIC in einem bestimmten Zelltyp ist wichtig, in geeigneter Hypothesen und die Konstruktion der Experimente einrahmen. Der erste und offensichtlichste Schritt Zellkulturbedingungen, bei denen funktionelle gap junctions Expres zu entwickeln sindsed. In gut differenzierten Zelltypen, die spezifische Stoffwechselfunktionen ausführen, Gap Junctions spielen typischerweise eine Rolle Stoffwechselwege zwischen benachbarten Zellen zu koordinieren. Gut differenzierte Zelltypen beschränkt, wenn überhaupt, proliferative Kapazitäten und die Kanäle wahrscheinlich eine gewebespezifische metabolische Rolle spielen, die oft hängt von der Morphologie und spezifische Anordnung von Zellen. Sind beispielsweise kardiale Myozyten länglichen Zellen, wo Gap Junctions überwiegend an den interkalierten Scheiben ausgerichtet sind, so dass die SL-DT-Verfahren erfordern würde, um die Zellen auszurichten, die in einer genuteten Schale durchgeführt werden kann. So müssen vorsichtig Überlegungen für jeden Zelltyp hergestellt werden. Studien mit neuronaler Zellkulturen werden typischerweise nicht konfluent und erfordern auch spezielle Kontaktstellen, welche die Verwendung der SL-DT ungeeignet und alternative GJIC Assays verwendet werden müssen macht.
In proliferative Zelltypen, wie Stengel und frühen Vorläuferzellen spielt GJIC eine kritische Rollebei der Koordinierung der Zelle Signalereignisse, die die Kontrolle der Genexpression regulieren mitogene Ereignisse. Die WB-F344 Rattenleber epithelialen in diesem Protokoll verwendeten Zellen fällt in diese Kategorie. Gap Junction - Gene sind von entscheidender Bedeutung bei der Gewebeentwicklung und -pflege 19-21. Obwohl Gap Junction Kanäle exprimiert werden und auf allen Zellplasmamembran Oberflächen gebildet, sind proliferative Zellen auf Wachstumsfaktoren sehr empfindlich, die GJIC hemmen. Kritische Überlegungen für proliferative Zelltypen sind in der Regel auf die Zusammensetzung des Mediums ausgerichtet ist. Wachstumsfaktoren sind oft im Überschuss, insbesondere in undefinierten Medium, das fötales Rinderserum enthält und die gap junctions "Zellen können in einem geschlossenen Zustand befinden. Der einfachste Weg, GJIC in diesen Zellen zu etablieren ist zu reduzieren oder die Serumspiegel für 4 bis 24 Stunden vor dem Experiment zu entfernen, obwohl 24 Stunden zu lang sein würde, für Zellen ohne Serum, wie sie würden apoptose. Die WB-F344 Leber Epithelzellen für die Experimente verwendet in t vorgestelltsein Papier sind nicht übermäßig empfindlich, ohne dass die Serum-Serumspiegel zu senken. Im Gegensatz dazu Experimente mit einer C10 - Maus - Zelllinie muss zuerst Serum sein beraubt GJIC 22 zu etablieren. Obwohl die Serumspiegel zwischen den beiden Zelltypen variieren Interessanterweise reagierten die C-10 - Zellen sehr ähnlich wie Methyl - Isomere von Anthracen 22,23.
Weitere Überlegungen zur Qualität der Ergebnisse gehören die Durchführung der Experimente an nicht-zytotoxischen Dosen. Zellen müssen mit Phasenkontrastmikroskopie überprüft werden gesunde morphologischen Eigenschaften des Zelltyps vor und nach der Behandlung zu erwarten zu bestimmen. Um sicherzustellen, dass die Effekte einer Verbindung auf gap junction-Funktion auf eine allgemeine zytotoxische Antwort nicht fällig ist, Zytotoxizitätsassays für jede Verbindung sollte zur gleichen Zeit durchgeführt werden und in dem SL-DT-Assay verwendete Dosis. Durchführung von Experimenten, um zu bestimmen, ob eine inhibitorische Wirkung einer Verbindung auf GJIC umkehrbar ist, ist auch ein guter Experiment für mindestens zwei Gründen. Mogetestet st Verbindungen hemmen reversibel GJIC, aber wenn es keine Erholung der GJIC ist, dann könnte die Zytotoxizität ein Faktor und weitere Tests wäre erforderlich. Wenn jedoch GJIC wiederhergestellt wird dann die Dosis und Zeit getestet wurden, waren wahrscheinlich nicht zytotoxisch. Es gibt biologische Implikationen für die reversible Hemmung der GJIC. Die negativen Auswirkungen auf die Gesundheit vieler Umwelt- und Lebensmittel getragen Giften und Toxinen ist ein reversibler Prozess. Daher auf molekularer Ebene dieses Reversibilität zu verstehen, ist wichtig. Wenn eine unbekannte Verbindung nicht reversibel GJIC hemmen, könnten die Auswirkungen auf die Gesundheit eines Organismus ganz von den meisten anderen Agenten unterschiedlich sein und muss einen Teil der Risikoberechnungen zu sein.
die Dosis und die Zeit, in der die Hemmung der GJIC involviert die Bestimmung ist ein iterativer Prozess. Um Zeit und Geld für die Kultur liefert speichern, wird der beste Ansatz ist, bei einer hohen Dosis zu beginnen, die auf die Löslichkeit und Zeit abhängig (in der Regel eine Stunde, da die meisten Hemmungtritt in weniger als 15 min), und dann die Zeit und die Dosis um die Hälfte in einem schrittweisen Prozess zu reduzieren, bis es keine Wirkung. Wenn es keine Hemmung bei einer hohen Dosis an einer Stunde, dann die doppelte Zeit in einem schrittweisen Prozess. Erste Versuche auf einer einzigen Platte erfolgen. Nachdem die allgemeinen Zeitschätzungen und Dosen festgelegt werden, dann gründlicher Studien effizient mit geeigneten Probengrößen für statistische Analysen ausgelegt werden. Eine experimentelle Design-Merkmal wäre die Dosis und die Zeit zu nutzen, die 75 erreichen, um 100% ige Hemmung. Offensichtlich werden die endgültigen Interpretationen der Ergebnisse ein Faktor der oben genannten Parameter. Allerdings , indem zunächst eine biologische Wirkung zu bestimmen, selbst wenn die Dosis und Zeit nicht in vivo relevant sein können, können die etablierten Dosen eine Rolle in Situationen der beruflichen Expositionen spielen, oder auf allgemeine Bevölkerung zu anderen Faktoren ausgesetzt , die auch GJIC beeinflussen mit potentiellen Additiv oder synergistische Effekte.
Die Hemmung der GJIC von den meisten Verbindungen ist in der Regel nicht sehr variabel und zwei bis drei Replikaten (jede Wiederholung wäre eine Kulturplatte oder gut sein) ausreichend Dosis und Zeit-Wirkungs-Kurven zu erzeugen. Wenn jedoch Variabilität hoch ist, dann würde mehr Wiederholungen benötigt werden, um einen genauen Wert für eine bestimmte abhängige Variable von einer unabhängigen Studie zu erhalten. Natürlich müssen mindestens drei unabhängigen Versuchen für statistische Analysen durchgeführt werden.
Die Einfachheit dieses Tests und die Beurteilung der signifikanten Zellpopulationsgrößen ist ein Vorteil für viele Anwendungen. Dies ist besonders nützlich in vielen toxikologischer Beurteilungen. Jedoch gibt es Beschränkungen der SL-DT-Assays, die von mehreren Faktoren abhängen kann. Eine davon ist, ob diese Technik geeignet ist, an die Zellen untersucht. Dieser Test würde gut funktionieren, nicht für Zellen, die oder nicht gut hoch Konfluenz mit sporadischen Kontakte in der Kulturplatte erreichen. Alternative Techniken wie Mikroinjektion sollten zusammen werdennsidered. Alternativ kann das SL-DT-Assay modifiziert werden. Erfolg beim Laden einzelner Zellen wurde mit einer Akupunktur - Nadel erreicht, die eine leichte Drehbewegung erfordert , wenn der Farbstoff 7 geladen werden . Die Ausbreitung von Farbstoff würde in mehr konfluenten Situationen oder amorphe durch Zellkultur mit sporadischen Zellkontakte radial sein. Die Zugabe von Rhodamin-Dextran (RD, 1 mg / ml) auf die LY Farbstofflösung wird für Experimente empfohlen, bei denen die geladenen Zellen zu identifizieren, ohne eine Markierung (beispielsweise RD) schwierig wäre. RD ist zu groß Gap Junction Kanäle zu durchlaufen, so dass die Identifizierung, welche Zellen geladen wurden. RD kann auch in allen SL-DT-Assay verwendet werden, aber das Skalpell lässt eine Einkerbung auf dem Boden der Schale zu identifizieren, wo Zellen geladen werden. Der SL-DT-Assay ist ebenfalls nicht förderlich für Änderungen in GJIC zwischen verschiedenen Zelltypen als Farbstoffbeladung Messung nicht zwischen Zelltypen zu unterscheiden. Wieder Mikroinjektions ist die Methode der Wahl, aber die Akupunkturnadel Methode might auch funktionieren, wenn man eine bestimmte Zelle mit Hilfe eines Mikroskops ausrichten können.
Die metabolische Kooperation Assay ist ein weiteres Verfahren GJIC zu messen. Diese Methode war einer der ersten standardisierten Bioassay für GJIC 24. In diesem Test wurden Wildtyp Chinese hamster V79-Zellen (6-Thioguanin-sensitiv) und 6-Thioguanin-resistenten Zellen co-kultiviert in hoher Dichte in dem 6-Thioguanin (6-TG) resistenten Zellen nicht metabolisieren nicht 6-TG so zu einem toxischen Metaboliten, Resistenz. Co-Kultur mit den 6-TG empfindlichen Zellen resultiert in der Übertragung des toxischen Metaboliten durch gap junctions was zu Zelltod, wo die Hemmung der GJIC Ergebnisse bei der Rettung von 6-TG-resistenten Zellen durch den Transfer des toxischen 6-TG Metabolit verhindert von den 6-TG empfindlichen Zellen. Obwohl ein Vorteil dieses Tests ist, dass sie minimal invasiv ist, ist ein großer Nachteil, dass es eine Woche Beendigung erfordert, die umfangreiche dosis- und zeitabhängige Beurteilung der toxi machtÜberhöhungen sowie mechanistische Studien usw. unpraktisch für viele Chemikalien zu bewerten.
Der SL-DT-Assay ist zu mechanistischen Untersuchungen nicht förderlich, die die Migration von Farbstoffen durch verschiedene Zelltypen zu verfolgen müssen, in denen die Mikroinjektion ist die bevorzugte Methode. Alternativ können Zellen mit dem Methylester von Fluoreszenzfarbstoffen vorgespannt werden. Die Beladung des Farbstoffes ist eine Funktion des intrazellulären methyl Esterasen, die die lipophilen Farbstoff in seine hydrophilere Form hydrolysieren, wodurch der Farbstoff in den Zellen eingeschlossen wird. Dies ist eine weniger invasive Weise die Fluoreszenzsonde vorzuladen, aber die häufigste Art und Weise interzelluläre Kommunikation zu messen , wo alle Zellen mit dieser Methode vorgespannt werden , ist der FRAP - Test 11. Der Vorteil von FRAP ist wieder die Fähigkeit Gap Junctions in einzelnen Zellen zu bewerten, was für mechanistische Studien ausgezeichnet. Jedoch den Nachteil, FRAP liegt in: die Unfähigkeit, Populationen von Zellen für die toxikologische Bewertung zu messen,die Notwendigkeit für anspruchsvolle und sehr teuren Mikroskope / Laser-Durchflusszytometer, ist der Bedarf an hoch qualifizierten technischen Know-how, mäßig invasive von den freien Radikalen, die durch den Laser erzeugt wird, und nicht förderlich für hohen Durchsatz.
In jüngerer Zeit wurde eine weitere Technik entwickelt worden; die lokale Aktivierung von molekularem Fluoreszenzsonde (LAMP) Verfahren 25, die auf einer neuen Generation von caged Cumarin-Fluorophore basiert. Ähnlich dem FRAP Assay werden alle Zellen vorbelastet mit Farbstoffen ein Methylester enthält, jedoch werden diese Farbstoffe fluoreszierende bei nachfolgendem lokalisierter Beleuchtung durch Laser mit einer geringen Dosis UV-Licht, die wahrscheinlich deutlich niedriger als ROS FRAP erzeugt. Auch dieser Assay die gleichen Einschränkungen des FRAP-Assay. Andere neuere Fortschritte für GJIC Messung sind die Vorbelastung und Fallschirm-Techniken, die auch die Verwendung von Methylester-Fluoreszenzfarbstoffe beinhalten. Die Vorbelastung Technik beinhaltet Suspendierendie Zellen mit den unbelasteten Pendants mit Fluoreszenzsonde zusammen vorgespannt werden und dann ausplattiert und erlaubt eine konfluente Monoschicht zu bilden. Die Ausbreitung des Farbstoffs kann dann mit einem Epifluoreszenz - Mikroskop 26 beobachtet werden. In der Fallschirm - Assay, die mit der fluoreszierenden Sonde vorbelastet Zellen werden auf eine Monoschicht der unbelasteten Zellen überlagert, und die Ausbreitung des Farbstoffs mit einem Epifluoreszenz - Mikroskop 27 beobachtet. Auch hier sind die oben genannten Techniken technisch anspruchsvoller für Hochdurchsatzanalysen, und sofort bei nahe Konfluenz plattiert werden müssen, und erfordert für das Wiederaufziehen von Zellen, die eine Zeitverzögerung.
Insgesamt ist das SL-DT - Assay eine relativ kostengünstige, einfache und vielseitige Technik , die Ausrüstung, wie beispielsweise CO 2 Zellkultur - Inkubatoren, Biosicherheit Schränke und Epifluoreszenzmikroskop verwendet, die typischerweise in den meisten Zellkultur labs gefunden. Mit minimaler Erfahrung können viele Platten in einem Tag verarbeitet werden, was förderlich ist foder Screening-Verbindungen zur Toxizität sowie für natürliche Produkte, die die Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen zu verhindern oder rückgängig machen. Auch diesen Test für hohen Durchsatz Anpassung Analysen Robotik, mit automatisierten Fluoreszenzmikroskopie Bildgebung und Analyse-Systeme haben das Potenzial, zu screenen, eine große Anzahl von Giften und Toxinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
