Summary
ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。
Abstract
過去10年間のシグナル伝達経路、転写制御ネットワーク、遺伝子発現、ゲノム編集、および遺伝子サイレンシングの分析のため、モデル種からの作物種に及ぶ植物プロトプラストの使用に復活がありました。さらに、重要な進展は、植物ゲノミクスのためのこれらのシステムの使用であってもより多くの関心を生成したプロトプラストからの植物の再生、で行われています。この作業では、プロトコルは、ロボットプラットフォームを使用して「明るい黄色 '2（BY-2）タバコ懸濁培養からのプロトプラストの分離および形質転換の自動化のために開発されてきました。形質転換手順は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（35S）の制御下で、オレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）を用いて検証しました。プロトプラストにおけるOFPの発現は、エピ蛍光顕微鏡によって確認されました。分析はまたpropidiuを用いてプロトプラスト生産効率の方法を含めメートルヨウ化。最後に、低コストの食品グレードの酵素は、ハイスループット自動プロトプラスト単離および分析にコスト高である実験室グレードの酵素の必要性を回避する、プロトプラスト単離手順のために使用しました。今回開発したプロトコルに基づいて、変換へのプロトプラスト単離からの完全な手順は、オペレータからの入力なしに、4時間の下で行うことができます。今回開発したプロトコルは、BY-2細胞培養で検証されたが、手順および方法は、作物ゲノム研究の加速を有効にする必要があります任意の植物懸濁培養/プロトプラストシステムに翻訳可能でなければなりません。
Introduction
除草剤抵抗性2を与える、様々な疾患1を克服するために、トランスジェニック作物の設計上に配置された有意な刺激があった近年、バイオマス収率7を高める、草食性6を防ぐ、干ばつ3,4および塩耐性5を付与し、細胞壁の反抗を減少させます8。この傾向は、CRISPRとTALENs 9を用いて、ゲノム編集、およびdsRNAの10、miRNAの11、およびsiRNA 12を介して遺伝子サイレンシングを含むトランスジェニック植物を生成するための新たな分子ツールの開発によって支援されています。これらの技術は、トランスジェニック植物の生成を簡略化しているが、彼らはまた、生成されたトランスジェニック植物の膨大な数は植物体再生に依存している従来のシステムを用いてスクリーニングすることができないボトルネックを作成しました。 、多くのサイレンシングゲノム編集構築物が急速に植物内に挿入することができるが、このボトルネックに関連します標的の形質は、植物を温室内で分析されるまで、頻繁に発見されていない所望の効果を生み出すことができません。この研究では、特異的ゲノム編集及び遺伝子サイレンシングの標的の多数の初期スクリーニングにおいて現在のボトルネックに対処するために、植物プロトプラストの迅速、自動化、ハイスループットスクリーニングのための方法を開発しました。
無傷の植物細胞とは対照的に、プロトプラストの使用は、自動化されたプラットフォームの開発のためのいくつかの利点を有します。まず、プロトプラストは、植物細胞壁の消化後に単離されており、もはや存在し、このバリアと、形質転換効率は、13に増加します。無傷の植物細胞14およびアグロバクテリウム媒介形質転換15遺伝子銃形質転換のために2つだけの十分に確立された方法があります。微粒子銃がtransfoのための特殊な装置を必要とするこれらの方法のいずれもが簡単に、液体ハンドリングプラットフォームに変換することができますアグロバクテリウムを介した形質転換一方rmationは、共培養し、細菌のその後の除去を必要とします。どちらも高スループット方法のために適していません。プロトプラストの場合には、変換は、日常的にのみ、いくつかの溶液交換を必要とし、理想的には、液体ハンドリングプラットフォームに適しているポリエチレングリコール（PEG）媒介性トランスフェクション16を用いて行われます。第二に、プロトプラストは、定義により、単一細胞培養物であり、従って、植物細胞培養物中で凝集し、鎖形成に関連する問題は、プロトプラストでは観察されません。プレートベースの分光光度計を用いて迅速なスクリーニングの観点から、複数の平面内の細胞、または細胞の凝集は、一貫した測定値を取得することの困難につながります。プロトプラストは、それらの培地よりも密であるので、それらは、プレートベースの分光光度法のために助長している単分子層を形成し、ウェルの底に沈降します。最後に、植物細胞懸濁培養物はprimarいる間ILYカルス17由来のプロトプラストは、組織特異的発現を同定する能力をもたらす、植物組織の数から採取することができます。例えば、遺伝子のルートで、または葉特異的発現を分析する能力は、表現型の予測にとって非常に重要であることができます。これらの理由から、本研究で開発されたプロトコルが広く使用されているタバコ（ タバコ L.）「明るい黄色'2（BY-2）懸濁培養物から単離したプロトプラストを用いて検証しました。
BY-2浮遊培養は、植物細胞18の分子分析におけるその遍在使用のために、高等植物の「HeLa細胞」細胞として記載されています。最近、BY-2細胞は、植物の効果を研究するために使用されている、細胞内タンパク質局在23,24、および植物生物学において、これらの培養物の広範な有用性を示す基本的な細胞生物学25-27を 19-22をストレッサー。 BY-2培養物のさらなる利点は遺伝子発現研究28向けに拡張再現性につながる可能性がアフィディコリン、と文化を同期する機能。さらに、方法は、伝統的に、プロトプラストを生成するために使用される酵素は、コスト高スループットシステムのために禁止されているように、低コストの酵素29,30を用いた BY-2プロトプラストの抽出のために開発されてきました。そのようなものとして、以下に記載されるプロトコルは、BY-2浮遊培養を用いて検証されていますが、それは任意の植物細胞懸濁培養に修正可能でなければなりません。概念実証実験は、ハードサンゴハマからオレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）はCaMV35Sプロモーターの制御下で、31を ハマ使用して実行されます。
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Protocol
懸濁細胞培養の1の確立
- 蒸留900 mlの4.43 gでLinsmaier＆スクーグ基本培地、スクロース30gを、200mgのKH 2 PO 4、及び2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）200μgのを添加することにより、BY-2培地液を調製水および0.1 M KOHで5.8にpHを。 pHを調整した後、蒸留水、オートクレーブで千ミリリットルへの最終的な音量を調整します。培地は4℃で2週間まで保存することができます。
- 1％を添加した培地BY-2 BY-2液を100mlの培地およびBY-2固体上に成長したBY-2カルス（>直径1cm）の一枚の媒体（液体250 mlの三角フラスコに接種寒天）とアルミニウム箔でシール。 5日間振とうしながら28から30℃で培養をインキュベートします。
注：液体培養物は急速に過剰に増殖ますようBY-2カルスは、長期保存のための固体培地上で維持されます。培養容量は、典型的には、100mlの培養物は、30個の6-Wロード可能となり、必要に応じて調整することができますエルプレート。 - 転送2 BY-2培養新鮮BY-2メディアの98ミリリットルに対数期のミリリットル、振とうしながら28から30℃で5〜7日間インキュベートします。
注：カルス100 5-7日齢の培養物の希釈物ではなく、接種：確立された液体培養物の継代培養は、定期的に1を用いて行うことができます。 - 細胞が急速に沈降するよう、徹底的に文化をミックスし、転送細胞培養の6ミリリットルを15ミリリットルコニカル遠心管に、細胞は、少なくとも10分間沈降させます。上清を除去することにより、全体積の50％まで充填細胞音量を調整します。
- 消化のための6ウェルプレートの各ウェルに500μlのを反転してピペットでチューブを振ります。彼らは密であるように、この段階で細胞を転送するために広い口径のピペットを使用し、標準的なピペットチップを詰まらせます。
2.プロトプラストの単離
- ロボットシステム（ 図1A）のすべてのコンポーネントをオンにして、ソフトスケジューリングプレートムーバタスクを開きますウェア。タスクスケジューリングプログラムは、各機器間のプレートの移動を可能にするために他の機器とマイクロムーバを統合します。
- 実験に先立ち、プロトコルで使用される技術的な実験機器の仕様（ 例えば 、プレート、蓋）を定義するだけでなく、次のように、プレートムーバソフトウェアで、実験器具の各部分のための開始位置と終了：
- プレートムーバソフトウェアのメインツールバーからセットアップをクリックし、[ 管理コンテナタイプ]コマンドを選択します。
- コンテナタイプが既存のコンテナタイプライブラリに記載されている場合は、適切なコンテナを選択します。
- コンテナタイプが既存のコンテナタイプライブラリに記載されていない場合、新しいコンテナ型を指定するには、[ 追加 ] をクリックします。
- 新しいコンテナ型を追加した後、適切なタブに新しいコンテナ（高さ、幅、寸法を積み重ね、グリッパオフセット）の寸法を挿入し、[ 保存 ] をクリックします。
- 正しい寸法はメーカーから利用できない場合は、正確にキャリパーを使用して、最も近いミリメートルまでのすべての寸法を決定。コンテナの寸法を測定する際のエラーは、プレート移動装置の故障の原因となります。
- 繰り返しは、プレート・ムーバーが遭遇するすべてのコンテナ型のための2.2.4.1を介して、2.2.2繰り返します。すべての実験器具のために、この工程の完了後、各容器（ステップ2.2.6）の開始と終了の位置を定義する必要があります。
注：このプロトコルについて実験器具は6ウェルプレート、ディープウェルプレート、および96ウェル蛍光スクリーニングプレートを含んでいます。 - 各コンテナの開始と終了位置を定義するには、特定のプロトコルに開始/終了]タブをクリックします。まず、各コンテナの開始位置を選択します。次に、開始と終了位置の両方で蓋付き/ Unliddedためのチェックボックスをオンにします。すべてのコンテナのために繰り返します。
注：コンテナは、EQUの別の部分に残される場合ipment（代わりにプレートムーバの）終了位置を空白のままにすることができます。
- この段階で手動で全体のワークフローの開始位置にすべてのプレートをロードします。ホテル3、プレートヒーター/冷却器巣2、及び50 mLコニカルに変換するために使用される96ディープウェルプレートにBY-2細胞を96ウェル蛍光ホテル2にスクリーニングプレート、6ウェルプレートにロードマルチモードディスペンサー上に酵素液を含むチューブ（ 補足ファイル 、第1.2.2項を参照してください）。
- 変換は、プロトコルで行わOFPレポーター構築物を含むウェルあたりプラスミドDNA（1μgの/μlの、260/280> 1.8）10μlのとプリロード96ディープウェルプレートとプレート上でインキュベートされる場合4℃でヒーター/チラー。各ウェルは、従って充填ウェルの数は、実験に依存し、単一の形質転換のために使用されます。
- 自動化上のすべての電源およびプレートをロード指定された場所にあるD液体処理プラットフォームとは、自動化制御ソフトウェア（ 図1B）の各項目の位置を定義します。
- MMGで40％PEG（0.4 Mマンニトール、100のMgCl 2、4mMのMES、pHは5.7）列1で、ヨウ化プロピジウム（PI、を1μg/ ml）を200μlの200μlのプリロード96ウェルプレートをロード列2、列3（巣2）中のエタノールを200μl、および巣8でのピペットチップのボックスに入力します。
- 、自動液体処理プラットフォームのソフトウェアで実験器具の位置を定義メニューから[ ツールや実験器具エディタをクリックします。
- プルダウンメニューから、実験器具の種類を選択するか、 新しい実験器具のボタンを使用して、新しい実験器具タイプを定義します。
- 主なプロトコル]タブを選択し、Configure実験器具をクリックして選択実験器具の各部分の位置を定義します。自動液体処理プラットフォーム上に配置された実験器具の各部分であることを確認してくださいプロトコルを実行する前に定義されています。
- 自動化されたプロトコルをトリガするには、プロファイル・エクスプローラウィンドウをクリックして、実行するプロトコル（ プロトプラストの単離 、 セル数 、およびPEG媒介形質転換 ）の名前を選択します。
- プロトコルで使用されるすべてのデバイスを初期化するために、[ 実行 ] をクリックします。
- 最後に、ワークエクスプローラウィンドウで、システム内のすべてのコンテナ/実験器具を確認し、自動化されたプロトコルを開始するために作業ユニットを追加 ] をクリックします。
注：自動化されたプロトコルの完全な説明は補足ファイルに含まれています。
3.細胞数の標準曲線を確立
- 手動で1 mlの容量で、1×10 6プロトプラスト/ mlの濃度でプロトプラストを濃縮します。遠心分離機は10分1,000×gでプロトプラスト、上清を除去します。
- 手動プロトプラストペレットに（4℃で維持）の70％エタノール900μlを添加しますそしてペレットを再懸濁します。細胞を固定するために、氷上で10分間インキュベートします。
- 核を標識し、プレートリーダーによる検出を可能にするために、プロトプラストにPI（1μg/ ml）の100μlのを追加します。
- 負荷BY-2液の80μlを96ウェル蛍光スクリーニングプレートの各列と行にメディアが2列で始まります。
- 96ウェル蛍光スクリーニングプレートの列1で、列に各ウェルにBY-2メディアプロトプラスト70μlの50μlを添加します。
- 自動液体処理プラットフォームの巣6に板を置き、2倍連続希釈を実行します。
- 自動液体処理プラットフォーム上で連続希釈を行うために、 シリアル希釈ウィザードを起動し、転送量（60μl）を調整し、ミックスとボリューム（2、70μl）を、最初のウェル（カラム1、行AF）の数、希釈クリックウェル（列2-11、行AF）、および吸引及び分配する性質（ウェル底から0.5ミリメートル）。
- パラメータを設定した後、保存プロトコルを実行しますdは。
注：すべてのプロトプラスト（細胞の固定化のために）PIで標識されているので、蛍光がプロトプラストの濃度に比例します。 - 連続希釈が完了した後、ネスト9からプレートを取り外し、プレートリーダーに挿入し、プレートリーダーソフトウェアの標準曲線プロトコルを実行します。
注：標準曲線は、既知のプロトプラストの濃度で各ウェルにPI（励起536 nmの/発光620 nm）での蛍光を比較することによって生成されます。
- プレートリーダープロトコルが完了すると、プレートを取り外し、オートクレーブまたは「バイオセーフティプロトコルで定義されている他の脱活性化の手順については、任意のトランスジェニック細胞を収集します。
変革の4顕微鏡分析
- ロボットシステムのホテル1から形質転換されたプロトプラスト（自動プロトコル3、 補足ファイルの製品）でプレートを取り外します。
- 順番倒立顕微鏡、カメラ、および蛍光灯に。
- プロトプラストに焦点を当てた初期のための10倍の対物レンズを選択し、ハロゲンランプをオンにし、蛍光ランプ用のシャッターを閉じます。
- 明を使用してプロトプラストに微細システムとフォーカス上にロードプレート。
- プロトプラストに焦点を当てた後、ハロゲン電球をオフにして、蛍光灯のためのシャッターを開きます。
- トランスジェニックプロトプラストによって発現pporRFPタンパク質の可視化のために設定CY3 / TRITCフィルターを選択します。
- pporRFP蛍光マーカーを発現するプロトプラストの数を決定するために、各ウェルをスキャンします。
- 蛍光マーカーをプロトプラストの合計数を表すプロトプラストの総数として、形質転換効率を計算します。
- オートクレーブ処理または「バイオセーフティプロトコルで定義されている他の脱活性化の手順については、承認されたバイオセーフティバッグでトランスジェニック細胞を含む任意のプレートを収集します。
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Representative Results
現在の研究では、BY-2の倍加速度は、培養物は、15時間の平均細胞周期の長さの以前の報告と一致して培養したときの温度に依存して14から18時間から変化しました。この倍加速度で、1：100の出発接種材料は5-7日で50％のパック細胞容積（PCV）での文化につながる、培養を開始するために使用されました。培養物を培地200mlに成長された現在のプロトコルでは、100mlとPCV 33 6ウェルプレートを満たすのに十分な細胞を提供した7日で生成しました。プロトプラスト収率の点では、プロトコルで指定された条件での消化は、6ウェルプレート（ 図2A）あたり2.82×10 6プロトプラストで、その結果、ウェル当たり4.70×10 5±5.77×10 3プロトプラストを生成しました。これらのデータに基づいて、214 96ウェルプレート（ウェルあたりプロトプラストの70μl）を潜在的なFOで、単6ウェルプレート消化からロードすることができますR 2つの6ウェルプレートは、二つのプレートヒータ/冷却器ステーションを利用して、同時に消化します。したがって、単一の3時間の消化プロトコルの間に生成することができるプロトプラストの最大数は、5.64×10 6です。
消化プロトコルごとに生成されたプロトプラストの総数は、システムの1つのメトリックを提供するが、プロトプラストがプロトコルの異なる工程を介して転送されるようにプロトプラストの濃度の損失を評価することも必要です。このように、プロトプラストの濃度は、プロトコル中の各転写工程後に評価しました。形質転換プロトコル、または96ウェル蛍光スクリーニングプレート（ 図2B）を行う場合、消化プロトコルの後に、1.15×10 4±1.35×10 2プロトプラストを、96ディープウェルプレートのそれぞれに移しました。形質転換プロトコルが完了した後、1.23×10 3±4.66のx10 1プロトプラストを、96ウェルの蛍光スクリーニングプレート（ 図2C）に移しました。転送プロトプラストの数に加えて、複数の分注段階がプロトプラストを損傷しなかったことを確実にするために、プロトプラストの生存率を決定することが重要でした。
生存率アッセイの結果に基づいて、プロトプラストの95.1±0.04％を96ウェル蛍光スクリーニングプレートに移し、及び16.67％の形質転換プロトコル後の91.7±後、消化した後に92.1±0.06％生存可能でした。多数のピペット操作ステップにもかかわらず、試料のいずれかとの間に有意差（P> 0.44）はなかったです。生存性のこの尺度に加えて、プロトコルは、PIで染色されたプロトプラストの数を測定することによって、手順の任意の段階でのプロトプラストの濃度を決定するために開発されました。 図3に示すように 、標準曲線をgeneratましたシステムからのプロトプラストの既知の濃度を蛍光強度を測定することによって編標準曲線は、0からうまく30,000プロトプラストの範囲に及ぶプロトプラストの総数との良好なフィット（R 2 = 0.967）でした。標準曲線、（8125と24375は、血球計数器を使用して計算）プロトプラストの数がわかっているサンプルの蛍光強度が得られた標準曲線の式から算出したプロトプラストの数を検証します。これらの結果に基づいて、標準曲線は、十分に15および14％の誤差をそれぞれにおける9560と28,200プロトプラストを予測しました。また、血球計数器を用いて細胞数を測定することでばらつきがあることを考慮すると、この誤差は許容されると考えられました。
F -細胞数および生存率の結果に加えて、形質転換プロトコールは、OFP（ 図2Dを発現するトランスジェニック細胞の生成に成功しました）。残念ながら、使用されるプロトコルが原因で、この研究では、プロトコルは、BY-2プロトプラストのために特別に最適化されていなかったので、使用される大16028 bpのバイナリープラスミドへ〜、低中2％、形質転換効率をもたらしました。議論で明らかのように形質転換プロトコルの最適化は、具体的にはBY-2プロトプラストのための試薬および条件の観点から、変換効率を高めることが期待されます。このプロトコルの観点では、形質転換手順は、形質転換にプロトプラスト単離の概念実証経路を示すために設計されており、この目標を達成するのに成功しました。
成功した個々の手順のすべてを検証した後、メトリックは、形質転換プロトプラスト単離からプロトコルの時間経過についても得られました。 図4に示すように、時間の大規模な投資は3時間がfoが必要とされた消化段階、中に費やされます細胞壁およびプロトプラストの放出の完全な消化をrは。この手順の間、18のループは、プレート・ムーバーは2つのステーション間のプレートを移動すると、プレートシェーカーとプレートヒーター/チラー1インキュベーション局との間で実行されます。プレートシェーカーとプレートヒーター/チラー1間の転送時間はわずか8.9秒を取り、消化手順の大部分は培養し、揺れ費やされていることを保証します。マルチモードディスペンサーにより酵素のロードを完了するための手順の開始からの総時間は2.2分です。全体として、完全なプロトプラスト単離プロトコールは、3時間および22.8分で完了する。これらの結果に基づいて、プロトプラストの単離プロトコールの88％が消化に費やされています。プロトプラスト単離プロトコールの完了後に、形質転換プロトコルが開始され、そして27.5分以内に完了する。プロトプラスト単離プロトコールと同様に、形質転換手順の72％が反応をインキュベートすることに費やされます。プロトコルにおける唯一の他のステップそれはかなりの時間成分（全手続き時間の> 10％）は、プロシージャ内の合計時間の14％を占める自動液体処理プラットフォームにより、プロトコルの初期化できました。このように、プロトコルの86％は、ピペット操作や転送ステップに費やした時間のわずか14％で、初期化およびインキュベーションに費やされています。プロトプラスト単離および形質転換の完全な期間は、オペレータからの不要外部入力で、3時間、50分、および53秒でした。
図1： プロトコル中の自動液体ハンドリングプラットフォームのロボットプラットフォームおよび構成の概略図 （A）ロボットシステムは、プレート移動装置によってアクセスすることができる3板スタック/ホテルで構成されています。ホテル1は、指定された蓋/ delidding駅でホテル2は、96ウェルの蛍光性でありますプレートスタック、およびホテル3は、6ウェルプレートのスタックです。システムは、2つの液体ハンドラー、自動液体ハンドリングプラットフォーム、およびノズルベースのマルチモードディスペンサを有します。ロボットプラットフォームを冷却する加熱/ためにプレートを混合するためのプレートシェーカーと一緒に、2枚の板の加熱/冷却ユニットを持っています。最後に、システムは、蛍光を測定するためのモノクロメータベースプレートリーダーを有しています。すべてのコンポーネントは、特注の安全キャビネット内に収納されています。 （B）は、従来の実験プロトコルを呼び出すに自動液体処理プラットフォームの巣8（C）の構成上に配置された試薬プレートとチップボックスによって占有巣2と自動液体処理プラットフォームの構成を開始しています。ディープウェルプレートがネスト4上に配置され、96ウェル蛍光スクリーニングプレートがネスト6上に配置され、およびプロトプラストを含む6ウェルプレートが巣5上に配置されているVにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。
図2： 各転送後、オレンジ色の蛍光タンパク質レポーター遺伝子を用いた形質転換後BY-2プロトプラストの代表的な画像 （A - C）70の転写後の6ウェルプレート中のBY-2プロトプラスト密度の顕微鏡写真、96ウェルプレート。 6ウェルプレートからμlを、96ウェルの蛍光スクリーニングプレート変換後。 （D）変換後BY-2プロトプラストの明視野顕微鏡写真。 （E）蛍光は、OFP遺伝子を発現するBY-2プロトプラストのCy3 / TRITCフィルターセットを使用して可視化しました。 （F）明視野のオーバーレイおよび蛍光顕微鏡写真は、変換効率が低いことが実証されました。 =50μmのスケールバー。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： プロトプラストの数を計算するための標準曲線ウェル所与におけるプロトプラストの数は、標準曲線のための方程式を、任意単位（AU）で、蛍光強度を比較することによって計算することができます。プロトプラスト番号の検証は、血球計数器で計数9561プレートリーダーから識別プロトプラスト、および8125で、グラフ上に示した点で、標準曲線と血球計数器との間で比較しました。全体的に、15％の誤差は二つの技術の間で発見された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4：BY-2 プロトプラストと遺伝的形質転換の生産のための記載された手順のためのガントチャートプロトコルの大部分は、2〜3時間は、プロトプラストを生成するために、BY-2細胞の消化に費やされています。酵素液および不活性化の負荷は、全体の処置時間の12％のみを必要とします。同様に、プレートシェーカー上で形質転換反応のインキュベーションは、形質転換プロトコルの72％を占めます。全体的に、遺伝的形質転換が達成されるまでプロトプラストの単離からの手順は4時間（3時間、50分、および53秒）の下にある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足ファイル：プロトプラスト単離、細胞計数、およびPEG媒介形質転換のための自動化されたプロトコル<。このファイルに含まれている上記の各タスクを達成するためのロボットプラットフォームで使用するために開発/ strong>の完全なプロトコル。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
上記のプロトコルが正常BY-2タバコ懸濁細胞培養を用いてプロトプラスト単離、列挙、および形質転換のために検証されています。しかしながら、このプロトコルは容易に任意の植物懸濁培養に拡張することができます。現時点では、プロトプラストの分離および形質転換は、トウモロコシ（ トウモロコシ ）10、ニンジン（ ニンジン属のcarota）32、ポプラ（ ポプラeuphratica）33、ブドウ（ ブドウ ）34、オイルパーム（ アブラヤシ ）35を含む、数多くの植物で達成されました、レタス（ レタス ）36、マスタード（ カラシナ ）37、稲（ イネ ）38、およびスイッチグラス（ キビのvirgatum）39,40。文化や消化条件の変化は掘るの条件を培養培地を交換したり、変更、今回開発したプロトコルの観点から、種から種に発生しているがestionは、基本的なプロトコルを変更しないでください。異なる種に調整するには、培養培地および消化に必要な酵素は、従来のプロトコルの初期化にオペレータによってロードされ、したがって、これらの部品を交換することは簡単です。利点として、プロトコルは、システムによって測定されたプロトプラストの収率で複数の消化条件をスクリーニングに修正可能です。低コストの酵素の使用は、高スループットのアプリケーションのために必要であるので、これは、したがって、消化に用いられる酵素の量を最小限にすることが重要であり、必須成分です。
異なる植物種から単離されたプロトプラストの形質転換のための制度を採用する場合、培養および消化と同様に、形質転換プロトコールの変更が必要となります。かなりの作業が形質転換の効率に影響を与える多数の因子と、植物プロトプラスト16,35にPEG媒介形質転換の最適化に行われています。 WO電流In形質転換効率に影響を与える要因を制限RK一つゲノム編集プラスミドサイズをモデル化する目的のために使用されたバイナリの試験プラスミド、16028塩基対の大きなサイズでした。 BY-2プロトプラストのPEG媒介形質転換の以前の研究では、40〜60％の変換が達成されました。しかしながら、これらの研究は、小5,000 bpのプラスミド41,42を使用します。種間のPEG媒介形質転換の主要な修飾は、PEGおよびMgCl 2の濃度は、DNAの量および濃度、反応時間が挙げられます。 PEGおよびMgCl 2溶液が、試薬プレート上のシステムに導入され、そしてDNAは、ディープウェルプレートに予め装填されているように、これらの条件を容易にプロトコルに変更することができる上述しましたまた、速度を混合する修正とともに、インキュベーション時間を増加または減少、正確にロボットプラットフォームによって制御することができます。形質転換プロトコルの現在の制限が不足していることですBY-2プロトプラスト中のPEG媒介形質転換の効率が低いことに起因する蛍光レポーターを検出するために、プレートリーダーを用いてスクリーニングします。このようなシロイヌナズナやトウモロコシ16などの他の種では、PEG媒介形質転換は、40から90パーセント効率的です。このようなシステムでは、形質転換体は、迅速に、ロボットのプレートリーダーを使用して特徴付けすることができます。従って、陽性形質転換体を用いてウェルを識別し、また発現レベルを定量することが可能です。そのようなプロモーターのスクリーニングなどの用途のために、この機能は、現在のプロトコルの有用性を増加させる、およびシステムのそれ以降の反復で添加されます。
BY-2プロトプラストの変換効率の最適化に加えて、いくつかの変更は、システムの効率と全体的なスループットを増加させることができます。プロトプラストは前だったの添加、ウェルの底に沈降させプロトプラスト形質転換の自動化に関するこれまでの研究時間ソリューション43。現在のプロトコルでは、プロトプラストは、沈降を防止し、平底ウェルプレートを用いて、懸濁液中のプロトプラストを維持するために、プレートシェーカー上で混合しました。また、変換中に、プロトプラストを長期暴露超える有毒であることができる、PEGへの露出を減らすために、ディープウェルプレートに定住することはできませんでした。 96ウェル蛍光スクリーニングプレートにディープウェルプレートから移したときにこのように、プロトプラストを、ウェル当たり1.23×10 3±4.66×10 1プロトプラストをもたらす〜W5溶液で10倍に希釈しました。変換後の転送プロトプラストの数を増加させるために、BY-2液体の少量の添加メディア続いてインキュベーション工程は、プロトプラストが沈降することを可能にするために添加することができ、そして上清を除去しました。プレートベースの遠心分離機がシステムに追加された場合に加えて、この工程は、より迅速に達成することができます。トンに機能を追加することができます別の改変彼のシステムは、変換前に分離されたプロトプラストの生存率を測定するための生/死蛍光アッセイの使用であろう。現在のプロトコルでは、フルオレセインジアセテート（FDA）は、ライブ染料として試験しました。ただし、BY-2プロトプラストのバックグラウンド蛍光は、FDAの信号を不明瞭。より安定した生存色素を使用した場合には、プロトプラスト生存率は緑色の赤色（PI）の比（カルセインAM、 等 ）、蛍光、および細胞計数プロトコルに標準化された類似したように決定することができます。これらの変更は、システムにさらに機能を追加して、将来のプロトコルに含まれます。
現在のプロトコルに関しては、プロトコルの成功を確実にするために従わなければならないいくつかの重要なステップがあります。まず、BY-2培養液の年齢/健康は、生存プロトプラストが後続のステップのために単離することができることを保証することが不可欠です。で新鮮なフラスコに対数期の文化を転送することにより、ステップ1.3で説明したように午前1時50分、新鮮な培地への細胞の割合、および培養は5-7日間増殖させ、生存プロトプラストの最大数は、単離することができます。文化が著しくプロトプラストの収率が低下し、その後のプロトコルの故障の原因となります指定された接種材料を使用して、長いか短い持続時間のために成長することができます。第二の重要なステップは、代わりに指定されたワイド口径のピペットチップの、標準的なピペットチップを使用するので、ステップ1.5である先端が詰まると転送され、誤ったボリュームにつながることになります。ロボットシステムのセットアップに関しては、自動液体処理プラットフォーム上のプレートの配置は、ステップ2.4は、変更されたセットアップは、6ウェルプレートに全てのウェルに到達する液体ハンドラーの頭を防止して、非常に重要です。自動液体処理プラットフォームの設計に、6ウェルプレートは、巣5に配置する必要があり、または、この楽器のために選択されたプロトコルが失敗します。同様に、障害が正しくプレートに実験器具を定義しますムーバソフトウェア、ステップ2.2は、楽器がつかむために失敗、またはプロトコルの終了の結果、実験器具をドロップするようになります。細胞計数プロトコルの場合、重要な工程は、エタノール、ステップ3.2で細胞を固定することを含みます。細胞はPIで標識する前に固定されていない場合は、唯一の非生存細胞は、代わりに、プロトプラストの全人口の、標識され、単離されたプロトプラストの数をカウントすることはできません。最後の重要なステップ、ステップ4.6は、pporRFP蛍光マーカーの発現の顕微鏡分析のための蛍光フィルタの選択を含みます。他の「赤」フィルターセットの使用は、形質転換効率の計算を防止する、著しくプロトプラストを含む全ての葉緑の信号を増大させる、クロロフィルからのバックグラウンド蛍光を可能にします。慎重にこれらの重要なステップで仕様に付着すると、成功のための最大の機会と最も再現件のデータの生成を保証しますら。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
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