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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54293
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, 2Department of Biophysics, University of Michigan

Abstract

La protéine structurale du VIH-1, Pr55 Gag (ou Gag) se lie à la membrane plasmatique dans les cellules au cours du processus d'assemblage du virus. liaison de Gag membrane est une étape essentielle pour la formation de particules de virus, car un défaut dans les résultats de liaison de la membrane Gag en déficience grave de la production de particules virales. Pour avoir des détails mécanistiques des interactions avec la membrane lipidique Gag, des procédés in vitro basés sur la RMN, la protéine empreinte, la résonance plasmon de surface, des liposomes flottation centrifugation ou de la fluorescence des lipides bourrelet liaison ont été développés jusqu'à présent. Cependant, chacune de ces méthodes in vitro a ses limites. Pour surmonter certaines de ces limitations et de fournir une approche complémentaire aux méthodes précédemment établies, nous avons développé un test in vitro dans lequel les interactions entre le VIH-1 Gag et membranes lipidiques ont lieu dans un environnement "cellule-like". Dans cet essai, la liaison Gag à des membranes lipidiques est analysé visuellement à l'aide YFP Taggebase de germe d Gag synthétisé dans un blé dans le système de traduction in vitro et GUVs préparés par une technique de électroformation. Nous décrivons ici le contexte et les protocoles d'obtenir Myristoylated pleine longueur protéines Gag et les membranes GUV nécessaires pour le dosage et pour détecter la liaison par microscopie Gag-GUV.

Introduction

l'immunodéficience humaine et le virus de type 1 (VIH-1) est un virus enveloppé qui se réunit à partir des bourgeons et la membrane plasmique (PM) dans la plupart des types de cellules. L'assemblage du VIH-1 des particules virales est entraîné par la protéine virale du noyau 55 kDa , appelée Pr55 Gag (GAG). Gag est synthétisée sous la forme d'une polyprotéine précurseur composée de quatre domaines structuraux principaux, à savoir, la matrice, capside et nucléocapside, p6, ainsi que deux peptides espaceurs SP1 et SP2. Lors de l'assemblage, la matrice (MA) domaine est responsable pour le ciblage de Gag sur le site d'assemblage, la capside (CA) domaine médiatise interactions-Gag Gag, la nucléocapside (NC) domaine recrute ARN génomique viral, et les facteurs p6 recrues d'accueil que l'aide scission de la particule virale à partir de la membrane plasmatique. Gag subit également une modification de la co-traductionnelle par l'addition d'un acide gras à 14 carbones ou un fragment myristate à son extrémité N-terminale.

liaison de Gag membrane est une condition essentielle pour l'assemblage viral, puisque mutants qui sont défectueux dans la liaison membrane ne parviennent pas à produire des particules de virus. Nous et d'autres ont montré que la liaison de Gag est médiée par des signaux bipartites au sein du domaine MA membrane: le fragment myristate N-terminale qui médie les interactions hydrophobes avec la bicouche lipidique et un groupe de résidus basiques au sein du domaine MA qualifié de région hautement basique ( HBR) qui interagit avec les lipides acides de la PM 1-4. Des études d'interactions Gag-membrane en utilisant l' expression ectopique de polyphosphoinositide 5 phosphatase IV (5ptaseIV), une enzyme qui catalyse l'hydrolyse du phospholipide acide phosphatidylinositol- PM-spécifique (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] à phosphatidylinositol-4-phosphate, dans les cellules suggère que Gag-PM localisation est médiée par PI (4,5) P2 3,5. Cependant, des études in vitro visant à comprendre les détails plus mécanistes de Gag-PI (4,5) P 2 interactions se sont révélés être difficile pour un certain nombre de raisons. Pourpar exemple, la purification de pleine longueur myristoylés Gag VIH-1 pour des expériences biochimiques a été techniquement difficile au moins en partie en raison de la tendance de Gag à agréger lors de la purification. Par conséquent, des formes tronquées de HIV-1 Gag, comme Myr-MA ou Myr-MA-CA, ou la forme non-myristoylés ont été fréquemment utilisés dans les études qui nécessitent une purification Gag (par exemple, la résonance magnétique nucléaire, la protéine empreinte, et la surface résonance plasmonique 6-9). Alternativement, couplée à des réactions de transcription-traduction in vitro ont été utilisés pour produire toute la longueur myristoylés Gag VIH-1 dans d' autres études biochimiques 1,2. Typiquement , dans ce système, un plasmide codant pour Gag est transcrit et traduit avec des lysats de cellules eucaryotes (par exemple, les lysats de réticulocytes de lapin) qui sont dépourvues de membranes cellulaires et les ARN messagers , mais qui contiennent la machinerie de la transcription et de la traduction. Après la réaction, les lysats cellulaires contenant Gag sont mélangés avec moimbranes pour l'analyse des interactions Gag avec des lipides. En plus de la facilité de préparation de pleine longueur myristoylés Gag, les méthodes utilisant le système de traduction de transcription in vitro ont un avantage que la synthèse Gag et des réactions de liaison de la membrane subséquente se produisent dans un milieu "cytosol ressemblant eucaryote» qui peuvent mieux représenter les conditions physiologiques. Cette propriété a contribué aux études qui ont montré que les molécules d'ARN liés au domaine de MA régulent la liaison Gag aux lipides acides d'une manière compétitive 1,2,10-12. Toutefois, étant donné que la quantité totale de protéines Gag obtenues dans ces lysats cellulaires ne sont pas élevés, marquage métabolique des protéines avec des acides aminés radiomarqués est nécessaire pour leur détection.

En fonction de la méthode pour mesurer les interactions Gag-lipide, une variété de préparations de membranes ont été utilisés. Chacune de ces méthodes a ses forces et ses limites. La plupart des dosages à base de RMN nécessitent l'utilisation de lipides avec un groupe acyle courtles chaînes qui sont (C8-PI (4,5) P 2 par exemple, C4- et) 6,8 soluble dans l'eau. Bien que les méthodes de RMN pour tester la liaison de Gag aux lipides qui ont des chaînes acyles longues trouvés dans les cellules sont en cours d' élaboration, ils ont été utilisés uniquement avec myristoylée ou nonmyristoylated MA jusqu'à 8,13. En variante, les liposomes préparés à partir de lipides qui ont des chaînes acyles longueur natives ont été utilisées dans des procédés biochimiques telles que la flottation des liposomes ou des liposomes fluorescents perles de dosages de liaison 2,3,10,14-16. Cependant, les liposomes utilisés dans ces essais ont de petits diamètres et, par conséquent leurs membranes présentent des courbures fortes et positives. En revanche, au cours de la première phase de l'assemblage des particules dans les cellules du VIH-1-infected, Gag se lie à la PM, qui est presque plane sur l'échelle de Gag, et par la suite induit une courbure négative au cours de bourgeonnement. Par conséquent, les membranes de liposomes avec forte courbure positive et pourraient ne pas être bicouches lipidiques idéales pour étudier les interactions Gag-lipidique. Pour ce qui est des liposomes Flotessais de ation, une autre mise en garde potentiel est que l'exposition des complexes Gag lipidiques à gradient de saccharose hypertonique pendant la centrifugation peut influer sur le résultat expérimental. Pour pallier ces limitations et de fournir un système expérimental complémentaire, des dosages pour la liaison à Gag vésicules géantes unilamellaires (GUVS) ont été développées ces dernières années. GUVs sont des vésicules bicouches lipidiques simples dont les diamètres s'étendre à plusieurs dizaines de micromètres. Ainsi, la courbure de ces membranes ressemble à la PM à l'échelle de Gag. En outre, en raison de sa grande taille, ce qui permet une inspection visuelle au microscope optique, la liaison membrane protéines Gag de fluorescence marqués ou étiquetés à ces vésicules lors du mélange peut être facilement déterminée sans traitement ultérieur des complexes Gag-lipidiques.

Nous décrivons ici un protocole pour étudier le VIH-1 Gag membrane de liaison utilisant GUVs obtenus à partir d'une méthode de électroformation. Diverses méthodes telles que l'hydratation douce, hydratation assistée gel, microlançage rofluidic et électroformation 17-22 ont été utilisées pour obtenir GUVs. Pour le protocole décrit ici, le procédé de électroformation est utilisé principalement en raison de son efficacité dans la formation GUVs avec des lipides acides et sa relative facilité d'utilisation sans la nécessité d'installations coûteuses. Etant donné que la visualisation de Gag nécessite un rapporteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP) est génétiquement ajouté à l'extrémité C-terminale de gag (Gag-YFP). Protéines Gag-YFP sont obtenus par des réactions in vitro de transcription et de traduction dans de blé lysats germinales en fonction du débit (CECF) la technologie d'échange continu continu. Dans cette technologie, à la fois l'élimination des sous-produits inhibiteurs des réactions et la fourniture de substrats de réaction et les composants d'énergie sont réalisées dans un mécanisme basé sur une dialyse. Pour ces réactions, un plasmide codant pour Gag-YFP sous le contrôle d'un promoteur T7 est utilisé. Il faut noter, comme indiqué précédemment, les lysats de germe de blé supportent myristoylation sans composants supplémentaires 23,24. En utilisant cette méthode, il a été possible d'obtenir des quantités suffisantes de pleine longueur myristoylés Gag-YFP pour la visualisation de Gag sur les membranes GUV 24. Nous décrivons ici le protocole avec lequel la liaison du VIH-1 Gag à PI (4,5) P2 contenant les membranes GUV peuvent être examinées sans traitement ultérieur long suivant des réactions de liaison et de proposer que cette méthode complète préexistante Gag-membrane des essais de liaison et peut être étendu pour mieux comprendre le VIH-1 Gag-membrane de liaison.

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Protocol

Jour 1: Expression des protéines Gag Utilisation de la transcription in vitro traduction-based System-Lysate Germe de blé

1. Préparation du VIH-1 gag

  1. Retirez tous les réactifs du kit de CECF de germe de blé commercial de congélateurs (lysats de germe de blé sont stockés à -80 ° C, d'autres réactifs à -20 ºC). Décongeler sur la glace et mélanger les composants comme indiqué dans le tableau 1.
Mix-1 (alimentation mix)
solution d'alimentation 900 ul
Acides aminés 80 ul
méthionine 20 ul
Total 1000 pi
Mix-2 (Lysate mix)
Des lysats de Germe de Blé 15 ul
RNase eau libre 7 pi
Acides aminés 4 ul
méthionine 1 ul
L'ADN de plasmide dans le tampon TE (1 pg / pl) ** 4 ul
un tampon de réaction 15 ul
RNasin * 4 ul
Total 50 ul

Tableau 1: Compositions contenant des mélanges nécessaires pour les réactions de germe de blé.
Remarque: Si l'expérience est conçue pour examiner l'effet de l'élimination de l'ARN par la RNase sur la membrane Gag de liaison, remplacer des inhibiteurs de ribonucléase avec de l'eau sans RNase. L'ADN plasmidique doit être exempt d'impuretés selon les instructions du fabricant. Cependant, plasmids préparés en utilisant classique, mais non, des kits d'isolement de plasmide endotoxine libres ont été utilisés avec succès. L'instruction du fabricant recommande également d'utiliser l'ADN dissous dans l'eau sans nucléase. Si l'on utilise l'ADN en suspension dans du TE [10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) contenant 1 mM d'EDTA], éviter d'utiliser des concentrations plus faibles d'ADN, étant donné que l'EDTA dans du TE peut affecter le rendement. Plasmides dissous dans du tampon TE à une concentration de 0,8 à 1 ug / ul ont été utilisés avec succès.

  1. Tout d'abord ajouter le mélange d'alimentation (Mix-1) dans la cassette de réaction (chambre transparente). Ensuite, ajouter le mélange de lysat (Mix-2) à l'autre chambre (rouge). Ne pas introduire de bulles tout en ajoutant les mélanges dans leurs chambres respectives, puisque cela peut conduire à un échange inefficace des composants de la solution et donc de réduire l'efficacité de la réaction.
  2. Couvrir les chambres avec le film adhésif fourni avec le kit.
  3. Insérer la cassette de réaction dans le support de cassette et incubate l'ensemble pendant 24 heures à 24 ° C à une vitesse de agitation constante de 900 tours par minute dans un Eppendorf thermomixer R.

Jour 2: Préparer GUVs par électroformation et récolte Germe de Blé lysats

2. Préparation de GUVs

  1. lipides aliquotes dissous dans des solvants organiques tels que le chloroforme ou des mélanges de chloroforme et de méthanol dans des flacons en verre avec bouchons à vis bordées de doublures en téflon et enveloppés avec du Parafilm. Manipuler les lipides avec des seringues en verre de type Hamilton, ou le cas échéant, des conseils en plastique chloroforme résistant. Sortir des flacons en verre contenant les lipides à utiliser pour la préparation des GUV du congélateur à -20 ° C.
    1. Une fois les flacons sont amenés à température ambiante, assurez-vous par une inspection visuelle que les suspensions lipidiques sont claires. La qualité des lipides, en particulier des lipides acides, tels que le palmitoyl-oléoyl phosphatidylsérine (POPS) et PI (4,5) P2, est important pour des expériences réussies. Ne pas utiliser les lipides qui sonten aliquotes pendant plus de 2 mois.
  2. Préchauffer un bloc chauffant à la température désirée. Cette température doit être d' au moins 5 ° C supérieure à la température de fusion (Tm) du lipide (s) avec la plus haute Tf.
  3. Calculer les volumes de lipides nécessaires en fonction des rapports molaires désirés lipidiques. Pour étudier la liaison ici Gag VIH-1, en ​​utilisant les rapports molaires suivants , comme indiqué dans le tableau 2.
Lipid mix Rapport molaire Volume (en ul) Concentration en Stock
POPC + POPS + Chol 46,6 + 23,3 + 30 19,74 + 10,18 + 6,57 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P 2 16.11 + 8,3 + 6,25 + 58.19 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
Du cerveau PI (4,5) P2: 1 mg / ml

Tableau 2: Les volumes de différents lipides utilisé pour obtenir GUVs.

  1. Ajouter les volumes souhaités de lipides dans un propre flacon de verre à bouchon à vis.
  2. Diapositives de dimensions 25 x 50 x 1,1 mm 3 et la résistance 70-100 Ohm (comme décrit dans le catalogue) Utilisation ITO-enduit. Placez deux diapositives ITO revêtus sur un banc propre. Chaque chambre de électroformation nécessite deux indium-étain (ITO), les lames de verre revêtues d'. Vérifiez que le côté conducteur de la lame de verre est orientée vers le haut en vérifiant la résistance à l'aide d'un multimètre. Elle doit montrer une valeur d'environ 200 Ω. Assurez-vous que la surface des lames sont propres en essuyant doucement avec 70% d'éthanol en utilisant des lingettes non pelucheux.
  3. Nettoyer la surface extérieure d'une aiguille d'une seringue par riNsing avec du chloroforme et placer la seringue dans le bloc thermique.
  4. Placez une nouvelle lame de verre revêtu d'ITO sur le bloc thermique avec le côté conducteur vers le haut et le laisser se stabiliser à la température désirée habituellement environ 2-3 min. Ne pas réutiliser les lames de verre ITO revêtus d'un risque potentiel que l'ITO-revêtement sur les lames de verre pourrait être endommagé pendant les procédures de nettoyage.
  5. Utiliser un volume de 40-50 ul du mélange lipidique pour chaque diapositive pour l'instant uniforme et rapide étalement des lipides sur la lame de verre. Ajuster le volume total avec un solvant organique approprié tel que le chloroforme.
    1. Placer une moitié du volume total du mélange de lipides sur la lame de verre et de se propager immédiatement le lipide en utilisant la seringue nettoyé (étape 2.6) pour laisser un film lipidique uniforme (déplacer l'aiguille 2-3 fois à travers la lame). Étaler le film lipidique doucement (mais rapidement) pour éviter tout dommage à la couche d'ITO mince. Non uniforme épandage ou épandage rugueuse peut conduire à sous-optimalerendements ou hétérogénéité de calcul des GUVs.
    2. Par conséquent, d'assurer la propagation uniforme en inspectant le film lipidique après se propager avant de passer à l'étape suivante. Si l'opacité du film apparaît trop non uniforme, refaire la procédure en utilisant une nouvelle diapositive.
  6. Placez la lame enduite dans une boîte de Pétri avec la face enduite vers le haut.
  7. Répétez les étapes 2,6-2,9 pour le reste du mélange en utilisant une autre lame revêtu d'ITO.
  8. Placez la boîte de Pétri contenant à la fois les lames dans une chambre de dessiccation à vide classique pour 60-90 min pour éliminer toute trace de solvants organiques.
  9. Pendant ce processus, mettre l'incubateur à la même température que celle du bloc de chaleur (65 ° C dans la plupart des cas) et pré-chauds 300 mM de solution de saccharose dans l'incubateur.
  10. Après séchage, mettre la boîte de Pétri sur le banc et placer la lame de verre sur une surface propre.
  11. Nettoyez délicatement un joint de PDMS (figure 1) en utilisant 70% d' éthanol et il comple secdiatement.
  12. Placez - le sur la lame de verre lipidique revêtu comme le montre la Figure 1 et doucement et fermement appuyez sur afin que les formes de joint un joint étanche à l' eau. Confirmer l'absence d'écarts entre le joint PDMS et la glissière. Il en résulte la formation d'une chambre peu profonde qui retient la solution de saccharose.

Figure 1
Figure 1:. La disposition de la lame de verre revêtu d' ITO utilisé pour électroformation S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Remplir la chambre avec une solution de saccharose préchauffée sans bulles.
  2. Placez l'autre lame enduite sur le dessus pour faire un joint étanche. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles. L'assemblage final doit apparaître comme le montre la figure 2. Fixer le usin de chambreclips g de liant.

Figure 2
Figure 2:. Représentation schématique de la chambre de électroformation (vue de côté) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Enlever l'excès de saccharose par aspiration et nettoyer les lames à l'aide de lingettes non pelucheux. Fixer les lames à la barre de cuivre de sorte que les côtés conducteurs sont en contact uniforme avec la barre. Faire en sorte que d'un seul côté conducteur de la lame de verre est en contact avec une barre de cuivre.
  2. Connectez la barre de cuivre à la sortie du générateur de fonction à l'aide des pinces crocodiles. Placer l'assemblage à l'intérieur de l'incubateur pour permettre à l'ensemble à équilibrer à la température désirée.
  3. Appliquer une fréquence d'une onde sinusoïdale de 10 Hz et une différence de potentiel de 1 V pendant 90 min. Ensure que la tension est de 1 V par un multimètre comme représenté sur la figure 3. Poursuivre le processus pendant 90 minutes.

Figure 3
Figure 3:. Les positions auxquelles les électrodes du multimètre sont placés pour mesurer la fréquence et le courant S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Après 90 minutes, réduire lentement la fréquence de 2 Hz et continuer électroformation pendant 10 minutes supplémentaires. Pendant ce temps, la récolte dans les réactions de traduction in vitro (étapes 3.1 à 3.2).
  2. Eteindre le générateur de fonction et de permettre l'assemblage refroidir à température ambiante lentement (en éteignant l'incubateur et en laissant la porte de l'incubateur légèrement ouverte).
  3. Après refroidissement, débrancher les câbles du générateurdes assemblages de glissières. GUVs peut être très fragile et doivent donc être manipulés avec beaucoup de douceur. Ramener ensuite avec précaution l'ensemble sur le banc.
  4. Démonter la chambre en retirant doucement la lame supérieure en utilisant une pince. Récolter la suspension contenant GUVs de saccharose à l'aide d'une pointe de pi coupé 1000 et le transfert dans un tube propre. Manipuler le tube doucement pour éviter la perturbation de GUVs.
  5. Utiliser immédiatement les GUVs. GUVs sont stables pendant au moins 90 minutes après la récolte lorsqu'elle est conservée à la température ambiante.

3. Récolte in vitro traduction Réactions

  1. Récolter les réactions de traduction in vitro contenant des protéines désirées de la chambre rouge à l' aide d' une micropipette dans un tube.
  2. Pour éliminer les protéines agrégées, tourner les lysats à 16.200 xg pendant 15 min dans une centrifugeuse de table et transférer soigneusement le surnageant dans un autre tube.

4. Essai de liaison GUV

  1. En utilisant une pointe de coupe, mélanger 51; l des réactions de traduction in vitro contenant des protéines traduites et 5 ul de GUVs dans un tube et incuber à température ambiante pendant 2-3 min.
  2. Joindre une feuille de PDMS avec un petit trou (diamètre 3-4 mm) sur une lamelle propre et assurer l'étanchéité par doucement et fermement le pressant contre la lamelle.
  3. Placer le mélange de 10 pi de l'étape 4.1 dans le petit trou.
  4. L'image du mélange sous un microscope à fluorescence confocale inversée épi- ou à la température ambiante.
    Remarque: Pour éviter l'évaporation, la chambre d'imagerie peut être couverte par une lamelle.

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Representative Results

En utilisant le protocole ci-dessus, nous avons préparé GUVs composés de POPC + POPS + Chol (rapport molaire: 4,66: 2,33: 3). Cette composition a été choisi pour refléter approximativement les PS et le cholestérol des concentrations de PM. Robuste et liaison de Gag efficace a été observée seulement lorsque le cerveau PI (4,5) P 2 a été inclus dans le mélange POPC + POPS + Chol-PI cerveau (4,5) P 2 [rapport molaire (POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1] dans cet exemple) (figure 4, comparer les panneaux B et D , avec A et C). La liaison à GUVs composés de POPC + gag-YFP POPS + Chol + de cerveau PI (4,5) P2 se manifeste par l'augmentation de l'intensité de fluorescence sur la surface de la membrane. Cette augmentation peut également être vu dans les profils d'intensité de fluorescence (figure 4), en bas le long de la ligne qui traverse la limite GUV (XX 'sur la figure 4C et D).

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Figure 4: Gag se lie au cerveau-PI (4,5) P2 -contianing GUVs Une section transversale confocale de POPC + Chol + POPS (A et C) et POPC + POPS + Chol + PI (4,5) P2. GUVs (B et D). Répartition des Gag-YFP est représenté en vert. images agrandies des GUVs sélectionnées (boîtes jaunes) sont présentés dans les panneaux C et l'intensité D. Fluorescence profils le long des lignes choisies au hasard tirées de traverser les côtés opposés de GUVs (X X ') sont indiqués ci-dessous les images. Bar = 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'essai de liaison de GUV tel que décrit ci-dessus donne une bonne alternative dans des scénarios où d'autres dosages d'interactions protéine-lipide ont leurs limites. Ce test nous permet d'examiner les interactions entre les myristoylée Gag pleine longueur et des lipides acides avec des chaînes acyles native de longueur dans le contexte de la bicouche lipidique et faire sans de longues flottation centrifugation à travers à haute densité des gradients de saccharose ou d'autres traitements post-liaison de Gag-lipidique complexes. Un autre avantage est que le comportement de Gag peut être examiné dans un mélange complexe (par exemple, en présence de composants cytosoliques), qui ne sont pas facilement réalisée dans d' autres techniques en temps réel telles que des analyses basées sur la résonance plasmon de surface. Par conséquent, on peut dire que l'essai décrit ici permet d'évaluer en temps réel des interactions lipidiques Gag-acides dans un contexte plus natif que d'autres tests utilisés dans le domaine.

Cependant, il existe des limitations associées à la méthode telle quebien. Faire en sorte que GUVs dans une préparation donnée ont une composition similaire à l'autre et le mélange d' origine, électroformation doivent être effectuées nettement supérieure à la température de transition des lipides qui ont la plus haute température de transition présent dans le mélange 25,26. Cependant, il est possible que l' exposition à des lipides à des températures plus élevées pour une plus longue durée peut conduire à une dégradation des lipides 25,27. Par conséquent, pour contrôler la qualité de GUVs, en plus de l' inspection visuelle est activée par incorporation de colorants fluorescents (par exemple , des lipides, DID), il est souhaitable de tester la fonctionnalité du lipide d'intérêt [par exemple, PI (4,5) P2 ] à l'aide d'une sonde spécifique des lipides. En outre, avec des compositions de GUV qui donnent lieu à une séparation de phase à une certaine température, il faut prendre soin de maintenir avec précision une température voulue lors de l'observation de l'interaction protéine-GUV. Une autre limitation est que les solutions de force ionique élevée sont incompatibles avec l'électroprotocole de formation décrit ici, et donc GUVs sont cultivées et maintenues dans 300 mM de solution de saccharose 26. Notamment, cependant, certaines études ont utilisé avec succès des tampons à des forces ioniques physiologiques dans leurs protocoles de électroformation modifiés 28.

Un aspect critique est la quantité de Gag. Un système à base de lysat de réticulocytes de lapin est souvent utilisé pour la préparation de toute la longueur du VIH-1 Gag dans des essais liposome de flottation. Cependant, la quantité de YFP-tagged pleine longueur Gag obtenu dans ce système était insuffisante pour la visualisation de Gag lier à GUVs. Pour remédier à ce problème, le système de transcription-traduction de germe de blé à base de lysat exempt de cellules, ce qui donne environ 8 à 10 fois plus grande quantité de Gag a été utilisé dans l'essai en cours. Cependant, si les expériences de liaison GUV doivent être effectuées en l'absence d'eucaryotes composants du lysat cellulaire, on peut utiliser des protéines purifiées marquées avec un fluorophore comme cela a été fait récemment (décrit ci-dessous).

Il a été montré que spécifique et contraignant de Gag à membranes efficaces est un processus coopératif régi par divers facteurs tels que le myristate, l' ARN, des groupes de tête lipidiques et des chaînes d'acyle, et les interactions Gag-Gag (revue en référence 29). Le système in vitro décrit ici peut être étendue pour répondre aux rôles des facteurs individuellement ou en combinaison pour comprendre l'ordre des événements dans le processus de coopération de la membrane Gag de liaison. Jusqu'à présent, le système d'essai décrit élucidé un rôle inattendu de insaturées PI (4,5) P2 chaînes acyle dans la liaison de Gag , mais pas celle d'un canonique de cellules de mammifères d' origine PI (4,5) P2 liant le domaine ( le domaine pleckstrine de la phospholipase C delta 1) 24, une constatation qui n'a pas été révélé par des tests de flottation liposome. systèmes de dosage à base de GUV ont également été utilisées pour comprendre d'autres aspects de la biologie Gag. L'utilisation d'un dérivé Gag contenant un multim inductible artificiellemotif erization et GUVs avec radeau-like et non-raft comme domaines, Keller et al. ont examiné la relation entre Gag partitionnement à des domaines «radeau comme 'et multimérisation 30. Une étude réalisée par Carlson et al. A utilisé le système de GUV et Gag purifié et marqué par fluorescence pour comprendre l'ordre séquentiel de recrutement de divers complexes de tri endosomes requis pour le transport (ESCRT) protéines par liée à la membrane Gag 31. Récemment, une autre étude a rapporté la reconstitution du processus de bourgeonnement vésiculaire induite Gag sur la GUV utilisant Gag conjugué à un fluorophore 32. Gag VIH-1 multimérisation conduit à la formation de sous-membranaire Gag treillis que l'on pense à la courbe des membranes pendant l'assemblage. Par conséquent, avec une nouvelle amélioration des systèmes de dosage Gag-GUV, la relation entre les changements de courbure de la membrane et la membrane Gag de liaison, qui est sans doute l'aspect le moins bien compris de l'ensemble du VIH, peut être analysé comme cela se fait for d' autres protéines de courbure sensibles cellulaires 33.

En résumé, en utilisant ce protocole, on peut obtenir des quantités suffisantes de myristoylés pleine longueur Gag et de visualiser la liaison Gag aux membranes GUV. Ce protocole peut être développé afin d'examiner les différents stades du VIH-1 ensemble et les processus de bourgeonnement.

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Acknowledgments

Nous tenons à remercier Mohammad Saleem, Jing Wu et Krishnan Raghunathan pour des discussions utiles. Nous remercions également Priya BEGANI d'assistance pendant le tournage. Ce travail est soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 AI071727 (AO) et R01 GM110052 (SLV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany		 BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
  2. Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
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Immunologie numéro 113 le VIH-1 Gag la liaison membrane l'assemblage du virus électroformation PI (4,5) P Vésicules unilamellaires géantes lipides biophysique
Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes
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Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

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