Summary
A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo.
Abstract
Durante a última década tem havido um ressurgimento do uso de protoplastos vegetais que variam de espécie para espécie vegetal modelo, para análise de vias de sinal de transdução, redes reguladoras da transcrição, a expressão do gene, genoma, e de edição de gene silenciador. Além disso, o progresso significativo tem sido feito para a regeneração de plantas a partir de protoplastos, o que tem gerado ainda mais o interesse na utilização destes sistemas para genoma das plantas. Neste trabalho, um protocolo tem sido desenvolvido para a automatização de isolamento de protoplastos e transformação de cultura em suspensão de tabaco um 'amarelo brilhante' 2 (A-2), utilizando uma plataforma robótica. Os procedimentos de transformação foram validados utilizando um gene repórter da proteína fluorescente laranja (OFP) (pporRFP) sob o controlo do promotor 35S do mosaico da couve-flor vírus (35S). OFP expressão em protoplastos foi confirmada por microscopia de epifluorescência. As análises também incluiu métodos de eficiência de produção de protoplastos usando propidium iodeto. Finalmente, as enzimas de grau alimentar de baixo custo foram usadas para o procedimento de isolamento de protoplastos, evitando a necessidade de enzimas laboratório-grade que são um custo proibitivo em high-throughput automatizado isolamento de protoplastos e análise. Com base no protocolo desenvolvida no presente trabalho, o procedimento completo de isolamento de protoplastos para transformação pode ser realizada em menos de 4 horas, sem qualquer entrada a partir do operador. Embora o protocolo desenvolvido neste trabalho foi validado com a cultura de células A-2, os procedimentos e métodos podem ser traduzidas a qualquer sistema de cultura em suspensão planta / protoplasto, o que deverá permitir a aceleração da pesquisa genómica de culturas.
Introduction
Nos últimos anos tem havido um impulso significativo colocado sobre a concepção de culturas transgênicas para superar várias doenças 1, dotar resistência a herbicida 2, conferem seca 3,4 e tolerância ao sal 5, evitar herbivoria 6, aumentar a produção de biomassa 7, e diminuir a recalcitrância da parede celular 8. Esta tendência foi ajudada pelo desenvolvimento de novas ferramentas moleculares para a geração de plantas transgénicas, incluindo genoma de edição utilizando CRISPR e TALENS 9, e silenciamento de genes por meio de ARNcd de 10, 11 miARN, e ARNsi 12. Embora estas tecnologias simplificaram a geração de plantas transgênicas, eles também criaram um gargalo, onde o grande número de plantas transgénicas gerada não podem ser rastreados usando sistemas tradicionais que dependem de regeneração de plantas. Relacionado com este gargalo, enquanto que o silenciamento e de edição de genoma construções podem ser rapidamente inserido em plantas, muitos doscaracterísticas visadas não conseguem produzir o efeito desejado, o que muitas vezes não é descoberto até que as plantas são analisados na estufa. Neste trabalho, nós desenvolvemos um método para o rápido rastreio automatizado, de alto rendimento de protoplastos de plantas, especificamente para lidar com o gargalo de corrente no rastreio inicial de um grande número de genoma de edição e silenciamento de genes alvos.
O uso de protoplastos, em oposição às células de plantas intactas, tem várias vantagens para o desenvolvimento de uma plataforma automatizada. Em primeiro lugar, os protoplastos são isolados após a digestão da parede celular de plantas, e com isso já não presente barreira, a eficiência de transformação é aumentada 13. Nas células vegetais intactas há apenas dois métodos bem estabelecidos para a transformação biolística, 14 e 15 de transformação mediada por Agrobacterium. Nenhum desses métodos podem ser facilmente convertidos para plataformas de manipulação de líquidos, como biolistics exige equipamento especializado para transformação, enquanto transformação mediada por Agrobacterium requer a co-cultura e a subsequente remoção das bactérias. Nem são passíveis de métodos de alto rendimento. No caso de protoplastos, a transformação é realizada rotineiramente utilizando polietileno-glicol (PEG) a transfecção mediada por 16, que só requer várias trocas de solução, e é especialmente adequado para plataformas de manipulação de líquidos. Em segundo lugar, os protoplastos, por definição, são as culturas de uma única célula, e assim os problemas associados com a acumulação e a formação da cadeia em culturas de células de plantas, não são observados em protoplastos. Em termos de rastreio rápida utilizando um espectrofotómetro de placa-base, a aglutinação de células, ou células em planos múltiplos irá conduzir a dificuldade em adquirir medições consistentes. Uma vez que os protoplastos são também mais denso do que o seu meio de cultura, eles sedimentar para o fundo dos poços, a formação de uma monocamada, o que é favorável para espectrofotometria à base de chapa. Finalmente, enquanto que as culturas em suspensão de células de plantas são Primarily derivado do calo 17, os protoplastos podem ser colhidas a partir de uma série de tecidos de plantas, conduzindo-se à capacidade para identificar a expressão específica de tecido. Por exemplo, a capacidade de analisar raiz- ou expressão específica de folha de um gene pode ser muito importante para a predição fenótipo. Por estas razões, os protocolos desenvolvidos neste trabalho foram validados utilizando protoplastos isolados do tabaco amplamente utilizado (Nicotiana tabacum L.) cultura em suspensão "amarelo brilhante" 2 (BY-2).
A cultura em suspensão BY-2 foi descrito como a célula "HeLa" de plantas superiores, devido ao seu uso disseminado em análise molecular de células de plantas 18. Recentemente, BY-2 de células têm sido usadas para estudar os efeitos da planta estressores 19-22, localização da proteína intracelular 23,24, biologia celular e de base 25-27 demonstrando a ampla utilidade destas culturas na biologia das plantas. Uma vantagem adicional de a-2 é a culturascapacidade para sincronizar as culturas com afidicolina, que pode levar a reprodutibilidade melhorada para a expressão do gene 28 estuda. Além disso, têm sido desenvolvidos métodos para a extracção de 2-POR protoplastos utilizando enzimas de baixo custo 29,30, como as enzimas utilizadas tradicionalmente para gerar protoplastos são de custo proibitivo para sistemas de alto rendimento. Como tal, o protocolo descrito abaixo foi validado usando a cultura em suspensão BY-2, mas deve ser modificável com qualquer cultura em suspensão de células de plantas. Experimentos de prova de conceito são realizadas utilizando um gene repórter da proteína de fluorescência laranja (OFP) (pporRFP) a partir dos Porites de coral Porites rígidos 31 sob o controlo do promotor CaMV 35S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Estabelecimento de culturas de células em suspensão
- Prepara-líquido, por 2 meios adicionando 4,43 g Linsmaier e Skoog, meio basal de 30 g de sacarose, 200 mg de KH 2 PO 4, e 200 g de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 900 mL de água destilada de água e o pH para 5,8 com 0,1 M KOH. Depois de ajustar o pH, ajustar o volume final a 1000 mL com água destilada e autoclave. Os meios podem ser armazenado até 2 semanas a 4 ° C.
- Inocular um frasco Erlenmeyer de 250 mL com 100 ml de líquido BY-2 meios de comunicação e um única peça de BY-2 de calo (> 1 cm em diâmetro) cultivadas num sólido por-dois meios (líquido BY-2 meios com a adição de 1% agar) e selar com folha de alumínio. Incubar a cultura a 28-30 ° C com agitação durante 5 dias.
NOTA: BY-2 calo é mantida em meio sólido para armazenamento de longo prazo, como culturas líquidas irão rapidamente crescer demais. volume de cultura pode ser ajustado como necessário, tipicamente, um mL de cultura de 100 será capaz de carregar trinta e três 6-wplacas ELL. - Transferência de 2 ml de fase log BY-2 cultura a 98 mL de frescos Media By-2 e incubar por 5-7 dias a 28-30 ° C com agitação.
NOTA: Sub-cultura de culturas líquidas estabelecidas pode ser levada a cabo regularmente utilizando 1: 100 diluições de 5-7 dias de idade, culturas, em vez do que a inoculação com calo. - Misturar cuidadosamente a cultura, as células irão resolver rapidamente, e a transferência de 6 ml da cultura de células para um tubo de centrifugação de fundo cónico de 15 ml e deixa as células assentar durante pelo menos 10 min. Ajustar o volume de células empacotadas a 50% do volume total, removendo o sobrenadante.
- Agitar tubo, invertendo e pipeta de 500 uL em cada poço de uma placa de 6 poços para a digestão. Use pipetas de grande calibre para transferir as células nesta fase, visto que são densos e vai obstruir pontas de pipetas convencionais.
2. protoplastos Isolamento
- Ligue todos os componentes do sistema robótico (Figura 1A) e abrir a tarefa placa movimentador de agendamento suavelouça. O programa de agendamento de tarefas integra o motor de microplacas com o outro equipamento para permitir a transferência de placas entre cada peça de equipamento.
- Antes da experimentação, definir as especificações técnicas de material de laboratório (por exemplo, pratos, tampas) utilizados no protocolo, bem como posições inicial e final para cada peça de material de laboratório, no software de placa de motor, como segue:
- Clique em Configuração no bar principal ferramenta no software placa motor e selecione o Container de comando Gerenciar Tipos.
- Se o tipo de recipiente é listada na biblioteca de tipo de recipiente existente, em seguida, selecione o recipiente adequado.
- Se o tipo de recipiente não estiver listado na biblioteca tipo de recipiente existente, em seguida, clique em Adicionar para especificar um novo tipo de recipiente.
- Depois de adicionar um novo tipo de recipiente, insira as dimensões do novo contêiner (altura, largura, dimensões de empilhamento, e pinça de compensação) nas guias apropriadas e clique em Salvar.
- Se as dimensões corretas não estão disponíveis a partir do fabricante, em seguida, determinar com precisão todas as dimensões ao milímetro utilizando pinças. Erros na medição das dimensões do contêiner irá resultar em falha do motor placa.
- Repita os passos 2.2.2 através 2.2.4.1 para todos os tipos de recipiente que o motor placa vai encontrar. Depois de se completar este passo para todo o material usado, é necessário definir o início e o fim de localização para cada recipiente (passo 2.2.6).
NOTA: Para este protocolo o material de laboratório inclui a placa de 6 poços, a placa de poço profundo, ea placa de rastreio de 96 poços fluorescente. - Para definir a posição de início e fim de cada recipiente, clique na guia Início / Fim de um protocolo específico. Primeiro, selecione a posição de início de cada recipiente. Em seguida, marque a caixa Lidded / Unlidded tanto no início e fim posição. Repita o procedimento para todos os recipientes.
NOTA: Se o recipiente será deixado em um outro pedaço de equipment (em vez do motor de placa) a localização final pode ser deixado em branco.
- Nesta fase carregar manualmente todas as placas para a posição inicial para todo o fluxo de trabalho. Carregar as placas de 96 poços de rastreio fluorescente no hotéis 2, placas de 6 poços com células BY-2 em Hotel 3, uma placa 96 de poço profundo que vai ser utilizado para a transformação em placa de aquecimento / arrefecedor ninho 2, e uma cónico de 50 ml tubo contendo a solução de enzima (ver arquivo suplementar, Secção 1.2.2) para o distribuidor multi-modo.
- Se transformação vai ser levada a cabo no protocolo, pré-carregar a placa de poços profundos com 96 a 10 ul de plasmídeo de ADN por cavidade (1 mg / mL, Uma 260/280> 1,8) contendo a construção repórter OFP e incubar no prato aquecedor / refrigerador a 4 ° C. Cada poço vai ser usado para uma única transformação, portanto, o número de poços cheios dependerá da configuração experimental.
- Coloque todos os suprimentos e placas no automatizard plataforma de manipulação de líquidos nos locais designados e definir a posição de cada item no software de controle de automação (Figura 1B).
- Carregar uma placa de 96 poços pré-carregado com 200 uL de PEG a 40% em MMG (manitol 0,4 M, MgCl2 100, MES 4 mM, pH 5,7) na coluna 1, 200 ul de iodeto de propídio (PI, 1 ug / ml) na coluna 2, e 200 mL de etanol na coluna 3 (ninho 2), e uma caixa de pontas de pipeta no ninho 8.
- Para definir a localização do material de laboratório no software da plataforma automatizada de manipulação de líquidos, selecione Ferramentas no menu e clique em Editor médico laboratorial.
- Selecione o tipo de material de laboratório no menu suspenso ou definir um novo tipo de material de laboratório usando o botão New médico laboratorial.
- Definir a posição de cada pedaço de material de laboratório selecionados, selecionando a guia Protocolo principal e clicando em Configurar médico laboratorial. Certifique-se de que cada pedaço de material de laboratório colocado sobre a plataforma de manuseamento de líquidos é automatizadodefinida antes de executar o protocolo.
- Para acionar os protocolos automatizados, clique janela do Explorer do perfil e selecione o nome do protocolo a ser executado (protoplastos isolamento, contagem de células, e Transformação mediada por PEG).
- Clique em Executar para inicializar todos os dispositivos que serão usados no protocolo.
- Finalmente, na janela de trabalho Explorer, clique em Adicionar Unidade de Trabalho para verificar todos os recipientes / material de laboratório no sistema e começar o protocolo automatizado.
NOTA: As descrições completas dos protocolos automatizados estão contidos no arquivo suplementar.
3. Estabelecer curva padrão para contagem de células
- Concentrar manualmente protoplastos, a uma concentração de 1 x 10 6 protoplastos / ml num volume de 1 ml. Centrifugar protoplastos a 1.000 xg durante 10 min, e remover o sobrenadante.
- Manualmente adicionar 900 ul de etanol a 70% (mantida a 4 ° C) para o sedimento de protoplastose re-suspender o pellet. Incubar durante 10 min em gelo para fixar as células.
- Adicionar 100 ul de Pi (1 ug / ml) aos protoplastos para rotular os núcleos e permitem a detecção de pelo leitor de placas.
- Carga de 80 ul de líquido BY-2 meios para cada coluna e linha de rastreio da placa de 96 poços de fluorescência a partir de coluna 2.
- Na coluna 1 da placa de 96 poços de rastreio fluorescente, adicionar 70 ul de protoplastos e 50 uL BY-2 meios para cada poço na coluna.
- Coloque a placa no ninho 6 da plataforma de manipulação de líquidos automatizado, e executar uma diluição em série de 2 vezes.
- Para realizar uma diluição em série na plataforma de manipulação de líquidos automatizado, clique em Assistente de diluição de série Lançamento e ajustar o volume de transferência (60 pi), o número de misturas e de volume (2, 70 mL), poços iniciais (coluna 1, linhas AF), a diluição Wells (Colunas 2-11, linhas AF), e aspirado e dispensar propriedades (0,5 mm de bem inferior).
- Depois de definir os parâmetros, salvar umd executar o protocolo.
NOTA: Uma vez que todos os protoplastos são marcadas com PI (devido à fixação das células), a fluorescência é proporcional à concentração de protoplastos. - Após a diluição em série é concluída, remova a placa do ninho 9 e inserir no leitor de placas e executar o protocolo de curva padrão no software leitor de placas.
NOTA: Uma curva padrão irá então ser gerado por comparação da fluorescência de PI (excitação 536 nm / emissão 620 nm) em cada poço com a concentração de protoplastos conhecido.
- Após a conclusão do protocolo de leitor de placas, remova a placa e recolher as células transgênicas para autoclave ou outros procedimentos de-vitalização tal como definidas em protocolos de biossegurança ".
4. Análise microscópica da Transformação
- Retire a placa com protoplastos transformados (o produto de Automated Protocolo 3, Supplemental Arquivo) do Hotel 1 do sistema robótico.
- vezem microscópio invertido, câmera, e lâmpada fluorescente.
- Seleccione a objectiva 10X inicial para incidindo sobre os protoplastos, ligue a lâmpada de halogéneo, e fechar o obturador para a lâmpada fluorescente.
- placa de carga em sistema microscópica e foco nos protoplastos usando brightfield.
- Depois de focar protoplastos, desligar a lâmpada de halogéneo e abrir o obturador para a lâmpada fluorescente.
- Seleccionar o filtro CY3 / TRITC definido para a visualização da proteína expressa por pporRFP os protoplastos transgénicos.
- Digitalizar cada poço para determinar o número de protoplastos expressando o pporRFP marcador fluorescente.
- Calcula-se a eficiência de transformação medida que o número total de protoplastos que expressam o marcador fluorescente o número total de protoplastos.
- Recolher quaisquer placas contendo células transgênicas em sacos de biossegurança aprovados para autoclave ou outros procedimentos de-vitalização tal como definidas em protocolos de biossegurança ".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
No presente estudo, a taxa de duplicação de BY-2 variou entre dependente da temperatura à qual as culturas foram incubadas, consistente com relatórios anteriores de uma duração do ciclo celular médio de 15 h 14-18 h. Com esta taxa de duplicação, de 1: 100 a partir de inoculo foi utilizado para iniciar culturas, levando a culturas com um volume empacotado de células (PCV) de 50% em 5-7 dias. No protocolo actual, em que as culturas foram cultivadas em 200 ml de meio, o hematócrito de 100 ml foi gerado em 7 dias, o que proporcionou células suficientes para preencher 33 placas de 6 poços. Em termos de rendimento de protoplastos, a digestão com as condições especificadas no protocolo gerado 4,70 x 10 5 5,77 x 10 ± 3 protoplastos por poço, resultando em 2,82 x 10 6 protoplastos por placa de 6 poços (Figura 2A). Com base nestes dados, 214 placas de 96 poços (70 uL de protoplastos por poço) pode ser carregado a partir de um único digestão placa de 6 poços, com o potencial for duas placas de 6 poços para ser digerido simultaneamente, utilizando as duas estações de placa de aquecimento / arrefecedor. Assim, o número máximo de protoplastos que podem ser gerados durante um único protocolo de digestão de três horas é de 5,64 x 10 6.
Embora o número total de protoplastos gerados por digestão protocolo proporciona uma métrica para o sistema, que é igualmente necessário para avaliar a perda em concentração de protoplastos como os protoplastos são transferidos através dos diversos passos do protocolo. Como tal, a concentração de protoplastos foi avaliada após cada passo de transferência no protocolo. Após o protocolo de digestão, 1,15 x 10 4 1,35 x 10 ± 2 protoplastos foram transferidas para cada poço das placas de 96 poços profundos, se conduzir o protocolo de transformação, ou a placa de rastreio de 96 cavidades fluorescente (Figura 2B). Uma vez que o protocolo de transformação foi concluída, 1,23 x 10 3 ± 4,66 x10 1 protoplastos foram transferidos para a placa de 96 poços de rastreio fluorescente (Figura 2C). Além do número de protoplastos transferidas, foi importante determinar a viabilidade dos protoplastos para garantir que as várias etapas de pipetagem não danificar os protoplastos.
Com base nos resultados do ensaio de viabilidade, 95,1 ± 0,04% de protoplastos foram viáveis após a digestão, 92,1 ± 0,06% após a transferência para a placa de 96 poços de rastreio fluorescente, e 91,7 ± 16,67% após o protocolo de transformação. Apesar de vários passos de pipetagem, não houve diferença significativa (p> 0,44) entre qualquer das amostras. Em adição a esta medida de viabilidade, foi desenvolvido um protocolo para a determinação da concentração de protoplastos em qualquer fase do procedimento através da medição do número total de protoplastos coradas com PI. Como mostrado na Figura 3, a curva padrão foi generated através da medição da intensidade de fluorescência para concentrações conhecidas de protoplastos a partir do sistema. A curva padrão era um bom ajuste (R 2 = 0,967) com o número total de protoplastos que abrangem a gama de 0 a 30000 protoplastos por poço. Para validar a curva padrão, a intensidade de fluorescência de amostras com um número conhecido de protoplastos (8125 e 24375 calculados utilizando um hemocitómetro) foi obtida e o número de protoplastos calculados a partir da equação da curva padrão. Com base nestes resultados, a curva padrão previsto 9.560 e 28.200 protoplastos em cada poço, um erro de 15 e 14%. Considerando que existe também a variabilidade na medição do número de células utilizando um hemocitómetro, este erro foi considerada aceitável.
Para além dos resultados sobre o número de células e viabilidade, o protocolo de transformação foi bem sucedido na geração de células transgénicas que expressam OFP (Figura 2D - M). Infelizmente, o protocolo utilizado resultou em baixo, ~ 2%, a eficiência de transformação, devido ao plasmídeo binário 16028 pb grande utilizado neste estudo e uma vez que o protocolo não foi optimizado especificamente para BY-2 protoplastos. Optimização do protocolo de transformação, em termos de reagentes e condições especificamente para a-2 protoplastos, é esperado um aumento da eficiência de transformação, como apresentado na discussão. Em termos deste protocolo, o procedimento de transformação foi projetado para demonstrar o caminho prova-de-conceito de isolamento de protoplastos para transformação, e foi bem sucedido na consecução deste objectivo.
Depois de validar com sucesso todos os procedimentos individuais, métricas foram obtidos para a timecourse do protocolo de isolamento de protoplastos para transformação. Como demonstrado na Figura 4, o grande investimento do tempo é utilizado durante a fase de digestão, em que 3 h foi necessária for digestão completa da parede celular e a libertação dos protoplastos. Durante este procedimento, 18 loops são executados entre a estação de incubação placa shaker e placa de aquecimento / chiller 1, com o motor placa mover a placa entre as duas estações. O tempo de transferência entre o agitador de placa e placa de aquecimento / chiller 1 leva apenas 8,9 segundos, e garante que a maior parte do processo de digestão é gasto incubação e agitação. O tempo total a partir do início do processo para concluir o carregamento das enzimas pelo distribuidor multi-modo é de 2,2 min. Em geral, o protocolo completo isolamento de protoplastos é completada em 3 h e 22,8 min. Com base nestes resultados, 88% de o protocolo de isolamento de protoplastos é gasto a digestão. Depois de se completar o protocolo de isolamento de protoplastos, o protocolo de transformação é iniciada e completada dentro de 27,5 min. Semelhante ao protocolo de isolamento de protoplastos, 72% de o procedimento de transformação é gasto incubação da reacção. O único outro passo no protocoloque tem uma componente significativa de tempo (> 10% do tempo total do processo) é de inicialização do protocolo por a plataforma de manuseamento de líquidos automatizado, o que representa 14% do tempo total do processo. Deste modo, 86% do protocolo é gasto na inicialização e a incubação, com apenas 14% do tempo gasto em passos de pipetagem e de transferência. A duração completa de isolamento de protoplastos e transformação foi de 3 horas, 50 minutos e 53 segundos, sem entrada externa exigido do operador.
Figura 1:. Esquemático da plataforma robótica e configuração da plataforma de manipulação de líquidos automatizado durante o protocolo (A) O sistema robótico é composto por 3 pilhas placa / hotéis que podem ser acessados pelo motor placa. Hotel 1 é a estação de cobertura / delidding designado, o Hotel 2 é a fluorescência de 96 poçospilha de placas, e Hotel 3 é a pilha de placas de 6 poços. O sistema tem dois manipuladores de líquidos, uma plataforma de manuseamento de líquidos automatizado, e um distribuidor multi-modo à base de bocal. Para o aquecimento / arrefecimento da plataforma robótica tem duas unidades de frio de aquecimento / placa, juntamente com um agitador de placas para misturar o prato. Finalmente, o sistema tem um leitor de placas à base de monocromador para a medição de fluorescência. Todos os componentes estão alojados num Biossegurança Gabinete personalizado construído. (B) A partir configuração da plataforma de manipulação de líquidos automatizado com ninho 2 ocupado pela chapa de reagente e a caixa de ponta colocado no ninho 8. (C) a configuração da plataforma de manipulação de líquidos automatizado antes de chamar um protocolo experimental. Uma placa de poços profundos está localizado no ninho 4, uma placa de 96 poços de rastreio fluorescente está localizado no ninho 6, e a placa de 6 poços contendo protoplastos está localizado no ninho 5. Por favor clique aqui para v IEW uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de by-2 protoplastos após cada transferência e após transformação com o gene repórter da proteína fluorescente laranja (A - C) As micrografias de EM-2 densidade de protoplastos em 6 poços da placa, placa de 96 poços após a transferência de 70. ul a partir da placa de 6 poços, e de 96 cavidades fluorescente placa de rastreio pós-transformação. (D) micrografia Brightfield de BY-2 protoplastos após a transformação. (E) fluorescente BY-2 protoplastos que expressa o gene OFP visualizada usando um conjunto filtro / TRITC Cy3. (F) Sobreposição de claro e micrografias fluorescentes demonstrando a baixa eficiência de transformação. Barra de escala = 50 mm. target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Curva padrão para calcular o número de protoplastos O número de protoplastos em uma bem determinada pode ser calculada por comparação da intensidade de fluorescência em unidades arbitrárias (UA), para a equação para a curva padrão. A validação do número de protoplastos foi comparado entre a curva padrão e hemocitómetro no ponto indicado no gráfico, com 9.561 protoplastos identificados a partir do leitor de placas, e 8125 contados no hemocitómetro. No geral, foi encontrado um erro de 15% entre as duas técnicas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
re 4 "src =" / files / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
Figura 4:. Gantt para o processo descrito para a produção de sub-2 protoplastos e transformação genética A maior parte do protocolo, ~ 3 h, é passado sobre a digestão das células BY-2 para gerar os protoplastos. Carregando da solução de enzima e inactivação requerem apenas 12% do tempo total de processo. De igual modo, a incubação da reacção de transformação no agitador de placas corresponde a 72% do protocolo de transformação. No geral, o procedimento de isolamento de protoplastos até transformação genética é alcançada é menos de 4 horas (3 horas, 50 min e 53 seg). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ficheiro suplementar: protocolos automatizados para o isolamento de protoplastos, a contagem de células, e transformação mediada por PEG <./ strong> protocolos completos desenvolvidos para uso na plataforma robótica para realizar cada uma das tarefas listadas acima estão incluídos neste arquivo. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo acima descrito foi validada com êxito para o isolamento de protoplastos, enumeração e transformação usando a cultura de células em suspensão BY-2 de tabaco; No entanto, o protocolo pode ser facilmente estendida a qualquer planta de cultura em suspensão. Actualmente, o isolamento e transformação de protoplastos foi alcançado em numerosas plantas, incluindo o milho (Zea mays) 10, cenoura (Daucus carota) 32, álamo (Populus euphratica) 33, de uva (Vitis vinifera) 34, óleo de palma (Elaeis guineensis) 35 , alface (Lactuca sativa) 36, mostarda (Brassica juncea) 37, arroz (Oryza sativa) 38, e switchgrass (Panicum virgatum) 39,40. Embora a variação nas condições de cultura e de digestão ocorrer a partir de uma espécie para outra, em termos de o protocolo desenvolvido neste trabalho, substituindo os meios de cultura ou alterando as condições de escavaçãoestion não deve alterar o protocolo fundamental. Para ajustar a diferentes espécies, meios de cultura e as enzimas necessárias para a digestão são carregados pelo operador antes da inicialização do protocolo, assim trocar estes componentes é trivial. Como um benefício adicional, o protocolo pode ser alterada para rastreio de várias condições de digestão com o rendimento de protoplastos medidos pelo sistema. Este é um componente essencial, como a utilização de enzimas de baixo custo são necessários para aplicações de alto rendimento, portanto, é importante minimizar a quantidade de enzimas utilizadas na digestão.
Similar à cultura e à digestão, seria necessário modificações no protocolo de transformação aquando da adopção do sistema de transformação de protoplastos isolados de diferentes espécies vegetais. Um trabalho considerável tem sido conduzida na optimização de transformação mediada por PEG em protoplastos de plantas 16,35, com numerosos factores que afectam a eficiência da transformação. No actual WORK um factor limitante que afecta a eficiência de transformação foi o grande tamanho do plasmídeo binário de teste, 16028 pb, o qual foi utilizado para efeitos de modelagem de um tamanho plasmídeo de edição de genoma. Em estudos anteriores sobre a transformação mediada por PEG de protoplastos BY-2, 40-60% transformação foi alcançada; No entanto, estes estudos utilizaram pequenos 5.000 plasmídeos bp 41,42. Os primários modificações para a transformação mediada por PEG entre espécies incluem a concentração de PEG e MgCl2, quantidade e a concentração de ADN, e a duração da reacção. À medida que as soluções de PEG 2 e MgCl são introduzidos no sistema sobre a placa reagente, e o ADN é pré-carregado na placa de poços profundos, estas condições podem ser facilmente modificados no protocolo descrito acima. Além disso, aumentando ou diminuindo o tempo de incubação, juntamente com a modificação de velocidades de mistura, pode ser precisamente controlada pela plataforma robótica. A limitação atual do protocolo de transformação é a faltade rastreio utilizando o leitor de placas para detectar o repórter fluorescente, devido à sua baixa eficiência de transformação mediada por PEG em BY-2 protoplastos. Em outras espécies, tais como Arabidopsis thaliana e de milho 16, transformação mediada por PEG é 40-90% eficaz. Em tais sistemas de transf ormantes pode ser caracterizado rapidamente utilizando o leitor de placas no robot. Assim, seria possível identificar poços com transformantes positivos, e também quantificar o nível de expressão. Para aplicações, tais como o rastreio promotor, esta característica iria aumentar a utilidade do protocolo actual, e serão adicionadas em iterações posteriores do sistema.
Além da otimização da eficiência de transformação para a-2 protoplastos, várias modificações podem aumentar a eficiência ea produtividade geral do sistema. Estudos anteriores sobre a automação de transformação de protoplastos para protoplastos permitido assentar no fundo dos poços, antes da adição de estavah soluções 43. No protocolo atual, protoplastos foram misturados no agitador placa para evitar a sedimentação e manter os protoplastos em suspensão usando placas de poços de fundo plano. Além disso, durante a transformação, protoplastos não foram autorizados a instalar-se nas placas de poços profundos, para reduzir a exposição ao PEG, que pode ser tóxico ao longo de exposição prolongada. Como tal, os protoplastos foram diluídas ~ 10 vezes com solução W5 quando transferidos a partir da placa de poços profundos para o rastreio da placa de 96 cavidades fluorescente, resultando em 1,23 x 10 3 ± 4,66 x 10 protoplastos 1 por poço. A fim de aumentar o número de protoplastos transferidos após a transformação, uma etapa de incubação pode ser adicionado para permitir que os protoplastos de resolver, e o sobrenadante foi removido, seguido pela adição de um volume menor de líquido meios BY-2. Além disso, se uma centrífuga à base de placa foi adicionado ao sistema, este passo pode ser alcançado mais rapidamente. Outra modificação que pode adicionar funcionalidade para tele sistema seria a utilização de um ensaio de fluorescência ao vivo / morto para determinar a viabilidade dos protoplastos isolados antes da transformação. No protocolo atual, diacetato de fluoresceína (FDA) foi testado como um corante ao vivo; no entanto, a BY-2 fundo de protoplastos de fluorescência obscurecido o sinal FDA. Se foi utilizado um corante de viabilidade mais estável, em seguida, a viabilidade de protoplastos pode ser determinado como a proporção da vermelha (PI) para o verde (calceína AM, etc.), a fluorescência, e padronizada semelhante ao protocolo de contagem de células. Estas modificações iria aumentar ainda mais a funcionalidade do sistema, e será incluída em protocolos futuros.
Com relação ao protocolo atual, há vários passos críticos que devem ser seguidas para garantir o sucesso do protocolo. Em primeiro lugar, a idade / saúde dos BY-2 culturas é essencial para garantir que os protoplastos viáveis podem ser isoladas para as etapas subsequentes. Tal como explicado no passo 1.3, através da transferência de uma cultura em fase logarítmica para um balão de fresco numa01:50 proporção de células para meio fresco, e permitindo que a cultura a crescer durante 5-7 dias, o número máximo de protoplastos viáveis pode ser isolado. Permitindo que as culturas a crescer durante períodos mais longos ou mais curtos, usando o inoculo especificado irá reduzir de forma significativa o rendimento de protoplastos, e causar falha de protocolos subsequentes. Um segundo passo é crítico passo 1.5, já que o uso de pontas de pipeta padrão, em vez das pontas de pipeta de largura de cano especificados, fará com que as pontas para obstruir e causar os volumes incorrectos a ser transferidos. No que diz respeito à configuração do sistema robotizado, o arranjo das placas na plataforma automatizado de manuseamento de líquidos, o passo 2.4, é crítica, com uma configuração modificada impedindo a cabeça do manipulador de líquido de alcançar todos os poços na placa de 6 poços. Devido ao desenho da plataforma de manuseamento de líquidos automatizado, a placa de 6 poços devem ser colocados no ninho 5, ou protocolos seleccionados para este instrumento irá falhar. Da mesma forma, a incapacidade de definir correctamente o material de laboratório na placasoftware motor, etapa 2.2, fará com que o instrumento deixar de pegar ou largar o material de laboratório resultando no término do protocolo. Para o protocolo de contagem de células, o passo crítico envolve a fixação das células com etanol, passo 3.2. Se as células não são fixadas antes da marcação com PI, apenas as células não viáveis irá ser marcado, em vez de toda a população de protoplastos, e não será possível contar o número de protoplastos isolados. O passo crítico final, etapa 4.6, envolve a selecção dos filtros fluorescentes para análise microscópica da expressão do marcador fluorescente pporRFP. O uso de outros conjuntos de filtros de "vermelhos" permite a fluorescência de fundo de clorofila, aumentando significativamente o sinal em todos os protoplastos contendo cloroplastos, evitando o cálculo da eficiência de transformação. Cuidadosamente aderindo às especificações nestas etapas críticas garante a maior oportunidade para o sucesso e a geração das datas mais reprodutíveiset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
