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Genetics

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

doi: 10.3791/54300 Published: September 27, 2016

Summary

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Abstract

Negli ultimi dieci anni c'è stata una recrudescenza nell'uso dei protoplasti vegetali che vanno da specie modello per ritagliare le specie, per l'analisi di trasduzione del segnale, reti di regolazione trascrizionale, l'espressione genica, del genoma-editing, e Gene-silenziamento. Inoltre, sono stati compiuti progressi significativi nella rigenerazione di piante da protoplasti, che ha generato ancor più interesse per l'uso di tali sistemi per genomica vegetale. In questo lavoro, un protocollo è stato sviluppato per l'automazione di isolamento protoplasti e trasformazione da 2 (BY-2) coltura in sospensione tabacco un 'giallo brillante' utilizzando una piattaforma robotica. Le procedure di trasformazione sono stati convalidati usando un gene reporter proteina fluorescente arancione (OFP) (pporRFP) sotto il controllo del promotore cavolfiore mosaic virus 35S (35S). espressione OFP in protoplasti stata confermata mediante microscopia in epifluorescenza. Le analisi inclusi anche i metodi di efficienza di produzione di protoplasti utilizzando propidium ioduro. Infine, a basso costo enzimi per alimenti sono stati utilizzati per la procedura di isolamento di protoplasti, eludendo la necessità di enzimi di laboratorio di grado che sono un costo proibitivo in high-throughput automatizzato isolamento di protoplasti e di analisi. Basato sul protocollo sviluppato in questo lavoro, la procedura completa dall'isolamento protoplasti di trasformazione può essere effettuata in meno di 4 ore, senza alcun intervento da parte dell'operatore. Mentre il protocollo sviluppato in questo lavoro è stato convalidato con la coltura cellulare BY-2, le procedure ei metodi dovrebbero essere traducibile a qualsiasi / sistema di coltura in sospensione di protoplasti impianto, che dovrebbe consentire l'accelerazione della ricerca genomica nel grano.

Introduction

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Negli ultimi anni vi è stato significativo impulso posto sulla progettazione delle colture transgeniche per superare le varie malattie 1, dotare resistenza agli erbicidi 2, conferiscono alla siccità e 3,4 tolleranza al sale 5, prevenire erbivori 6, aumento della biomassa resa 7, e diminuire recalcitrance parete cellulare 8. Questa tendenza è stata aiutata dallo sviluppo di nuovi strumenti molecolari per la generazione di piante transgeniche, tra cui genoma di modifica utilizzando CRISPR e Talens 9, e silenziamento genico attraverso dsRNA 10, miRNA 11, e siRNA 12. Mentre queste tecnologie hanno semplificato la generazione di piante transgeniche, hanno anche creato un collo di bottiglia, dove il gran numero di piante transgeniche generate non possono essere sottoposti a screening con sistemi tradizionali che si basano sulla rigenerazione delle piante. In relazione a questo collo di bottiglia, mentre il silenziamento e del genoma di modifica costrutti possono essere rapidamente inseriti nelle piante, molte delletratti mirati riescono a produrre l'effetto desiderato, che spesso non è scoperto fino piante sono analizzati nella serra. In questo lavoro, abbiamo messo a punto un metodo per la rapida automatizzato, lo screening, high-throughput di protoplasti vegetali, in particolare per affrontare il collo di bottiglia attuale screening precoce di un gran numero di genoma-editing e silenziamento genico obiettivi.

L'uso di protoplasti, al contrario di cellule vegetali intatte, ha diversi vantaggi per lo sviluppo di una piattaforma automatizzata. Innanzitutto, protoplasti sono isolati dopo la digestione della parete cellulare, e questo non è più presente barriera, efficienza di trasformazione è aumentato 13. In cellule vegetali intatte ci sono solo due metodi consolidati per la trasformazione, biolistics 14 e Agrobacterium mediata trasformazione 15. Nessuno di questi metodi può essere facilmente tradotto per piattaforme gestione di liquidi, come biolistics richiede attrezzature specializzate per Transformazioni, mentre Agrobacterium trasformazione mediata richiede co-cultura e la successiva rimozione dei batteri. Né sono suscettibili di metodi di high throughput. Nel caso di protoplasti, trasformazione viene normalmente condotta utilizzando polietilene glicole (PEG) trasfezione mediata 16, che richiede solo alcuni scambi soluzione, ed è particolarmente adatto per le piattaforme gestione dei liquidi. In secondo luogo, protoplasti, per definizione, sono culture monocellulari e quindi i problemi associati con formazione di grumi e catena di formazione in colture cellulari vegetali, non sono osservati in protoplasti. In termini di screening rapido utilizzando uno spettrofotometro piatto a base di aggregazione delle cellule, o cellule in piani multipli porterà a difficoltà di acquisire misurazioni coerenti. Poiché protoplasti sono anche più densa loro terreni di coltura, essi sedimentare sul fondo dei pozzetti, formando un monostrato, che è favorevole per spettrofotometria piastra base. Infine, mentre colture in sospensione di cellule vegetali sono Primarily derivati da callo 17, protoplasti possono essere raccolte da un certo numero di tessuti vegetali, portando alla capacità di identificare l'espressione tessuto-specifica. Ad esempio, la capacità di analizzare root- o-specifico espressione foglia di un gene può essere molto importante fenotipo previsione. Per queste ragioni, i protocolli sviluppati in questo lavoro sono stati convalidati usando protoplasti isolati dal tabacco diffuso (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) cultura sospensione.

La coltura in sospensione BY-2 è stato descritto come la cella "HeLa" di piante superiori, grazie al suo uso diffuso in analisi molecolare di cellule vegetali 18. Recentemente, BY-2 le cellule sono state usate per studiare gli effetti delle piante di stress 19-22, la localizzazione della proteina intracellulare 23,24, e biologia cellulare di base 25-27 dimostrare l'ampio programma di utilità di queste culture in biologia vegetale. Un ulteriore vantaggio di BY-2 culture è ilpossibilità di sincronizzare le culture con afidicolina, che può portare ad una maggiore riproducibilità per l'espressione genica studia 28. Inoltre, sono stati sviluppati metodi per l'estrazione di BY-2 protoplasti utilizzando enzimi basso costo 29,30, come enzimi tradizionalmente utilizzati per generare protoplasti sono costi proibitivi per i sistemi ad elevata capacità. Come tale, il protocollo descritto di seguito è stato convalidato utilizzando la coltura in sospensione BY-2, ma dovrebbe essere modificabile a qualsiasi coltura in sospensione delle cellule vegetali. Proof-of-concept esperimenti vengono eseguiti utilizzando un arancio proteina a fluorescenza (OFP) gene reporter (pporRFP) dalle Porites di corallo duro Porites 31 sotto il controllo del promotore CaMV 35S.

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Protocol

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1. Istituzione di sospensione culture cellulari

  1. Preparare liquido BY-2 supporti aggiungendo 4,43 g Linsmaier & Skoog supporti basali, 30 g di saccarosio, 200 mg KH 2 PO 4, e 200 mg di 2,4-diclorofenossiacetico acido (2,4-D) a 900 ml di acqua distillata l'acqua e il pH a 5,8 con 0,1 M KOH. Dopo la regolazione del pH, regolare il volume finale a 1000 ml con acqua distillata e autoclave. I supporti possono essere memorizzati fino a 2 settimane a 4 ° C.
  2. Seminare un pallone da 250 ml Erlenmeyer con 100 ml di liquido BY-2 media e un pezzo unico di BY-2 callo (> 1 cm di diametro) coltivati ​​in solidi supporti BY-2 (liquido BY-2 supporti con l'aggiunta di 1% agar) e sigillare con un foglio di alluminio. Incubare cultura a 28-30 ° C con agitazione per 5 giorni.
    NOTA: BY-2 callo è mantenuto sul solido supporto per l'archiviazione a lungo termine, come colture liquide saranno rapidamente invadere. volume di cultura può essere regolata se necessario, tipicamente una cultura 100 ml sarà in grado di caricare trentatré 6-wPiastre ELL.
  3. Trasferimento 2 ml di fase registro BY-2 cultura a 98 ml di fresca media da parte-2 e incubare per 5-7 giorni a 28-30 ° C con agitazione.
    NOTA: Sub-coltura delle colture liquide stabiliti può essere effettuata regolarmente con 1: 100 diluizioni di vecchie culture 5-7 giorno, piuttosto che l'inoculazione con callo.
  4. Mescolare accuratamente la cultura, le cellule saranno rapidamente stabilirsi, e il trasferimento di 6 ml di coltura cellulare in una provetta da fondo centrifuga 15 ml conica e lasciare che le cellule riposare per almeno 10 minuti. Regolare l'ematocrito al 50% del volume totale rimuovendo surnatante.
  5. Agitare il tubo invertendo e pipetta 500 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti per la digestione. Utilizzare pipette ampio tunnel per trasferire le cellule in questa fase, in quanto sono densi e intasare puntali standard.

2. Isolamento Protoplast

  1. Accendere tutti i componenti del sistema robotico (Figura 1A) e aprire l'attività targa motore pianificazione morbidoware. Il programma di pianificazione delle attività integra il motore micropiastra con le altre apparecchiature per consentire il trasferimento di piastre tra ogni pezzo di equipaggiamento.
  2. Prima di sperimentazione, di definire le specifiche tecniche per mediche di laboratorio (ad esempio, piatti, coperchi) utilizzati nel protocollo, così come posizioni di inizio e fine per ogni pezzo di articoli da laboratorio, nel software piastra di motore, come segue:
    1. Fare clic su Imposta dalla barra degli strumenti principale del software piastra di motore e selezionare il comando Gestisci tipi di container.
    2. Se il tipo di contenitore è elencato nella libreria dei tipi contenitore esistente, quindi selezionare il contenitore appropriato.
    3. Se il tipo di contenitore non è elencato nella libreria dei tipi contenitore esistente quindi fare clic su Aggiungi per specificare un nuovo tipo di contenitore.
    4. Dopo aver aggiunto un nuovo tipo di contenitore, inserire le dimensioni del nuovo contenitore (altezza, larghezza, dimensioni accatastamento, e di presa di offset) nelle schede appropriate e fare clic su Salva.
      1. Se le dimensioni corrette non sono disponibili presso il produttore, quindi determinare con precisione tutte le dimensioni al millimetro con le pinze. Gli errori nella misurazione delle dimensioni del contenitore si tradurrà in un fallimento del motore piatto.
    5. Ripetere i passaggi 2.2.2 attraverso 2.2.4.1 per tutti i tipi di contenitori che il motore piatto incontrerà. Dopo il completamento di questa fase per tutti da laboratorio, è necessario definire l'inizio e la posizione di fine per ciascun contenitore (fase 2.2.6).
      NOTA: per questo protocollo il labware comprende la 6-pozzetti, il piatto profondo bene, e la piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti.
    6. Per definire la posizione di inizio e la fine di ogni contenitore, fare clic sulla scheda Start / End in un protocollo specifico. In primo luogo, selezionare la posizione di partenza di ogni contenitore. Avanti, selezionare la casella per Lidded / Unlidded sia l'inizio e la posizione finale. Ripetere l'operazione per tutti i contenitori.
      NOTA: Se il contenitore sarà lasciato su un altro pezzo di equipment (al posto del motore piatto) la posizione finale può essere lasciato vuoto.
  3. In questa fase caricare manualmente tutte le piastre nella posizione di partenza per l'intero flusso di lavoro. Caricare le piastre di screening fluorescenti-ben 96 in hotel 2, 6 pozzetti con by-2 cellule in hotel 3, una piastra 96 ​​profondo bene che verrà utilizzato per la trasformazione sul riscaldamento piatto / chiller nido 2, ed una conica da 50 ml provetta contenente la soluzione enzimatica (vedi file supplementare, sezione 1.2.2) al dispenser multi-mode.
    1. Se trasformazione sarà effettuata nel protocollo, pre-caricare la piastra profondo bene 96 con 10 ml di DNA plasmidico per pozzo (1 mg / mL, A 260/280> 1.8) contenente il reporter costrutto OFP e incubare sul piatto riscaldamento / raffreddamento a 4 ° C. Ogni pozzetto sarà utilizzato per una singola trasformazione, quindi il numero di pozzetti riempiti dipenderà dalla configurazione sperimentale.
  4. Caricare tutte le forniture e le piastre sul automatizzared piattaforma di gestione dei liquidi nei luoghi designati e definire la posizione di ogni elemento del software di controllo di automazione (Figura 1B).
    1. Caricare una piastra a 96 pozzetti precaricato con 200 ml di 40% PEG in MMg (0,4 M mannitolo, 100 mM MgCl 2, 4 MM MES, pH 5.7) nella colonna 1, 200 ml di ioduro di propidio (PI, 1 mg / ml) nella colonna 2, e 200 ml di etanolo nella colonna 3 (nido 2), e una scatola di punte della pipetta in nido 8.
    2. Per definire la posizione del labware nel software della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, selezionare Strumenti dal menu e fare clic mediche di laboratorio Editor.
    3. Selezionare il tipo di materiale da laboratorio dal menu a tendina o definire un nuovo tipo di materiale da laboratorio utilizzando il pulsante Nuovo mediche di laboratorio.
    4. Definire la posizione di ogni pezzo di labware selezionato selezionando la scheda protocollo principale e facendo clic su Configura mediche di laboratorio. Assicurarsi che ogni pezzo di labware posto sulla piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato èdefinito prima di eseguire il protocollo.
    5. Per attivare i protocolli automatici, fare clic sulla finestra di Explorer profilo e selezionare il nome del protocollo da eseguire (Isolamento Protoplast, Cell Count, e trasformazione PEG-mediata).
    6. Fare clic su Esegui per inizializzare tutti i dispositivi che verranno utilizzati nel protocollo.
    7. Infine, nella finestra di lavoro Explorer, fare clic su Aggiungi unità di lavoro per verificare tutti i contenitori / labware nel sistema e iniziare il protocollo automatizzato.
      NOTA: le descrizioni complete dei protocolli automatizzati sono contenuti nel file supplementare.

3. Stabilire curva standard per conteggio delle cellule

  1. Concentrarsi manualmente protoplasti ad una concentrazione di 1 x 10 6 protoplasti / ml in un volume di 1 ml. Centrifuga protoplasti a 1.000 xg per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
  2. Aggiungere manualmente 900 ml di etanolo al 70% (mantenuto a 4 ° C) al pellet protoplastie risospendere il pellet. Incubare per 10 minuti in ghiaccio per riparare le cellule.
  3. Aggiungere 100 ml di PI (1 mg / ml) per i protoplasti di etichettare i nuclei e consentire il rilevamento da parte del lettore di piastre.
  4. Carico 80 ml di liquido BY-2 supporti in ogni colonna e riga della piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti a partire da colonna 2.
  5. Nella colonna 1 di una piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti, aggiungere 70 ml di protoplasti e 50 ml BY-2 media per ciascun bene nella colonna.
  6. Porre la piastra in nido 6 della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, ed eseguire una diluizione seriale a 2 volte.
    1. Per condurre una diluizione di serie sulla piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, fare clic su Avvia procedura guidata diluizione seriale e regolare il volume di trasferimento (60 ml), numero di miscele e di volume (2, 70 ml), pozzi iniziali (colonna 1, righe AF), la diluizione Wells (Colonne 2-11, righe AF), e aspirare e dispensare proprietà (0,5 mm dalla ben inferiore).
    2. Dopo aver impostato i parametri, salvare und eseguire il protocollo.
      NOTA: Dal momento che tutti i protoplasti sono etichettati con PI (a causa della fissazione delle cellule), la fluorescenza è proporzionale alla concentrazione protoplasti.
    3. Dopo la diluizione di serie è completata, rimuovere la piastra dal nido 9 e inserire nel lettore di piastre ed eseguire il protocollo curva standard nel software lettore di piastre.
      NOTA: Una curva standard verrà generato confrontando la fluorescenza da PI (eccitazione 536 nm / emissione 620 nm) in ciascun pozzetto con la concentrazione protoplasti noto.
  7. Al termine del protocollo lettore di piastre, rimuovere la piastra e raccogliere eventuali cellule transgeniche per la sterilizzazione in autoclave o altre procedure di de-vitalizzazione come definite nei protocolli di biosicurezza '.

4. Analisi microscopica di Trasformazione

  1. Rimuovere la piastra con protoplasti trasformati (il prodotto di Automated protocollo 3, File supplementare) dall'Hotel 1 del sistema robotico.
  2. Giroil microscopio invertito, la macchina fotografica, e lampada fluorescente.
  3. Selezionare l'obiettivo 10X per iniziale concentrandosi sui protoplasti, accendere la lampada alogena, e chiudere l'otturatore per la lampada fluorescente.
  4. Piatto di carico sul sistema microscopico e focus sulle protoplasti con campo chiaro.
  5. Dopo concentrandosi su protoplasti, spegnere la lampada alogena e aprire l'otturatore per la lampada fluorescente.
  6. Selezionare il filtro CY3 / TRITC set per la visualizzazione della proteina pporRFP espressa dai protoplasti transgenici.
  7. La scansione di ogni bene per determinare il numero di protoplasti esprimere il marcatore pporRFP fluorescente.
  8. Calcolare l'efficienza di trasformazione come il numero totale di protoplasti esprimere il marcatore fluorescente il numero totale di protoplasti.
  9. Raccogliere tutte le piastre contenenti cellule transgeniche in sacchetti di biosicurezza approvati per la sterilizzazione in autoclave o altre procedure di de-vitalizzazione come definite nei protocolli di biosicurezza '.

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Representative Results

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In questo studio, il tasso di raddoppio BY-2 varia dai 14-18 hr dipendente dalla temperatura alla quale sono stati incubati le culture, coerente con le precedenti relazioni di media durata del ciclo cellulare delle 15 ore. Con questo tasso raddoppio, 1: 100 inoculo di partenza è stato usato per iniziare culture, portando a culture con un volume imballato cellulare (PCV) del 50% in 5-7 giorni. Nel protocollo attuale, in cui le culture sono state coltivate in 200 ml di mezzi di comunicazione, un PCV di 100 ml è stata generata in 7 giorni, che ha fornito abbastanza cellule per riempire 33 6 pozzetti. In termini di resa di protoplasti, digestione alle condizioni specificate nel protocollo ha generato 4,70 x 10 5 ± 5,77 x 10 3 protoplasti per pozzetto, con conseguente 2,82 x 10 6 protoplasti per 6 pozzetti (Figura 2A). Sulla base di questi dati, 214 piastre a 96 pozzetti (70 microlitri di protoplasti per pozzetto) potrebbero essere caricati da un unico digestione 6-pozzetti, con il potenziale for due 6 pozzetti per essere digerito contemporaneamente, utilizzando le stazioni di due riscaldatore piatto / refrigeratore. Così, il numero massimo di protoplasti che possono essere generati durante un unico protocollo digestione tre ore è 5,64 x 10 6.

Mentre il numero totale di protoplasti generati da protocollo digestione fornisce una metrica per il sistema, è necessario valutare la perdita di concentrazione protoplasti i protoplasti sono trasferiti attraverso le diverse fasi del protocollo. Come tale, la concentrazione di protoplasti è stata valutata dopo ogni fase di trasferimento nel protocollo. Dopo il protocollo di digestione, 1,15 x 10 4 ± 1,35 x 10 2 protoplasti sono stati trasferiti in ciascun pozzetto di piastre da 96 pozzetti profondi, se conducendo il protocollo di trasformazione, o piastra di screening a 96 pozzetti fluorescente (Figura 2B). Una volta che il protocollo di trasformazione è stato completato, 1,23 x 10 3 ± 4.66 x10 1 protoplasti sono stati trasferiti alla piastra di screening fluorescente 96 pozzetti (Figura 2C). Oltre al numero di protoplasti trasferiti, era importante per determinare la vitalità dei protoplasti di garantire che più fasi di pipettaggio non danneggiare i protoplasti.

Sulla base dei risultati del test di vitalità, 95,1 ± 0,04% di protoplasti sono stati vitali dopo la digestione, 92,1 ± 0,06% dopo il trasferimento alla piastra di screening 96 pozzetti fluorescenti, e 91,7 ± 16,67% dopo il protocollo di trasformazione. Nonostante più passaggi di pipettamento, non vi era alcuna differenza significativa (p> 0,44) tra uno qualsiasi dei campioni. Oltre a questa misura della redditività, un protocollo è stato sviluppato per determinare la concentrazione di protoplasti in qualsiasi fase del procedimento misurando il numero totale di protoplasti colorati con PI. Come mostrato in figura 3, una curva standard era generatcato misurando l'intensità di fluorescenza per concentrazioni note di protoplasti dal sistema. La curva standard era una buona forma (R 2 = 0,967) con il numero totale di protoplasti abbracciano il campo da 0 a 30.000 protoplasti per pozzetto. Per convalidare la curva standard, l'intensità di fluorescenza di campioni con un numero noto di protoplasti (8.125 e 24.375 calcolato utilizzando un emocitometro) è stato ottenuto e il numero di protoplasti calcolata mediante l'equazione della curva standard. Sulla base di questi risultati, la curva standard previsto 9.560 e 28.200 protoplasti in ogni pozzetto, un errore di 15 e 14%. Considerando che c'è anche variabilità misurando il numero di cellule con un emocitometro, questo errore è ritenuto accettabile.

In aggiunta ai risultati del numero e la vitalità cellulare, il protocollo trasformazione ha avuto successo nel generare cellule transgeniche che esprimono OFP (Figura 2D - F). Purtroppo il protocollo utilizzato portato basso, ~ 2%, efficienza di trasformazione, a causa della grande 16.028 bp plasmide binario usato in questo studio e poiché il protocollo non è stato ottimizzato specificamente per BY-2 protoplasti. L'ottimizzazione del protocollo di trasformazione, in termini di reagenti e condizioni appositamente per BY-2 protoplasti, si prevede di aumentare l'efficienza di trasformazione, come chiarito nella discussione. In termini di questo protocollo, la procedura di trasformazione è stato progettato per dimostrare il percorso di proof-of-concept dall'isolamento protoplasti alla trasformazione, e ha avuto successo nel raggiungimento di questo obiettivo.

Dopo la convalida con successo tutte le singole procedure, metriche sono stati ottenuti per la timecourse del protocollo dall'isolamento protoplasti alla trasformazione. Come mostrato nella Figura 4, il maggiore investimento di tempo è trascorso durante la fase di digestione, in cui è stato richiesto 3 ore for completa digestione della parete cellulare e il rilascio dei protoplasti. Durante questa procedura, 18 cicli vengono eseguiti tra la piastra shaker e piastra riscaldante / raffreddatore 1 stazione incubazione, con il motore piastra di movimento della lamiera tra le due stazioni. Il tempo di trasferimento tra l'agitatore e di riscaldamento piatto / chiller 1 prende solo 8.9 secondi, e assicura che la maggior parte della procedura di digestione viene speso incubando e agitazione. Il tempo totale tra l'inizio della procedura di completare il caricamento degli enzimi dall'erogatore multi-mode è 2.2 min. Nel complesso, il completo protocollo di isolamento di protoplasti si completa in 3 ore e 22,8 min. Sulla base di questi risultati, l'88% del protocollo di isolamento protoplasti viene speso digerire. Dopo il completamento del protocollo di isolamento di protoplasti, viene avviato il protocollo di trasformazione, e completata entro 27.5 min. Simile al protocollo di isolamento di protoplasti, 72% del procedimento trasformazione viene speso incubando la reazione. L'unico altro passo nel protocolloche ha una componente significativa di tempo (> 10% del tempo totale della procedura) è di inizializzazione del protocollo dalla piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, che rappresenta il 14% del tempo totale della procedura. In questo modo, l'86% del protocollo è trascorso in inizializzazione e l'incubazione, con solo il 14% del tempo speso per pipettaggio e di trasferimento passi. La durata completa di isolamento protoplasti e trasformazione era 3 ore, 50 min e 53 sec, con nessun input esterno richiesto dall'operatore.

Figura 1
Figura 1:. Schematica della piattaforma robotica e configurazione della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato durante il protocollo (A) Il sistema robotizzato è composto da 3 pile piastra / strutture accessibili dal motore piatto. Hotel 1 è la stazione lidding / delidding designato, Hotel 2 è la fluorescenza a 96 pozzettipiatto pila, e l'Hotel 3 è lo stack 6 pozzetti. Il sistema ha due gestori liquidi, una piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, e un erogatore multi-mode ugello-based. Per il riscaldamento / raffreddamento della piattaforma robotica ha due unità di riscaldamento piastre / raffreddamento, con un agitatore per la miscelazione della piastra. Infine, il sistema ha un lettore di piastre monocromatore a base per la misurazione della fluorescenza. Tutti i componenti sono alloggiati in un biosicurezza Gabinetto su misura. (B) A partire configurazione della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato con il nido 2 occupata dalla piastra di reagente e la casella punta immessi sul nido 8. (C) Configurazione della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzata prima di chiamare un protocollo sperimentale. Un piatto profondo bene si trova sul nido 4, una piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti si trova sul nido 6, e il 6 pozzetti contenenti protoplasti si trova sul nido 5. Si prega di cliccare qui per v iew una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Immagini rappresentative di By-2 protoplasti dopo ogni trasferimento e dopo la trasformazione con il gene della proteina reporter fluorescente arancione (A - C) micrografie BY-2 densità di protoplasti in 6 pozzetti, piastra a 96 pozzetti dopo il trasferimento di 70. microlitri dal 6 pozzetti e 96 pozzetti fluorescenti piastra di screening post-trasformazione. (D) Brightfield microfotografia di BY-2 protoplasti dopo la trasformazione. (E) fluorescente BY-2 protoplast che esprime il gene OFP visualizzato utilizzando un set / filter TRITC Cy3. (F) Sovrapposizione di campo chiaro e micrografie fluorescenti a dimostrazione della bassa efficienza di trasformazione. Barra di scala = 50 micron. target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Curva standard per calcolare il numero di protoplasti Il numero di protoplasti in un dato pozzo può essere calcolata confrontando l'intensità di fluorescenza, in unità arbitrarie (AU), l'equazione per la curva standard. La convalida del numero protoplasti è stata confrontata tra la curva standard e emocitometro nel punto indicato sul grafico, con 9.561 protoplasti individuati dal lettore di piastre, e 8.125 contato sul emocitometro. Nel complesso, è stato trovato un errore del 15% tra le due tecniche. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4:. Diagramma di Gantt per il metodo descritto per la produzione di BY-2 protoplasti e trasformazione genetica La maggior parte del protocollo, ~ 3 ore, viene speso per la digestione delle cellule BY-2 per generare i protoplasti. Caricamento della soluzione enzimatica e inattivazione richiede solo il 12% del tempo complessivo procedura. Analogamente, l'incubazione della reazione di trasformazione sulla agitatore rappresenta il 72% del protocollo trasformazione. Nel complesso, la procedura dall'isolamento protoplasti fino ad ottenere la trasformazione genetica è sotto 4 ore (3 ore, 50 minuti e 53 secondi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

File supplementare: protocolli automatizzati per l'isolamento di protoplasti, conteggio delle cellule, e la trasformazione PEG-mediata <./ strong> protocolli completi sviluppati per l'uso nella piattaforma robotica per realizzare ciascuno dei compiti sopra elencati sono inclusi in questo file. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

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Il protocollo sopra descritto è stato convalidato con successo per l'isolamento di protoplasti, l'enumerazione e la trasformazione utilizzando il tabacco coltura cellulare sospensione BY-2; Tuttavia, il protocollo potrebbe facilmente essere esteso a qualsiasi coltura in sospensione pianta. Allo stato attuale, l'isolamento di protoplasti e trasformazione è stato raggiunto in numerose piante, tra cui il mais (Zea mays) 10, carota (Daucus carota) 32, il pioppo (Populus euphratica) 33, di uva (Vitis vinifera) 34, palma da olio (Elaeis guineensis) 35 , lattuga (Lactuca sativa) 36, senape (Brassica juncea) 37, il riso (Oryza sativa) 38, e il panico verga (Panicum virgatum) 39,40. Mentre variazione delle condizioni di coltura e di digestione verificarsi da specie a specie, in termini di protocollo sviluppato in questo lavoro, in sostituzione di terreni di coltura o alterare le condizioni di scavoestion non dovrebbe modificare il protocollo fondamentale. Per regolare a specie diverse, terreni di coltura e gli enzimi necessari per la digestione sono caricati dall'operatore prima inizializzazione del protocollo, scambiando questi componenti così è banale. Come ulteriore vantaggio, il protocollo è modificabile per lo screening più condizioni di digestione con la resa di protoplasti misurati dal sistema. Questo è un componente essenziale, come l'uso di enzimi economici sono necessarie per applicazioni ad alta produttività, quindi è importante ridurre al minimo la quantità di enzimi utilizzati nella digestione.

Simile alla cultura e la digestione, le modifiche al protocollo trasformazione sarebbero richiesti in sede di adozione del sistema di trasformazione di protoplasti isolati da diverse specie di piante. Lavoro considerevole è stato condotto su ottimizzazione della trasformazione PEG-mediata in protoplasti vegetali 16,35, con numerosi fattori che influenzano l'efficienza di trasformazione. Nell'attuale work un fattore limitante interessano l'efficienza di trasformazione è la grande dimensione del plasmide test binario, 16.028 bp, che è stato utilizzato per gli scopi di modellazione dimensioni plasmide genoma editing. In studi precedenti sulla trasformazione PEG-mediata di BY-2 protoplasti, è stato raggiunto il 40-60% di trasformazione; Tuttavia, questi studi utilizzati piccoli 5.000 plasmidi bp 41,42. Le modifiche principali per trasformazione PEG-mediata tra le specie comprendono la concentrazione di PEG e MgCl 2, di concentrazione di DNA, e la durata della reazione. Poiché le 2 soluzioni PEG e MgCl vengono introdotti nel sistema sulla piastra reattivo, e il DNA è pre-caricata nella piastra profondo bene, queste condizioni possono essere facilmente modificati nel protocollo descritto sopra. Inoltre, aumentando o diminuendo il tempo di incubazione, con la modifica della velocità di miscelazione, può essere controllato con precisione dalla piattaforma robotica. L'attuale limitazione del protocollo trasformazione è la mancanzadi screening utilizzando il lettore di piastre per rilevare il reporter fluorescente, a causa della bassa efficienza di trasformazione PEG-mediata in BY-2 protoplasti. In altre specie, come l'Arabidopsis thaliana e mais 16, trasformazione PEG-mediata è efficiente 40-90%. In tali sistemi trasformanti possono essere rapidamente caratterizzate con il lettore di piastre sul robot. Pertanto, sarebbe possibile identificare pozzetti con trasformanti positivi, e anche quantificare il livello di espressione. Per le applicazioni, come ad esempio lo screening promotore, questa caratteristica aumenterebbe l'utilità del protocollo in vigore, e verrà aggiunto in successive iterazioni del sistema.

Oltre a ottimizzare l'efficienza di trasformazione per BY-2 protoplasti, varie modifiche possono aumentare l'efficienza e la produttività complessiva del sistema. Precedenti studi sulla automazione di protoplasti trasformazione permesso protoplasti di depositarsi sul fondo dei pozzi, prima dell'aggiunta di erah soluzioni 43. Nel protocollo corrente, protoplasti sono stati mescolati sulla agitatore per evitare sedimentazione e mantenere i protoplasti in sospensione con pozzetti a fondo piatto. Inoltre, durante la trasformazione, protoplasti non sono stati autorizzati a stabilirsi nelle piastre profondo bene, per ridurre l'esposizione al PEG, che può essere tossico nel corso di esposizione prolungata. Come tali, i protoplasti sono stati diluiti ~ 10 volte con soluzione W5 quando trasferiti dalla piastra profondo bene alla piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti, con conseguente 1,23 x 10 3 ± 4,66 x 10 1 protoplasti per pozzetto. Per aumentare il numero di protoplasti trasferiti dopo la trasformazione, potrebbe essere aggiunto un incubazione per consentire i protoplasti di stabilirsi, e il surnatante eliminato seguito da aggiunta di un volume inferiore di supporti BY-2 liquido. Inoltre, se una centrifuga piastra base è stato aggiunto al sistema, questa fase potrebbe essere raggiunta più rapidamente. Un'altra modifica che potrebbe aggiungere funzionalità a tl sistema sarebbe l'uso di un saggio di fluorescenza Live / Dead per determinare la vitalità dei protoplasti isolati prima della trasformazione. Nel protocollo corrente, diacetato di fluoresceina (FDA) è stato testato come un colorante dal vivo; tuttavia, il by-2 protoplasti fluorescenza di fondo oscurato il segnale FDA. Se è stato utilizzato un colorante redditività più stabile, allora redditività protoplasti potrebbe essere determinato come rapporto del rosso (PI) a verde (calceina AM, ecc) di fluorescenza, e standardizzato simile al protocollo conteggio delle cellule. Queste modifiche potrebbero aggiungere ulteriori funzionalità al sistema, e saranno inclusi in futuri protocolli.

Per quanto riguarda il protocollo attuale, ci sono diversi passaggi critici che devono essere seguite per garantire il successo del protocollo. In primo luogo, l'età / salute dei BY-2 culture è fondamentale per garantire che i protoplasti vitali possono essere isolati per le fasi successive. Come spiegato nel passo 1.3, trasferendo una cultura fase logaritmica in un pallone fresco ad una01:50 rapporto tra cellule a mezzi freschi, e permettendo la cultura di crescere per 5-7 giorni, il numero massimo di protoplasti vitali può essere isolato. Consentire alle culture di crescere per le durate più o meno lunghi utilizzando l'inoculo specificato ridurrà notevolmente la resa protoplasti, e causare il fallimento di protocolli successivi. Un secondo passo fondamentale è passo 1.5, dal momento che l'uso di puntali normali, invece dei puntali ampio tunnel specificate, farà sì che i suggerimenti per intasare e portare a volumi non corretti in fase di trasferimento. Per quanto riguarda la configurazione del sistema robotico, la disposizione delle piastre sulla piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, passo 2.4, è critica, con una configurazione modificata impedendo la testa del conduttore liquido di raggiungere tutti i pozzetti sulla piastra da 6 pozzetti. Grazie alla struttura della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, il 6 pozzetti deve essere collocato in nido 5, o protocolli selezionati per questo strumento sicuro. Analogamente, la mancata definire correttamente il labware nella piastrasoftware di motore, passo 2.2, farà sì che lo strumento non riescono a prendere, o far cadere il materiale da laboratorio con conseguente interruzione del protocollo. Per il protocollo conta delle cellule, la fase critica comporta la fissazione delle cellule con etanolo, punto 3.2. Se le cellule non sono fissate prima della marcatura con PI, solo le cellule non vitali saranno marcate, invece di tutta la popolazione di protoplasti, e non sarà possibile contare il numero di protoplasti isolati. La fase critica finale, passo 4.6, prevede la selezione dei filtri fluorescenti per l'analisi microscopica della espressione del marcatore fluorescente pporRFP. L'uso di altri "rosso" set di filtri permette di fluorescenza di fondo dalla clorofilla, aumentando sensibilmente il segnale in tutte protoplasti cloroplasti contenente, impedendo calcolo dell'efficienza trasformazione. aderendo con attenzione alle specifiche in questi passaggi critici garantisce la più grande opportunità per il successo e la generazione dei dati più riproducibiliet.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orbitor RS Microplate mover Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser BioTek
Teleshake Inheco 3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler Inheco 7000190
Vworks Automation Software Agilent Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software Thermo Scientific Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software Biotek Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set Chroma Technology Corp 49004
Rohament CL AB Enzymes sample bottle low-cost cellulase
Rohapect UF AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase
Rohapect 10L AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium Phytotechnology Laboratories L689
2,4-dichlorophenoxyacetic acid Phytotechnology Laboratories D295
propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Poly(ethylene glycol) 4000 Sigma Aldrich 95904-250G-F Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide Fisher Scientific 25535-16-4 Acros Organics
CaCl2 Sigma Aldrich C7902-1KG
Sodium Acetate Fisher Scientific BP333-500
Mannitol Sigma Aldrich M1902-1KG
Sucrose Fisher Scientific S5-3
KH2PO4 Fisher Scientific AC424205000
KOH Sigma Aldrich P1767
Gelzan CM Sigma Aldrich G1910-250G
6-well plate Thermo Scientific 103184
96-well 1.2 ml deep well plate Thermo Scientific AB-0564
96 well optical bottom plate Thermo Scientific 165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips Thermo Scientific 9405 163
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Sigma Aldrich P4504-1KG
MES Fisher Scientific AC17259-5000
MgCl2 Fisher Scientific M33-500

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Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione
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Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).More

Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).

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