Summary
من أجل فهم الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية، فمن المهم استخدام نماذج يمكن الاعتماد عليها. هذه الورقة سوف تصف واحد من النماذج السكتة الدماغية الأكثر استخداما في الفئران، ويطلق عليه نموذج المتوسطة الدماغي انسداد الشريان (MCAo) (كما وصف خيوط داخل اللمعة أو نموذج خياطة) مع ضخه.
Abstract
السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، وتستمر لتكون واحدة من الأسباب الرئيسية للإعاقة الكبار على المدى الطويل. حوالي 87٪ من السكتات الدماغية هي الدماغية في الأصل وتحدث في أراضي الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر). حاليا فقط إدارة الغذاء والدواء (FDA) وافقت المخدرات لعلاج هذا المرض الفتاك هو منشط البلازمينوجين النسيجي (TPA). ومع ذلك، منشط البلاسمينوجين النسيجي لديه نافذة العلاجية صغير لإدارة (3-6 ساعة)، وغير فعالة إلا في 4٪ من المرضى الذين يحصلون عليها بالفعل. يركز البحث الحالي على فهم الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية من أجل العثور على الأهداف العلاجية المحتملة. وهكذا، ونماذج يمكن الاعتماد عليها هي الحاسمة، و(MCAo) نموذج MCA انسداد (تسمى أيضا داخل اللمعة خيوط أو خياطة نموذج) والتي تعتبر نموذج الجراحية الأكثر صلة سريريا من السكتة الدماغية، وهي إلى حد ما غير الغازية واستنساخه بسهولة. وعادة ما تستخدم نموذج MCAo مع القوارض، خاصة مع الفئران بسببإلى كل الاختلافات الجينية المتاحة لهذه الأنواع. نحن هنا وصف (وموجودة في شريط الفيديو) كيفية تنفيذ بنجاح نموذج MCAo (مع ضخه) في الفئران لتوليد بيانات موثوقة وقابلة للتكرار.
Introduction
السكتة الدماغية هي السبب الخامس للوفاة في جميع أنحاء العالم، مع شخص واحد يموت من المرض كل 4 دقائق. أكثر من 800،000 الاميركيين يعانون من السكتة الدماغية كل عام، وهي ليست مدمرة فقط للمريض، ولكن أيضا لعائلاتهم. السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي للعجز الكبار، ويقدر الإنفاق السنوي ليكون في ترتيب 36500000000 $ 1 على الرغم من عدد قليل جدا من خيارات العلاج يجري المتاحة.
منشط بلاسمينوجين النسيجي (TPA) هو الوحيد إدارة الغذاء والدواء (FDA) مرخصة المخدرات للسكتة الدماغية. ومع ذلك، فإنه لا تكون فعالة إلا إذا ما تم إعطاؤها للمرضى في غضون 3-6 ساعات من بداية السكتة الدماغية، وفي هذه الحالات فهي تستفيد سوى 4٪ من المرضى 2. وبالتالي، فمن الضروري أن يتم استخدام استنساخه، النماذج الحيوانية ذات الصلة سريريا من السكتة الدماغية للمساعدة في وضع استراتيجيات والعلاجات المحتملة لهذا المرض. ومن المهم أن نلاحظ أنه في المختبر في النماذج الحية ضرورية.
النوع الاكثر شيوعا من السكتات الدماغية هو في الأصل، وهو ما يمثل 87٪ من إجمالي السكتات الدماغية. السكتات الدماغية الأخرى نزيف داخل المخ (9٪) ونزيف تحت العنكبوتية (4٪)، وتسببت في معظم الأحيان من قبل الصمات إلى الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر). ويعزى هذا إلى منحنى بارز في جذور مولودية الجزائر، الذي يسبب تدفق الصفحي الدم الى الدماغ لتصبح تعطلت. وMCA ينشأ من الشريان السباتي الداخلي (ICA) والطرق على طول التلم الجانبي، حيث الفروع والمشاريع في العقد القاعدية والسطوح الجانبية للالجبهي، الجداري والفص الصدغي، بما في ذلك المحرك الأساسي والقشرة الحسية. يتم إنشاء دائرة ويليس من الشرايين الدماغية الخلفية يجريتوصيل الشرايين الدماغية والخلفي التواصل الشرايين.
خيوط أو خياطة نموذج داخل اللمعة من MCAo هي واحدة من الأكثر استخداما في البحوث السكتة الدماغية. ومع ذلك، هناك بضعة أشكال مختلفة لهذا النموذج، وهذه هي على أساس ما إذا تم إدراج خييط في الشريان السباتي الخارجي (ECA، ووصف طريقة لونجا) 3، أو ما إذا كان يتم إدراجها في ICA (يدعى كويزومي طريقة) 4. في طريقة كويزومي، الشريان السباتي المشترك (CCA) على جانب الجراحة يجب أن تكون مرتبطة بشكل دائم إذا تم إزالة خيوط لمنع نزيف من شق في التقييم القطري المشترك، بينما في طريقة لونجا انها هي اللجنة الاقتصادية لأفريقيا يجب أن تكون مرتبطة 5 بشكل دائم . هنا سيتم استخدام طريقة لونجا ونحن نرى أن هذا هو أعلى بكثير، ونموذجا الجراحية أكثر أهمية سريريا من السكتة الدماغية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام حيدة ذات الرؤوس السيليكون، وخصوصا مع طريقة لونجا، وتنتج جدا MCAo استنساخه بدلا من الأحادية-اضعافها لهب، والتي غالبا ما تنتج انسداد ناقصة و / أو نزيف تحت العنكبوتية (6).
طريقة خيوط داخل اللمعة يمكن استخدامها كنموذج لل4،6 انسداد دائم أو مؤقت. لأداء نموذج عابرة، تتم إزالة خيوط بعد فترة من نقص التروية (على سبيل المثال، 30 دقيقة، 60 دقيقة، أو 2 ساعة) يسمح، وضخه إلى ذلك. هذا النموذج، إلى حد ما، يحاكي استعادة تدفق الدم بعد التدخل العفوي أو العلاجي (على سبيل المثال، إدارة TPA) إلى ليز جلطة الانسداد التجلطي في البشر. لنموذج دائم، هو بكل بساطة ترك خيوط في مكان لفترة من الوقت (على سبيل المثال، 24 ساعة)، حتى لا يحدث ضخه. ميزة أخرى لهذا الأسلوب خيوط داخل اللمعة هو حقيقة أن حج القحف لا تحتاج إلى أن يؤديها، والسماح للالجمجمة إلى أن تترك سليمة وتجنب أي تغيرات في الضغط داخل الجمجمة ودرجة الحرارة.
معشوقة = "jove_content"> في هذا الفيديو نحن لشرح كيفية تنفيذ ونجا طريقة خيوط داخل اللمعة للحث على MCAo وضخه. وتبين لنا أيضا كيفية تنفيذ النتيجة العصبية 18 نقطة وتحديد حجم احتشاء باستخدام 2،3،5-triphenyltetrazalium كلوريد (TTC) تلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول والتجارب التي أعلن عنها في شريط الفيديو عن طريق لجنة LSUHSC-S المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام وهم في الامتثال للمبادئ التوجيهية من المعاهد الوطنية للصحة.
ملاحظة: ذكر C57BL / 6 الفئران وزنها 25 - تم استخدام 29 غرام في هذه الدراسة. تم الحفاظ على الفئران على نظام غذائي موحد طعام بيليه مع حرية الوصول إلى المياه، في ظل 12 ساعة دورة الضوء / الظلام في أقفاص التهوية بشكل فردي. سيتم إجراء العملية تحت ظروف معقمة باستخدام تقنيات معقمة (على سبيل المثال، والقفازات المعقمة، أدوات معقمة).
الاستعدادات 1. مرحلة ما قبل العمليات الجراحية
- حمل التخدير باستخدام مزيج من الكيتامين (150 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حقن داخل الصفاق (IP). رصد عمق التخدير عن طريق قرصة القدم في البداية كل 3-5 دقيقة وكل 10 دقيقة مرة واحدة ويتم تحقيق التخدير. في حين أن الحيوان هو تحت التخدير وإدارة مرهم العين عقيمة لمنع جفاف. الجرعة الأولي من الكيتامين / زيلازين يستمر عادة من أساسهامن 30-40 دقيقة. يمكن أن تدار جرعة إضافية إذا لزم الأمر، والذي يتم التحقق من قبل استجابة الحيوان للقرصة القدم.
- وضع الفئران في موقف ضعيف على تنظيم درجة الحرارة حصيرة الحرارة والحفاظ على درجة حرارة الجسم في 36.5 ± 0.1 درجة مئوية، والتي يتم التحقق منها باستخدام مسبار المستقيم.
- حلق الرقبة وتطهير الجلد مع 70٪ الكحول الإيثيلي.
2. انسداد MCA (الشكل 1)
- جعل شق خط الوسط الرقبة باستخدام قزحية المقص مباشرة وسحب (باستخدام مبعدات) الأنسجة الرخوة لفضح السفن.
- تشريح التقييم القطري المشترك واللجنة الاقتصادية لأفريقيا من الأنسجة المحيطة باستخدام ملقط دومون دون الإضرار العصب المبهم.
- جعل خياطة مؤقتة عن طريق ربط عقدة فضفاضة حول التقييم القطري المشترك باستخدام 6-0 الحرير.
- جعل خياطة دائمة حول اللجنة الاقتصادية لأفريقيا والسفن الصغيرة التي تمتد من من قبل ligating بإحكام السفن (القاصي إلى التشعب من CCA).
- جعل آرو خياطةاوند القريبة اللجنة الاقتصادية لأفريقيا إلى التشعب التقييم القطري المشترك.
- وضع مقطع microvessel حول الشريان السباتي الداخلي (ICA) والشريان الحنكي (PPA).
- إجراء شق صغير في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا باستخدام الجزئي تشريح مقص الربيع وادخال 180 ميكرون ذات الرؤوس السيليكون حيدة. جعل خفض أقرب إلى خياطة دائمة ممكن لتسهيل التلاعب في خيوط.
- تشديد خياطة مؤقتة حول اللجنة الاقتصادية لأفريقيا مع خيوط إدراج وإزالة مقطع microvessel.
- قطع اللجنة الاقتصادية لأفريقيا بين دائمة، خياطة القاصي ونقطة دخول خيوط باستخدام الجزئي تشريح مقص الربيع.
- توجيه خيوط من خلال ICA حتى يشعر المقاومة (حوالي 9 - 10 ميكرون وراء التشعب التقييم القطري المشترك) في MCA.
ملاحظة: في حال شعرت الكثير من المقاومة في حين أن الغالبية العظمى من خيوط لا تزال واضحة، وخيوط قد دخلت المؤسسة العامة للتقاعد. إذا حدث هذا، وسحب خيوط العودة إلى التشعب، بلطف صديدح قدما في ICA باستخدام ملقط دومون، وتقدم إلى خيوط حتى يمكن تصور في ICA.
3. ضخه
- بعد فترة انسداد 30 دقيقة، إزالة خيوط عن طريق سحب بلطف مرة أخرى باستخدام ملقط دومون وتأمين خياطة حول نهاية مفتوحة للجنة الاقتصادية لأفريقيا.
- إزالة خياطة مؤقتة حول التقييم القطري المشترك من خلال تخفيف بعناية ربطة باستخدام دومون ملقط وتدفق الدم واستأنفت من خلال التقييم القطري المشترك.
- إغلاق شق مع خياطة الجراحية مستمرة. إغلاق الجلد ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق الغرز مستمرة أو متقطعة. المواد الغذائية الجلد هي أيضا وسيلة مقبولة.
- حقن الفئران مع 1 مل من تحت الجلد المالحة من حيث حجم التجارة التجديد ومع كاربروفين مسكن (5 ملغ / كغ، الشوري) لتخفيف الألم والانزعاج من العملية الجراحية، علامات تشير إلى الحاجة لتخفيف الآلام إضافية تشمل منحنية الظهر، ومعطف ungroomed، انخفاض النشاط، غير طبيعيالمواقف، وقلة الشهية.
- مراقبة الفئران في جميع أنحاء التعافي من التخدير في ساخن 30 درجة مئوية القفص باستخدام مصباح الحرارة تنظم استخدام وحدة تحكم في درجة الحرارة ووضع طعام المهروسة في طبق بتري على أرضية القفص لتشجيع تناول الطعام. سيتم إيواء الفئران واحد في القفص خلال فترة ضخه.
4. جراحة الشام
- الفئران تخضع لنفس الإجراء دون الإدراج حيدة.
5. بعد العملية العصبية عشرات (الجدول 1؛ الشكل 2)
- عصبيا تقييم الفئران بعد فترة ضخه المناسبة باستخدام نظام التهديف 18 نقطة تقييم العامة؛ محرك؛ الحسية. استقبال الحس العميق. والنتيجة العصبية أعلى يتوافق مع انخفاض وظيفة الجهاز العصبي.
سوف يتم التخلص الفئران التي يتم الحكم لا تستجيب وغير قادر على المشي: ملاحظة. وسوف تشمل معايير أخرى للقتل الرحيم إنسانية وفقدان الوزن تزيد عن 20٪، دي في الجهاز التنفسيالإجهاد، والعدوى في جميع أنحاء منطقة العمليات الجراحية. وسيتم استخدام غرفة CO 2 للقتل الرحيم وطريقة المادية لتأكيد وفاة سيكون خلع عنق الرحم أو بضع الصدر.
6. قياس الدماغ عائق الحجم (الشكل 3)
- حمل التخدير باستخدام مزيج من الكيتامين (150 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حقن الملكية الفكرية مراقب عمق التخدير عن طريق قرصة القدم في البداية كل 3-5 دقيقة وكل 10 دقيقة مرة واحدة ويتم تحقيق التخدير.
- وضع الفئران في موقف ضعيف وقطع الجلد من البطن في الرقبة تليها الصفاق باستخدام مقص القزحية على التوالي.
- رفع القص باستخدام ملقط دومون وقطع الأضلاع لفضح القلب.
- فتح اليسار والجانب الأيمن من الصدر باستخدام اثنين من أزواج من المرقأة، وفضح القلب.
- اضافة الى وجود إبرة 26 G تعلق على حقنة 5 مل إلى البطين الأيسر وقطع الأذين الأيمن. يروي مع درجة حرارة الغرفة ملحي أو phosphaالشركة المصرية للاتصالات مخزنة المالحة (PBS) حتى يصبح السائل واضح (عادة 3-5 دقائق).
- إزالة الجمجمة بعناية بعيدا عن الدماغ باستخدام مقص القزحية على التوالي، وملقط دومون.
- قطع بصيلات الشم والمخيخ باستخدام شفرة حلاقة بحيث الدماغ سوف يصلح في المصفوفة. استخدام هذه المصفوفة لشريحة الدماغ حتى إلى شرائح. هدئ المصفوفة قبل الاستخدام للحفاظ على النسيج بارد. وضع الدماغ في مصفوفة وضعه على الجليد.
- شريحة الدماغ إلى أجزاء الاكليلية 2 مم باستخدام اثنين من شفرات الحلاقة. يقطع المرحلة الأولى باستخدام شفرة حلاقة ابتداء من 2 مم من أعلى وترك هذا شفرة حلاقة في المكان. جعل 2 ملم تخفيض آخر وراء أولا. إزالة أول شفرة حلاقة مع الأنسجة المرفقة. كرر هذه العملية حتى يتم شرائح جميع الأنسجة.
ملاحظة: يجب أن يكون هناك 4-5 شرائح عند الانتهاء. - وضع شرائح في 24 لوحة جيدا تحتوي على 2٪ 2،3،5-triphenyltetrazalium كلوريد (TTC)، الذي يوضع بعد ذلك في حمام مائي ضحل لر 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. وضع كل قطعة في بئر الفردية يساعد على الاحتفاظ بها في الترتيب الذي قطعت. ضمان أن الحل عقاري يغطي كامل شرائح الأنسجة. بعد 10 دقيقة تتحول جميع شرائح أكثر.
- ضع كمية صغيرة من 10٪ من الفورمالين في الآبار من 24 لوحة جيدا جديدة ونقل شرائح لهذه اللوحة في الترتيب الذي قطعت.
- مسح شرائح في الكمبيوتر وتحليل حجم احتشاء كنسبة مئوية من كامل شريحة الدماغ 6 باستخدام يماغيج برامج التحليل (NIH 1.57 صورة البرنامج) 6.
- الخطوط العريضة للمنطقة محتشية لتوليد قياس المجال. بجانب قياس نصف الكرة الأرضية المقابل كامل لتحديد المنطقة. تقسيم منطقة احتشاء من منطقة نصف الكرة الأرضية المقابل وضرب من قبل 100 لتحديد حجم احتشاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خضع الفئران 30 دقيقة نقص تروية الدماغ الناجم عن MCAo (الشكل 1)، يليه فترة ضخه (يتم عرض 24 ساعة و 1 أسبوع هنا، ولكن طول ضخه يمكن أن يكون متنوع). كان معدل الوفيات خلال MCAo الحد الأدنى (حوالي 2٪). نقص التروية بعد، كان معدل وفيات (خلال أول 24 ساعة) حوالي 26٪.
تم استخدام الليزر دوبلر flowmetry لتأكيد نضح تدفق الدم في إقليم MCA قبل وبعد MCAo / ضخه الشكل 4 يظهر بوضوح أنه عندما يتم تحرير التقييم القطري المشترك التعادل المؤقت بعد 30 دقيقة من نقص التروية لإزالة خيوط وضخه أن يحدث، وهناك طفرة في التروية، والتي وصلت <100٪ من نضح الأساسي (أي قبل الجراحة) 5 دقائق إلى ضخه.
24 ساعة بعد الإصابة بالسكتة الدماغية (قبل قياس حجم احتشاء) neurolتم تقييم عشرات ogical المتعلقة العام، الحسية والحركية والعجز التحفيز (الجدول 1). ويهدف هذا النظام هدفا لتوفير الهدف ( "نعم أو لا") معايير لتقييم الشكل 2 يوضح أن النتيجة بالنسبة للفئران (ن = 27) في 24 ساعة كانت 12.56 ± 0.7، وظلت عالية في وقت لاحق 1 أسبوع (11.50 ± 1.5 ). والنتيجة العصبية أعلى يتوافق مع انخفاض وظيفة الجهاز العصبي.
أحجام احتشاء عكست أنماط مماثلة لدرجة العصبية في 24 ساعة، أي أكبر من الحيوانات صورية. 24 ساعة بعد MCAo، كانت الفئران كميات كبيرة احتشاء (الشكل 3: 15.9 ± 2.6٪)، والتي تصاعدت 1 أسبوع آخر السكتة الدماغية (28.5 ± 1.9٪).
الشكل 1: تخطيطي عرض الموقع من انسداد الشريان الدماغي الأوسط(MCAo) جراحة الأوعية الدموية والأوعية الدموية الكبيرة من الدورة الدموية الدماغية. ويتحقق A. الجراحية MCAo عبر إدخال خيوط في الشريان السباتي الخارجي وبعد ذلك في القريب الشريان السباتي الأوسط. BG. خطوات لإحداث MCAo. الأمامي الشريان الاتصالات (ACA)؛ الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر)؛ الشريان الاتصالات (PcomA)؛ الشريان الدماغي (PCA)؛ الشريان القاعدي (BA)؛ الشريان السباتي الداخلي (ICA)؛ الشريان السباتي الخارجي (ECA)؛ الشريان الحنكي (PPA)؛ الشريان السباتي الداخلي (ICA). (تم التعديل بإذن من سميث وآخرون، المرجع رقم 5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: و18 نقطة السكتة الدماغية نتيجة هذا comprehensiلقد النتيجة السكتة الدماغية بتقييم التحسينات الوظيفية بشكل عام، والحسية والحركية وجوانب التحفيز من سلوك الماوس بعد إصابته بجلطة. البيانات يعني ± SEM. * P <0.05. ن = 3 الفئران / مجموعة. تم تحليل البيانات باستخدام أنوفا بالإضافة إلى بونفيروني الاختبار اللاحق. (تم التعديل بإذن من سميث وآخرون، المرجع رقم 5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تعرض أحجام التداول احتشاء من C57BL / 6 الفئران 24 ساعة بعد MCAo الفئران إلى 30 دقيقة MCAo و 24 ساعة أو 1 أسبوع من ضخه أ) أدمغة أزيلت، مقطوع وملطخة 2٪ 2،3،5-: الرقم 3. كلوريد triphenyltetrazolium (TTC). في الأنسجة الحية، أنزيم نازع للهيدروجين تقليل إنزيمي عقاري ل1،3،5 وإياباhenylformazaon (مدفوعات نهاية الخدمة)، وهو اللون الأحمر، ولكن في الأنسجة الدماغية الإنزيم غير فعال، لذلك يبقى الأنسجة البيضاء. ب) ويبين الرسم البياني زيادة في حجم احتشاء في الفئران نتيجة الاصابة بسكتة دماغية. البيانات يعني ± SEM. ** P <0.002، **** P <0.0001 مقابل صورية. ن = 4 الفئران / مجموعة. تم تحليل البيانات باستخدام أنوفا بالإضافة إلى بونفيروني الاختبار اللاحق. مقياس شريط = 1 سم (تم التعديل بإذن من سميث وآخرون، المرجع رقم 5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: الإرواء من MCA الأرض طوال MCAo وضخه الفئران تعرضوا ل30 دقيقة MCAo، و<5 دقائق ضخه. تم تطبيع خطوط الأساس إلى 100٪. كما بةوكانت المديرية، نضح 5 دقائق في فترة ضخه أعلى من MCAo، أي عند وقوع أي نضح من الأنسجة. البيانات يعني ± SEM. * P <0.05. ن = 3 الفئران / مجموعة. تم تحليل البيانات باستخدام أنوفا بالإضافة إلى بونفيروني الاختبار اللاحق. (تم التعديل بإذن من سميث وآخرون، المرجع رقم 5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: سجل النظام العصبي نقطة واحدة نظرا للإجابة بنعم على كل من الاختبارات. علامات من أصل 18 7،8.
| اختبار | وصف مختصر | ماذا اختبار؟ | المراجع |
| موريس متاهة مائية | إجراء المياه متاهة حقل مفتوح حيث تعلم القوارض للهروب من الماء على منصة مخفية | الذاكرة المكانية، ومراقبة الحركة، ورسم الخرائط المعرفية | 19 |
| Rotarod | قضيب الدورية الأفقي حيث يجب القوارض يدخلون إلى الأمام حتى لا تسقط | التنسيق الحركي والتوازن وقوة قبضة | 20 |
| عمود | القوارض وضعت على القطب، ولاحظ للانزلاق أو سقوط لأنها تشق طريقها إلى أسفل داخل القفص | اضطرابات الحركة الناجمة عن تلف القشري | 21، 22 |
| تحليل المشي. | كما القوارض تعبر لوحة من الزجاج يتم التقاط بمخالبه لدراسة تحركاتهم | أنماط المشي (الضغط مخلب، طول الخطوة، عرض والتردد، وانتشار اصبع القدم، زاوية المشية، ودوران الجسم)والتنسيق الحركي | 23، 24 |
| اختبار التسمية لزجة | شرائط من الشريط تطبيقها على جزء أصلع من forepaw من القوارض لتسجيل الوقت للاتصال كل مخلب، ترتيب الاتصال، والوقت من الإزالة، والنظام من إزالة | حساسية Forepaw والحسية العجز | 25، 26 |
| ركن | القوارض وضعت بين مجلسين تشكيل زاوية 30 درجة. عند الدخول في عمق الزاوية يتم تحفيز كلا الجانبين من vibrissae والمؤخرات القوارض ويتحول مرة أخرى لمواجهة نهاية مفتوحة | الاضطرابات العصبية النمائية والسلوكيات المتكررة (مراقبة يتحول في اتجاه واحد مقابل الاتجاه المعاكس) | 27، 28 |
| أسطوانة | توضع القوارض في اسطوانة زجاجية مع النشاط forelimb بينما تربية ضد الجدار يتم تسجيلها | عدم التكافؤ الحركي وتقييم poststrاستخدام أطرافهم والرقص | 28 |
| سلم | القوارض وضعت على منصة في مربع مع درج مزدوج اصطاد. القوارض والمواد الغذائية يقتصر على تعزيز حركة صعود الدرج لجمع الطعم | الوصول إلى قدرات لكل forelimb التي تتطلب قدرات الحسية بشكل مستقل، والبراعة، والتنسيق الحركي | 25، 29 |
| سلم | القوارض سيرا على الأقدام عبر سلم الأفقي للوصول إلى القفص. قدم ينزلق في حين أن المشي عبر سلم تسجل | أخطاء القدم أثناء الحركة. forelimb وظيفة hindlimb والتنسيق | 30 |
الجدول 2: أمثلة من الاختبارات السلوكية الفئران.
| اقتراح لGLP على النحو التالي: |
| - تفاصيل محددة منها تم اختيار نموذج من السكتة الدماغية (على سبيل المثال، لونجا مقابل كويزومي)، وسلالة والعمر والجنس والوزن وذكرت بوضوح. |
| - وفي دراسة أجريت على نحو أعمى المزدوج. |
| - أفاد تحليل الطاقة. |
| - معايير الإدماج والإقصاء في الدراسة قررت قبل الدراسة، والإبلاغ عنها. |
| - الحيوانات مراقبتها يوميا (المظهر الأساسي، ووزن الجسم والسلوك) لأي علامات الضيق أو الألم أو المرض. |
| - الإبلاغ عن الحيوانات استبعادها من الدراسة. |
| - التوزيع العشوائي للحيوانات في مجموعات. |
| - & #160؛ الإبلاغ عن النتائج السلبية والإيجابية. |
| - الإبلاغ عن طول عملية جراحية، مخدر، درجة حرارة الجسم وغازات الدم. |
| - الإبلاغ عن تخصيب البيئية المستخدمة، إن وجدت. |
الجدول 3: اقتراحات بالممارسات الجيدة للمختبرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منذ بدايته قبل 20 عاما، وقد تم استخدام نموذج MCAo للسكتة الدماغية البشرية التي تنطوي على إدخال خيوط في عدد كبير من الدراسات. ويرجع ذلك أساسا إلى حقيقة أنه يحاكي ما يحدث سريريا في الشكل الأكثر شيوعا من السكتة الدماغية (أي السكتة الدماغية). المخطط هو أكثر حساسية لنقص تروية من قشرة الدماغ، وعلى هذا النحو، فإن طول الفترة الزمنية الدماغية تترجم إلى ما إذا كان كل من المخطط والقشرة الظهرية الوحشية ستتأثر، أو مجرد المخطط. يمكن أن تختلف على حد سواء احتشاء وضخه مرة وفقا لذلك، وهذا يوفر للباحث القدرة على أن تكون قادرة على دراسة الآثار المرضية المرتبطة هجمات نقص تروية عابرة (س م ص د) إلى عوائق أكبر من ذلك بكثير.
وقد أظهرت خلال السنوات التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من طريقة خيوط من MCAo على أهمية إجراء يتم تنفيذها في ظروف معقمة لتجنب خطر الإصابة 9. قد تختلف النتائجبين أنواع القوارض، (وقد ثبت التشريحية الاختلافات) سلالة 10،11، والوزن، ومواد التخدير المستخدمة، ولكن من المرجح أن تنعكس في غيرها من المختبرات حيث يتم تنفيذ MCAo الاتجاهات في النتائج المقدمة هنا. الخطوات الحاسمة الأخرى أن تأخذ في الاعتبار هي درجة حرارة الجسم وضغط الدم وغازات الدم. ومن الثابت أن درجة حرارة الجسم يؤثر تلف عصبي، مع الآفات الصغيرة المرتبطة مع انخفاض درجة الحرارة 12 والعجز أكثر الحادة التي تعرض في ارتفاع الحرارة (13). على هذا النحو، ينبغي قياس درجة الحرارة والتحكم، على سبيل المثال، من خلال استخدام وحدات التحكم في درجة الحرارة الحيوانية مع وسادة الحرارة، وذلك للحفاظ على درجة حرارة الجسم في 36.5 درجة مئوية. تجديد حجم وتشجيع الأكل عن طريق وضع طعام تليين في الجزء السفلي من القفص أيضا عوامل إضافية لمراقبة. ضغط الدم والغازات في الدم 6،14 على حد سواء يمكن بسهولة أن تقاس ورصدها باستخدام المعدات المتاحة بسهولة من المبادلات التجارالموردين الاتحاد العالمي للتعليم.
وتشمل القيود المفروضة على تقنية MCAo بتشريحه العصب المبهم من الشرايين دون ضرر، وتجنب دفع خيوط في المؤسسة العامة للتقاعد، والتي يمكن أن تؤثر ليس فقط القدرة للحث على السكتة الدماغية على نحو فعال، ولكن أيضا معدل البقاء على قيد الحياة من الفأرة. أهمية أهم فيما يتعلق بديل في أساليب MCAo الجسم الحي هو معدل البقاء على قيد الحياة عند استخدام طريقة لونجا هو موضح هنا. لقد وجدنا أيضا أن هذا يتوافق مع زيادة التفاعلات خلية الكريات البيض البطانية وزيادة حجم احتشاء، مما يجعل هذا النموذج، مرة واحدة يتقن، أداة ممتازة لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة لعلاج السكتة الدماغية.
على الرغم من أننا لم تبلغ أي هنا، ويمكن أيضا إجراء عدد من الاختبارات السلوكية مثل موريس متاهة مائية، Rotarod، اختبار القطب، تحليل المشية، اختبار تسمية لزجة، اختبار الزاوية، اختبار اسطوانة، اختبار سلم، واختبار سلم (انظر الجدول2 لمزيد من التفاصيل والمراجع). الحيوانات صورية ليس لها أي مشاكل مع استكمال هذه الاختبارات السلوكية. ومع ذلك، الحيوانات السكتة الدماغية أداء هذه الاختبارات أقل بكثير بنجاح. وبعد يوم من ذلك، منطقة واحدة من النقاش هو ما إذا كان تخصيب البيئي لا يؤثر فقط على استنساخ نموذج MCAo، ولكن أيضا ما إذا كان سوف يؤثر على نتيجة اختبارات سلوكية 15. هذا غير واضح، ولكن الأمر يستحق توحيد هذا داخل المختبر، وطوال فترة الدراسة.
وهناك عدد كبير من الاختبارات المختلفة المتاحة لقياس نتائج السكتة الدماغية. لقد قدمنا توظيف دوبلر ليزر لقياس تدفق الدم، على درجة تقييم عصبي في عمق 18 نقطة، وأيضا احتشاء قياسات حجم. ومع ذلك، خيارات إضافية مفيدة أيضا، مثل التصوير. نحن نوظف بشكل روتيني باستخدام المجهر مضان حيوي داخلي لدراسة التفاعلات الخلوية (من سمات استجابة التهابية) 6 داخل قيردوران الأوعية الدقيقة bral في الوقت الحقيقي، في الحيوانات تخدير 5،6،16. MCAo وضخه تنتج الاستجابة الالتهابية الدماغية تزايد مقابل الحيوانات صورية 5،6،16. ويمكن أيضا طرائق التصوير الأخرى مثل التصوير بالرنين المغناطيسي 17 و البوزيترون الطبقي لانبعاثات 18 استخدامها، لأنها توفر فرصة لإجراء دراسات طولية ذات الصلة سريريا.
التحليل النسيجي لأنسجة المخ، وعينات البلازما والمصل يجب أن تمارس بشكل روتيني لأنها تسمح مزيد من توصيف الاستجابات الفيزيولوجية المرضية إلى السكتة الدماغية والآليات المعنية، ولكن أيضا، وربما الأهم من ذلك، أنها تسمح للباحثين لدراسة آثار المركبات على نتائج من السكتة الدماغية، وبالتالي توفير بيانات هامة عن الأهداف العلاجية المحتملة لهذا المنهكة والمرض المدمر. وأخيرا، فإننا نعتقد أنه من المستحسن جدا للباحثين في الاعتبار ليس فقط با نموذج السكتة الدماغية أنسبالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على متطلبات دراستهم، ولكن أيضا أن يرصد GLP ( "الممارسة المعملية الجيدة") إلزامية. انظر الجدول 3 للحصول على اقتراحات GLP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Marks, M. P., et al. Patients with acute stroke trated with intravenous tPS 3-6 hours after stroke onset: correlations between MR angiography findings and perfusion- and diffusion-weighted imaging in the DEFUSE study. Radiology. 249 (2), 614-623 (2008).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimnetal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. (8), 1-8 (1986).
- Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. E. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Meth. 249, 99-105 (2015).
- Gavins, F. N., Dalli, J., Flower, R. J., Granger, D. N., Perretti, M. Activation of the annexin 1 counter-regulatory circuit affords protection in the mouse brain microcirculation. FASEB J. 21 (8), 1751-1758 (2007).
- Chen, J., et al. Atorvastain induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 281-290 (2005).
- Li, Y., et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (9), 1311-1319 (2000).
- Liesz, A., et al. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia; the immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40 (8), 2849-2858 (2009).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44 (2), 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Burk, J., Burggraf, D., Vosko, M., Dichgans, M., Hamann, G. F. Protection of cerebral microvasculature after moderate hypothermia following experimental focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. (1226), 248-255 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthemia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Würbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments? Nat Methods. 6 (4), 257-261 (2009).
- Holloway, P. M., et al. Both MC1 and MC3 receptors provide protection from cerebral ischemia-reperfusion-induced neutrophil recruitment. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, (2015).
- Vandeputte, C., et al. Characterization of the inflammatory response in a photothrombotic stroke model by MRI: implications for stem cell transplantation. Mol Imaging Biol. 13 (4), 663-671 (2010).
- Iwae, Y., et al. Glial cell-mediated deterioration and repair of the nervous system after traumatic brain injury in a rat model as assessed by positron emission tomography. J Neurotrauma. 27 (8), 1463-1475 (2010).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
- Mouzon, B., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in a mouse model produces learning and memory deficits accompanied by histological changes. J Neurotrauma. 29 (18), 2761-2773 (2012).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human α-synuclein. J Neurosci. 24 (42), 9434-9440 (2004).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 125 (1-2), 109-125 (2001).
- Toon, L., Silva, M., D'Hooge, R., Aerts, J. M., Berckmans, D. Automated gait analysis in the open-field test for laboratory mice. Behav Res Methods. 41 (1), 148-153 (2009).
- Lubjuhn, J., et al. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184 (1), 95-103 (2009).
- Bouët, V., Freret, T., Toutain, J., Divoux, D., Boulouard, M., Schumann-Bard, P. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203 (2), 555-567 (2007).
- Freret, T., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: usefulness of adhesive removal test. Behav Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosci. 17, 400-406 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow. 33, 330-338 (2012).
- Wiessner, C., et al. Anti-nogo-a antibody infusion 24 hours after experimental stroke imporved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 154-165 (2003).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp Transl Stroke Med. 2 (13), (2010).
