Summary
Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.
Abstract
In het laatste decennium is er een opleving in het gebruik van plantaardige protoplasten die variëren van model soort tot soort gewas, voor de analyse van signaaloverdracht, transcriptionele regulatorische netwerken, genexpressie, genoom-editing, en gen-silencing is geweest. Bovendien is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de regeneratie van planten uit protoplasten, die nog meer belangstelling voor het gebruik van deze systemen voor plantengenomics heeft gegenereerd. In dit werk is een protocol ontwikkeld voor de automatisering van protoplastisolatie en transformatie van een 'Bright Yellow' 2 (BY-2) tabak schorsing cultuur met behulp van een robot platform. De transformatie procedures zijn gevalideerd met een oranje fluorescerend eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) onder controle van de bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter (35S). OFP expressie in protoplasten werd bevestigd door epifluorescentie microscopie. Analyses omvatte ook protoplast efficiëntie van de productie methoden waarbij propidium jodide. Tenslotte werden goedkope food-grade enzymen die voor de protoplast isolatiewerkwijze, omzeilen de noodzaak van lab-klasse enzymen die kosten prohibitief in high-throughput geautomatiseerde protoplastisolatie en analyse. Op basis van het protocol ontwikkeld in dit werk, kan de volledige procedure van protoplastisolatie transformatie worden uitgevoerd in minder dan 4 uur, zonder enige inbreng van de operator. Terwijl de ontwikkelde in dit werk protocol werd gevalideerd met de BY-2 celkweek, moeten de procedures en methodes vertaalbaar naar alle planten schorsing cultuur / protoplast-systeem, dat de versnelling van het gewas genomics onderzoek moet mogelijk te maken.
Introduction
In de afgelopen jaren is er een belangrijke impuls gelegd aan het ontwerp van transgene gewassen voor verschillende ziekten 1 te overwinnen, schenken herbicide weerstand 2, overleggen droogte 3,4 en zouttolerantie 5 geweest, herbivorie 6 te voorkomen, te verhogen biomassaopbrengst 7 en celwand weerspannigheid verlagen 8. Deze trend is geholpen door de ontwikkeling van nieuwe moleculaire technieken voor het genereren van transgene planten, waaronder genoom-bewerk, CRISPR Talens en 9, en silencing tot dsRNA 10, 11 miRNA en siRNA 12. Hoewel deze technologieën het genereren van transgene planten hebben vereenvoudigd, hebben ze ook een bottleneck, waarbij het grote aantal transgene planten gegenereerd kunnen niet worden gescreend met behulp van traditionele systemen die afhankelijk zijn van planten regeneratie. Voor dit knelpunt, terwijl zwijgen en genoom-editing constructen kunnen snel in planten worden ingebracht, velegerichte eigenschappen niet het gewenste effect, die vaak niet ontdekt tot planten worden geanalyseerd in de kas te produceren. In dit werk hebben we een werkwijze voor snelle, geautomatiseerde high-throughput screening van plantenprotoplasten ontwikkeld, specifiek de huidige bottleneck begin screening van grote aantallen genoom-editing en silencing streefwaarden.
Het gebruik van protoplasten, in tegenstelling tot intacte plantencellen, heeft een aantal voordelen voor de ontwikkeling van een geautomatiseerd platform. Eerst worden protoplasten geïsoleerd na digestie van de plantencelwand, en deze barrière niet meer aanwezig, wordt transformatie-efficiëntie verhoogd 13. In intacte plantencellen zijn er slechts twee gevestigde methoden voor transformatie, biolistica 14 en Agrobacterium-gemedieerde transformatie 15. Geen van deze methoden kan gemakkelijk worden vertaald naar liquid handling platforms, zoals biolistica vereist gespecialiseerde apparatuur voor transformatie, terwijl Agrobacterium-gemedieerde transformatie vereist co-cultuur en de daarop volgende verwijdering van de bacteriën. Niet vatbaar voor high throughput methode. Bij protoplasten, transformatie wordt routinematig uitgevoerd met polyethyleenglycol (PEG) bemiddelde transfectie 16, die op verschillende oplossing vereist uitwisseling, en is ideaal voor vloeistofverwerking platforms. Anderzijds protoplasten per definitie zijn eencellige kweken, en dus de problemen van klontering en ketenvorming in plantencelkweken, worden niet waargenomen in protoplasten. In termen van een snelle screening met behulp van een plaat gebaseerde spectrofotometer, samenklontering van cellen, of cellen in meerdere vlakken zal leiden tot moeilijkheden bij het verkrijgen van consistente metingen. Aangezien protoplasten ook dichter dan de kweekmedia ze bezinken op de bodem van putjes, waarbij een monolaag, die bevorderlijk is voor platen gebaseerde spectrofotometrie. Tot slot, terwijl de fabriek celsuspensieculturen zijn primarily afgeleid van callus 17, kunnen protoplasten worden verzameld van verschillende plantenweefsels, waardoor de mogelijkheid om weefselspecifieke expressie te identificeren. Bijvoorbeeld, het vermogen om wortel- of blad-specifieke expressie van een gen te analyseren kan zeer belangrijk fenotype te voorspellen. Daarom werden de die in dit werk protocollen gevalideerd middels protoplasten geïsoleerd uit de veel gebruikte tabak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow '2 (BY-2) suspensiekweek.
Het BY-2 suspensiekweek is beschreven als het "HeLa" cel van hogere planten door zijn alomtegenwoordige gebruik in moleculaire analyse van 18 plantencellen. Onlangs BY-2 cellen werden gebruikt om de effecten te bestuderen van plantaardige stressoren 19-22, intracellulair eiwit lokalisatie 23,24 en fundamentele celbiologie 25-27 tonen de brede bruikbaarheid van deze culturen in plantenbiologie. Een bijkomend voordeel van BY-2 culturen demogelijkheid om de kweken te synchroniseren met aphidicoline, wat kan leiden tot verbeterde reproduceerbaarheid genexpressiestudies 28. Bovendien zijn werkwijzen ontwikkeld voor de extractie van BY-2 protoplasten met behulp van goedkope enzymen 29,30, enzymen traditioneel gebruikt voor het genereren van protoplasten onbetaalbaar voor high-throughput systemen. Als zodanig heeft de hieronder beschreven protocol gevalideerd met de door-2 suspensiekweek, maar het moet geamendeerd om alle planten celsuspensie cultuur. Proof-of-concept experimenten uitgevoerd met een fluorescentie eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) vanaf het harde koraal Porites Porites 31 onder de controle van de CaMV35S-promoter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. De vaststelling van Suspension Cell Cultures
- Bereid vloeibare BY-2 media door het toevoegen van 4,43 g Linsmaier & Skoog basale media, 30 g sucrose, 200 mg KH 2PO 4 en 200 ug van 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (2,4-D) aan 900 ml gedestilleerd water en pH 5,8 met 0,1 M KOH. Na het aanpassen van de pH, aan te passen uiteindelijke volume tot 1000 ml met gedestilleerd water en autoclaaf. Media kunnen tot 2 weken bewaard bij 4 ° C.
- Inoculeren een 250 ml Erlenmeyer fles met 100 ml vloeibaar BY-2 media en één stuk BY-2 callus (> 1 cm in diameter) gekweekt op vaste BY-2 medium (vloeistof BY-2 medium met de toevoeging van 1% agar) en sluit af met aluminiumfolie. Incubeer kweken bij 28-30 ° C onder schudden gedurende 5 dagen.
LET OP: BY-2 eelt wordt gehandhaafd op vaste media voor langdurige opslag, zoals vloeibare kweken snel zal overwoekeren. Kweekvolume kan zodanig aangepast, kenmerkend een 100 ml kweek in staat zijn het laden drieëndertig 6-well platen. - Overdracht 2 ml log fase BY-2 cultuur tot 98 ml vers BY-2-media en incubeer gedurende 5-7 dagen bij 28-30 ° C onder schudden.
OPMERKING: Sub-kweken van gevestigde vloeibare kweken kan worden uitgevoerd regelmatig met 1: 100 verdunningen van 5-7 dagen oude kweken, in plaats van inoculatie met callus. - Meng de cultuur grondig, als cellen zich snel zal vestigen, en de overdracht 6 ml van de celkweek aan een 15 ml conische bodem centrifugebuis en laat de cellen genoegen nemen met ten minste 10 min. Stel het gepakte celvolume tot 50% van het totale volume door het verwijderen van supernatant.
- Schud de buis door het omkeren en pipet 500 ul in elk putje van een 6-wells plaat voor de spijsvertering. Gebruik wide-bore pipetten aan de cellen dragen in dit stadium, omdat ze dicht en verstoppen standaard pipetpunten.
2. protoplastisola-
- Zet alle componenten van het robotsysteem (Figuur 1A) en open de plaat mover taak plannen zachteware. De taak planningsprogramma integreert de microplaat mover met de andere apparatuur om de overdracht van de platen tussen elk apparaat mogelijk te maken.
- Voorafgaand aan experimenten, bepalen de technische specificaties voor laboratorium (bijvoorbeeld borden, deksels) die in het protocol, en begin- en eindposities voor elk stuk laboratorium, in de plaat mover software als volgt:
- Klik op Setup van de belangrijkste werkbalk in de plaat mover-software en selecteer het beheren Container Types commando.
- Als het type container in de bestaande soort container bibliotheek wordt vermeld, selecteer vervolgens de juiste container.
- Als het type container niet in de bestaande soort container bibliotheek wordt weergegeven en klik vervolgens op Toevoegen om een nieuwe container opgeven.
- Na het toevoegen van een nieuw type container, plaatst u de afmetingen van de nieuwe container (hoogte, breedte, stapelen dimensies en grijper offset) in de juiste tabbladen en klik op Opslaan.
- Als de juiste afmetingen zijn niet verkrijgbaar bij de fabrikant, vervolgens nauwkeurig alle dimensies op de millimeter te bepalen met behulp van remklauwen. Fouten in het meten van de container afmetingen zal leiden tot het falen van de plaat mover.
- Herhaal de stappen 2.2.2 tot 2.2.4.1 voor elk type container die de plaat verhuizer zal tegenkomen. Na voltooiing van deze stap voor laboratorium, is het noodzakelijk om het begin- en eindpunt van elke container (stap 2.2.6) definiëren.
LET OP: Voor dit protocol het laboratorium bevat de 6-wells plaat, de deep-well plaat, en de 96-well fluorescerende screening plaat. - Aan het begin en einde positie van elke container te definiëren, klikt u op het tabblad Start / End in een specifiek protocol. Selecteer eerst de startpositie van elke container. Vervolgens vinkt u het vakje voor Dekselkisten / Unlidded op zowel de begin- en eindstand. Herhaal dit voor alle containers.
OPMERKING: Als de container zal worden overgelaten aan een ander stuk van equipment (in plaats van de plaat mover) het einde locatie kan worden ingevuld.
- Op dit moment staat alle platen laden in de uitgangspositie voor de gehele workflow. Laad de 96-well fluorescerende zeefplaten in hotel 2, 6-well platen met BY-2 cellen in hotel 3, een 96 deep-well plaat die wordt gebruikt voor transformatie op plaat verwarmer / koeler nest 2, en een 50 ml conische buis die het enzym oplossing (zie Hulp File, paragraaf 1.2.2) op de multi-mode dispenser.
- Als de transformatie in het protocol zal worden uitgevoerd, pre-laad de 96 deep-well plaat met 10 ul van plasmide-DNA per putje (1 ug / ul, A 260/280> 1.8) die het OFP reporter construct en broeden op de plaat verwarmer / koeler bij 4 ° C. Elk putje wordt gebruikt voor een enkele transformatie, waardoor het aantal putten gevuld is afhankelijk van de experimentele opstelling.
- Laad alle leveringen en platen op het automatiserend liquid handling platform in de aangewezen locaties en bepalen de positie van elk item in de automatisering controle software (Figuur 1B).
- Plaats een 96-wells plaat voorgeladen met 200 pi 40% PEG in MMG (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5,7) in kolom 1, 200 ul propidiumjodide (PI, 1 ug / ml) in kolom 2, en 200 ui ethanol in kolom 3 (nest 2), en een doos van pipet tips in het nest 8.
- Om de locatie van het laboratorium in de software van de geautomatiseerde liquid handling platform, selecteer Tools in het menu te definiëren en klik op Labware Editor.
- Selecteer het type laboratorium uit het pulldown menu of definieer een nieuw laboratorium in met behulp van het nieuwe Laboratoriumbestek knop.
- Bepaal de positie van elk stuk van laboratorium geselecteerd door het tabblad Main Protocol en klik op Configure Labware. Zorg ervoor dat elk stuk van laboratorium geplaatst op de geautomatiseerde verwerking vloeistof platform isgedefinieerd vóór het uitvoeren van het protocol.
- Om de geautomatiseerde protocollen starten, klikt u op de Profile Explorer-venster en selecteer de naam van het protocol worden uitgevoerd (protoplastisolatie, celgetal, en PEG-gemedieerde transformatie).
- Klik op Uitvoeren om alle apparaten die worden gebruikt in het protocol initialiseren.
- Ten slotte is in het venster Work Explorer, klikt u op Toevoegen Work Unit om alle containers / laboratorium in het systeem te controleren en beginnen met het automatische protocol.
OPMERKING: Volledige gegevens van geautomatiseerde protocollen zijn opgenomen in de aanvullende bestand.
3. Vaststelling van Standard Curve voor celtellingen
- Handmatig concentreren protoplasten bij een concentratie van 1 x 10 6 protoplasten / ml in een volume van 1 ml. Centrifugeer protoplasten bij 1000 xg gedurende 10 min, en verwijder supernatant.
- Voeg 900 pl 70% ethanol (gehandhaafd op 4 ° C) aan de protoplast pelleten resuspendeer de pellet. Incubeer gedurende 10 min op ijs om cellen te repareren.
- Voeg 100 ul van PI (1 ug / ml) aan de protoplasten om de kernen te labelen en waarmee de aanwezigheid van de plaatlezer.
- Load 80 ul van vloeistof BY-2 media in elke kolom en rij van de 96-well fluorescerende screening plaat te beginnen bij kolom 2.
- In kolom 1 van een 96-well fluorescerende schermplaat, voeg 70 ul van protoplasten en 50 gl BY-2 medium aan elk putje van de kolom.
- Plaats de plaat in nest 6 van de geautomatiseerde liquid handling-platform, en uitvoeren van een 2-voudige seriële verdunning.
- Een seriële verdunning van de geautomatiseerde vloeistofverwerking platform voeren op starten seriële Wizard verdunning en het volume overdracht (60 ui), aantal mixen en volume (2, 70 ui), aanvankelijk putjes (kolom 1, rijen AF), verdunning aanpassen Wells (Kolommen 2-11, Rijen AF), en aspireren en afzien eigenschappen (0,5 mm uit goed onder).
- Na het instellen van de parameters, behalve eend het protocol uit te voeren.
Opmerking: Aangezien alle protoplasten worden gelabeld met PI (vanwege fixatie van cellen), de fluorescentie is evenredig met de concentratie protoplast. - Nadat de seriële verdunning is voltooid, verwijdert u de plaat uit nest 9 en in te voegen in de plaat lezer en voer de standaard curve protocol in de plaat lezer software.
OPMERKING: Een standaard curve wordt dan gegenereerd door vergelijking van de fluorescentie van PI (excitatie 536 nm / emissie 620 nm) in elk putje met bekende concentratie protoplast.
- Na voltooiing van de plaat lezer protocol, verwijder de plaat en het verzamelen van elke transgene cellen voor behandeling in een autoclaaf of andere de-vitalisering procedures zoals gedefinieerd in bioveiligheid protocollen '.
4. Microscopische analyse van Transformatie
- Verwijder plaat met getransformeerd protoplasten (het product van Automated Protocol 3, Aanvullende File) van Hotel 1 van het robotsysteem.
- Beurtop omgekeerde microscoop, camera, en tl-lamp.
- Selecteer de 10X doelstelling voor de initiële focus op de protoplasten, zet de halogeenlamp, en sluit de sluiter voor de tl-lamp.
- Load plaat op microscopische systeem en de focus op de protoplasten met behulp van helderveld.
- Na de nadruk op protoplasten, uitschakelen van de halogeenlamp en open de sluiter voor de tl-lamp.
- Selecteer de CY3 / TRITC filterset voor visualisatie van de pporRFP eiwit door de transgene protoplasten uitgedrukt.
- Scannen elk putje het aantal protoplasten expressie pporRFP de fluorescente merker bepalen.
- Bereken de transformatie-efficiëntie als het totaal aantal protoplasten uiting van de fluorescente merker het totaal aantal protoplasten.
- Verzamel elke platen met transgene cellen in goedgekeurde bioveiligheid zakken voor een autoclaaf of andere de-vitalisering procedures zoals gedefinieerd in bioveiligheid protocollen '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de huidige studie, de verdubbelingstijd percentage BY-2 varieerde 14-18 uur afhankelijk van de temperatuur waarbij de kweken werden geïncubeerd, in overeenstemming met eerdere rapporten van een gemiddelde lengte van de celcyclus van 15 uur. Met deze verdubbeling rate, een 1: 100 werd beginnen entstof gebruikt om culturen te initiëren, wat leidt tot culturen met een hematocriet (PCV) van 50% in 5-7 dagen. In het huidige protocol, waarin kweken werden gekweekt in 200 ml medium, een PCV van 100 ml werd gemaakt in 7 dagen, wat genoeg cellen 33 6-well platen vullen ontvangen. In termen van protoplast opbrengst, de spijsvertering bij het in het protocol vermelde voorwaarden gegenereerd 4,70 x 10 5 ± 5,77 x 10 3 protoplasten per well, wat resulteert in 2,82 x 10 6 protoplasten per 6-well plaat (Figuur 2A). Op basis van deze gegevens kan 214 96-well platen (70 ui protoplasten per putje) worden geladen vanuit een 6-well plaat digestie, met het potentieel for twee 6-well platen tegelijk worden verteerd, met gebruikmaking van de twee plaatvormige verwarmer / koeler stations. Zo is het maximum aantal protoplasten die tijdens een drie uur durende digestie protocol kan worden gegenereerd is 5,64 x 10 6.
Terwijl het totaal aantal protoplasten gegenereerd per digestie protocol verschaft een maatstaf voor het systeem, is het ook noodzakelijk om het verlies van protoplast concentratie evalueren de protoplasten overgebracht door de verschillende stappen van het protocol. Als zodanig, de concentratie van protoplasten werd beoordeeld na elke overdracht stap in het protocol. Na de digestie protocol werden 1,15 x 10 4 ± 1,35 x 10 2 protoplasten overgebracht naar elk putje van de 96 diepe putjes, indien bij de transformatie protocol, of de 96-well fluorescerende schermplaat (figuur 2B). Zodra de transformatie protocol werd voltooid, 1,23 x 10 3 ± 4,66 x10 1 protoplasten overgebracht naar 96-well fluorescerende schermplaat (figuur 2C). Naast het aantal protoplasten overgebracht, was het belangrijk om de levensvatbaarheid van de protoplasten te treffen noodzakelijk pipetteren meerdere fasen niet de protoplasten niet beschadigen.
Op basis van de resultaten van de levensvatbaarheid-assay, 95,1 ± 0,04% van de protoplasten levensvatbaar na digestie, 92,1 ± 0,06% na overdracht naar de 96-well fluorescerende schermplaat en 91,7 ± 16,67% na de transformatie protocol. Ondanks meerdere pipetteerstappen, was er geen significant verschil (p> 0,44) tussen elk van de monsters. Naast deze meting van levensvatbaarheid werd een protocol ontwikkeld voor het bepalen van de concentratie van protoplasten in elk stadium van de procedure door meting van het totaal aantal protoplasten gekleurd met PI. Zoals getoond in figuur 3, een standaard curve generated door meting van de fluorescentie-intensiteit van bekende concentraties van protoplasten uit het systeem. De standaardkromme was een goede fit (R 2 = 0,967) met het totaal aantal protoplasten verspreid over het bereik van 0 tot 30.000 protoplasten per putje. Met de standaardkromme, de fluorescentie-intensiteit van monsters met een bekend aantal protoplasten (8125 en 24.375 berekend met een hemocytometer) werd verkregen en het aantal protoplasten berekend uit de vergelijking van de standaardcurve valideren. Op basis van deze resultaten, de standaardcurve voorspelde 9560 en 28.200 protoplasten in elk putje een fout 15 en 14%. Aangezien er ook variatie in het meten van het aantal cellen met een hemocytometer, werd deze fout acceptabel geacht.
F - naast de resultaten van het aantal cellen en de levensvatbaarheid, het transformatieprotocol succesvol in transgene cellen die OFP (figuur 2D expressie was). Helaas het protocol resulteerde in lage, ~ 2%, transformatie-efficiëntie, vanwege de grote 16.028 bp binair plasmide gebruikt in deze studie en aangezien het protocol is niet specifiek geoptimaliseerd voor BY-2 protoplasten. Optimalisatie van de transformatie protocol, in termen van reagentia en omstandigheden specifiek voor BY-2 protoplasten, wordt verwacht dat de transformatie-efficiëntie te verhogen, zoals toegelicht in de discussie. In termen van dit protocol, werd de transformatie procedure ontworpen om de proof-of-concept pad van protoplastisolatie transformatie te demonstreren, en succesvol in het bereiken van dit doel was.
Na succesvolle validering alle afzonderlijke procedures werden statistieken verkregen voor tijdsverloop van het protocol van protoplastisolatie transformatie. Zoals aangetoond in Figuur 4, is de grote investering van tijd tijdens het oplossen fase, waarbij 3 uur werd vereist for volledige digestie van de celwand en lossen van de protoplasten. Tijdens deze procedure worden 18 lussen lopen tussen de plaat shaker en plaat verwarming / chiller 1 incubatie station, met de plaat verhuizer het bewegen van de plaat tussen de twee stations. De transfer tussen de plaat shaker en plaat verwarming / chiller 1 duurt slechts 8,9 sec, en zorgt ervoor dat de meerderheid van de spijsvertering procedure wordt besteed incubatie en schudden. De totale tijd vanaf het begin van de procedure om het laden van de enzymen te voltooien door de multi-mode dispenser is 2,2 min. In het algemeen wordt een totale protoplastisolatie protocol voltooid in 3 uur en 22,8 min. Op basis van deze resultaten is 88% van de protoplastisolatie protocol besteed verteren. Na voltooiing van de protoplastisolatie protocol, wordt het transformatieprotocol gestart en voltooid in 27,5 minuten. Vergelijkbaar met de protoplastisolatie protocol, wordt 72% van de transformatie procedure bracht incuberen van de reactie. De enige andere stap in het protocoldat een aanzienlijke tijd component (> 10% van de totale procedure tijd) is de initialisatie van het protocol door de geautomatiseerde vloeistofverwerking platform, die goed is voor 14% van de totale tijd van de procedure. Zo is 86% van het protocol doorgebracht in initialisatie en incubatie met slechts 14% van de tijd besteed aan het pipetteren en overdracht stappen. De volledige duur van protoplastisolatie en transformatie was 3 uur, 50 minuten en 53 seconden, zonder externe invoer van een operator nodig.
Figuur 1:. Schema van de robot platform en de configuratie van de geautomatiseerde vloeistofverwerking platform tijdens het protocol (A) Het robotsysteem bestaat uit 3 plate stacks / hotels die toegankelijk is door de plaat mover. Hotel 1 is de aangewezen lidding / delidding station, Hotel 2 is de 96-well fluorescerendeplaat stack, en Hotel 3 is de 6-wells plaat stack. Het systeem heeft twee vloeibare handlers, een geautomatiseerde liquid handling platform, en een spuitmond gebaseerde multi-mode dispenser. Voor de verwarming / koeling van de robot platform heeft twee plaat verwarming / koeling units, samen met een plaat shaker voor het mixen van de plaat. Tot slot, het systeem heeft een monochromator gebaseerde plaatlezer voor het meten van fluorescentie. Alle componenten zijn ondergebracht in een custom-built bioveiligheid kabinet. (B) Vanaf de configuratie van de geautomatiseerde liquid handling platform met nest 2 bezet door het reagens plaat en de tip box geplaatst op nest 8. (C) Configuratie van geautomatiseerde liquid handling platform vóór het oproepen van een experimenteel protocol. Een deep-well plaat ligt op nest 4, is een 96-well fluorescerende screening plaat op nest 6, en de 6-well plaat met protoplasten ligt op nest 5. Klik hier om v IEW een grotere versie van deze figuur.
Figuur 2: Representatieve beelden van BY-2 protoplasten na elke overdracht en na transformatie met de oranje fluorescerend eiwit reportergen (A - C) microfoto van BY-2 protoplasten dichtheid in 6-wells plaat met 96 putjes na overdracht van 70. ul van de 6-well plaat, en 96-well fluorescerende screening plaat post-transformatie. (D) Helderveld microfoto van BY-2 protoplasten na transformatie. (E) TL-BY-2 protoplasten uiting van de OFP gen gevisualiseerd met behulp van een Cy3 / TRITC filter set. (F) Overlay van helderveld en fluorescerende microfoto het aantonen van de lage efficiëntie van de transformatie. Schaal bar = 50 micrometer. target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Standaard curve voor het berekenen van het aantal protoplasten Het aantal protoplasten in een goed bepaald kan worden berekend door de fluorescentie-intensiteit in willekeurige eenheden (AU), de vergelijking voor de standaardcurve. Validatie van de protoplast getal vergeleken tussen de standaardcurve en hemocytometer in de op de grafiek met 9561 protoplasten geïdentificeerd van de plaatlezer en 8125 telde de hemocytometer punt. Over het geheel genomen een fout van 15% werd gevonden tussen de twee technieken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
re 4 "src =" / files / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
Figuur 4:. Gantt diagram voor de beschreven procedure voor het vervaardigen van BY-2 protoplasten en genetische transformatie De meeste protocol ~ 3 uur wordt besteed aan digestie van het BY-2 cellen om de protoplasten te genereren. Laden van de enzymoplossing en inactivatie vereisen slechts 12% van de totale procedure tijd. Evenzo incubatie van de transformatiereactie op de plaat shaker voor 72% van de transformatie protocol. Over het algemeen, de procedure vanaf protoplastisolatie tot genetische transformatie wordt bereikt, is jonger dan 4 uur (3 uur, 50 min en 53 sec). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende File: Geautomatiseerde protocollen voor protoplastisolatie, cel tellen, en PEG-gemedieerde transformatie <./ strong> Complete protocollen ontwikkeld voor gebruik in de robotic platform aan elk van de hierboven vermelde zijn opgenomen in dit bestand taken uit te voeren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven protocol is met succes gevalideerd voor protoplastisolatie, telling, en transformatie met behulp van de door-2 tabak schorsing celkweek; echter, kon het protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar alle planten schorsing cultuur. Op dit moment heeft protoplastisolatie en transformatie gerealiseerd in tal van planten, met inbegrip van maïs (Zea mays) 10, wortel (wilde peen) 32, populier (Populus euphratica) 33, druif (Vitis vinifera) 34, oliepalm (Elaeis guineensis) 35 , sla (Lactuca sativa) 36, mosterd (Brassica juncea) 37, rijst (Oryza sativa) 38, en switchgrass (Panicum virgatum) 39,40. Terwijl variatie in de cultuur en de spijsvertering omstandigheden zich voordoen van soort tot soort, in termen van het protocol ontwikkeld in dit werk, ter vervanging van de cultuur media of wijziging van de voorwaarden van de opgravingestion moet de fundamentele protocol niet veranderen. Aan te passen aan verschillende soorten, cultuur media en enzymen die nodig zijn voor de spijsvertering worden geladen door de bediener voor initialisatie van het protocol, waardoor het omwisselen van deze componenten is triviaal. Als een extra voordeel, het protocol is amendeerbaar om het screenen van meerdere spijsvertering omstandigheden met de opbrengst van protoplasten gemeten door het systeem. Dit is een essentiële component, het gebruik van goedkope enzymen die nodig zijn voor high-throughput toepassingen, dus is het belangrijk de hoeveelheid enzymen die bij de spijsvertering minimaliseren.
Soortgelijke cultuur en spijsvertering, zouden wijzigingen in de transformatie protocol vereist de goedkeuring van het systeem voor transformatie van protoplasten geïsoleerd uit verschillende plantensoorten. Er is veel werk verricht op het optimaliseren van PEG-gemedieerde transformatie in plantenprotoplasten 16,35, met tal van factoren die de efficiëntie van de transformatie. In de huidige work een beperkende factor die de transformatie-efficiëntie is de grote omvang van de binaire testplasmide, 16.028 bp, die werd gebruikt voor het doel van het modelleren van een genoom-editing plasmide grootte. In eerdere studies op PEG-gemedieerde transformatie van BY-2 protoplasten, is 40-60% omzetting bereikt; Echter, deze studies gebruikten kleine 5000 bp plasmiden 41,42. De primaire wijzigingen van PEG-gemedieerde transformatie tussen soorten zijn de concentratie van PEG en MgCl 2, hoeveelheid en concentratie van DNA en reactieduur. Als PEG en MgCl 2 oplossingen worden ingevoerd in het systeem op het reagens plaat, en het DNA wordt vooraf geladen in de deep-well plaat, kunnen deze condities eenvoudig worden aangepast in het hierboven beschreven protocol. Bovendien verhogen of verlagen van de incubatietijd, evenals wijziging van mengsnelheden, nauwkeurig worden geregeld door de robot platform. De stroombegrenzing van de transformatie protocol is het gebrekdie gebruikmaken van de plaat lezer de fluorescente reporter detecteren vanwege de lage efficiëntie van PEG-gemedieerde transformatie BY-2 protoplasten. In andere soorten, zoals Arabidopsis thaliana en maïs 16, PEG-gemedieerde transformatie is 40-90% efficiënt. In dergelijke systemen kunnen transformanten snel worden gekarakteriseerd met de plaatlezer op de robot. Zo zou het mogelijk zijn om putjes met positieve transformanten te identificeren, en ook het niveau van expressie te kwantificeren. Voor toepassingen, zoals promoter screening, zou deze functie het nut van de huidige protocol oplopen en in latere iteraties van het systeem worden toegevoegd.
Naast optimalisatie van de transformatie-efficiëntie van BY-2 protoplasten kunnen verscheidene modificaties de efficiëntie en de algehele doorvoercapaciteit van het systeem te verhogen. Eerdere studies op automatisering van protoplasttransformatie protoplasten liet bezinken op de bodem van putjes, vóór de toevoeging werdh oplossingen 43. In het huidige protocol, werden protoplasten gemengd op de plaat shaker om te voorkomen dat de afwikkeling en houden de protoplasten in suspensie met behulp van platbodem putjes. Voorts werd bij transformatie protoplasten werden niet bezinken in de diepe putjes, de blootstelling aan PEG, die toxisch gedurende lange blootstelling kan verminderen. Zo werden de protoplasten verdund ~ 10-voudig met W5-oplossing bij overdracht van de diepe-well plaat om de 96-well fluorescerende zeefplaat, waardoor 1,23 x 10 3 ± 4,66 x 10 1 protoplasten per putje. Om het aantal protoplasten overgebracht na transformatie vergroten kan een incubatiestap worden toegevoegd om de protoplasten te bezinken en de bovenstaande vloeistof verwijderd, gevolgd door toevoeging van een kleine hoeveelheid vloeistof BY-2 media. Bovendien, als een plaat gebaseerde centrifuge aan het systeem werd toegevoegd, deze stap kan worden sneller bereikt. Een andere wijziging die functionaliteit kunnen toevoegen aan thij systeem zou het gebruik van een levende / dode fluorescentie assay om de levensvatbaarheid van de geïsoleerde protoplasten vóór transformatie bepalen. In het huidige protocol, fluoresceïne diacetaat (FDA) werd getest als een levend kleurstof; Echter, de BY-2 protoplasten achtergrond fluorescentie verduisterde de FDA signaal. Als een stabielere levensvatbaarheid kleurstof werd gebruikt, dan protoplast levensvatbaarheid bepaald als de verhouding van rode (PI) naar groen (calceïne AM, etc.) fluorescentie en gestandaardiseerde vergelijkbaar met de cel telvoorschrift. Deze wijzigingen zouden meer functionaliteit toe te voegen aan het systeem, en zal worden opgenomen in de toekomst protocollen.
Met betrekking tot het huidige protocol, zijn er verschillende kritische stappen die moeten worden gevolgd om het succes van het protocol waarborgen. Ten eerste, de leeftijd / gezondheid van BY-2 culturen essentieel belang dat de levensvatbare protoplasten kunnen worden geïsoleerd voor verdere stappen. Zoals beschreven in stap 1.3, door het overbrengen van een log fase cultuur een nieuwe kolf bij een01:50 verhouding van cellen vers medium, en waarbij de kweek groeien gedurende 5-7 dagen, kan het maximum aantal levensvatbare protoplasten geïsoleerd worden. Waardoor de kweken groeien voor langere of kortere duur met de opgegeven inoculum zal aanzienlijk verminderen de protoplast opbrengst en falen van daaropvolgende protocollen veroorzaken. Een tweede belangrijke stap is stap 1.5, omdat het gebruik van standaard pipet tips, in plaats van de grote boring pipet tips vermeld, zal de tips te verstoppen en leiden tot de onjuiste volumes worden overgebracht. Wat betreft de opstelling van het robotsysteem, de opstelling van de platen op de geautomatiseerde vloeistofverwerking platform, stap 2,4, kritisch, met een gewijzigde opstelling voorkomen van de kop van de vloeistofhandler bereiken alle putjes van de 6-well plaat. Door de vormgeving van de geautomatiseerde vloeistofverwerking platform moet de 6-well plaat in nest 5 worden gebracht of protocollen geselecteerd voor dit instrument niet. Op dezelfde manier, het niet juist het laboratorium te definiëren in de plaatverhuizer software, stap 2.2, zal ertoe leiden dat het instrument niet aan te pakken, en laat het laboratorium voor de beëindiging van het protocol. Voor de cellen protocol, de kritische stap is de fixatie van de cellen met ethanol, stap 3,2. Als cellen niet vóór merken met PI worden vastgesteld, maar niet levensvatbare cellen worden gemerkt, in plaats van de gehele bevolking van protoplasten en het zal niet mogelijk zijn het aantal protoplasten geïsoleerd tellen. De laatste kritische stap, stap 4,6, behelst selectie van de fluorescente filters voor microscopische analyse van de expressie van de pporRFP fluorescente merker. Het gebruik van andere "rode" filter sets maakt achtergrondfluorescentie van chlorofyl, een aanzienlijk hogere signaal in alle chloroplasthoudende protoplasten, waardoor berekening van de transformatie-efficiëntie. Zorgvuldig vast te houden aan de specificaties van deze kritische stappen garandeert de grootste kans op succes en het genereren van de meest reproduceerbare dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financieel belang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
