Summary
Методология с высокой пропускной способностью, автоматизированное, табачных протопластов производство и преобразование описано. Роботизированная система позволяет массово-параллельной экспрессии генов и открытие в модельной системе BY-2, которая должна быть переводимым не-модельных культур.
Abstract
За последнее десятилетие наблюдается всплеск в использовании растительных протопластов, которые варьируются от модельных видов подрезать видов, для анализа путей передачи сигнала, транскрипционных регуляторных сетей, экспрессии генов, генома редактирования и гена-глушителей. Кроме того, значительный прогресс был достигнут в регенерации растений из протопластов, породившей еще больший интерес к использованию этих систем для растений геномики. В этой работе, протокол был разработан для автоматизации изоляции протопластов и трансформации из «Ярко-желтый '2 (BY-2) табака суспензионной культуры с использованием роботизированной платформы. Процедуры трансформации были подтверждены с использованием оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) ген-репортер (pporRFP) под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S (35S). ОФП выражение в протопласты было подтверждено эпифлуоресцентной микроскопии. Анализы также включены протопластов методы эффективности производства с использованием propidiuм йодистый. И, наконец, недорогие ферменты пищевые были использованы для процедуры выделения протопластов, обходя необходимость лабораторного класса ферментов, которые непомерно в высокой пропускной способности автоматизированной изоляции и анализа протопластов. На основании протокола, разработанного в данной работе, полная процедура от выделения протопластов к трансформации может быть проведена в соответствии с 4 ч, без какого-либо вмешательства оператора. В то время как протокол, разработанный в данной работе была подтверждена с клеточной культурой BY-2, процедуры и методы должны быть переводимым к любой подвески растений культуры / протопластов системы, которая должна позволить ускорению исследований в области геномики культур.
Introduction
В последние годы наблюдается значительный импульс уделяется разработке трансгенных культур для преодоления различных заболеваний 1, наделяют устойчивость к гербицидам 2, придают засуху 3,4 и солеустойчивости 5, предотвратить herbivory 6, увеличить выход биомассы 7, и уменьшение клеточной стенки упрямство 8. Эта тенденция способствовала развитию новых молекулярных инструментов для создания трансгенных растений, в том числе генома редактирования с использованием CRISPR и Таленс 9 и молчанием генов через дсРНК 10, микроРНК 11 и миРНК 12. Несмотря на то, что эти технологии упростили поколение трансгенных растений, они также создали узкое место, где огромное количество трансгенных растений, генерируемый не могут быть подвергнуты скринингу с использованием традиционных систем, которые полагаются на регенерации растений. В связи с этим узким местом, в то время как глушителей и геном-редактирования конструкции могут быть быстро вставлены в растения, многие изцелевые черты не производят желаемого эффекта, который часто не обнаружен, пока растения не анализируются в теплице. В этой работе, мы разработали метод для быстрого, автоматизированного, высокопроизводительного скрининга растительных протопластов, специально для решения текущего узкого места в начале скрининга большого количества генома-редактирования и молчанием генов мишеней.
Использование протопластов, в отличие от интактных клеток растений, имеет ряд преимуществ для разработки автоматизированной платформы. Во- первых, Протопласты были выделены после переваривания клеточной стенки растений, и с этим барьером больше нет, эффективность преобразования повышается 13. В интактных клетках растений существуют только два хорошо известных методов трансформации, биолистики 14 и Agrobacterium опосредованной трансформации 15. Ни один из этих методов могут быть легко переведены на жидких погрузочно-платформ, так как биолистики требует специального оборудования для Трансформатория, в то время как Agrobacterium -опосредованного преобразование требует совместной культуре и последующее удаление бактерий. Ни один не поддаются для высоких методов пропускной способности. В случае протопластов, преобразование обычно проводят с использованием полиэтиленгликоля (PEG) -опосредованного трансфекцию 16, которая требует только несколько обменов решения, и идеально подходит для жидких обработки платформ. Во-вторых, протопласты, по определению, являются одноклеточные культуры, и, таким образом, проблемы, связанные с слипания и цепи формирования в растительных клеточных культурах, не наблюдаются в протопласты. С точки зрения быстрого скрининга с использованием планшетов на основе спектрофотометра, слипание клеток, или клетки в нескольких плоскостях, приведет к трудности в получении устойчивых результатов измерений. Так как протопласты также более плотной, чем их культуральных сред, они оседают на дно лунок, образуя монослой, которая благоприятна для плиты на основе спектрофотометрии. И, наконец, в то время как клетки растения суспензионные культуры являются примарILY полученный из каллуса 17, протопласты могут быть собраны из ряда тканей растений, что приводит к возможности идентификации экспрессии тканеспецифической. Например, возможность анализа или листа: корневой-специфическую экспрессию гена, может быть очень важным для прогнозирования фенотипа. По этим причинам, протоколы , разработанные в этой работе были проверены с использованием протопластов , выделенных из широко используемых табака (Nicotiana аЬасит L.) 'Ярко - желтый' 2 (BY-2) суспензионную культуру.
Побочный 2 суспензионной культуры была описана как "HeLa" клетки высших растений, из - за его повсеместной использования в молекулярном анализе растительных клеток 18. В последнее время BY-2 клетки были использованы для изучения влияния основных стрессоров 19-22, локализация внутриклеточный белок 23,24, и основной клеточной биологии 25-27 демонстрируют широкой полезности этих культур в биологии растений. Дополнительное преимущество × 2 культур являетсявозможность синхронизации культур с aphidicolin, что может привести к повышению воспроизводимости для экспрессии гена исследования 28. Кроме того, были разработаны методы для извлечения BY-2 протопласты с использованием недорогих ферментов 29,30, так как ферменты , традиционно используемые для формирования протопластов являются экономически запретительной для систем с высокой пропускной способностью . Таким образом, протокол, описанный ниже, была проверена с использованием суспензионного культуры BY-2, но оно должно быть исправимо к любой клеточной суспензии растений культуры. Доказательство концептуальных экспериментов проводили с использованием оранжевого флуоресцентного белка (ОФП) ген - репортер (pporRFP) из твердых кораллов Porites Porites 31 под контролем промотора CaMV 35S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание суспензионных клеточных культур
- Готовят жидкость × 2 сред путем добавления 4,43 г Linsmaier & Скоог основных сред, 30 г сахарозы, 200 мг KH 2 PO 4, и 200 мкг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) до 900 мл дистиллированной воды и рН до 5,8 с помощью 0,1 М КОН. После доведения рН, регулировать конечный объем до 1000 мл дистиллированной водой и автоклаве. Средства массовой информации могут храниться до 2-х недель при 4 ° С.
- Привить колбу 250 мл Эрленмейера с 100 мл жидкости-2 СМИ и одного куска BY-2 каллуса (> 1 см в диаметре), выращенных на твердом теле-2 сред (жидкости-2 средах с добавлением 1% агар) и печать с алюминиевой фольгой. Инкубируйте культуру при 28-30 ° С при встряхивании в течение 5 дней.
Примечание: BY-2 каллус поддерживается на твердых средах для длительного хранения, так как жидкие культуры будут быстро зарастают. Объем культуры может быть отрегулировано по мере необходимости, как правило, 100 мл культуры будет способен загружать тридцать три 6-WELL пластины. - Передача 2 мл лог-фазы BY-2 культуры до 98 мл свежей среды, BY-2 и инкубировать в течение 5-7 дней при температуре 28-30 ° С при встряхивании.
Примечание: Под-Культивирование установленных жидких культур может осуществляться регулярно с использованием 1: 100 разбавлени 5-7-дневных культур, а не инокуляции каллуса. - Смешайте культуру тщательно, как и клетки быстро оседают, и передача 6 мл клеточной культуры в 15 мл коническую центрифужную пробирку снизу, и пусть клетки оседать в течение не менее 10 мин. Отрегулировать гематокрита до 50% от общего объема удалением надосадочной жидкости.
- Взболтать трубку, перевернув и пипетка 500 мкл в каждую лунку 6-луночного планшета для пищеварения. Использование широким отверстием пипетки для переноса клеток на этой стадии, поскольку они плотны и закупоривать стандартные советы пипеткой.
2. Выделение протопластов
- Включите все компоненты роботизированной системы (рис 1А) и откройте задачу пластины первопроходца планирования мягкойпосуда. Программа планирования задач интегрирует микропланшетов движитель с другим оборудованием, чтобы включить передачу пластин между каждой единицы оборудования.
- До начала эксперимента, определить технические спецификации для лабораторного оборудования (например, плиты, крышки) , используемые в протоколе, а также начальные и конечные позиции для каждой части лабораторного оборудования, в программном обеспечении пластины первопроходца, следующим образом :
- Выберите пункт Настройка главной панели инструментов в программном обеспечении пластины первопроходца и выберите контейнер команды управления типами.
- Если тип контейнера указан в существующей библиотеке контейнерного типа, затем выберите соответствующий контейнер.
- Если тип контейнера не указан в существующей библиотеке контейнерного типа затем нажмите кнопку Добавить , чтобы указать новый тип контейнера.
- После добавления нового контейнерного типа, вставьте размеры нового контейнера (высота, ширина, укладывая размеры и грейфером Offset) в соответствующие вкладки и нажмите кнопку Сохранить.
- Если правильные размеры не доступны от производителя, а затем точно определить все размеры с точностью до миллиметра с помощью штангенциркуля. Ошибки при измерении размеров контейнера приведет к выходу из строя пластины движителя.
- Повторите шаги 2.2.2 через 2.2.4.1 для всех типов контейнеров, что пластина движитель будет столкнуться. После завершения этого шага для всех лабораторного оборудования, необходимо определить начальную и конечную место для каждого контейнера (этап 2.2.6).
Примечание: Для этого протокола лабораторного оборудования включает в себя 6-луночного планшета, глубоководный луночного планшета, а также 96-луночного флуоресцентного скрининга пластины. - Для того, чтобы определить начальную и конечную позицию каждого контейнера, щелкните вкладку Start / End в определенном протоколе. Во-первых, выбрать начальное положение каждого контейнера. Далее, установите флажок / Unlidded закрывают крышкой как на начальной и конечной позиции. Повторите эти действия для всех контейнеров.
Примечание: Если контейнер будет оставлен на другой части фасчь (вместо пластины движителя) конец местоположение может быть оставлено пустым.
- На этом этапе вручную загрузить все пластины в исходное положение в течение всего рабочего процесса. Загрузить 96-луночного флуоресцентных экранирующих пластин в отеле 2, 6-луночные планшеты с BY-2 клеток в Hotel 3, 96-артезианской пластину, которая будет использоваться для преобразования на пластины нагревателя / чиллера гнезда 2 и 50 мл коническую пробирку , содержащую раствор фермента (см Дополнительный файл, раздел 1.2.2) на многорежимный дозаторе.
- Если преобразование будет осуществляться в протоколе, предзагрузить 96 артезианской пластинку с 10 мкл ДНК плазмиды на лунку (1 мкг / мкл, А 260/280> 1,8) , содержащий репортерной конструкции OFP и инкубировать на пластине нагреватель / охладитель при температуре 4 ° С. Каждая скважина будет использоваться для одного преобразования, таким образом, число скважин, заполненных будет зависеть от экспериментальной установки.
- Загрузите все расходные материалы и плиты на Automated жидкости платформы обработки в специально отведенных местах и определить положение каждого элемента автоматизации управления программным обеспечением (Рисунок 1В).
- Загрузка 96-луночный планшет предварительно загружено с 200 мкл 40% ПЭГ в ММГ (0,4 М маннитола, 100 мМ MgCl 2, 4 мМ MES, рН 5,7) в колонке 1, 200 мкл пропидийиодидом (PI, 1 мкг / мл) в колонке 2, и 200 мкл этанола в колонке 3 (гнездо 2), и коробку пипеток в гнезде 8.
- Для того, чтобы определить местоположение лабораторного оборудования в программном обеспечении автоматической обработки платформы Ликвида, выберите Сервис в меню и выберите Редактор Лабораторное оборудование.
- Выберите тип лабораторного оборудования из выпадающего меню или определить новый тип , используя лабораторное кнопку New Лабораторное оборудование.
- Определить положение каждого элемента , выбранного лабораторного оборудования, выбрав вкладку Main Protocol и нажать кнопку Настроить Лабораторное оборудование. Убедитесь в том, что каждая часть лабораторного оборудования размещена на платформе автоматизированной обработки жидкостиопределены перед запуском протокола.
- Для запуска автоматизированных протоколов, щелкните окно проводника профиля и выберите имя протокола , который будет запускать (выделения протопластов, Cell Count и ПЭГ-опосредованной трансформации).
- Нажмите кнопку Выполнить , чтобы инициализировать все устройства , которые будут использоваться в протоколе.
- Наконец, в окне Проводника работы, нажмите кнопку Add Work Unit для проверки всех контейнеров / лабораторного оборудования в системе и начать автоматизированный протокол.
Примечание: Полное описание автоматизированных протоколов содержатся в Дополнительной File.
3. Установите стандартную кривую для Цитоз
- Вручную концентрировать протопластов при концентрации 1 × 10 6 протопластов / мл в объеме 1 мл. Центрифуга протопластов при 1000 х г в течение 10 мин, и удаления надосадочной жидкости.
- Вручную добавьте 900 мкл 70% этанола (поддерживаемую при 4 ° С) до протопластов гранулыи повторно приостанавливать осадок. Инкубировать в течение 10 мин на льду, чтобы зафиксировать клетки.
- Добавьте 100 мкл PI (1 мкг / мл) в протопласты для обозначения ядра и позволяют обнаружить с помощью ридера.
- Нагрузка 80 мкл жидкости × 2 носитель в каждом столбце и строке 96-луночного флуоресцентного скрининга пластины, начиная с колонки 2.
- В колонке 1 в 96-луночные флуоресцентного скрининга пластины, добавить 70 мкл протопластов и 50 мкл × 2 сред в каждую лунку в колонке.
- Место пластины в гнезде 6 автоматизированной платформы и транспортировки жидкости, и запустить 2-кратное серийное разведение.
- Провести серийное разведение на автоматизированную платформу обработки жидкости, нажмите кнопку Запустить мастер последовательного разбавления и регулировки громкости передачи (60 мкл), количество смесей и объема (2, 70 мкл), начальные лунки (колонка 1, строки AF), разведение колодцы (Столбцы 2-11, Ряды AF), а также диспенсирующих и отсасывающих свойства (0,5 мм от скважины снизу).
- После настройки параметров, сохранитеd запустить протокол.
Примечание: Так как все протопласты помечены PI (из-за фиксации клеток), флуоресценция пропорциональна концентрации протопластов. - После того, как последовательное разведение завершено, удалить пластину из гнезда 9 и вставить в планшет-ридере и запустить стандартный протокол кривой в программном обеспечении планшет-ридер.
Примечание: Стандартная кривая будет генерироваться путем сравнения флуоресценции от PI (возбуждение 536 нм / эмиссии 620 нм) в каждой лунке с известной концентрацией протопластов.
- После завершения протокола для считывания планшетов, удалить пластину и собирают трансгенной клетки для автоклавирования или других процедур, де-витализации, как это определено в протоколах биологической безопасности.
4. Микроскопический анализ трансформации
- Удалить пластину с трансформированных протопластов (продукт Automated протокола 3 Справочная файлов) из Hotel 1 роботизированной системы.
- Очередьна инвертированный микроскоп, фотоаппарат, и люминесцентной лампой.
- Выберите цель 10X для первоначального упором на протопластов, включите галогенной лампы, и закройте затвор для люминесцентной лампы.
- Нагрузка на пластины микроскопической системы и сосредоточиться на протопласты с использованием светлого.
- После фокусировки на протопластов, выключите галогенную лампу и открыть затвор для люминесцентной лампы.
- Выберите Cy3 / TRITC набор фильтров для визуализации белка pporRFP, выраженное трансгенных протопластов.
- Сканирование в каждую лунку, чтобы определить количество протопластов, выражающий pporRFP флуоресцентный маркер.
- Расчет эффективности преобразования как общее число протопластов, выражающее флуоресцентный маркер общее количество протопластов.
- Соберите все пластины, содержащие трансгенные клетки в утвержденных мешки для автоклавирования биобезопасности или других процедур де-витализации, как это определено в протоколах биобезопасности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В текущем исследовании, удвоение скорости BY-2 изменялась от 14-18 ч в зависимости от температуры, при которой инкубировались культуры, в соответствии с предыдущими сообщениями о средней продолжительности клеточного цикла 15 ч. При этом скорость удвоения, 1: 100, начиная прививочный материал был использован для инициации культур, что приводит к культурам с гематокрита (PCV) 50% в течение 5-7 дней. В текущем протоколе, в котором культуры выращивают в 200 мл носителе, PCV 100 мл сгенерирована за 7 дней, что обеспечило достаточное количество клеток, чтобы заполнить 33 6-луночных планшетах. С точки зрения протопластов доходности, сбраживание при соблюдении условий , указанных в протоколе генерируется 4,70 × 10 5 ± 5,77 × 10 3 протопластов на лунку, что приводит к 2,82 х 10 6 протопластов на 6-луночного планшета (Рисунок 2А). На основании этих данных, 214 96-луночные планшеты (70 мкл протопластов на лунку) могут быть загружены из одного 6-луночный планшет пищеварением, с потенциалом FoR две 6-луночные планшеты переваривается одновременно, используя две пластины нагревателя / холодильной машины станций. Таким образом, максимальное количество протопластов , которые могут быть сгенерированы в течение одного протокола трехчасового переваривание 5,64 х 10 6.
В то время как общее количество протопластов, полученных в соответствии с протоколом переваривания обеспечивает одну метрику для системы, также необходимо оценить потери в протопластов концентрации, как протопласты передаются через различные этапы протокола. Таким образом, концентрация протопластов оценивали после каждого этапа передачи в протоколе. После того, как протокол пищеварения, 1,15 х 10 4 ± 1,35 х 10 2 протопласты переносили в каждую лунку 96 - артезианской пластин, при проведении протокола преобразования или 96-луночных флуоресцентного скрининга пластины (рис 2B). После того , как протокол преобразования был закончен, 1,23 х 10 3 ± 4,66 х10 1 протопласты были переданы в 96-луночного флуоресцентного скрининга пластины (рис 2С). В дополнение к числу протопластов переданных, то важно, чтобы определить жизнеспособность протопластов, чтобы гарантировать, что несколько этапов пипетирующие не повредить протопластов.
Основываясь на результатах анализа жизнеспособности, 95,1 ± 0,04% от протопласты жизнеспособными после переваривания, 92,1 ± 0,06% после переноса в 96-луночные флуоресцентного скрининга пластины и 91,7 ± 16,67% после протокола трансформации. Несмотря на многочисленные шаги пипеток, не было никаких существенных различий (р> 0,44) между любыми из образцов. В дополнение к этому показателю жизнеспособности, был разработан протокол для определения концентрации протопластов на любой стадии процедуры путем измерения общего количества протопластов окрашивали PI. Как показано на рисунке 3, стандартная кривая была Generatред путем измерения интенсивности флуоресценции для известных концентраций протопластов из системы. Калибровочная кривая была хорошей подгонкой (R 2 = 0,967) с общим количеством протопластов , перекрывающих диапазон от 0 до 30 000 протопластов на лунку. Для подтверждения стандартной кривой интенсивности флуоресценции образцов с известным количеством протопластов (8125 и 24375, вычисленных с помощью гемоцитометра) получали и количество протопластов, вычисленных из уравнения стандартной кривой. На основании этих результатов, стандартная кривая предсказывал 9,560 и 28,200 протопластов в каждую лунку, сообщение об ошибке на 15 и 14%. Принимая во внимание, что существует также изменчивость в измерении количества клеток с помощью гемоцитометра, эта ошибка была признана приемлемой.
В дополнение к результатам числа клеток и их жизнеспособности, протокол трансформации был успешным в создании трансгенных клеток , которые экспрессируют ОФП (рис 2D - F). К сожалению, протокол, используемый привело к низкой, ~ 2%, эффективность преобразования, в связи с большой 16028 п.н. бинарной плазмиды, использованной в данном исследовании, и поскольку протокол не был оптимизирован специально для BY-2 протопластов. Оптимизация протокола преобразования, с точки зрения реагентов и условий специально для BY-2 протопластов, как ожидается, увеличит эффективность трансформации, излагаемые в обсуждении. С точки зрения этого протокола, то процедура преобразования была разработана, чтобы продемонстрировать доказательство правильности концепции путь от выделения протопластов к трансформации, и был успешным в достижении этой цели.
После успешного подтверждения всех отдельных процедур, показатели были получены для timecourse протокола от выделения протопластов к трансформации. Как показано на рисунке 4, основные инвестиции времени тратится на стадии пищеварения, в которых 3 ч требовалось FOг полного переваривания клеточной стенки и высвобождение протопластов. Во время этой процедуры, 18 петли проложены между шейкере и пластины нагревателя / чиллер 1 инкубационного станции, с пластиной движителя движущейся пластины между двумя станциями. Время переключения между шейкере и пластины нагревателя / чиллер 1 занимает всего 8,9 сек, и гарантирует, что большая часть процедуры пищеварения тратится на инкубацию и тряски. Общее время от начала процедуры, чтобы завершить загрузку ферментов многорежимный дозатора в 2,2 мин. В целом, полный протокол изоляции протопластов завершается в 3 ч и 22,8 мин. На основании этих результатов, 88% из протокола изоляции протопластов потраченное переваривание. После завершения протокола изоляции протопласта, протокол трансформации инициируется и завершается в течение 27,5 мин. Подобно протоколу изоляции протопласта, 72% от процедуры трансформации проводится инкубирования реакцию. Единственный шаг в протоколечто имеет значительный компонент времени (> 10% от общего времени процедуры) инициализация протокола с помощью автоматизированной платформы обработки жидкости, на долю которой приходится 14% от общего времени в порядке. Таким образом, 86% от протокола проводится при инициализации и инкубации, причем только 14% времени, затрачиваемого на пипеток и передачи шагов. Полная продолжительность выделения протопластов и трансформации было 3 ч 50 мин и 53 сек, без внешнего источника, требуемого от оператора.
Рисунок 1:. Схема роботизированной платформы и конфигурации автоматизированной платформы обработки жидкости в течение протокола (A) роботизированная система состоит из 3 -х плит штабеля / гостиниц , которые могут быть доступны пластины движителя. Отель 1 является назначенным отслаиваемой крышки / delidding станция, гостиница 2 флуоресцентный 96-луночногопластинчатым и Hotel 3 является 6-хорошо стопка пластины. Система имеет два жидких обработчиков, автоматизированную платформу обработки жидкости, и сопло на основе многорежимный дозатором. Для нагрева / охлаждения роботизированной платформы состоит из двух пластин отопления / охлаждая единицы, наряду с шейкере для смешивания пластины. И, наконец, система имеет монохроматора на основе планшет-ридер для измерения флуоресценции. Все компоненты размещаются в пользовательских построен биозащитой. (B) Запуск конфигурации автоматизированной платформы обработки жидкости с гнездом 2 , занимаемого пластиной реагента и коробки наконечника , размещенной на гнезде 8. (C) Конфигурация платформы обработки автоматизированы жидкости до вызова экспериментальный протокол. Пластина глубоких скважин расположена на гнезде 4, 96-а люминесцентная Скрининг табличка расположена на гнезде 6, а 6-луночный планшет , содержащий протопласты расположен на гнезде 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы V IEW большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Типичные изображения BY-2 протопластов после каждой передачи и после трансформации с апельсиновым флуоресцентного гена белка - репортера (А - С) Микрофотографии BY-2 Плотность протопластов в 6-луночный планшет, 96-луночный планшет , после передачи 70. мкл из 6-луночного планшета и 96-луночного флуоресцентного скрининга пластины после преобразования. (D) Светлое микрофотография BY-2 протопластов после трансформации. (Е) Флуоресцентные BY-2 протопластов экспрессию гена OFP визуализированы с помощью набора / TRITC фильтра Су3. (F) Накладка и флуоресцентные светлого микрофотографии демонстрируют низкую эффективность трансформации. Шкала бар = 50 мкм. целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: стандартная кривая для вычисления количества протопластов Количество протопластов в данной скважине может быть рассчитана путем сравнения интенсивности флуоресценции, в произвольных единицах (АС), к уравнению для стандартной кривой. Проверка количества протопластов сравнивали между стандартной кривой и гемоцитометра в точке, указанной на графике, с 9,561 протопластов, идентифицированных из ридера и 8125, подсчитанных на гемоцитометра. В целом, ошибка в 15% была обнаружена между этими двумя методами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Re 4 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
Рис . 4: Диаграмма Ганта для описанной процедуры для получения BY-2 протопластов и генетической трансформации Большинство протокола, ~ 3 ч, расходуется на переваривание клеток BY-2 для создания протопластов. Загрузка раствора фермента и инактивацией требуют лишь 12% от общего времени процедуры. Аналогичным образом, инкубация реакции трансформации на планшетном шейкере составляет 72% от трансгенной. В целом, процедура от выделения протопластов до генетическая трансформация не будет достигнуто под 4 ч (3 ч, 50 мин и 53 сек). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Справочная Файл: Автоматизированные протоколы для выделения протопластов, подсчета клеток, и ПЭГ-опосредованной трансформации <./ STRONG> Полные протоколы , разработанные для использования в роботизированной платформы для достижения каждой из перечисленных выше задач, включены в этот файл. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный выше, был успешно проверен для выделения протопластов, перечисления и трансформации с использованием табака культуры суспензии клеток BY-2; Тем не менее, протокол может быть легко расширена на любое растение подвески культуры. В настоящее время протопластов выделение и преобразование было достигнуто во многих растениях, в том числе кукурузы (Zea MAYS) 10, морковь (морковь дикая) 32, тополь (тополь евфратский) 33, винограда (Vitis винифера) 34, пальмового масла (Elaeis Guineensis) 35 , салат (Lactuca сатива) 36, горчицы (Brassica Джунсея) 37, рис (Oryza Sativa) 38, и проса (Panicum virgatum) 39,40. В то время как изменения в культуре и пищеварения условий происходят от вида к виду, с точки зрения протокола, разработанного в данной работе, заменяя культуру средств массовой информации или изменения условий рытьestion не должны изменить фундаментальный протокол. Для того, чтобы приспособиться к разным видам, питательных сред и ферментов, необходимых для пищеварения загружаются оператором до инициализации протокола, тем самым поменяв эти компоненты тривиально. В качестве дополнительного преимущества, протокол исправимо для скрининга нескольких условий с пищеварением с выходом протопластов, измеренных с помощью системы. Это является существенным компонентом, поскольку использование недорогих ферментов необходимы для высокой пропускной способности приложений, таким образом, важно, чтобы свести к минимуму количество ферментов, используемых в пищеварении.
Подобно культуре и пищеварения, модификации протокола трансформации потребовалось бы при принятии системы для трансформации протопластов, выделенных из различных видов растений. Значительная работа была проведена по оптимизации ПЭГ-опосредованной трансформации в растительных протопластов 16,35, с многочисленными факторами , влияющими на эффективность трансформации. В текущем горегк одним ограничивающим фактором, влияющим на эффективность трансформации была большой размер бинарного тестовой плазмиды, 16028 пар оснований, который был использован для целей моделирования генома редактирования плазмиды размер. В предыдущих исследованиях ПЭГ-опосредованной трансформации × 2 протопластов, 40-60% превращение было достигнуто; Однако, эти исследования использовали небольшие 5000 п.о. плазмид 41,42. Первичные модификации ПЭГ-опосредованной трансформации среди видов , включают концентрацию ПЭГ и MgCl 2, количество и концентрацию ДНК, и продолжительность реакции. По мере того как 2 решения PEG и MgCl, вводятся в систему на пластине реагента, и ДНК, предварительно загружаются в глубокую-луночный планшет, эти условия могут быть легко изменены в протокол , описанный выше. Кроме того, увеличение или уменьшение времени инкубации, наряду с изменением скорости перемешивания, можно точно контролировать с помощью роботизированной платформы. Ограничение тока протокола преобразования является отсутствиескрининга с использованием планшет-ридера для обнаружения флуоресцентного репортеру, из-за низкой эффективности ПЭГ-опосредованной трансформации в коэффициентах 2 протопластов. У других видов, таких как Резуховидка Таля и кукурузы 16, ПЭГ-опосредованной трансформацией является 40-90% КПД. В таких системах трансформанты могут быть охарактеризованы с помощью быстро ридере на робота. Таким образом, можно было бы идентифицировать лунки с положительными трансформантов, а также количественного определения уровня экспрессии. Для приложений, таких как скрининг промотора, эта функция увеличит полезность текущего протокола, и будут добавлены в последующих итераций системы.
В дополнение к оптимизации эффективности преобразования для BY-2 протопластов, несколько модификаций может повысить эффективность и общую пропускную способность системы. Предыдущие исследования по автоматизации трансформации протопластов позволили протопластов оседают на дно лунок, перед добавлением былоРешения ч 43. В текущем протоколе, протопласты смешивали на шейкере, чтобы предотвратить оседание и держать протопластов в виде суспензии с использованием плоских пластин забоя скважины. Кроме того, в процессе трансформации, протопласты не давали отстояться в глубоководные луночные планшеты, чтобы уменьшить воздействие PEG, который может быть токсичен в течение длительного воздействия. Таким образом , протопласты разбавляют ~ 10 раз с раствором W5 при переносе из артезианской пластины на 96-луночные флуоресцентного скрининга пластины, что приводит к 1,23 х 10 3 ± 4,66 х 10 1 протопластов на лунку. Для увеличения количества протопластов, переданных после трансформации, стадию инкубирования может быть добавлен, чтобы позволить протопласты осесть и супернатант удаляли с последующим добавлением меньшего объема жидких сред 2 столбца. Кроме того, если плита на основе центрифуга была добавлена к системе, этот шаг может быть достигнуто быстрее. Другая модификация, которая может добавить функциональность тон система будет использование живого / мертвого флуоресцентного анализа для определения жизнеспособности выделенных протопластов перед трансформацией. В текущем протоколе, флуоресцеин-диацетата (FDA), был испытан в качестве живого красителем; однако, BY-2 протопластов фон флуоресценции заслоняли сигнал FDA. Если более стабильная жизнеспособность красителе, затем протопласты жизнеспособность может быть определена как отношение интенсивности красного (PI) на зеленый (кальцеина AM и т.д.) флуоресценции и стандартизированный схожий с протоколом подсчета клеток. Эти изменения будут добавить дополнительные функциональные возможности системы, и будут включены в будущие протоколы.
Что касается текущего протокола, есть несколько важных шагов, которые необходимо соблюдать, чтобы обеспечить успех протокола. Во-первых, возраст / здоровье побочно 2 культур имеет важное значение, чтобы гарантировать, что жизнеспособные протопласты могут быть выделены для последующих шагов. Как описано в шаге 1.3, путем переноса логарифмической фазы культуры в свежую колбу с1:50 соотношение клеток на свежую среду, и позволяя культуре расти в течение 5-7 дней, максимальное количество жизнеспособных протопластов может быть выделен. Разрешение культуры расти на более длительные или более короткие сроки с использованием указанного посевного материала позволит значительно снизить выход протопластов, и привести к отказу последующих протоколов. Вторым важным шагом является шагом 1,5, так как использование стандартных советов пипеткой, вместо советов пипеткой с широким отверстием, указанным, заставит советы закупорить и привести к неправильным объемов переводимых. Что касается установки роботизированной системы, расположение пластин на автоматизированной платформе обработки жидкости, шаг 2,4, имеет решающее значение, с измененной установкой, препятствующего головку жидкости обработчика достичь всех скважин на 6-луночный планшет. Благодаря конструкции автоматизированной платформы обработки жидкости, 6-луночный планшет должен быть помещен в гнездо 5, или протоколы, выбранные для этого инструмента не получится. Аналогичным образом, неспособность правильно определить лабораторного оборудования в пластинедвижитель программное обеспечение, шаг 2.2, заставит инструмент не захватить, или падение лабораторного оборудования, что приводит к прекращению протокола. Для протокола подсчета клеток, критический этап включает фиксацию клеток с этанолом, стадия 3.2. Если клетки не являются фиксированными до маркировки с PI, только нежизнеспособные клетки будут помечены, вместо того, чтобы все население протопластов, и это не будет возможным подсчитать количество протопластов изоляции. Окончательный важный шаг, шаг 4.6, включает в себя выбор флуоресцентных фильтров для микроскопического анализа экспрессии pporRFP флуоресцентного маркера. Использование других "красных" наборов фильтров позволяет фоновой флуоресценции хлорофилла, что значительно увеличивает сигнал во всех хлоропластов, содержащие протопласты, предотвращая расчет эффективности трансформации. Тщательно придерживаясь спецификаций в этих критических шагов гарантирует наибольшие возможности для успеха и поколение самых воспроизводимых DATASи др.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
