Summary
Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.
Abstract
Son on yıl içinde, sinyal transdüksiyon yollarının, transkripsiyonel düzenleyici ağlar, gen ekspresyonu, genom düzenleme ve gen sessizleştirme analizi için, tür kırpmak için örnek türlerin arasında değişen bitki protoplastlarına kullanımında bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Ayrıca, önemli bir ilerleme bitki genomik için bu sistemlerin kullanımında bile daha fazla ilgi üretti protoplast bitkilerin rejenerasyonu, ilerleme kaydedilmiştir. Bu çalışmada, bir protokol bir robot platformu kullanılarak bir "açık san '2 (x 2), tütün süspansiyon kültüründen protoplast izolasyon ve dönüşüm otomasyonu için geliştirilmiştir. dönüşüm yöntemleri Karnabahar mozaik virüsü 35S promoteri (35S) kontrolü altında portakal renkli bir floresan protein (OFP) raportör geni (pporRFP) kullanılarak doğrulanmıştır. protoplastlarda OFP sentezleme epifloresans mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Analizler aynı zamanda propidiu kullanarak protoplast üretim verimliliği yöntemleri dahilm iyodür. Son olarak, düşük maliyetli bir yiyecek cinsi enzimler maliyet açısından çok pahalı protoplast izolasyon ve analizi otomatik yüksek verimli olan laboratuvar dereceli enzimler gerektiren gereksinimin ortadan kaldırılmasının, protoplast izolasyon prosedürü kullanılmıştır. Bu çalışmada geliştirilen protokolüne göre, dönüşüm, protoplast izolasyon bütün yöntemi operatörün herhangi bir giriş olmadan 4 saat altında yapılabilir. Bu çalışmada geliştirilen protokol BY-2 hücre kültürü ile doğrulandı iken, prosedürler ve yöntemler ekin genomik araştırma ivmesini etkinleştirmeniz gerekir herhangi bir bitki süspansiyon kültürü / protoplast sistemine çevrilebilir olmalıdır.
Introduction
Son yıllarda, bitkisel beslenme 6 bilmek biyokütle verimi 7 geliştirmek, ve hücre duvarı rekalsitrantların azaltmak kuraklık 3,4 ve tuz tolerans 5 iletmektedir, herbisite karşı direnç 2 kavuşturulması, çeşitli hastalıkların 1 üstesinden gelmek için transgenik bitkileri tasarım yerleştirilen önemli ivme olmuştur 8. Bu eğilim dsRNA 10, miRNA 11 ve siRNA 12 üzerinden susturma CRISPR ve Talens 9 kullanarak genom düzenleme ve gen dahil olmak üzere transgenik bitkiler, üretmek için yeni moleküler araçlar geliştirilmesi ile yardım görmüştür. Bu teknolojilerin transgenik bitkilerin üretimini basitleştirilmiş olsa da, onlar da transgenik bitkilerin çokluğu bitki rejenerasyonu güveniyor geleneksel sistemler kullanılarak taranabilir olamaz oluşturulan bir darboğaz oluşturduk. Birçoğu susturma ve genom düzenleme konstruktları hızlı bitkilere sokulabilir ise, bu dar ilişkinhedeflenen özellikleri bitkiler serada analiz kadar sık tespit edilmez arzu edilen etkiyi üretmek için başarısız olur. Bu çalışmada, özellikle hedef susturulması genom düzenleme ve genin çok sayıda erken tarama mevcut darboğaz gidermek için, bitki protoplast hızlı, otomatik, yüksek verimli tarama için bir yöntem geliştirdik.
sağlam bitki hücrelerine karşı protoplast kullanımı, otomatik bir platformun geliştirilmesi için pek çok avantajı vardır. İlk olarak, protoplastlar, bitki hücre duvarının sindirilmesinden sonra izole edilir, ve bundan sonra, bu, bu bariyer, dönüşüm etkinliği 13 arttırılır. Sağlam bitki hücrelerinde 14 ve Agrobacterium aracılı transformasyon 15 Biolistics transformasyonu için sadece iki yaygın olarak kullanılan yöntemler vardır. biyolistik TRANSFO için özel ekipman gerektirir olarak bu yöntemlerin hiçbiri kolayca sıvı taşıma platformları tercüme edilebilirım, Agrobacterium ise aracılı transformasyon ko-kültür ve bakterilerin sonraki çıkarılmasını gerektirir. Ne yüksek verimli yöntemleri için uygundurlar. Protoplast durumda, dönüşüm rutin ancak birkaç çözeltisi değişimini gerektiren ve ideal olarak sıvı kullanım platformlar için uygundur, polietilen glikol (PEG) aracılı transfeksiyon 16 kullanılarak yapılır. İkinci olarak, protoplastlar, tanımı gereği, tek hücre kültürleri, ve böylece bitki hücresi kültürlerinde topaklanma ve zincir oluşumu ile bağlantılı problemler, protoplastlarda gözlenmez. Bir plaka bazlı spektrofotometre hücre topaklanma kullanılarak süratle taranması açısından ya da birden çok sayıda düzlemde hücre tutarlı ölçümler elde zorluk yol açacaktır. protoplastlar kendi kültür ortamı daha da yoğun oldukları için, plaka tabanlı spektrofotometresi için elverişli bir tek tabaka oluşturan, kuyu dibine tortu. Son olarak, bitki hücre süspansiyon kültürleri Primar ikenily kallustan 17 türetilmiş, protoplastlar dokuya özgü ifade tespit etmek potensitesi, bitki dokularının bir dizi hasat edilebilir. Örneğin, özelliği fenotipi tahmin için çok önemli olabilir kök veya bir genin yaprağa özel ifadesini analiz etmek. Bu nedenlerle, bu işin geliştirilen protokol yaygın olarak kullanılan tütün (Nicotiana tabacum L.) parlak sarı bir '2 (x 2) süspansiyon kültüründen izole edilen protoplastlardan kullanılarak doğrulanmıştır.
X 2 süspansiyon kültürü, bitki hücrelerinin 18 moleküler analizlerde her yerde kullanımı sayesinde, daha yüksek bir bitki ", HeLa" hücre olarak tanımlanmıştır. Son zamanlarda, BY-2 hücreleri bitkinin etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur hücre içi protein lokalizasyonu 23,24 ve bitki biyolojisinde bu kültürlerin geniş bir kullanım gösteren temel hücre biyolojisi 25-27, 19-22 Stresörler. X 2 kültürlerin ilave bir avantajı, birGen ifadesi için geliştirilmiş tekrarlanabilirlik yol açabilir, aphidicolin ile kültürleri senkronize yeteneği 28 inceler. Ayrıca, araştırılan yöntemler, geleneksel protoplastlar üretilmesi için kullanılan enzimler, maliyeti yüksek olan sistemlerin için engelleyici olarak, düşük maliyetli enzimler 29,30 kullanarak-2 protoplast çıkarılması için geliştirilmiştir. Bu nedenle, aşağıda açıklanan protokol BY-2 süspansiyon kültürü kullanılarak valide edilmiş, ancak herhangi bir bitki hücre süspansiyonu kültürüne amendable olmalıdır. Korumalı kavram deneyleri sabit Poritesin turuncu bir flüoresan proteini (OFP) raportör geni (pporRFP) CaMV 35S promoterinin kontrolü altında 31 Porites kullanılarak gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Süspansiyon Hücre Kültürleri 1. kurulması
- BY-2 ortamı PO4 4.43 g Linsmaier ve Skoog bazal ortamı, sukroz, 30 gr, 200 mg KH 2 ekleyerek sıvı hazırlayın ve damıtılmış 200 ug ila 900 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) mi su ve 0.1 M KOH ile pH değeri 5.8'e. pH ayarlandıktan sonra damıtılmış su ve otoklav ile 1000 ml nihai hacim ayarlayın. Ortam, 4 ° C'de 2 hafta kadar saklanabilir.
- % 1 ilave By-2 ortamı, 250 ml'lik bir Erlenmeyer bir katı İLE-2 ortamı üzerinde yetiştirilen 100 ile-2 ortamı sıvı ml x 2 yara dokusunun tek bir parça (> 1 cm çaplı) ile balonun (sıvı inoküle ağar) ve alüminyum folyo ile kapatın. 5 gün çalkalanarak 28-30 ° C 'de kültür inkübe edin.
NOT: Sıvı kültürler hızla büyümek gibi BY-2 kallus, uzun süreli depolama için katı ortam üzerinde muhafaza edilir. Kültür hacmi, tipik olarak, 100 ml kültür üç otuz 6-w yükleme kapasitesine sahip olacaktır, gerektiğinde ayarlanabilirarşın plakalar. - Transferi 2 x 2 Kültür Fresh-2 ortamı 98 ml log fazı ml çalkalanarak 28-30 ° C'de 5-7 gün süreyle inkübe edilir.
Not: kallus 100, 5-7 günlük kültür dilüsyonları yerine aşı: kurulan sıvı kültürlerin Alt kültür düzenli 1 kullanılarak gerçekleştirilebilir. - Hücreler hızla yerleşmek gibi, iyice karıştırın kültür, ve transfer hücre kültürü 6 ml 15 ml konik alt santrifüj tüpüne ve hücreler en az 10 dakika süreyle razı olsun. Süpernatan uzaklaştırılmış, toplam hacminin% 50'si için paketlenmiş hücre hacmi ayarlayın.
- sindirim için, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, 500 ul çevrilerek ve bir pipet ile tüp çalkalayın. Onlar yoğun olarak, bu aşamada hücreler aktarmak için geniş çaplı pipetleri kullanın ve standart pipet ipuçları yapışmasına neden olacaktır.
2. Protoplast İzolasyonu
- Robot sistemi (Şekil 1A) tüm bileşenleri açın ve yumuşak zamanlama plaka taşıyıcı görevi açmakware. görev zamanlama programı her ekipman parçasının arasına plakaların transferini sağlamak için diğer ekipman ile mikroplağı değişenlerden bütünleştirir.
- Aşağıdaki gibi önceki deney için, plaka taşıyıcı yazılım laboratuvar her bir parça, teknik protokolde kullanılan laboratuvar özelliklerini (örneğin, tabak, kapaklar), hem de başlangıç ve bitiş pozisyonları tanımlamak:
- Plaka taşıyıcı yazılımı ana araç çubuğundan Kur'u tıklatın ve Yönet Konteyner Çeşitleri komutunu seçin.
- konteyner tipi mevcut konteyner tipi kitaplığında listede varsa, o zaman uygun bir kap seçin.
- Konteyner tipi mevcut konteyner tipi kitaplığında yer almıyorsa o zaman yeni bir konteyner türünü belirtmek için Ekle 'yi tıklatın.
- Yeni bir konteyner tipi ekledikten sonra, uygun sekmeler halinde (ofset yükseklik, genişlik, istifleme boyutları ve kavrayıcı) yeni konteyner boyutları eklemek ve Kaydet'i tıklatın.
- Doğru boyutlar üreticinin mevcut değilse, o zaman doğru kumpas kullanılarak en yakın milimetreye kadar tüm boyutlarını belirlemek. konteyner boyutları ölçmek hatalar plaka taşıyıcı başarısızlıkla sonuçlanacaktır.
- Tekrarlayın plaka taşıyıcı karşılaşacak tüm konteyner tipleri için 2.2.4.1 ile 2.2.2 adımları. Tüm laboratuvar Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, her bir kabın (aşama 2.2.6) için başlangıç ve bitiş konumunu tanımlamak için gereklidir.
NOT: Bu protokol için laboratuvar 6-plaka derin oyuklu plaka ve 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plaka içerir. - Her kabın başlangıç ve bitiş konumunu tanımlamak için, belirli bir protokol Başlangıç / Bitiş sekmesini tıklatın. İlk olarak, her kabın başlangıç konumu seçin. Sonraki, başlangıç ve bitiş pozisyonunda hem de Kapaklı / Unlidded kutusunu işaretleyin. tüm konteynerler için tekrarlayın.
NOT: Konteyner equ başka bir parça sol edilecek iseipment (yerine levha taşıyıcı içinde) son konumu boş bırakılabilir.
- Bu aşamada el ile tüm iş akışı için başlangıç pozisyonuna tüm plakaları yükleyin. , Otel 3'e BY-2 hücreleri ile otel haline levha ısıtıcı / soğutucu yuva 2 üzerine transformasyonu için kullanılacak bir 96 kuyulu plaka ve 50 ml konik 2, 6 oyuklu plakalar 96 oyuklu flüoresan görüntüleme levhaları yük çok modlu dağıtıcı üzerine enzim solüsyonu (Company Dosya, Bölüm 1.2.2 bakınız) içeren tüp.
- Transformasyon protokolü içinde gerçekleştirilebilir olacaksa, oyuk başına plasmid DNA, 10 ul 96 kuyulu plaka ön yük (1 ug / ml, A 260/280> 1.8) OFP raportör konstruktunu ihtiva eden ve levha üzerinde inkübe 4 ° C'de ısıtma / soğutma. Her iyi, tek bir dönüşüm için deney düzeneği bağlıdır dolu kuyuların böylece sayıda kullanılacaktır.
- otomatikleştirmek tüm malzemeleri ve tabak yükleyinbelirlenmiş yerlerde d sıvı taşıma platformu ve otomasyon kontrol yazılımı (Şekil 1B) her öğenin konumunu tanımlar.
- Sütun 1 mmg içinde% 40 PEG 200 ul (0.4 M manitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5.7), propidyum iyodür 200 ul ile önceden yüklenmiş, 96 oyuklu bir plaka yükleme (p, ve 1 ng / ml) 2. sütun ve sütun 3 (yuva 2) etanol 200 ul ve yuva 8 pipet uçları bir kutu içinde.
- Menüden otomatik sıvı taşıma platformunun yazılımında laboratuvar konumunu Araçlar tanımlamak ve Laboratuvar Editör tıklayın.
- Açılan menüden laboratuvar türünü seçin veya Yeni Laboratuvar düğmesini kullanarak yeni bir laboratuvar türü tanımlar.
- Ana Protokol sekmesini seçip yapılandırma laboratuvar tıklayarak seçilen laboratuvar her parçasının konumunu tanımlayın. Otomatik sıvı taşıma platformu üzerine yerleştirilen laboratuvar her parça olduğundan emin olunprotokol çalıştırmadan önce tanımlanmış.
- Otomatik protokolleri tetiklemek için, Profil Explorer penceresini tıklayın ve çalıştırmak için protokolü (Protoplast İzolasyonu, Hücre Sayımı ve PEG-aracılı Dönüşüm) adını seçin.
- Protokolünde kullanılacak olan tüm cihazların başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın.
- Son olarak, Çalışma Explorer penceresinde, sistemdeki tüm konteynerler / laboratuar aletlerinin doğrulamak ve otomatikleştirilmiş protokol başlamak için Çalışma Birimi Ekleme tıklayın.
NOT: Otomatik protokollerin tam açıklamaları Company Dosya yer almaktadır.
3. Hücre Sayımı için Standart Eğrisi oluşturulması
- El ile 1 ml'lik bir hacim içinde, 1 x 10 6 protoplastlar / ml'lik bir konsantrasyonda protoplast konsantre. Santrifüj 10 dakika boyunca 1.000 xg'de protoplastlannda ve süpernatant kaldırmak.
- El ile protoplast pelet (4 ° C'de),% 70 etanol içinde 900 ulve pelet yeniden askıya. hücrelerin tespit edilmeleri için, buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin.
- çekirdekleri etiket ve plaka okuyucu tarafından fark edilmesine olanak vermek için protoplast için PI, 100 ul (1 ug / ml) eklenir.
- Yük sütununda 2 başlayarak 96-iyi floresan tarama plakasının her sütun ve satır içine BY-2 medya sıvının 80 ul.
- 96 oyuklu bir flüoresan görüntüleme plaka sütun 1 de, her bir kuyucuğa İLE-2 ortamı protoplast 70 ul ve 50 ul ekle.
- otomatik sıvı taşıma platformunun yuva 6 plaka koyun ve 2-kat seri seyreltme çalıştırın.
- Otomatik sıvı taşıma platformu üzerinde bir seri seyreltme yapmak için, Seri Sulandırma Sihirbazı başlatın tıklayın ve transfer hacmi (60 ul), karışımları ve hacim (2, 70 ul), ilk kuyu sayısı (sütun 1, Satırlar AF), seyreltme ayarlamak kuyular (Sütunlar 2-11, Satırlar AF) ve aspire ve dağıtmak özellikleri (kuyu alt 0,5 mm).
- parametreleri ayarladıktan sonra, bir kaydetmeprotokolü çalıştırmak d.
NOT: Tüm protoplastlar (nedeniyle hücrelerin fiksasyon) PI ile etiketlenmiş beri, floresan protoplast konsantrasyonu ile orantılıdır. - seri seyreltme işlemi tamamlandıktan sonra, yuva 9'dan plaka kaldırmak ve plaka okuyucu içine yerleştirin ve plaka okuyucu yazılımı standart eğri protokolünü çalıştırın.
Not: bir standart eğri daha sonra bilinen protoplast konsantrasyonu her bir PI den (eksitasyon 536 nm / emisyon 620 nm) floresan karşılaştırılarak oluşturulur.
- plaka okuyucu protokolünün tamamlanmasının ardından, plaka kaldırmak ve otoklav veya "biyo-güvenlik protokolleri de tanımlandığı gibi de-canlandırma prosedürlerinin herhangi bir transgenik hücreleri toplamak.
Dönüşüm 4. Mikroskobik Analizi
- Dönüştürülmüş protoplastların robot sisteminin Otel 1 (Otomatik Protokolünün 3, Ek Dosya ürünü) ile plakasını sökün.
- dönüşinverted mikroskop, kamera ve floresan lamba.
- , Protoplastlar odaklanan ilk için 10X objektif seçmek halojen lamba açmak ve floresan lamba için deklanşöre kapatın.
- aydınlık kullanarak protoplastlar mikroskobik sistemi ve odak üzerine yük plakası.
- protoplastlar odaklanarak sonra, halojen ampul kapatın ve floresan lamba için deklanşöre açın.
- Transgenik protoplastlar tarafından ifade pporRFP proteinin görselleştirme için belirlenen CY3 / TRITC filtresini seçin.
- pporRFP floresan işaretleyici ifade protoplastlar sayısını belirlemek için de her tarayın.
- floresan işaretleyici protoplast sayısı ifade protoplast toplam sayısı olarak transformasyon etkinliğini hesaplayın.
- otoklav ya da 'biyogüvenlik protokollerde tanımlanan diğer de-yaşatma işlemleri için onaylanmış biyogüvenlik torbalarda transgenik hücre içeren herhangi bir levha toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, x 2 iki katına çıkma oranı 15 saat bir ortalama hücre döngüsü uzunluğu bir önceki raporlar ile uyumludur kültürleri inkübe edildi sıcaklığa bağımlıdır 14-18 saat arasında değişmiştir. Bu katlama oranı ile, 1: 100 Başlangıç aşı 5-7 günde% 50 bir paketlenmiş hücre hacmi (PCV) kültürlerin neden kültürlerini başlatmak için kullanılmıştır. Kültürler ortam 200 ml içinde büyütülmüştür içinde mevcut protokolde dokunun bütünleşmesi, 100 ml'lik bir PCV 33 6 oyuklu plakalar doldurmak için yeterli hücrelerin Resim 7 gün üretilmiştir. Protoplast verim açısından, protokolde belirtilen koşullarda sindirim 6 plaka (Şekil 2A) her 2.82 x 10 6 protoplastlarında sonuçlanan göz başına 4.70 X 10 5 ± 5.77 x 10 3 protoplastlar oluşturulur. Bu verilere dayanarak, 214, 96 oyuklu plakalar (oyuk başına protoplastların 70 ul) potansiyel fo ile tek bir 6-yuvalı plaka sindirimden yüklü olabilirR iki adet 6 oyuklu plakalar iki plaka ısıtıcı / soğutucu istasyonları kullanılarak, aynı anda sindirilmiş olan. Bu nedenle, tek bir üç saat sindirim protokolü esnasında oluşturulabilir protoplast en fazla 5.64 x 10 6.
sindirim protokol başına üretilen protoplast toplam sayı sistemi için tek bir metrik sunarken, protoplast protokol farklı adımlarda aktarılır olarak protoplast konsantrasyon kaybı değerlendirmek için de gereklidir. Bu nedenle, protoplastların konsantrasyonu protokolünde, her transfer adımı sonra değerlendirilmiştir. Transformasyon protokolü, ya da 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plaka (Şekil 2B) yapılması halinde sindirim protokolü sonra, 1.15 x 10 4 ± 1.35 x 10 2 protoplastlar, 96 çukurlu derin oyuklu plakalar, her transfer edildi. Dönüşüm protokolü tamamlandıktan sonra, 1.23 x 10 3 ± 4.66 x10 1 protoplastlar 96 gözlü flüoresan görüntüleme plaka (Şekil 2C) aktarılmıştır. transfer protoplast sayısına ek olarak, çok pipetleme aşamaları protoplast zarar vermediği sağlamak için protoplast kapasitesini belirlemek önemliydi.
protoplast 95.1 ±% 0.04 sindiriminden sonra uygulanabilir olduğu canlılığı deneyi sonuçları, 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plaka transfer edildikten sonra 92.1 ±% 0.06, ve dönüşüm protokolü sonra 91.7 ±% 16.67 esas alınmıştır. Birden fazla pipetleme adımlara rağmen, örneklerin hiçbiri arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p> 0.44) oldu. canlılığı Bu önlem ek olarak, bir protokol PI ile boyandı protoplastların sayısı ölçülerek prosedürünün herhangi bir aşamasında protoplastların konsantrasyonunun belirlenmesi için geliştirilmiştir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, bir standart eğri olarak generatsistemi protoplastların bilinen yoğunlukları için flüoresan yoğunluğu ölçülerek ed. Standart eğri de ortalama 0 30.000 protoplast aralığı kapsayan protoplast toplam sayısı ile iyi bir uyum (= 0,967 R2) idi. Standart eğri, (8125 ve 24.375 hemasitometre kullanarak hesaplanan) protoplast bilinen bir dizi ile örneklerin floresan yoğunluğu elde edildi ve standart eğrinin denklemden hesaplanan protoplast sayısını doğrulamak için. Bu sonuçlara dayanarak, standart eğri, iyi bir 15 ve% 14 hata her 9560 ve 28200 protoplast öngördü. Ayrıca hemasitometre kullanarak hücre sayısını ölçülmesinde değişkenlik olduğunu göz önüne alındığında, bu hata kabul edilebilir görüldü.
F - Hücre sayısı ve canlılığı sonuçlarına ek olarak, transformasyon protokolü OFP (Şekil 2D eksprese eden transgenik hücrelerin üretilmesi başarılı oldu). Ne yazık ki kullanılan protokol ~, düşük bu çalışmada ve protokol BY-2 protoplastlar için özel olarak optimize değildi çünkü kullanılan büyük 16028 bp ikili plazmid nedeniyle% 2, dönüşüm verimliliği, sonuçlandı. Tartışma açıklanamamıştır olarak BY-2 protoplastlar için özel reaktifler ve koşulları bakımından dönüşüm protokolü, optimizasyonu, dönüşüm verimliliğini artırmak bekleniyor. Bu protokolün açısından, dönüşüm prosedürü dönüşüme protoplast izolasyondan proof-of-concept yolunu göstermek için tasarlanmış, ve bu hedefe ulaşmada başarılı oldu.
başarıyla bireysel prosedürlerin hepsi doğrulayarak sonra, ölçümler dönüşüme protoplast izolasyondan protokol timecourse elde edilmiştir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, bir zaman önemli yatırım 3 saat fo gerekli olan sindirim aşaması sırasında harcananprotoplast hücre duvarı ve tahliye tam sindirim r. Bu işlem sırasında, 18 döngüler iki istasyon arasındaki plaka hareketli plaka taşıyıcı ile, plaka çalkalayıcı ve plaka ısıtıcı / soğutucu 1 inkübasyon istasyonu arasında çalıştırılır. plaka karıştırıcısı ve plaka ısıtıcı arasındaki transfer süresi / soğutucu 1 sadece 8.9 sn sürer, ve sindirim işleminin çoğunluğu kuluçkaya ve sallayarak harcanan olmasını sağlar. Çok modlu dağıtıcı tarafından enzim yükleme tamamlamak için prosedürün başlaması toplam süre 2.2 dakikadır. Genel olarak, tam protoplast izolasyon protokolü 3 saat ve 22.8 dakikada tamamlanır. Bu sonuçlara dayanarak, protoplast izolasyon protokolü% 88 sindirerek harcanmaktadır. Protoplast İzolasyon protokolünün tamamlanmasının ardından, transformasyon protokolü başlatılır ve 27.5 dakika içinde tamamlandı. protoplast izolasyon protokolü benzer şekilde, dönüşüm işleminin% 72 reaksiyonunu kuluçkaya harcanmaktadır. protokolde sadece diğer adımBu önemli bir zaman bileşeni (> toplam işlem süresi 10%) prosedürde toplam süre 14% 'ini otomatik sıvı taşıma platformu ile protokol başlatma olduğunu vardır. Bu şekilde, protokolün% 86 pipetleme ve transfer adımlar harcanan zaman sadece% 14 ile, başlatma ve inkübasyon harcanmaktadır. protoplast izolasyon ve dönüşümün tam süresi operatör gerekli dış girişi ile, 3 saat, 50 dakika ve 53 saniye idi.
Şekil 1:. Protokol sırasında robotik platformu ve otomatik sıvı taşıma platformu yapılandırma şematik (A) robotik sistem plakası taşıyıcı ulaşılabilir 3 plakalı yığınlarının / otel oluşmaktadır. Otel 1 belirlenen kapatıcı / delidding istasyonu, otel, 2 96-kuyu floresanplaka yığını ve Otel 3 6-plaka yığını olduğunu. Sistem iki sıvı işleyicileri, otomatik bir sıvı taşıma platformu ve bir meme tabanlı çok modlu dağıtıcı vardır. Robotik platformu soğutma, ısıtma / plaka karıştırmak için bir plaka karıştırıcısı ile birlikte iki plaka ısıtma / soğutma birimleri vardır. Son olarak, sistem floresan ölçümü için bir monokromatör tabanlı plaka okuyucusu vardır. Tüm bileşenler bir özel inşa Biyogüvenlik Kurulu yerleştirilmiştir. (B) önce deneysel bir protokol çağırmak için otomatik sıvı taşıma platformu yuva 8. (C) Yapılandırma yerleştirilen reaktif plakası ve uç kutusu tarafından işgal yuva 2 ile otomatik sıvı taşıma platformu yapılandırmasını başlatılıyor. Bir derin oyuklu plaka yuva 4 üzerinde yer almaktadır, 96 oyuklu bir flüoresan görüntüleme plakası yuva 6 bulunur ve protoplast içeren 6 oyuklu plaka yuva 5. bulunur v burada tıklayın Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu iew.
Şekil 2: Her transfer edildikten sonra, turuncu floresan protein bildirici gen ile transformasyondan sonra x 2 protoplast Örnek görüntüleri (A - C) mikrograflar x 2 protoplast yoğunluğu 6-plaka, 70 transferinden sonra 96 oyuklu plaka içerisinde. 6-çukurlu plaka ul ve 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plakası, post-Transformation. Dönüşümden sonra x 2 protoplast (D) aydınlık mikrografı. OFP genini ifade (E) Floresan BY-2 protoplast bir Cy3 / TRITC filtre seti kullanılarak görüntülendi. (F) aydınlık Yerleşimi ve floresan mikrograflar dönüşümün düşük verimlilik gösteren. Ölçek çubuğu 50 mikron =. target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Protoplast sayısını hesaplamak için bir standart eğri de verilen protoplastlarındaki sayısı, standart eğri için denkleme, rasgele birimi (AU) olarak floresans yoğunluğunu karşılaştırarak hesaplanır. Protoplast numarasının doğrulama hemasitometre sayılır 9,561 plaka okuyucusu ile ilgili tanımlanan protoplast ve 8,125 ile grafiğinde gösterilen noktada standart eğrinin ve hemasitometre ile karşılaştırılmıştır. Genel olarak,% 15 oranında bir hata iki teknik arasında ilişki saptanmadı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4 re "src =" / files / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
Şekil 4:. X 2 protoplast ve genetik dönüşümün üretimi için tarif edilen prosedüre Gantt şeması protokolü çoğunluğu, ~ 3 saat, protoplast oluşturmak için İLE-2 hücrelerinin sindirim harcanmaktadır. enzim çözeltisi ve inaktivasyon yükleme genel prosedür süresi sadece 12% gerektirir. Benzer şekilde, plaka çalkalayıcı üzerinde dönüşüm reaksiyonunun kuluçka dönüşüm protokolü% 72 oluşturmaktadır. Genel olarak, genetik transformasyon elde edilene kadar protoplast izolasyondan prosedür 4 saat (3 saat, 50 dakika ve 53 saniye) altındadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yan İçerik: protoplast izolasyon, hücre sayımı, ve PEG-aracılı transformasyon için otomatik protokolleri <.Bu dosyada yer almaktadır yukarıda listelenen görevlerin her gerçekleştirmek için robot platformu kullanılmak üzere geliştirilmiş / strong> Tam protokoller. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan protokol başarıyla protoplast izolasyon, numaralandırma ve dönüşüm BY-2 tütün süspansiyon hücre kültürü kullanarak valide edilmiştir; Ancak, protokol kolayca herhangi bir bitki süspansiyon kültürü için uzun olabilir. Şu anda, protoplast izolasyon ve dönüşüm mısır (Zea mays), 10, havuç (Daucus carota) 32, kavak (Populus euphratica) 33, üzüm (Vitis vinifera) 34, palmiye yağı (Elaeis guineensis) 35 de dahil olmak üzere pek çok bitki, elde edilmiştir , salata (Lactuca sativa) 36, hardal (Brassica Juncea) 37, pirinç (Oryza sativa) 38 ve darı (dallı darı) 39,40. Kültür ve sindirim koşulları varyasyon da manşet koşulları kültür ortamı yerine veya değiştirilmesi, bu işin geliştirilen protokol açısından, türden türe meydanaSorusuna temel protokol değiştirmemelisiniz. böylece bu bileşenleri takas önemsiz, önceki protokol başlatma için operatör tarafından yüklenen sindirim için gerekli olan farklı türler, kültür ortamı ve enzimlere ayarlamak için. Ek bir avantaj olarak, protokol sistemi ile ölçülen protoplastların verimi ile birden sindirim koşulları tarama için amendable olduğunu. düşük enzim kullanımı, yüksek hacimli uygulamalar için gerekli olan bu nedenle sindirim kullanılan enzimlerin miktarı en aza indirmek için önemlidir, temel bir bileşenidir.
Farklı bitki türlerinden izole edilmiş protoplastların dönüşümü için bir sistem kabul ederken kültür ve sindirim benzer şekilde, şekil değiştirme protokolüne modifikasyonlar gerekli olacaktır. Bir husus da şudur dönüşüm verimini etkileyen çeşitli faktörler, bitki protoplast 16,35 PEG aracılı transformasyon optimizasyonu üzerinde yürütülmüştür. wo akımdönüşüm verimini etkileyen rk bir sınırlayıcı faktör ikili testi plazmid büyük boyutu, bir genom düzenleme plazmid boyutu modelleme amacıyla kullanılan 16.028 bp. X 2 protoplast PEG aracılı transformasyon önceki çalışmalarda,% 40-60 dönüşüm elde edilmiştir; Ancak, bu çalışmalar küçük 5,000 bp plazmidler 41,42 kullanılır. Türler arasında, PEG aracılı transformasyon birincil modifikasyonlar PEG ve MgCl2, miktarı ve DNA konsantrasyonu, konsantrasyon, ve reaksiyon süresi bulunmaktadır. PEG ve MgCl2 çözeltileri reaktif plaka sistemi içine ve DNA önceden yüklenmiş kuyulu plaka gibi olduğu protokolü, yukarıda tarif edilen, bu koşullar, kolayca değiştirilebilir. Ek olarak, tam robot platform tarafından kontrol edilebilir, olabilir, artan veya karıştırma hızlarının değiştirilmesi ile birlikte inkübasyon süresi azalmaktadır. transformasyon protokolü akım sınırlama olmamasınedeniyle x 2 protoplastlarda PEG-aracılı dönüşümün düşük verimlilik, floresan raportör tespit etmek için plaka okuyucusu kullanılarak tarama. Bu Arabidopsis thaliana ve mısırın 16 gibi diğer türlerin, PEG aracılı transformasyon% 40-90 etkilidir. Bu tür sistemlerde transformantlar hızlı robot plaka okuyucusu kullanılarak karakterize edilebilir. Bu durumda, pozitif transformantlar ile kuyu tespit ve aynı zamanda ifade seviyesini ölçmek için mümkün olacaktır. promotör tarama gibi uygulamalar için, bu özellik mevcut protokolün yarar artıracak ve sistemin daha sonraki iterasyon eklenecektir.
X 2, protoplastlar için dönüşüm verimliliği optimize edilmesine ek olarak, çeşitli modifikasyonlar sisteminin etkinliğini ve genel verimi arttırabilir. protoplast transformasyonu izin protoplastların otomasyon Önceki çalışmalar öncesinde olduğu ilavesinden, kuyu dibine yerleşmeyeh çözümleri 43. Mevcut protokolde, protoplastlar çökelme önleme ve düz tabanlı oyuklu plakalar kullanılarak süspansiyon içinde tutmak için protoplast plaka karıştırıcısı üzerinde karıştırıldı. Ayrıca, dönüşüm sırasında, protoplastlar, derin kuyu plakaları yerleşmek uzun süre maruz üzerinde toksik olabilir PEG maruziyeti azaltmak için izin verilmemiştir. 96 gözlü flüoresan görüntüleme plaka derin oyuklu plakaya transfer edildiğinde Bu haliyle, protoplastlar, göz başına 1.23 x 10 3 ± 4.66 x 10 1 protoplastlarında sonuçlanan ~ W5 çözeltisi ile 10 kat seyreltildi. dönüşümden sonra transfer protoplast sayısını artırmak amacıyla, bir inkübasyon aşaması protoplastlar yerleşmesine izin eklenebilir ve süpernatan sıvı ile-2 ortamı daha küçük bir hacimde ilave edilir kaldırıldı. Bir plaka bazlı santrifüj sistemi ilave edildi Buna ek olarak, bu adım, daha hızlı bir şekilde elde edilebilir. t işlevsellik eklemek olabilir başka bir değişikliko sistem dönüştürmeden önce izole protoplastlar canlılığı belirlemek için canlı / ölü floresan testinin kullanımı olacaktır. mevcut protokol, floresandiasetat (FDA), canlı bir boya olarak test edilmiştir; Ancak, BY-2 protoplast eşiğe FDA sinyali gizlenmiş. Daha kararlı bir canlılığı boya kullanılmış ise, o zaman protoplast canlılığı kırmızıdan yeşile (PI) oranı (Calcein AM, vb) floresans ve hücre sayımı protokolüne standart benzeri tespit edilebilir. Bu modifikasyonlar sisteme daha fazla işlevsellik eklemek istiyorum, ve gelecekteki protokoller dahil edilecektir.
mevcut protokole ilgili olarak, protokol başarılı olmasını sağlamak için takip edilmesi gereken birkaç kritik adımlar vardır. Ilk önce, 2-kültürlerin yaş / sağlık bu canlı protoplastlar sonraki adım için izole edilebilir garanti etmek için gereklidir. Bir de taze bir balona bir log fazı kültürü aktararak, adım 1.3 olarak açıklandığı üzereKültür 5-7 gün boyunca büyümeye izin veren 1:50 taze ortam hücre oranı ve canlı protoplast en fazla izole edilebilir. kültürlerinin önemli bir protoplast veriminin azalmasına ve daha sonraki protokollerin başarısız olmasına neden olur belirtilen inokulum kullanarak uzun veya daha kısa süreler için büyümeye izin verir. İkinci kritik bir adım yerine belirtilen geniş çaplı pipetlemeyin ipuçları, standart pipet ipuçları kullanımı, çünkü ipuçları yapışmasına neden olabilir ve transfer edilen hatalı hacimleri almasına neden olur, adım 1.5 olduğunu. Robotik sistemin kurulumu ile ilgili olarak, otomatik sıvı taşıma platformu üzerinde levha düzeneği, 2.4 adım 6 çukurlu bir levha üzerinde her kuyu ulaşan sıvı işleyici baş engelleyen bir tadil edilmiş ayarı ile, kritik öneme sahiptir. Nedeniyle otomatik sıvı taşıma platformunun tasarımı, 6-plaka yuvaya 5 yerleştirilmesi gerekir veya bu enstrüman için seçilen protokoller başarısız olur. Benzer şekilde, başarısızlık doğru plakadaki laboratuar aletlerinin tanımlamak içintaşıyıcı yazılımı, adım 2.2, enstrüman kapmak için başarısız, ya da protokolün feshi sonuçlanan laboratuar aletlerinin bırakmasına neden olur. hücre sayımı protokolü için, kritik bir adım etanol, adım 3.2 ile hücrelerin tespiti içerir. Hücreler PI ile etiketleme önce sabit değildir, yalnızca cansız hücreler yerine protoplast tüm nüfusun, etiketli olacak ve izole protoplastlar sayısını saymak mümkün olmayacaktır. son kritik adım adım 4.6 pporRFP floresan markör ifade mikroskopik analiz için floresan filtrelerin seçimini içerir. Diğer "kırmızı" filtre setleri kullanımı önemli ölçüde dönüşüm verimliliği hesaplama önlenmesi, tüm kloroplast içeren protoplastlarda sinyali artan klorofil gelen eşiğe sağlar. Dikkatle bu kritik adımda özelliklerine bağlı kalarak başarı için büyük bir fırsat ve en tekrarlanabilir verilerin nesil garantive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi var olduğunu beyan ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
