Summary
A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.
Abstract
בעשור האחרון חלה התעוררות מחודשת השימוש פרוטופלאסט צמח נעים בין מיני מודל לחתוך מינים, לניתוח של מסלולי העברת אותות, רשתות רגולטוריות תעתיק, ביטוי גנים, הגנום עריכה-להשתקת גנים. יתר על כן, התקדמות משמעותית נעשתה ההתחדשות של צמחים מפני פרוטופלאסט, אשר יצרה עניין עוד יותר את השימוש במערכות אלה עבור הגנומיקה צמח. בעבודה זו, פרוטוקול פותח לאוטומציה של בידוד פרוטופלאסט וטרנספורמציה מתרבה השעית טבק 2 'צהובה בוהק "(BY-2) באמצעות פלטפורמה רובוטית. נהלי טרנספורמציה אומתו באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום גן כתב (OFP) (pporRFP) תחת השליטה של אמרגן 35S וירוס פסיפס הכרובית (35S). ביטוי OFP ב פרוטופלאסט אושר על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. ניתוח כלל גם שיטות יעילות הייצור פרוטופלאסט באמצעות propidiuיודיד מטר. לבסוף, אנזימי כיתת מזון בעלות נמוכה שמשו הליך בידוד פרוטופלאסט, עקיפת הצורך אנזימי מעבדת כיתה כי הם עלות אוסרני ב תפוקה גבוהה אוטומטי בידוד פרוטופלאסט וניתוח. בהתבסס על הפרוטוקול שפותח בעבודה זו, הנוהל במלואו מבידוד פרוטופלאסט לטרנספורמציה יכול להתנהל תחת 4 שעות, ללא כל קלט מהמפעיל. בעוד פרוטוקול שפותח בעבודה זו קיבלה תוקף עם תרבית תאים BY-2, נהלים ושיטות צריכה להיות לתרגום לכל ההשעיה צמח תרבות / מערכת פרוטופלאסט, מה שאמור לאפשר האצה של מחקר הגנום היבול.
Introduction
בשנים האחרונות חלה תנופה משמעותית דגש על העיצוב של יבולים מהונדסים להתגבר מחלות שונות 1, מעניק עמידות עשבים 2, להעניק בצורת 3,4 וסובלנות מלח 5, למנוע herbivory 6, להגדיל את התשואה ביומסה 7, ולהקטין סרבנות דופן תא 8. מגמה זו כבר שנעזר בפיתוח כלים מולקולריים חדשים להפקת צמחי מהונדס, כולל הגנום עריכה באמצעות CRISPR ו TALENs 9, ואת הגן השתקה דרך dsRNA 10, מירנה 11, ו siRNA 12. בעוד הטכנולוגיות הללו יש לפשט את הדור של צמחים מהונדסים, הם גם יצרו צוואר בקבוק, שבו המספר העצום של צמחים מהונדסים שנוצר לא יכול להיות מוקרן באמצעות מערכות מסורתיות המסתמכות על התחדשות צמח. הקשורים צוואר הבקבוק הזה, תוך השתקה בונה לעריכת הגנום יכול להיות מוכנס לתוך במהירות צמחים, רבים שלתכונות ממוקדות מצליחות לייצר את האפקט הרצוי, אשר לעתים קרובות ומתגלה רק צמחים מנותחים בחממה. בעבודה זו, פיתחנו שיטה מהירה, אוטומטית, הקרנת תפוקה גבוהה של פרוטופלאסט צמח, במיוחד כדי לענות על צוואר הבקבוק הנוכחי להקרנה מוקדמת של מספר גדול של עריכת-הגנום הגן השתקה מטרות.
השימוש פרוטופלאסט, בניגוד בתאי צמח שלם, יש מספר יתרונות לפיתוח פלטפורמה אוטומטית. ראשית, פרוטופלאסט מבודד לאחר העיכול של דופן תא צמח, ועם המחסום הזה כבר לא קיים, יעילות שינוי היא גדלה 13. בתאי צמח שלמים יש רק שתי שיטות ותיקות לטרנספורמציה, biolistics 14 ו Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה 15. אף אחת מהשיטות הללו יכולים להיות מתורגמים בקלות לפלטפורמות טיפול נוזל, כמו biolistics דורש ציוד מיוחד עבור transformation, ואילו Agrobacterium טרנספורמציה בתיווך דורשת שיתוף תרבות והסרה הבאה של החיידקים. לא ניתנים עבור שיטות תפוקה גבוהות. במקרה של פרוטופלאסט, שינוי מתבצע באמצעות פוליאתילן גליקול שיגרתי (PEG) transfection בתיווך 16, מחייב חילוף פתרון מספר בלבד, והוא אידיאלי עבור פלטפורמות טיפול נוזל. שנית, פרוטופלאסט, מעצם הגדרתו, תרבויות תא בודד, ובכך הבעיות קשורות היווצרות בצעדים כבדה שרשרת בתרביות תאי צמח, אינם שנצפה פרוטופלאסט. מבחינת לסינון מהיר באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס-צלחת, התקבצות של תאים, או תאים במטוסים מרובים יובילו קושי ברכישת מדידות עקביות. מאז פרוטופלאסט צפוף גם מאשר התקשורת והתרבות שלהם, הם משקעים לתחתית בארות, ויצרו בשכבה, שהיא תורמת spectrophotometry מבוסס צלחת. לבסוף, בעוד תרבויות השעית תא צמח הם primarily נגזר יבלת 17, ניתן לקצור פרוטופלאסט ממספר רקמות הצמח, מה שמוביל את היכולת לזהות ביטוי רקמות ספציפיות. לדוגמא, היכולת לנתח root- או ביטוי ספציפי עלים של גן יכול להיות חשוב מאוד לניבוי הפנוטיפ. מסיבות אלה, פרוטוקולים שפותחו בעבודה זו אומתו באמצעות פרוטופלאסט מבודד טבק-בשימוש נרחב (Nicotiana tabacum L.) 'צהוב בוהק' 2 (BY-2) תרבות ההשעיה.
תרבות ההשעיה BY-2 תוארה תא "הלה" של צמחים גבוהים יותר, בשל השימוש הנפוץ שלה באנליזה מולקולרית של בתאי צמח 18. לאחרונה, BY-2 תאים שמשו כדי לחקור את ההשפעות של צמח לחצי 19-22, לוקליזציה חלבון תאית 23,24, ביולוגיה של תא בסיסי 25-27 הוכחת השירות הרחב של תרבויות אלה בביולוגית צמח. יתרון נוסף של תרבויות BY-2 הואהיכולת לסנכרן התרבויות עם aphidicolin, מה שעלול להוביל שחזור משופר עבור ביטוי גנים שלומד 28. יתר על כן, שיטות פותחו עבור החילוץ של BY-2 פרוטופלאסט באמצעות אנזימים בעלות נמוך 29,30, כמו אנזימים מסורתיים המשמשים לייצור פרוטופלאסט הם עלות גבוהה למערכות תפוקה גבוהה. ככזה, הפרוטוקול המתואר להלן יאומת באמצעות תרבות השעית BY-2, אבל זה צריך להיות amendable לכל תרבות השעית תא צמח. הוכחה של קונספט ניסויים מבוצעים באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום (OFP) גן כתב (pporRFP) מן Porites האלמוגים הקשה porites 31 תחת השליטה של אמרגן 35S CAMV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמת תא תרבויות השעיה
- הכן נוזלי BY-2 מדיה ידי הוספת 4.43 גרם Linsmaier & Skoog התקשורת בסל, 30 גרם של סוכרוז, 200 מ"ג KH 2 PO 4, ו -200 מיקרוגרם של 2,4-dichlorophenoxyacetic חומצה (2,4-D) ל -900 מ"ל של מזוקקים מי pH 5.8 עם 0.1 M KOH. לאחר תקנון pH, להתאים את עוצמת סופית 1,000 מיליליטר עם מים מזוקקים חיטוי. מדיה ניתן לאחסן עד 2 שבועות 4 ° C.
- לחסן בבקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer עם 100 מ"ל של נוזל BY-2 התקשורת חתיכה אחת של יבלת BY-2 (> 1 ס"מ קוטר) גדל על BY-2 התקשורת מוצק (נוזל BY-2 מדיה בתוספת 1% אגר) ואת החותם עם רדיד אלומיניום. דגירת התרבות ב C 28-30 מעלות עם רעד במשך 5 ימים.
הערה: BY-2 יבלת מתוחזק על תקשורת מוצקה עבור אחסון לטווח ארוך, כמו תרבויות נוזל תהיינה לגדול יותר במהירות. נפח תרבות יכול להיות מותאם לפי צורך, בדרך כלל תרבות 100 מיליליטר תהיה מסוגל טעינת שלושים ושלושה 6-wצלחות ell. - העברת 2 מ"ל של שלב יומן BY-2 תרבות 98 מ"ל של התקשורת BY-2 טריים דגירה של 5-7 ימים ב 28-30 מעלות צלזיוס עם רעד.
הערה: culturing-Sub של תרבויות נוזליות הוקמו יכולה להתבצע באמצעות בקביעות 1: 100 דילולים של תרבויות ישנות 5-7 יום, ולא חיסון עם יבלת. - מערבבים את התרבות ביסודיות, כמו תאים יישב במהירות, והעברת 6 מ"ל של תרבית תאים לצינור צנטריפוגות התחתונה חרוטי 15 מ"ל ולתת התאים להסתפק דקות 10 לפחות. התאם את נפח תא ארוז 50% מכלל נפח על ידי הסרת supernatant.
- Shake צינור ידי היפוך ו pipet 500 μl לבאר כל צלחת 6-גם לעיכול. השתמש pipets רחב נשא להעביר את התאים בשלב זה, כפי שהם צפופים יסתום טיפים pipet סטנדרטי.
2. בידוד פרוטופלאסט
- הפעל את כל המרכיבים של מערכת רובוטית (איור 1A) ולפתוח את המשימה מניעת צלחת תזמון רךכלי. תכנית תזמון משימות משלבת את מניע microplate עם הציוד האחר כדי לאפשר העברת הצלחות בין כל חלקי ציוד.
- לפני ניסויים, להגדיר את המפרט הטכני עבור מעבדתי (למשל, צלחות, מכסים) בשימוש בפרוטוקול, כמו גם התחלה ועמדות מסתיימות עבור כל פיסת מעבדתי, בתוכנה המניעה צלחת, כדלקמן:
- לחץ על הגדרה מסרגל הכלים הראשי בתוכנה המניעה צלחת ובחר את פקודת סוגי מכולות ניהול.
- אם סוג המכל מופיע בספריית הסוג מיכל הקיימת, ולאחר מכן בחר את המכל המתאים.
- אם סוג המכל אינו רשום בספריית סוג המכל הקיימת ולאחר מכן לחץ על הוספה כדי לציין סוג מכל חדש.
- לאחר הוספת סוג מיכל חדש, הכנס את הממדים של המכל החדש (גובה, רוחב, מידות ערמה, ואת תפסן לקזז) לתוך הכרטיסיות רצויות ולחץ על שמור.
- אם הממדים הנכונים אינם זמינים מהיצרן, אז לקבוע במדויק בכל הממדים עד המילימטר הקרוב באמצעות מחוגה. שגיאות במדידת הממדים מיכל תגרומנה לכישלון מניע הצלחת.
- חזור על שלבי 2.2.2 דרך 2.2.4.1 לכל סוגים מיכל שמניע הצלחת יפגוש. לאחר השלמת שלב זה עבור כל מעבדתי, יש צורך להגדיר את ההתחלה מיקום הסיום עבור כל מכולה (שלב 2.2.6).
הערה: עבור פרוטוקול זה המעבד כוללת את 6-גם צלחת, צלחת העמוקה היטב, ואת 96-גם צלחת הקרנת ניאון. - כדי להגדיר את מיקום ההתחלה וסיום של כל מכולה, לחץ על כרטיסיית ההתחלה / סיום בפרוטוקול ספציפי. ראשית, בחר את מיקום ההתחלה של כל מכולה. בשלב הבא, סמן את התיבה עבור עפעפיים / Unlidded היא ברמה של ההתחלה וסיום המיקום. חזור על הפעולה עבור כל מכולה.
הערה: אם המיכל יישאר על עוד פיסת סוסיםipment (במקום מניע הצלחת) המיקום סוף ניתן להשאיר ריק.
- בשלב זה באופן ידני לטעון את כל הצלחות לתוך למצב ההתחלתי עבור כל העבודה. טען את צלחות ההקרנה פלורסנט 96-היטב לתוך מלון 2, 6 צלחות היטב עם BY-2 תאים לתוך מלון 3, צלחת 96 עמוק היטב אשר ישמשו לטרנספורמציה על הקן מחמם צלחת / ילר 2, ו חרוטי 50 מ"ל שפופרת המכילה את פתרון האנזים (ראה קובץ משלימה, סעיף 1.2.2) על מתקן המצב המרובה.
- אם השינוי יתבצע בפרוטוקול, טרום לטעון 96 צלחת עמוקה היטב עם 10 μl של ה- DNA פלסמיד לכל טוב (1 מיקרוגרם / μl, A 260/280> 1.8) המכיל את לבנות כתב OFP דגירה על הצלחת דוד / ילר ב 4 ° C.. כל טוב ישמש טרנספורמציה יחיד, ובכך הגיע מספר בארות מלא יהיה תלוי בהגדרת הניסוי.
- טענת את כל האספקה והצלחות על האוטומציהלפלטפורמת טיפול ד נוזלי במקומות המיועדים ולהגדיר את המיקום של כל פריט ב תוכנות שליטה אוטומציה (איור 1B).
- טען צלחת 96-היטב מראש עם 200 μl של PEG 40% ב MMG (0.4 M מניטול, 100 מ"מ MgCl 2, 4 מ"מ MES, pH 5.7) בטור 1, 200 μl של יודיד propidium (PI, 1 מיקרוגרם / מ"ל) בטור 2, ו -200 μl של אתנול בעמודה 3 (הקן 2), וקופסת טיפים פיפטה בקן 8.
- כדי להגדיר את מיקומו של מעבדתי בתוכנה של פלטפורמת טיפול הנוזל אוטומטית, כלים מהתפריט ולחץ עורך Labware.
- בחר את סוג מעבדתי מהתפריט הנפתח או להגדיר סוג מעבדי חדש באמצעות הלחצן Labware החדש.
- הגדר את המיקום של כל פיסת המעבדת שנבחרה על ידי בחירת הכרטיסייה ראש הפרוטוקול ולחיצת Labware Configure. ודא כי כל פיסת מעבדתי להוסיף על פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית היאכהגדרתו ערב הפעלת הפרוטוקול.
- כדי לעורר את הפרוטוקולים האוטומטיים, לחץ על חלון פרופיל Explorer ובחר את שמו של הפרוטוקול שיופעל (בידוד פרוטופלאסט, ספירת תאים, וטרנספורמציה בתיווך PEG).
- לחץ על הפעל כדי לאתחל את כל ההתקנים אשר ישמשו בפרוטוקול.
- לבסוף, בחלון העבודה Explorer, לחץ על הוסף יחידת עבודה כדי לאמת את כל המכולות / מעבדתי במערכת ולהתחיל הפרוטוקול האוטומטי.
הערה: תיאור מלא של הפרוטוקולים האוטומטיים מוכלים קובץ המשלימה.
3. יקבע תקן Curve עבור ספירת תאים
- ידנית להתרכז פרוטופלאסט בריכוז של 1 x 10 6 פרוטופלאסט / מ"ל בנפח של 1 מ"ל. צנטריפוגה פרוטופלאסט XG ב 1000 למשך 10 דקות, ולהסיר supernatant.
- הוספה ידנית של 900 μl של אתנול 70% (שמרו על 4 מעלות צלזיוס) כדי גלולה פרוטופלאסטמחדש להשעות גלולה. דגירה במשך 10 דקות על קרח כדי לתקן תאים.
- הוספת 100 μl של PI (1 מיקרוגרם / מ"ל) אל פרוטופלאסט לתייג את הגרעינים ולאפשר זיהוי על ידי הקורא צלחת.
- טען 80 μl של נוזל BY-2 מדיה לתוך כל שורה ועמודה של צלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב החל עמודת 2.
- בטור 1 של צלחת ההקרנה פלורסנט 96-היטב, להוסיף 70 μl של פרוטופלאסט ו -50 μl BY-2 התקשורת היטב כל בעמודה.
- מניח את צלחת קן 6 של פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, ולהפעיל דילול סדר פי 2.
- כדי לערוך דילול סדר על פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, לחץ הפעל אשף דילול סדר ולהתאים את עוצמת קול ההעברה (60 μl), מספר תערובות ונפח (2, 70 μl), בארות ראשוניות (טור 1, שורות AF), דילול בארות (עמודות 2-11, שורות AF), ואת לשאוב ומאפיינים לוותר (0.5 מ"מ היטב למטה).
- לאחר הגדרת הפרמטרים, לשמורd להריץ את הפרוטוקול.
הערה: מכיוון שכל פרוטופלאסט מסומן עם PI (בשל קיבעון של תאים), הקרינה היא מידתית לריכוז פרוטופלאסט. - לאחר דילול סדרתי יושלם, הסר את הצלחת מן הקן 9 ולהכניס לתוך קורא הצלחת ולהפעיל את הפרוטוקול העקום הסטנדרט בתוכנה קוראת צלחת.
הערה: עקומת סטנדרט אז תופק על ידי השוואת הקרינה מן PI (עירור 536 ננומטר / פליטה 620 ננומטר) בכל טוב עם ריכוז פרוטופלאסט ידוע.
- עם השלמת הפרוטוקול הקורא הצלחת, להסיר את הצלחת לאסוף את כל תאים מהונדסים עבור מעוקר או נהלי דה-חִיוּן נוספים שנקבעו פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים ".
4. ניתוח מיקרוסקופי של טרנספורמציה
- הסר את הצלחת עם פרוטופלאסט טרנספורמציה (התוצר של אוטומט פרוטוקול 3, קובץ משלימה) ממלון 1 של מערכת רובוטית.
- לפנותעל מיקרוסקופ הפוכה, מצלמה, ואת מנורת פלורסנט.
- בחר את המטרה 10X עבור היין הראשי התמקדות פרוטופלאסט, להדליק את מנורת הלוגן, ולסגור את התריס על מנורת פלורסנט.
- צלחת טען גבי מערכת מיקרוסקופית ולהתמקד פרוטופלאסט באמצעות brightfield.
- לאחר התמקדות פרוטופלאסט, לכבות את נורת הלוגן ולפתוח את התריס על מנורת פלורסנט.
- בחר את מסנן CY3 / TRITC להגדיר להדמיה של חלבון pporRFP שהביע פרוטופלאסט המהונדס.
- סרוק היטב כל כדי לקבוע את מספר פרוטופלאסט להביע pporRFP סמן ניאון.
- חשב את יעילות השינוי כמספר הכולל של פרוטופלאסט המבטא את בסמן פלורסנטי המספר הכולל של פרוטופלאסט.
- איסוף כל צלחות המכילות תאים מהונדסים בשקיות בטיחות ביולוגיות שאושרו מעוקר או נהלי דה-חִיוּן נוספים שנקבעו פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים ".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר הנוכחי, שיעור ההכפלה של BY-2 נע בין 14-18 שעות תלויות בטמפרטורה שבה התרבויות הודגרו, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים של אורך מחזור התא ממוצע של 15 שעות. עם שיעור הכפלה זו, ביחס של 1: בידוד החל 100 שמש ליזום תרבויות, מה שמוביל תרבויות עם נפח תא ארוז (PCV) של 50% ב 5-7 ימים. בפרוטוקול הנוכחי, שבו תרבויות גדלו ב -200 מ"ל של התקשורת, PCV של 100 מ"ל נוצר ב -7 ימים, אשר סיפקה מספיק תאים כדי למלא 33 6 צלחות היטב. במונחי תשואה פרוטופלאסט, עיכול על התנאים המפורטים בפרוטוקול שנוצר 4.70 x 10 5 ± 5.77 x 10 3 פרוטופלאסט לכל טוב, וכתוצאה מכך 2.82 x 10 6 פרוטופלאסט לכל צלחת 6-היטב (איור 2 א). על סמך נתונים אלה, 214 96-גם צלחות (70 μl של פרוטופלאסט לכל טוב) ניתן לטעון מתוך עיכול 6-גם צלחת אחת, עם הפוטנציאל FOr שתי 6-גם צלחות להתעכל זמנית, ומשתמשים בשתי התחנות מחממות צלחת / ילר. כך, המספר המרבי של פרוטופלאסט שיכולים להיווצר במהלך פרוטוקול העיכול של שלוש שעות אחת הוא 5.64 x 10 6.
בעוד המספר הכולל של פרוטופלאסט שנוצר לכל פרוטוקול עיכול מספק ערך אחד עבור המערכת, היא גם צורך להעריך את האובדן בריכוז פרוטופלאסט כמו פרוטופלאסט מועבר דרך השלבים השונים של הפרוטוקול. ככזה, ריכוז פרוטופלאסט הוערך לאחר כל שלב העברה בפרוטוקול. לאחר פרוטוקול העיכול, 1.15 x 10 4 ± 1.35 x 10 2 פרוטופלאסט הועברו כל טוב של 96 צלחות עמוקות היטב, באופן מדמה את פרוטוקול טרנספורמציה, או צלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב (איור 2 ב). לאחר פרוטוקול הטרנספורמציה הושלמה, 1.23 x 10 3 ± 4.66 x10 1 פרוטופלאסט הועבר צלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב (איור 2 ג). בנוסף למספר פרוטופלאסט העביר, היה חשוב לקבוע את הכדאיות של פרוטופלאסט על מנת להבטיח כי בשלבי pipetting מספר לא פגעו פרוטופלאסט.
בהתבסס על התוצאות של assay הכדאית, 95.1 ± 0.04% פרוטופלאסט היו קיימא לאחר עיכול, 92.1 ± 0.06% לאחר העברה לצלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב, 91.7 ± 16.67% לאחר פרוטוקול טרנספורמציה. למרות צעדי pipetting מרובים, לא היה הבדל מובהק (p> 0.44) בין כל הדגימות. בנוסף מדד זה של כדאיות, פרוטוקול פותח לקביעת הריכוז של פרוטופלאסט בכל שלב של ההליך על ידי מדידה את המספר הכולל של פרוטופלאסט מוכתם PI. כפי שניתן לראות בתרשים 3, עקומת סטנדרט היה generatאד על ידי מדידת עוצמת הקרינה עבור ריכוזים ידועים של פרוטופלאסט מהמערכת. עקומת התקן הייתה בכושר טוב (R 2 = 0.967) עם המספר הכולל של פרוטופלאסט פורש בטווח שבין 0 ל -30,000 פרוטופלאסט לכל טוב. כדי לאמת את עקומת סטנדרט, את עוצמת הקרינה של דגימות עם מספר ידוע של פרוטופלאסט (8125 ו 24,375 מחושב באמצעות hemocytometer) הושג ומספר פרוטופלאסט מחושב מן המשוואה של עקומת סטנדרט. בהתבסס על תוצאות אלו, עקומת סטנדרט ניבא 9560 ו 28,200 פרוטופלאסט בכל טוב, טעות 15 ו -14%. בהתחשב בכך גם ישן שונה במדידה את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer, שגיאה זו נחשבת קבילה.
בנוסף לתוצאות של מספר התא הכדאי, פרוטוקול השינוי היה מוצלח ליצירת תאים מהונדסים מבטאי OFP (איור 2 ד - F). למרבה צער הפרוטוקול המשמש הביא נמוך, ~ 2%, יעילות שינוי, בשל פלסמיד בינארי 16,028 נ"ב הגדול המשמש במחקר זה ומאחר הפרוטוקול לא היה מותאם במיוחד עבור BY-2 פרוטופלאסט. אופטימיזציה של פרוטוקול טרנספורמציה, במונחים של ריאגנטים ותנאים במיוחד עבור BY-2 פרוטופלאסט, צפויה להגדיל את יעילות השינוי, כפי שהובהרה בדיון. במונחים של פרוטוקול זה, הליך השינוי נועד להדגים את נתיב ההוכחה של קונספט מבידוד פרוטופלאסט לטרנספורמציה ועבר בהצלחה בהשגת מטרה זו.
לאחר אימות כל הליכי הפרט בהצלחה, מדדים התקבלו עבור timecourse של פרוטוקול מהבידוד פרוטופלאסט לטרנספורמציה. כפי שניתן לראות באיור 4, עיקר ההשקעה של הזמן הוא בילה בשלב העיכול, שבו 3 שעות נדרשו FOr עיכול מלא של דופן התא ולשחרור של פרוטופלאסט. במהלך הליך זה, 18 לולאות מנוהלות בין תחנת דגירת הדוד שייקר צלחת צלחת / ילר 1, עם מניע צלחת הזזת הצלחת בין שתי התחנות. זמן הנסיעה בין שייקר צלחת מחמם צלחת / ילר 1 לוקח רק 8.9 שניות, ומבטיח כי הרוב המכריע של הליך העיכול הוא בילה דוגרים ורועדים. הזמן הכולל מתחילת ההליך כדי להשלים את הטעינה של האנזימים על ידי מנפק המצב המרובה הוא 2.2 דקות. באופן כללי, פרוטוקול בידוד פרוטופלאסט המלא יושלם בתוך 3 שעות ו 22.8 דקות. בהתבסס על תוצאות אלו, 88% של פרוטוקול בידוד פרוטופלאסט הוא בילה לעכל. לאחר השלמת פרוטוקול בידוד פרוטופלאסט, פרוטוקול השינוי הוא יזם, והשלים בתוך 27.5 דקות. בדומה פרוטוקול בידוד פרוטופלאסט, 72% של הליך השינוי הוא בילה דוגרי התגובה. הצעד הנוסף היחיד בפרוטוקוליש שרכיב זמן משמעותי (> 10% מזמן ההליך הכולל) הוא אתחול של הפרוטוקול על ידי פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, המהווה 14% מהזמן הכולל בהליך. בדרך זו, 86% של הפרוטוקול הוא בילה אתחול ו דגירה, עם רק 14% מהזמן בילה על צעדי pipetting והעביר. המשך השלם של בידוד פרוטופלאסט וטרנספורמציה היה 3 שעות, 50 דקות ו -53 שניות, ללא קלט חיצוני נדרש מהמפעיל.
איור 1:. סכמטי של הפלטפורמה רובוטית ותצורה של פלטפורמת טיפול נוזל האוטומטית במהלך הפרוטוקול (א) מערכת רובוטית מורכבת מ 3 ערימות צלחת / מלונות שניתן לגשת על ידי מניע הצלחת. Hotel 1 היא תחנת lidding / delidding המיועד, Hotel 2 הוא פלורסנט 96-היטבצלחת ערימה ולאחר Hotel 3 היא ערימת 6-גם הצלחת. המערכת כוללת שני מטפלים נוזליים, פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, מנפק מצב מרובה מבוסס זרבובית. לחימום / קירור פלטפורמה רובוטית יש שתי יחידות חימום צלחת / מצמרר, יחד עם צלחת שייקר לערבוב הצלחת. לבסוף, המערכת כוללת קורא צלחת מבוסס monochromator למדידת קרינה. כל הרכיבים הם שוכנו בתוך ארון בטיחות ביולוגית שהותקן. (ב) החל תצורה של פלטפורמת טיפול נוזל האוטומטית עם קן 2 שנכבש על ידי צלחת המגיב ותיבת טיפ דגש על קן 8. (ג) תצורה של פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית לפני פניות פרוטוקול ניסוי. צלחת עמוקה היטב ממוקמת על קן 4, צלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב ממוקמת על קן 6, ואת הצלחת 6-היטב המכילה פרוטופלאסט ממוקמת על קן 5. נא ללחוץ כאן נ iew גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תמונות נציג BY-2 פרוטופלאסט לאחר כל העברה ואחרי שינוי עם גן כתב חלבון פלואורסצנטי הכתום (A - C) micrographs של BY-2 צפיפות פרוטופלאסט בצלחת 6-היטב, 96-גם צלחת לאחר העברת 70. μl מצלחת 6-היטב, ו -96 היטב פלורסנט צלחת הקרנת טרנספורמציה פוסט. (ד) מיקרוסקופ Brightfield של BY-2 פרוטופלאסט לאחר השינוי. (E) פלורסנט BY-2 פרוטופלאסט לבטא את הגן OFP דמיינו באמצעות מערכת סינון Cy3 / TRITC. (F) כיסוי של brightfield ו micrographs ניאון הוכחת היעילות הנמוכה של טרנספורמציה. בר סולם = 50 מיקרומטר. Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. עקומת סטנדרט לחישוב מספר פרוטופלאסט מספר פרוטופלאסט ב באר נתונה יכול להיות מחושבת על ידי השוואת עוצמת הקרינה, ביחידות כלשהן (AU), למשוואה עבור העקומה הסטנדרטית. אימות של מספר פרוטופלאסט הושוותה בין העקומה הסטנדרטית hemocytometer בנקודה הצביעה על הגרף, עם 9561 פרוטופלאסט מזוהה מקורא הצלחת, ו 8125 לספור על hemocytometer. בסך הכל, שגיאה של 15% נמצאת בין שתי הטכניקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מחדש 4 "src =" / files / ftp_upload / 54,300 / 54300fig4.jpg "/>
איור 4:. תרשים גנט עבור ההליך המתואר לייצור BY-2 פרוטופלאסט וטרנספורמציה גנטי רוב הפרוטוקול, ~ 3 שעות, הוא בילה על עיכול של תאי-2 BY כדי ליצור את פרוטופלאסט. טוען של פתרון איון האנזים דורש רק 12% מזמן ההליך הכולל. באופן דומה, דגירה של התגובה טרנספורמציה על הצלחת שייקרה חשבונות עבור 72% של פרוטוקול טרנספורמציה. בסך הכל, הנוהל מבידוד פרוטופלאסט עד שינוי גנטי מושג נמצא תחת 4 שעות (3 שעות, 50 דקות ו -53 שניות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קובץ משלימה: פרוטוקולים אוטומטיים לבידוד פרוטופלאסט, ספירת תאים, וטרנספורמציה בתיווך PEG <./ strong> פרוטוקולים שלמים שפותחו לשימוש פלטפורמה רובוטית להשיג כל אחת מהמשימות המפורטות לעיל כלולים בקובץ זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר לעיל יאומת בהצלחה לבידוד פרוטופלאסט, ספירה, וטרנספורמציה באמצעות תרבית תאי השעית טבק BY-2; עם זאת, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מורחב על כל תרבות השעית צמח. נכון לעכשיו, בידוד וטרנספורמציה פרוטופלאסט הושגה בצמחים רבים, כולל תירס (Zea Mays) 10, גזר (Carota Daucus) 32, צפצפה (צפצפת הפרת) 33, ענבים (גפן היין) 34, שמן דקלים (guineensis Elaeis) 35 36, חסה (Sativa Lactuca), חרדל (juncea Brassica) 37, אורז (Sativa Oryza) 38, ועשבים (virgatum Panicum) 39,40. בעוד וריאציה של תנאי התרבות ועיכול להתרחש ממין למין, במונחים של הפרוטוקול שפותח בעבודה זו, החלפת תקשורת ותרבות או לשנות את התנאים של חפירהestion לא צריך לשנות את הפרוטוקול הבסיסי. כדי להסתגל מינים שונים, התקשורת בתרבות האנזימים הדרושים לעיכול נטענים על ידי המפעיל לפני אתחול של פרוטוקול, ובכך להחליף רכיבים אלה הוא טריוויאלי. כיתרון נוסף, הפרוטוקול הוא amendable כדי הקרנת תנאי עיכול מרובים עם התשואה של פרוטופלאסט נמדד על ידי המערכת. זהו מרכיב חיוני, כמו השימוש של אנזימים בעלות הנמוכה נחוץ עבור יישומים עתיר תפוקה, ולכן חשוב כדי לצמצם את כמות אנזימים המשמשים לעיכול.
בדומה תרבות ועיכול, שינויים בפרוטוקול שהתמורה לא להידרש בעת אימוץ מערכת לחידוש פרוטופלאסט מבודד מיני צמחים שונים. עבודה רבה נערך על אופטימיזציה של טרנספורמציה PEG בתיווך במפעל פרוטופלאסט 16,35, עם גורמים רבים המשפיעים על יעילות הטרנספורמציה. ב הנוכחי ווRK אחד הגורם המגביל המשפיעים על יעילות השינוי היה גודלו של פלסמיד מבחן בינארי, 16,028 BP, אשר שימש למטרות דוגמנות גודל הפלסמיד הגנום עריכה. במחקרים קודמים על שינוי PEG בתיווך של פרוטופלאסט BY-2, טרנספורמציה 40-60% הושגה; עם זאת, המחקרים הללו השתמשו קטנים 5,000 פלסמידים נ"ב 41,42. השינויים העיקריים לשינוי בתיווך PEG בין מינים כוללים ריכוז PEG ו MgCl 2, כמות וריכוז DNA, ומשך תגובה. כפי פתרונות 2 PEG ו MgCl מוכנסים למערכת על הצלחת המגיבה, ואת ה- DNA הוא טעון מראש לתוך הצלחת העמוקה היטב, תנאים אלו ניתן לשנות בקלות את הפרוטוקול מתואר לעיל. בנוסף, להגדיל או להקטין את זמן הדגירה, יחד עם שינוי של מהירויות ערבוב, ניתן לשלוט באופן מדויק על ידי פלטפורמה רובוטית. המגבלה הנוכחית של פרוטוקול טרנספורמציה היא החוסרמיון באמצעות קורא הצלחת כדי לזהות את כתב הניאון, בגלל היעילות הנמוכה של טרנספורמציה PEG בתיווך פרוטופלאסט BY-2. במינים אחרים, כגון ארבידופסיס thaliana ותירס 16, טרנספורמציה בתיווך PEG הוא 40-90% יעיל. במערכות כאלה transformants ניתן לאפיין במהירות באמצעות קורא צלחת על הרובוט. לפיכך, ניתן יהיה לזהות בארות עם transformants חיובית, וגם לכמת את רמת הביטוי. עבור יישומים, כגון הקרנת אמרגן, תכונה זו תגדיל את התועלת של הפרוטוקול הנוכחי, וכן תתווסף חזרות יותר של המערכת.
בנוסף אופטימיזציה של יעילות השינוי עבור BY-2 פרוטופלאסט, מספר שינויים עשויים להגביר את היעילות ואת התפוקה הכוללת של המערכת. מחקרים קודמים על אוטומציה של פרוטופלאסט מותר טרנספורמציה פרוטופלאסט כדי ליישב לתחתית של בארות, לפני התוספת של היהפתרונות h 43. בפרוטוקול הנוכחי, פרוטופלאסט עורבב על הצלחת שייקר למנוע שיקוע לשמור על פרוטופלאסט השעיה באמצעות צלחות גם תחתיות שטוחות. יתר על כן, במהלך שינוי, פרוטופלאסט לא הורשו להתיישב הצלחות העמוקות היטב, כדי להקטין את החשיפה PEG, אשר יכול להיות רעילה על חשיפה ממושכת. ככזה, פרוטופלאסט דולל ~ פי 10 עם פתרון W5 כאשר הם מועברים מהצלחת העמוקה היטב לצלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב, וכתוצאה מכך 1.23 x 10 3 ± 4.66 x 10 1 פרוטופלאסט לכל טוב. על מנת להגדיל את מספר פרוטופלאסט הועבר לאחר שינוי, צעד דגירה ניתן להוסיף לאפשר פרוטופלאסט להתיישב, ואת supernatant הוסר ואחריו תוספת של נפח קטן יותר של תקשורת BY-2 נוזלים. בנוסף, אם בצנטריפוגה מבוסס צלחת נוסף למערכת, שלב זה יכול להיות מושגת מהר יותר. שינוי נוסף שיכול להוסיף פונקציונליות ל- tהוא המערכת תהיה השימוש של assay קרינה חייה / מתה כדי לקבוע את הכדאיות של פרוטופלאסט המבודד לפני השינוי. בפרוטוקול הנוכחי, diacetate והעמסה (FDA) נבדקה כמו צבע חי; עם זאת, קרינת רקע פרוטופלאסט BY-2 טשטשה את אות ה- FDA. אם צבע כדאיות יציב יותר שמש, אז כדאיות פרוטופלאסט ניתן לקבוע כיחס אדום (PI) לירוק (Calcein AM, וכו ') קרינה, וסטנדרטי דומה פרוטוקול ספירת תאים. שינויים אלה היו להוסיף פונקציונליות נוספת למערכת, ו ייכללו פרוטוקולים בעתיד.
באשר הפרוטוקול הנוכחי, ישנם מספר שלבים קריטיים שיש אחריו כדי להבטיח את הצלחת של הפרוטוקול. ראשית, גיל / בריאות של תרבויות BY-2 הוא חיוני כדי להבטיח כי פרוטופלאסט קיימא יכול להיות מבודד על הצעדים הבאים. כמוסבר בשלב 1.3, על ידי העברת תרבות שלב יומן בבקבוק טרי בכליחס 1:50 של תאי תקשורת טריה, ומאפשר התרבות לגדול במשך 5-7 ימים, המספר המרבי של פרוטופלאסט קיימא יכול להיות מבודד. התיר התרבויות לגדול במשך תקופות ארוכות או קצרות באמצעות הבידוד המצוין יפחית את התשואה פרוטופלאסט משמעותי, לגרום לכשל של הפרוטוקולים הבאים. שלב קריטי שני הוא שלב 1.5, שכן השימוש של טיפי pipet רגילים, במקום טיפי pipet הרחב הנישאים שצוינו, יגרום טיפים כדי לסתום ולהוביל הכרכים השגויים המועברים. לגבי ההתקנה של מערכת רובוטית, ההסדר של הצלחות על פלטפורמת טיפול הנוזל אוטומטית, צעד 2.4, הוא קריטי, עם התקנה שונה מניעת ראש המטפל הנוזל מלהגיע כל הבארות על צלחת 6 באר. בשל העיצוב של פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, צלחת 6-גם יש להציב קן 5, או פרוטוקולים שנבחרו עבור מכשיר זה ייכשלו. בדומה לכך, הכישלון להגדיר את מעבדתי כראוי בצלחתהתוכנה Mover, שלב 2.2, יגרום המכשיר להיכשל לתפוס, או טיפה את מעבדתי וכתוצאה מכך הפסקת בפרוטוקול. בשביל הפרוטוקול ספירת תאים, השלב הקריטי כרוך קיבעון של תאים עם אתנול, בשלב 3.2. אם התאים אינם קבועים לפני תיוג עם PI, תאים nonviable רק יתויגו, במקום כלל אוכלוסיית פרוטופלאסט, וזה לא יהיה אפשר לספור את מספר פרוטופלאסט מבודד. השלב הקריטי האחרון, השלב 4.6, עוסק בבחירת הנושאים מסנן ניאון ניתוח מיקרוסקופי של הביטוי של סמן פלואורסצנטי pporRFP. שימוש סינונים "אדומים" אחרים מאפשר קרינת רקע מ כלורופיל, להגדיל באופן משמעותי את האות בכל פרוטופלאסט המכיל הכלורופלסט, מניעת חישוב היעיל השינוי. בזהירות דבקות מפרטים ב שלבים קריטיים אלה מבטיח את ההזדמנות הגדולה ביותר להצלחה דור datas לשחזור ביותרet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
