Summary
Denna modifierade utvinning protokoll förbättrar RNA och DNA avkastningen från mer precist utvalda regioner av intresse i histopatologiska vävnadsblock.
Introduction
Genomisk biomarkör forskning syftar till att identifiera molekylära korrelat som noggrant och tillförlitligt återspeglar sjukdomsstatus, och göra det på ett kliniskt användbart sätt. 1 Biomarker utveckling är beroende av retrospektiv analys av väl kommenterade vävnadsprover. Sjuka och normala vävnadsprover lagras antingen som färskfryst vävnad i specialiserade biobanker eller formalinfixerade paraffininbäddade vävnads (FFPET) block i kliniska arkiv. Färskfryst vävnad möjliggör utvinning av högkvalitativa nukleinsyror och har använts i stor utsträckning i iska biomarkörer studier. 2,3 emellertid färre vävnadsprover finns i biobanker och studera sådan vävnad introducerar en bias mot större prov, ovanliga kategorier av sjukdom, och patienterna ses på specialiserade centra med större förmåga att bank vävnad. 4 FFPET, däremot är standardlagringsmetod för sjuka människor och djur vävnader. Medan FFPET block upprätthålla cellulär morphology de fixeringsprocessen tvärbindningar andra cellulära beståndsdelar till nukleinsyror. Tvärbunden RNA och DNA är återvinningsbara, men bara i degraderade, höggradigt fragmenterade former. 5,6 Men dessa DNA- och RNA-fragment är tillgängliga för analys av en expanderande uppsättning av analyser, inklusive mRNA-expression, DNA hypermetylering, och riktad sekvensering. 7,8 för att utnyttja denna möjlighet i stor mängd och variation av FFPET tillgängliga för forskning, finns det ett behov av en effektiv och tillförlitlig extraktion protokoll.
En stor del av biomarkör forskning vävnad fokuserar på cancer. Liksom andra typer av sjuk vävnad, visar cancervävnad ofta betydande regional heterogenitet i cell bevarande och celltyp. Eftersom biomarkör forskning bygger på förmågan att korrelera beståndsdelar i sjuk vävnad med molekylära egenskaper, är ett kritiskt steg i denna process exakt skörd av vävnad som är väl bevarat och berikas för disease under utredning. I FFPET, två anriknings tekniker används ofta: laser capture microdissection (LCM), och mikrotom sektionering. LCM möjliggör mycket fokuserad vävnad skörd och kan användas för att isolera specifika, välbevarade celltyper i heterogena vävnader. 9,10 kräver dock LCM dyr utrustning och är oöverkomligt tidskrävande för ett stort antal prover. Mikrotom sektionering är en mer allmänt använd process där tunna snitt skärs från FFPET block. 11,12 mikrotom-cut sektioner innehåller ofta vävnad som är heterogen i cell bevarande (t.ex. nekrotisk jämfört välbevarad) och sammansättning (t.ex. cancer vs benign parenkym), och därmed kan leda till homogenisering av molekylära funktioner ter undersökts separat. Det finns således ett behov av en hög genomströmning metod som berikar för celler av intresse. En tredje metod, isolering av nukleinsyror från FFPET kärnor, ger denna anrikning, är lämplig för hög rakt igenomströmningen protokoll, och har använts av andra för att isolera RNA eller DNA från olika vävnadskärnorna. 7,13,14
Ett antal publicerade protokoll specificera metoder för att extrahera nukleinsyror från FFPET (tabell 1). Men protokoll där RNA och DNA extraheras från samma vävnad optimerats för Eggen vävnadssnitt, men inte för vävnadskärnorna. 15,16 Likaså publicerade protokoll som erbjuder ökad vävnadsspecificitet, antingen genom vävnads kärnor eller glid microdissections anger förfaranden för extraktion av DNA, men inte RNA. 7,17 Här, ett optimerat protokoll för dubbel extraktion av både DNA och RNA från samma vävnad kärna demonstreras. Vävnads kärnor skördas genom att sätta vävnad microarray (TMA) slag i områden av intresse mappas på FFPET block. Kartläggningen utförs genom anteckningar på ett mikroskopobjektglas med en tuschpenna och överföra annoteringen till ytan av den motsvarande FFPET-block (Figur 1).
Tidigare arbete som ledde till utvecklingen av detta protokoll ingår en jämförelse av flera kommersiellt tillgängliga nukleinsyra utsugssystem. I denna jämförelse ändringar kommersiella protokoll, som beskrivs nedan under förutsättning att högsta DNA- och RNA avkastning och kvalitet (Selvarajah et al., I Prep). Vävnads kärnor är tjockare än 5-10 pm micron avsnitt som vanligtvis används i FFPET utvinningsprotokoll 11,12,14,18 - 20, och kan innehålla mer varierande mängder av paraffin. För att kompensera för detta, var avparaffinering förbättras genom att upprepa xylen och etanol behandlingar och genom att införa ett motoriserat homogeniseringssteg (Figur 1). Vidare har proteinas K uppslutningstider förlängs för att öka DNA avkastning. Sammantaget är detta protokoll kostnadseffektivt och gör det möjligt att upprätta kopplingar mellan molekylära och histopatologiska egenskaperna hos sjukdomen i laRGE, väl karakteriserade populationer. Protokollet i sin helhet kan genomföras på ett tillförlitligt sätt inom 2 dagar, inklusive tre timmar av praktisk tid, med litet behov av specialiserad eller dyr utrustning.
Steg-för-steg-protokollet är härefter som en modifierad version av tillverkarens protokoll. 21 Se tabell of Materials / Utrustning för specifika reagenser, utrustning och tillverkare.
Protocol
1. Vävnads Coring
- Granska objektglas och beskriva regionen (s) av intresse med hjälp av en fin punkt permanent markör. Klipp ut en del av paraffin film tillräckligt stor för att täcka området av intresse på objektglas. Placera film stadigt på bilden och linda film över kanter för att hålla filmen från att glida. Med hjälp av en fin punkt permanent markör, beskriva hela vävnaden och regionen (s) av intresse i vävnaden, hålla konturerna beröring - men utanför - regionen (s).
- Ta bort filmen och överföra den till motsvarande vävnadsblock. Orientera filmen genom att vända eller rotera det så att konturen av hela vävnaden matchar den observerade formen av vävnaden i blocket (fig 1). Tryck på den del av filmen fast på ytan av blocket för att förhindra glidning.
- Hjälp av spetsen på den permanenta markör, göra grunda men synliga (~ 0,2 mm) fördjupningar längs konturerna av regionen (er) itresse, sedan ta bort filmen. Belastning 1 ml blekmedel, 70% etanol, och vatten i separata 1,5 eller 2,0 ml mikrocentrifugrör.
- Rengör receptorn (röd) punch från 0,6 mm stansuppsättningen genom att skjuta stansen upp och ned flera gånger medan spetsen är nedsänkt in i röret med lut. Upprepa ovanstående steg med 70% etanol och därefter vatten (kritisk för att säkerställa att blekmedel avlägsnas).
- Tryck på stansen in i vävnaden, inne i regionen av intresse till ett djup av 3 mm och dra tillbaka stansen. Frigöra kärnan i en låg bindnings 1,5 eller 2 ml rör genom att trycka det ut ur stansen med pennan. Förvara kärnorna vid -20 ° C (långsiktigt) eller 4 ° C för kortvarig användning.
- Rengör stansen enligt steg 1,4 och fortsätt med nästa regioner eller prov.
2. Avparaffinera de FFPE Vävnads Cores
- Carryout avparaffinering i 1,5 eller 2 ml rör genom att tillsätta 1 ml xylen till vävnaden kärna och vortexa kraftigt i 10 sek. heat under 3 min vid 50 ° C.
- Centrifugera i 2 minuter vid rumstemperatur (RT) och maximal hastighet (21.130 xg) och placera röret på is under 5 min (tillåter den vaxartade återstoden för att stelna på toppen).
- Försiktigt bort paraffin samlats kring menisken med supernatant med hjälp av en pipett spets och upprepa xylen behandling (steg från 2,1 till 2,2).
- Tillsätt 1 ml etanol (100%) och skaka kraftigt i 10 sek. Centrifugera under 2 minuter vid RT (maximal hastighet), och försiktigt kasta etanolen. Upprepa ovanstående steg en gång.
3. Homogenisering av de avparaffineras Cores
- Resuspendera kärnor i 700 | il etanol (100%) före homogenisering. Med hjälp av en motordriven vävnadshomogenisator, slipa kärnorna till fina vävnadspartiklar (~ 1 min på medelinställning). Rengör homogenisator sonden mellan varje prov för att minimera överföring kontaminering.
- Fyll 15 ml rör med ~ 10 ml blekmedel, RNas neutraliserande lösning och 70% etanol. Efter prov homogenization, tvätta homogenisatorn sonden i var och en av de rengöringsmedel som i den ordning som anges ovan. Kör homogenisator på den högsta hastigheten under tvättsteget.
- Torka sonden med vävnad och tillåta sonden torka helt innan homogenisering av nästa prov. Inspektera sondbladen för restvävnadsbitar. Om den hittas, rengör sonden igen. Ändra rengöringsmedel (blekmedel, etanol, och RNas neutraliserande lösning) dagligen.
- Efter homogenisering, ta provvolymen till 1 ml genom att tillsätta mer 100% etanol (~ 300 l). Centrifugera vid maximal hastighet under 15 min, försiktigt aspirera etanol och lufttorka pellet i ungefär 15-20 minuter innan man går vidare med RNA-extraktion.
4. Digerering med Proteinas K
- Återsuspendera pelleten i 150 | il proteinas K-spjälkning Buffert och flick röret för att lossa pelleten. Tillsätt 10 | il av temperaturstabila proteinas K och blanda genom att ställa (intevirvel röret). Inkubera innehållet i röret vid 56 ° C under 15 min med försiktig omröring.
- Låt röret inkubera på is i 3 min. Fullständig avkylning är viktigt för effektiv utfällning i det följande steget. Centrifugera i 15 minuter vid maximal hastighet.
5. Separat RNA från DNA
- Försiktigt överföra supernatanten utan att störa pelleten, till en ny 1,5 ml för RNA rening.
- Hålla pelleten för DNA-rening (pellet kan förvaras under 2 h vid RT, under upp till en dag vid 2-8 ° C, eller under längre tidsperioder vid -20 ° C).
6. RNA Rening
- Inkubera RNA-innehållande supernatanten vid 80 ° C under 15 min (inte överstiger denna tid). centrifugera nästa kortfattat röret för att samla droppar från insidan av locket.
- Lägg 320 l Buffer RLT att justera bindande villkor, och blanda genom att pipettera. Därefter till 720 l etanol (100%), och skaka.
- överföring 600 ul av provet, inklusive eventuell fällning som kan ha bildats, till RNA spinnkolonn (medföljer i satsen) placerades i en 2 ml provrör och upphäva den återstående innehåll. Centrifugera i 15 s vid ≥8,000 xg, kassera genomströmning och återanvända uppsamlingsröret.
- Överföring återstående provet på en kolonn, inklusive droppar som kan ha samlats i locket av röret, centrifug för 15 sek vid ≥8,000 xg, och kassera genomströmning.
- Lägg 350 l Buffer FRN till spinnkolonn och centrifugera i 15 sek vid ≥8,000 xg, kassera genomströmning och åter provrör.
- Blanda försiktigt 10 | il DNas I-förrådslösning med 70 | j, l Buffert RDD, lägga direkt till spinnkolonn membranet, och inkubera vid RT i 15 min.
- Tillsätt 500 | al Buffert FRN till spinnkolonn, centrifugera i 15 sek vid ≥8,000 xg och spara genomflödet för användning i nästa steg. För att öka återvinningen av små RNA, placerar rotationskolonn i ennya 2 ml uppsamlingsrör och tillämpa genomflödet från det föregående steget till den spinnkolonn.
- Centrifugera i 15 s vid ≥8,000 xg, kassera genomströmning och återanvända uppsamlingsröret i nästa steg. Tillsätt 500 | il Buffer RPE till spinnkolonn och centrifugera i 15 s vid ≥8,000 xg, kassera genomströmning och återanvända uppsamlingsröret i nästa steg.
- Tillsätt 500 | il Buffer RPE till spinnkolonn och centrifugera i 15 sek vid ≥8,000 xg och kassera uppsamlingsröret med genomflödet.
- Placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör, öppna locket och centrifugera vid maximal hastighet under 5 min. Kassera uppsamlingsröret med genomflödet.
- Placera spinnkolonn i ett nytt 1,5 ml uppsamlingsrör, tillsätt 20 pl RNase-fritt vatten direkt på spinnkolonn membranet och inkubera röret i 1 min vid RT. Centrifugera vid maximal hastighet under 1 min för att eluera RNA. Lagra det eluerade RNA-provet vid -80 ° C.
- Suspendera pelleten som erhålls vid RNA-extraktion genom stegvis tillsats av 45 | il proteinas K-buffert (400 mM Tris 7,5, 400 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 4% SDS); 45 pl H2O; och 400 | j, g av hög potens Proteinase K.
- Inkubera lösningen ovan vid 56 ° C under 24 h (rekommenderas) eller över natten. Performincubation vid 90 ° C i 2 h utan omröring och kortvarigt centrifugera mikrocentrifugrör för att samla droppar från insidan av locket.
- Låt provet svalna till RT och sedan lägga till 4 | j, l RNas A (100 mg / ml). Inkubera provet under 2 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 200 l Buffer AL till provet, och blanda väl genom att vortexa. Därefter tillsätt 200 pl 100% etanol, och blanda väl genom att vortexa. Överföra hela provet till tillgänglig spinnkolonn och placera i en 2 ml uppsamlingsrör, och centrifugera i 1 min vid ≥8,000 x g.
- Kassera uppsamlingsrör medgenomströmning och placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör. Lägg 700 l Buffer AW1 till spinnkolonn, centrifugera i 15 sek vid ≥8,000 xg, kassera genomströmning och återanvända provröret.
- Lägg 700 ul buffert AW2 till spinnkolonn, centrifugera i 15 sek vid ≥8,000 xg, kassera genomströmning och återanvända provröret. Nästa, tillsätt 700 | il av 100% etanol till den spinnkolonn, centrifugera i 15 sek vid ≥8,000 xg och kassera uppsamlingsröret med genomflödet.
- Placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör, öppna locket av spinnkolonn, och centrifugera vid full hastighet under 5 min. Kassera uppsamlingsröret med genomflödet.
- Placera spinnkolonn i ett nytt 1,5 ml uppsamlingsrör och tillsätt 25 | il av uppvärmd nukleasfritt vatten (50 ° C). Inkubera kolonn och rör vid 50 ° C under 10 minuter. Centrifugera under 1 min vid maximal hastighet, tillsätt 25 | il av nukleasfritt vatten (RT) till kolonn och inkubera i1 min vid RT.
- Centrifugera i 1 minut vid maximal hastighet (21.130 xg) och skörd genomströmning innehållande genomisk DNA (cirka 50 pl DNA totalt). Lagra kolonnen vid -20 ° C (i fallet en annan eluering krävs senare).
Representative Results
Detta protokoll utgör en optimerad metod för att utvinna DNA och RNA från vävnadskärnor, med hjälp av ändringar i kommersiell utvinning system som utformats för vävnadssnitt. Optimering ingår införandet av vävnaden homogenisering, utnyttjande av mer potenta proteinas K för DNA-extraktion, och förlängning av vävnadskoktiden. Grafer och statistiska analyser ingår två-vägs ANOVA, linjär regression och korrelation.
Optimeringar av proteinasklyvning
Den kommersiella kit ingår en rumstemperatur stabil proteinas K-lösning som ersattes med en mer potent proteinas K, vilket resulterar i högre DNA avkastning (Figur 2A). För att ytterligare öka de DNA-utbyten, var digestion förlängdes från 2 till 24 timmar. Inga signifikanta skillnader sågs mellan de två tidpunkter, men 24 hr matsmältningen verkade ge mer konsekvent avkastning över samples. Men ytterligare inkubation till 48 timmar inte ytterligare förbättra DNA återhämtning (Figur 2B, p = 0,74).
Typiska DNA Återhämtning från FFPE Prostate Cancer vävnadsprover
Använda den optimerade protokoll, var co-utvinns ur 333 prostatacancer FFPET prover från 3 till 14 år i prov ålder RNA och DNA. Från varje prov var 3 vävnadskärnor (genomsnittliga totala vävnadsvolym på 0,95 ± 0,13 mm 3) används som indata. Medan det finns andra mikroflödesbaserade gel-elektroforesmetoder, som kan uppskatta koncentrationerna och ge utvärderingar av storleksfördelningen av nukleinsyror molekyler, behöver sådana metoder inte ger reproducerbar nukleinsyror kvantifiering, och kan inte skilja mellan RNA och DNA som flourometrically-baserade analyser gör. 22 Och eftersom mikroflödes gel-elektroforesresultat är inte tillförlitliga för fragmenteradnukleinsyror härrörande från FFPET var 23 nukleinsyra avkastningen mäts fluorometriskt (se reagens lista för detaljer). Det genomsnittliga utbytet var 2270 ng av RNA och 820 ng av DNA (figur 3A). Ungefär 90% av alla FFPET prover som analyserats i denna studie gav ≥100 ng DNA och ≥ 500 ng av RNA. Intressant nog fanns det ingen signifikant korrelation mellan ålder på FFPET provet och nukleinsyra återhämtning (Figur 3B). Totalt sett var RNA- och DNA-utbyten korreleras tvärs prover (R 2 = 0,39; p <0,0001), även om mer än dubbelt så mycket RNA än DNA utvanns från varje prov (figur 3C).
Som pilot och optimeringsarbetet utfördes på prostatavävnad, nästa steg var att undersöka genomförandet av detta protokoll på några ytterligare typer av arkiv vävnad. Från och med avlägsnas kirurgiskt och obduktions FFPET prover som representerar varanign levern (ett prov från ett fall), cancer i hjärnan (8 prover från ett fall), urinblåsa (2 prover från 2 fall), och bröstcancer (3 prover från 3 fall), gav det protokoll> 100 ng DNA och RNA från 90% av proverna (Figur 3D). Medan nukleinsyra avkastningen var lägre i obduktionsvävnader än i kirurgiska vävnader representativa resultat tyder på att protokollet ger liknande utbyten över cancer som härrör från olika platser.
Bedömning av RNA och DNA integritet och deras representativ i nedströmsanalys
RNA-expressionsanalys av 47 gener i 8 utvalda FFPET prostatacancerprov och ett färskt PC-3 prostatacancercellinje prov (som en positiv kontroll) genomfördes med användning av en kommersiell multianalyte genuttryck plattform som är optimerad för FFPET. MRNA räknas i PC3 var typiskt högre än de från FFPET samples (Figur 4A). Emellertid att jämföra relativa expressionen av alla gener, FFPET prostatacancerprover visade liknande uttrycksprofiler för att PC-3-RNA, vilket indikerar att båda källor för RNA är lämpliga för RNA-uttrycksprofilering.
För att demonstrera prestanda iskt DNA extraheras med detta protokoll, var bisulfit-konverterade DNA extrakt från FFPET prover förstärks genom metylering specifik PCR (MSP). 24 MSP analys av ALU repetitiva element, mycket metylerade regioner som finns i miljontals exemplar i det mänskliga genomet, 25 användes som en genomisk metylering kontroll, och väntas visa minimala variationer mellan prover. Som visas i figur 4B, det var lite eller ingen variation ses mellan olika prover i ALU MSP metylering nivåer. Vidare, MSP analyser baserade på GSTP1 en gen känd för att vara hypermethylated i prostatacancer men inte i benigna prover, 26 visade ingen påvisbar amplifIKATION i DNA från godartade prover. Som väntat var lägre qPCR cykel tröskelvärden detekteras i DNA från cancervävnad, vilket indikerar anrikning av metylerade GSTP1 kopior. Nyttan av nukleinsyror utvanns genom detta protokoll testades vidare i typiska nedströms analyser med hjälp av nukleinsyror som återvunnits från godartad lever och från en hjärna (obduktion) och från två kirurgiskt avlägsnade bröstcancerprover. Både RT-qPCR baserad uttrycks och MSP-analyser utvecklades väl på bröstcancer och lever FFPET, men RT-PCR-analys misslyckats med att förstärka en höggradigt uttryckt mRNA från obduktions hjärntumör prov (Figur 4C), vilket tyder på att RNA hade försämras, sannolikt på grund av försenad vävnadsfixering.
Figur 1:. Översikt över extraktionsmetod för FFPET Prover Figuren visar hur ett område av intresse i envävnadsblock avbildas baserat på histopatologisk urval från ett objektglas. Tre 0,6 mm vävnadskärnor erhålls sedan från varje vävnadsområdet med hjälp av biopsi slag, homogeniseras tillsammans och sedan utsattes för extraktion av både RNA och DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: nukleinsyror (DNA och RNA) ger i ng / mm 3 av FFPET från två Proteinas K (temperaturstabila och hög potens Enzymer) och testades i en rad inkubationstider för sista (A) Utförande av proteinas K. från olika leverantörer. DNA-extraktioner utfördes på ett representativt FFPET prov med användning av temperaturstabila enzym som medföljer kdet mot en mer potent enzym från en annan tillverkare. (B) bestämma en optimal Proteinas K inkubationstid för att maximera DNA utbyte. Utförande av hög koncentration proteinas K-spjälkning utvärderades vid tre olika inkubationsperioder använder 3 FFPET prover. Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Nukleinsyror (DNA och RNA) ger i ng / mm3 av FFPET totalt över Sample år och representativa vävnadstyper (A) Totalt återvinns nukleinsyror från formalinfixerade paraffininbäddade vävnaden. De nukleinsyror kvantiteter som är baserade på utvinning av 333 FFPET prover usjunga optimerat protokoll. (B) Jämförelse tomt mellan återvunna total DNA och RNA och ålder FFPET prover. De extraherade FFPET prov som användes erhölls från åren 2000 till 2012. (C) Samband mellan avkastningen från samtidigt extraherade DNA och RNA från 333 prostataprov. Det finns en positiv korrelation mellan DNA- och RNA-utbyten. (D) Demonstration av protokollet använda ytterligare arkivvävnadstyper. Den optimerade protokoll användes för att extrahera nukleinsyror från 14 cancer (bröst, urinblåsa och hjärna) och normala (lever) prover. Felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Utförande av RNA och DNA Co-utvinns ur TissuE-kärnor i nedströmstillämpningar. (A) mRNA räknas för FFPE prostatacancer vävnader och för färskt PC-3-cellinjen kontroll. Varje punkt representerar medelvärdet av 3 tekniska replikat extraherade separat. Färsk PC-3 cellinje RNA värden illustreras av gula barer och FFPET vävnadsvärden representeras av färgade prickar. (B) Metylering specifika PCR-analyser på DNA av FFPET prostatacancer prover. Cykel tröskelvärden erhölls för 10 prover som utförs som förväntat med hjälp av 50 ng / reaktion av bisulfit konverterade DNA. ALU MSP analyser från alla FFPET proven hade liknande cykel tröskelvärden (p> 0,67). GSTP1 MSP-analyser visade högre metylering (lägre cykel tröskel) nivåer i prostatacancer än i godartad prostata. (C) Bedömning av DNA och RNA kvalitet från andra vävnadstyper. HPRT1 genuttryck och Alu gense metylering analyser utfördes på nukleinsyror (RNA och DNA respektive) som extraheras från ellerMal lever (obduktion), och hjärnan (obduktion) och bröstcancer (alla FFPET). Resultat från prostata visas som jämförelse. Notera: liknande resultat observerades från varje vävnadstyp, utom för misslyckats mRNA amplifiering från en obduktionsprov. Varje punkt eller stapel representerar ett prov, och felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| vävnads~~POS=TRUNC Cores | ||||||||||||||||||||
| Vävnads ingång (mm3) | Extraherade nukleinsyran | Godkännande | Kvalitetskontroll: DNA | Kvalitetskontroll: RNA | ||||||||||||||||
| (# Av proverna) | Ålder Prov (år) | Totalavkastning (ng) | Fragmentstorlek (bp) | PCR | Totalavkastning (ng) | Fragmentstorlek (bp) | PCR | NanoString | ||||||||||||
| Pikor et al. | 43-129 | DNA | Inga data | Inga data | Inga data | Inga data | ||||||||||||||
| Montaser-Kouhsari et al. | 18-29,5 | RNA | 763 | 0-25 | 843 | Inga data | ||||||||||||||
| Detta papper | 1,71 | DNA och RNA | > 350 | 3-12 | 820 | 100-500 |  | 2270 | 100-500 | | /ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/> | |||||||||
| vävnadssnitt | ||||||||||||||||||||
| vävnads Input | Extraherade nukleinsyran | Godkännande | Kvalitetskontroll: DNA | Kvalitetskontroll: RNA | ||||||||||||||||
| (# Av proverna) | Ålder Prov (år) | Totalavkastning (ng) | Fragmentstorlek (bp) | PCR | Totalavkastning (ng) | Fragmentstorlek (bp) | PCR | NanoString | ||||||||||||
| Heikal et al. | 5 x 5 ^ m | DNA | 12 | 7-22 | 88-300 | 103-351 | | |||||||||||||
| Chung et al. | 1 x 20 um | RNA | 9 | > 5 | 16,000- 23000 | 100-200 | | |||||||||||||
| Antica et al. | 2 x 4 ^ m | RNA | 18 | Inga data | Okänd (621 ng / l) | 80-202 + | | |||||||||||||
| Ghatak et al. | 5 x 5 ^ m | DNA och RNA | 5 | 1 | 14 256 | <1030 | | 16 000 | 109-400 + | | ||||||||||
| Hennig et al. | 1 x 10 ^ m | DNA och RNA | 210 | 1-25 | Inga data | Inga data | | Inga data | Inga data | | ||||||||||
| Laser Capture Microdissection | ||||||||||||||||||||
| Vävnads ingång (mm2) | Extraherade nukleinsyran | Godkännande | Kvalitetskontroll: DNA | Kvalitetskontroll: RNA | ||||||||||||||||
| (# Av proverna) | Ålder Prov (år) | Totalavkastning (ng) | Fragmentstorlek (bp) | PCR | Totalavkastning (ng) | Fragmentstorlek (bp) | PCR | NanoString | Snow et al. | 1-2 | DNA | 110 | 0-2 | 430 | Inga data | | ||||
Tabell 1:. En jämförelse mellan publicerade DNA och RNA extraktion protokoll för vävnadskärnor, sektioner och laser capture microdissections ingår också flera molekylära endpoints bedömning av dessa metoder med användning av PCR och Nanostring analyser.
Discussion
För framgångsrik extraktion av DNA och RNA från vävnadsområden av intresse, är korrekt kärn kritisk. Detta protokoll beskriver användningen av en vävnad punch för att isolera 0,6 mm kärnor diameter och beskriver processen för att överföra noteringar från objektglas till motsvarande FFPET block. Ändringar av tillverkarens protokoll krävdes för att effektivt extrahera nukleinsyror från kärnor, som är cirka 50 gånger tjockare än Mikrotomen sektioner som protokollet är avsedd. Eftersom kärnorna kan innehålla mer paraffin i förhållande till vävnadssnitt, effektiv avparaffinering kärnor genom upprepad xylen och etanol behandlingsstegen krävdes. Framgången för efter avparaffinering steg beroende på ordentlig mekanisk vävnadskärnor homogenisering och effektiv proteinas K matsmältningen. Ytterligare optimering av proteinas K-spjälkning kan utföras.
Det är värt att nämna att denna metod identiFIES intresseområden på ytan av blocket, som identifieras i motsvarande histopatologiska diabilder. Eftersom kärn skördar vävnad som kan vara 3 eller 4 mm djup, kan användare av detta protokoll vara bekymrad över vad celler eller vävnader låg under blocket yta. Även om detta är en giltig oro, har flera studier (översikt i referens 27) visade att vävnadskärnor står troget histologiska och molekylära funktioner av patologiska vävnadsblock, i synnerhet när dubbla eller tredubbla kärnor samplas från området av intresse.
Eftersom modifierad kommersiell utvinning kit som antogs i detta protokoll möjliggör samtidig extraktion av både DNA och RNA från samma vävnad, sparar protokollet värdefulla biologiska materialet och gör en direkt jämförelse mellan de två resulterande nukleinsyror från samma prov. Samtidig extraktion av RNA och DNA minskar arbetskraft och vävnads utarmning med hälften, och möjliggör exakt integrerad analys av genen expression, liksom epigenetiska och genetiska funktioner som finns i DNA. Eftersom halterna av både RNA och DNA från dessa representativa vävnadskärnor typiskt överstiga 600 och 300 ng, respektive, och eftersom de flesta nuvarande PCR och nästa generations sekvense tillämpningar kräver typiskt 10-100 ng, bör de flesta av proverna som renats genom detta protokoll ge adekvat material för flera nedströms analyser. Detta protokoll har visat sig vara reproducerbar över oberoende laboratorier (Selvarajah et al., I Prep.). RNA från detta protokoll var av tillräckligt hög kvalitet för genuttryck analys med hjälp av antingen RT-PCR eller en populär multianalyte plattform, och DNA utvecklades väl i metylering specifika PCR-analyser. Framtida studier som syftar till att bedöma nyttan av återvunna nukleinsyror i nästa generations sekvensering är motiverade.
Således har flera ändringar gjorts till ett kommersiellt tillgängligt protokoll, avsedd för tunna FFPET sektioner, vilket gör den lämplig for samtidig extraktion av RNA och DNA från 0,6 mm FFPET kärnor. Protokollet visade genomgående höga utbyten i en stor kohort av prostatacancer prover och i ett begränsat antal prover av cancer i bröst, hjärna och urinblåsa. Sammantaget bör protokoll gör det möjligt för användare att genomföra riktade genbaserade analyser av stora väl kommenterade vävnadssamlingar. Viktigt, gör protokollet effektiv fokuserad provtagning av regioner av intresse i FFPET relativt små hands-on tid, och tillräckligt hög avkastning för de flesta tillämpningar nedströms.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
| Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
| Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
| Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
| 0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
| Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
| FFPE tissue block | |||
| Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
| 1.5 ml Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
| 2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
| 1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
| Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
| Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
| Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
| Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
| High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
| RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
| RNaseA 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | |
| BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
| Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
| -20 °C and -80 °C Laboratory Freezer | |||
| Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes | |||
| Digital Vortex Mixer | |||
| Pipettes and filter tips | |||
| Heating blocks or water baths | |||
| Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
| Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
| Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
| Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 ml | BD Integra | 305274 | |
| Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
| Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
| Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |
References
- Kern, S. E. Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures. Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).
- Beltran, H., et al. Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity. Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).
- Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies. Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).
- von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).
- Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
- Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Turashvili, G., et al. Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques. Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).
- Espina, V., et al.
- Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).
- Bonin, S., Stanta, G. Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics. Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).
- Bonin, S., et al. Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).
- Montaser-Kouhsari, L., et al. Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).
- van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).
- Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens. J. Clin. Lab. Anal. , (2014).
- Hennig, G., et al. Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression. Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).
- Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing. BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).
- Torrente, M. C., et al. DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques. Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).
- Okello, J. B. A., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).
- Abramovitz, M., et al. Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay. BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).
- AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).
- Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment (2012).
- Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).
- Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight. Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).
- Yegnasubramanian, S. Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer. Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).
- Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).
