Summary
Om de pathofysiologie van beroerte te begrijpen, is het belangrijk betrouwbare modellen. Dit document zal een van de meest gebruikte takt modellen beschrijven in muizen, genaamd de middelste cerebrale slagader occlusie (MCAo) model (ook aangeduid als de intraluminale filament of hechtdraad model) met reperfusie.
Abstract
Beroerte is een belangrijke doodsoorzaak wereldwijd en blijft een van de belangrijkste oorzaken van langdurige volwassene handicap. Ongeveer 87% van de beroertes zijn ischemisch oorsprong en komen op het grondgebied van de middelste cerebrale slagader (MCA). Momenteel is de enige Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde geneesmiddel voor de behandeling van deze verwoestende ziekte is weefselplasminogeenactivator (tPA). Echter, tPA heeft een klein therapeutisch venster voor toediening (3-6 uur) en is alleen effectief in 4% van de patiënten die daadwerkelijk ontvangen. Huidige onderzoek richt zich op het begrijpen van de pathofysiologie van een beroerte om potentiële therapeutische targets te vinden. Zo betrouwbare modellen zijn van cruciaal belang, en de MCA occlusie (MCAo) model (ook aangeduid als de intraluminale filament of hechtdraad model) wordt beschouwd als de meest klinisch relevante chirurgische model van ischemische beroerte, en is vrij niet-invasieve en gemakkelijk reproduceerbaar. Typisch de MCAo model wordt gebruikt bij knaagdieren, vooral muizen wijtenalle genetische varianten voor deze species. Hier beschrijven wij (en aanwezig in de video) hoe de MCAo model (met reperfusie) in muizen met succes uit te voeren om betrouwbare en reproduceerbare gegevens te genereren.
Introduction
Beroerte is de vijfde belangrijkste doodsoorzaak ter wereld, met een persoon de ziekte sterven elke 4 minuten. Meer dan 800.000 Amerikanen lijden aan een beroerte elk jaar, die niet alleen is verwoestend voor de patiënt, maar ook voor hun families. Beroerte is de belangrijkste oorzaak van volwassen gehandicapten en de jaarlijkse uitgaven worden geraamd op in de orde van 36500000000 $ 1, ondanks zeer weinig behandeling opties beschikbaar zijn.
Tissue (tPA) is de enige Food and Drug Administration (FDA) een licentie drug voor ischemische beroerte. Het is echter alleen effectief indien toegediend aan patiënten binnen 3-6 uur na het begin van de slag, en in deze gevallen profiteert slechts 4% van de patiënten 2. Daarom is het noodzakelijk dat reproduceerbaar klinisch relevante diermodellen beroerte worden gebruikt om te helpen bij de ontwikkeling van mogelijke therapeutische strategieën en behandelingen voor deze ziekte. Het is belangrijk op te merken dat in vitro in vivo methoden zijn noodzakelijk.
De meest voorkomende vorm van een beroerte is ischemische oorsprong, goed voor 87% van de totale beroertes. Andere bewegingen zijn intracerebrale bloeding (9%) en subarachnoïdale bloeding (4%), en worden meestal veroorzaakt door een emboli naar de middelste cerebrale arterie (MCA). Dit is toe te schrijven aan de prominente curve aan de wortel van MCA, die laminaire bloedstroom invoeren van de hersenen veroorzaakt te worden verstoord. De MCA komt voort uit de interne halsslagader (ICA) en de routes langs de laterale sulcus, waar ze takken en projecten om de basale ganglia en de zijvlakken van de frontale, pariëtale en temporale kwabben, met inbegrip van de primaire motorische en sensorische cortex. De cirkel van Willis wordt gecreëerd door posterieure cerebrale slagaders zijnverbonden met de cerebrale arteriën en de achterste communicerende arteriën.
De intraluminale filament of hechting model van MCAo is een van de meest gebruikte beroerte onderzoek. Er zijn echter een paar verschillende variaties op dit model, en deze zijn op basis van of de gloeidraad in de externe halsslagader wordt gestoken (ECA, de zogenoemde Longa methode) 3, of dat in de ICA ingebracht (aangeduid als de Koizumi methode) 4. Bij methode Koizumi, moet de carotis communis (CCA) aan de zijde van de operatie permanent gekoppeld indien het filament verwijderd om te voorkomen bloeden uit de incisie in de CCA, terwijl in de werkwijze Longa's is de ERK die permanent moet worden gekoppeld 5 . Hier de Longa methode zal gebruikt worden als we het gevoel dat dit is een veel betere en een meer klinisch relevante chirurgische model van ischemische beroerte. Bovendien is het gebruik van een silicium getipt monofilament, vooral met de Longa werkwijze produceert zeerreproduceerbaar MCAo tegenover de vlam stomp monofilamenten, die vaak produceren onvolledige occlusie en / of subarachnoïdale bloeding 6.
De intraluminale filament methode kan worden gebruikt als een model van permanente of transiënte occlusie 4,6. Om de vluchtige model voeren, wordt het filament verwijderd na een periode van ischemie (bijvoorbeeld, 30 minuten, 60 minuten of 2 uur) en reperfusie mag gebeuren. Dit model, enigszins, simuleert het herstel van de bloedstroom na spontane of therapeutische interventie (bijvoorbeeld tPA toediening) een trombo-embolische stolsel bij mensen lyseren. Voor de vaste model wordt het filament eenvoudigweg in plaats gelaten gedurende een periode (bijvoorbeeld 24 uur), dus geen reperfusie plaatsvindt. Een ander voordeel van de intraluminale filament methode is dat een craniotomie niet hoeft te worden uitgevoerd, zodat de schedel intact worden gelaten en wijzigingen intracraniële druk en temperatuur voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol en de experimenten gerapporteerd in de video werden goedgekeurd door de LSUHSC-S Institutional Animal Care en gebruik Comite en zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de NIH.
OPMERKING: Mannelijke C57BL / 6 muizen met een gewicht 25-29 g werden gebruikt in deze studie. De muizen werden gehandhaafd op een standaard chow pellet dieet met vrije toegang tot water, onder een 12 uur licht / donker-cyclus in individueel geventileerde kooien. De procedure zal worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden met behulp van steriele technieken (bijvoorbeeld, steriele handschoenen, steriele instrumenten).
1. Pre-operatieve Voorbereidingen
- Induceren anesthesie met een combinatie van ketamine (150 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) intraperitoneaal geïnjecteerd (ip). Monitor diepte van de anesthesie te voet pinch in eerste instantie om de 3 - 5 minuten en elke 10 min als de verdoving eenmaal is bereikt. Terwijl het dier onder narcose toedienen een steriele oculaire zalf tot droog voorkomen. De initiële dosis van ketamine / xylazine duurt meestal about 30-40 minuten. Een extra dosis kan worden toegediend als dat nodig is, die wordt gecontroleerd door de reactie van het dier om een voet snuifje.
- Plaats muizen in een liggende positie op een temperatuur gebracht verwarmingsmat en handhaven lichaamstemperatuur bij 36,5 ± 0,1 ° C, die geverifieerd wordt met een rectale sonde.
- Scheer de nek en desinfecteren van de huid met 70% ethanol.
2. Occlusie van de MCA (figuur 1)
- Maak een middellijn hals incisie met behulp van Iris rechte schaar en trekken (met behulp van oprolmechanismen) de zachte weefsels naar de schepen bloot te leggen.
- Ontleden de CCA en de Rekenkamer uit de omliggende weefsel met behulp van Dumont tang zonder schade aan de nervus vagus.
- Maak een tijdelijke hechting door koppelverkoop een losse knoop rond de CCA met behulp van 6-0 zijde.
- Maak een permanente hechting rond de Rekenkamer en de kleinere schepen die zich uitstrekt van door strak ligeren van de vaten (distaal van de splitsing van de CCA).
- Maak een hechting around de Rekenkamer proximale naar de CCA bifurcatie.
- Plaats een microvaatje clip rond de interne halsslagader (ICA) en de pterygopalatine slagader (PPA).
- Maak een kleine incisie in de ECA met behulp van micro ontleden voorjaar schaar en plaats een 180 pm-silicium getipt monofilament. De ketting zo dicht mogelijk bij de permanente hechting mogelijk gemakkelijker manipuleren van het filament.
- Draai de tijdelijke hechting rond de Europese Rekenkamer met de gloeidraad geplaatst en verwijder het microvaatje clip.
- Snijd de Rekenkamer tussen de permanente, distale hechtdraad en de ingang van het filament met behulp van micro ontleden voorjaar schaar.
- Leid de draad door de ICA tot u weerstand voelt (ongeveer 9 -. 10 urn voorbij de splitsing van de CCA) in het MCA.
LET OP: In het geval te veel weerstand wordt gevoeld, terwijl de meerderheid van de gloeidraad is nog steeds zichtbaar is, kan het filament de PPA hebben gesloten. Als dit gebeurt, trek de draad terug naar de splitsing, voorzichtig push naar voren in de ICA met behulp van Dumont tang, en voortgang van het filament tot het kan worden gevisualiseerd in de ICA.
3. reperfusie
- Na een 30-min occlusie periode, verwijder de gloeidraad door voorzichtig terug te trekken met behulp van Dumont tang en zet de hechtdraad rond het open einde van de Europese Rekenkamer.
- Verwijder de tijdelijke hechting rond de CCA door voorzichtig losmaken van de ligatuur met behulp van Dumont pincet en de bloedstroom wordt hervat door de CCA.
- Sluit de incisie met een continue chirurgisch hechtmateriaal. Sluiting van de huid kan worden bereikt door continue of onderbroken hechtingen. Huid nietjes zijn ook een aanvaardbare methode.
- Injecteer muizen met 1 ml zoutoplossing subcutaan als volume aanvullen en de analgetische carprofen (5 mg / kg, sc) voor de verlichting van pijn en ongemak van de chirurgische procedure, tekens dat ook aanvullende pijnverlichting nodig onder terug gebogen, ungroomed laag, verminderde activiteit, abnormalehouding en verminderde eetlust.
- Acht muizen gedurende het herstel van de anesthesie bij een verwarmd 30 ° C kooi met een warmtelamp geregeld met een temperatuurregelaar en plaats fijngestampt Chow in een petrischaal op de vloer van de kooi te eten te stimuleren. De muizen zal men per kooi worden gehuisvest tijdens de reperfusie periode.
4. Sham Surgery
- Muizen onderworpen aan dezelfde procedure zonder monofilament inbrengen.
5. Postoperatieve Neurological Scores (tabel 1; figuur 2)
- Neurologisch evalueren muizen na de juiste reperfusie periode met behulp van een 18-puntensysteem beoordelen van de Algemene; Motor; Sensory; Proprioceptie. Een hogere neurologische score komt overeen met verminderde neurologische functie.
LET OP: Muizen die niet reageert en niet in staat om te lopen worden beoordeeld zullen worden gedood. Andere criteria voor humane euthanasie zal een gewichtsverlies van meer dan 20%, respiratoir distress en infectie rond het operatiegebied. A CO 2 kamer wordt gebruikt voor euthanasie en de fysische methode gedood bevestigen cervicale dislocatie of thoracotomie zijn.
6. Meting van herseninfarct Volume (figuur 3)
- Induceren anesthesie met een combinatie van ketamine (150 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) geïnjecteerd ip Monitor anesthesiediepte voet pinch aanvankelijk iedere 3-5 minuten en elke 10 minuten na verdoving is bereikt.
- Plaats muizen in een liggende positie en snijd de huid van de buik naar de hals gevolgd door het peritoneum behulp rechte iris scharen.
- Til het borstbeen met behulp van Dumont pincet en snijd de ribben naar het hart bloot te leggen.
- Open de linker- en rechterzijde van de borstkas en twee paren hemostats, waardoor de hart.
- Plaats een 26 G naald bevestigd aan een 5 ml spuit in de linker hartkamer en snijd de rechter atrium. Perfuseren met kamertemperatuur fysiologische zoutoplossing of fbsfate gebufferde zoutoplossing (PBS) tot het vloeibaar wordt duidelijk (gewoonlijk 3-5 min).
- Verwijder de schedel voorzichtig weg van de hersenen met behulp van iris rechte schaar en Dumont tang.
- Snijd de reukkwabben en cerebellum met behulp van een scheermesje zodat de hersenen past in de matrix. Gebruik deze matrix aan de hersenen snijden in gelijke segmenten. Chill de matrix voor gebruik om het weefsel koel te houden. Plaats de hersenen in de matrix en zet deze op het ijs.
- Snijd de hersenen in het 2 mm coronale segmenten met behulp van twee scheermesjes. Maak de eerste snede met behulp van een scheermesje beginnend 2 mm van de bovenkant en laat dit scheermesje in zijn plaats. Voeg een 2 mm achter de eerste snede. Verwijder het eerste scheermesje met het weefsel verbonden. Herhaal dit proces tot alle weefsel is gesneden.
NB: Er moeten 4-5 segmenten als u klaar bent. - Plaats de segmenten in 24-wells plaat met 2% 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC), die vervolgens in een ondiep waterbad geplaatst eent 37 ° C gedurende 20 min. Plaatsen van elk segment een individuele put helpt in de volgorde waarin ze werden gesneden houden. Zorg ervoor dat de TTC oplossing volledig bedekt het weefsel segmenten. Na 10 minuten zet alle plakjes over.
- Plaats een kleine hoeveelheid 10% formaline in de putjes van een nieuwe plaat met 24 putjes en de segmenten dragen aan deze plaat in de volgorde waarin ze werden gesneden.
- Scan de segmenten in de computer en analyseren van de infarctgrootte uitgedrukt als percentage van de gehele hersenen segment 6 gebruikt ImageJ analysesoftware (NIH Image 1.57 software) 6.
- Schets de infarctgebied een oppervlaktemeting te genereren. Naast het meten van de gehele contralaterale halfrond om het gebied te bepalen. Verdeel het infarct gebied van het gebied van de contralaterale hemisfeer en vermenigvuldig met 100 tot het infarct volume bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muizen ondergingen 30-min MCAo geïnduceerde hersenischemie (figuur 1), gevolgd door een periode van reperfusie (24 uur en 1 week worden hier voorgesteld, maar de lengte van reperfusie kan worden gevarieerd). De mortaliteit gedurende MCAo was minimaal (ongeveer 2%). Bericht ischemie, het sterftecijfer (binnen de eerste 24 uur) was ongeveer 26%.
Laser Doppler flowmetrie werd gebruikt om de bloedstroom perfusie in het gebied MCA voor en na MCAo / reperfusie bevestigen. Figuur 4 toont duidelijk dat wanneer de tijdelijke CCA tie is vrijgegeven na 30 min ischémie voor gloeilampen verwijdering en reperfusie optreden, is er een piek in perfusie, die bereikte <100% van de uitgangswaarde perfusie (dwz voorafgaand aan de operatie) 5 min in reperfusie.
24 uur na het begin van de beroerte (voorafgaand aan de meting van het infarct volume) Neurological scores met betrekking tot algemene, zintuiglijke, motorische en proprioceptieve tekorten werden gemeten (tabel 1). Deze scoring systeem is bedoeld om objectief ( 'ja of nee') criteria voor de beoordeling te verstrekken. Figuur 2 laat zien dat de score voor muizen (n = 27) bij 24 uur was 12,56 ± 0,7, en bleef hoog 1 week later (11.50 ± 1.5 ). Een hogere neurologische score komt overeen met verminderde neurologische functie.
Infarct volumes gespiegelde vergelijkbare patronen op de neurologische score op 24 uur, dat wil zeggen, meer dan sham dieren. 24 uur na MCAo, muizen infarct grote volumes (Figuur 3: 15,9 ± 2,6%), die werden verhoogd 1 week na CVA (28,5 ± 1,9%).
Figuur 1: schematische weergave van de plaats van midden cerebrale slagader Occlusie(MCAo) Chirurgische Large vaartuig vaatstelsel van de cerebrale circulatie. A. Chirurgische MCAo wordt bereikt door het inbrengen van een filament in de externe halsslagader en vervolgens in het proximale middelste halsslagader. BG. Stappen voor het induceren MCAo. Anterior communicatie slagader (ACA); middelste cerebrale slagader (MCA); posterior communicatie slagader (PcomA); cerebralis posterior (PCA); basilaire arterie (BA); interne halsslagader (ICA); externe halsslagader (ECA); pterygopalatine slagader (PPA); interne halsslagader (ICA). (Gewijzigd met toestemming van Smith et al., Referentie # 5.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. De 18-point Stroke Score Dit comprehensive beroerte score beoordeelt functionele verbeteringen in het algemeen, en de zintuiglijke, motorische en proprioceptieve aspecten van de muis gedrag na een beroerte. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM. * P <0,05. n = 3 muizen / groep. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van ANOVA plus een Bonferroni post hoc-test. (Gewijzigd met toestemming van Smith et al., Referentie # 5.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Infarct Volumes van C57BL / 6-muizen 24 uur na MCAo Muizen werden onderworpen aan 30-min MCAo en 24 uur of 1 wk reperfusie A) De hersenen werden verwijderd, doorgesneden en gekleurd met 2% 2,3,5-. trifenyltetrazoliumchloride (TTC). In levend weefsel, dehydrogenases enzymatisch verminderen TTC aan 1,3,5-triphenylformazaon (TPF), die een rode kleur, maar in ischemisch weefsel het enzym niet functioneel, zodat het weefsel blijft wit. B) De grafiek laat een toename van infarctvolume bij muizen een beroerte hebben gehad. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM. ** P <0,002, **** p <0,0001 versus sham; n = 4 muizen / groep. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van ANOVA plus een Bonferroni post hoc-test. Schaal bar = 1 cm (Gewijzigd met toestemming van Smith et al., Referentie # 5.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Perfusie van MCA territorium Gedurende MCAo en reperfusie Muizen werden onderworpen aan 30-min MCAo en <5 min reperfusie. Basislijnen werden genormaliseerd tot 100%. als ervaCTED, perfusie 5 min in de reperfusie periode boven MCAo, dat wil zeggen wanneer er geen perfusie van het weefsel heeft plaatsgevonden. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM. * P <0,05. n = 3 muizen / groep. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van ANOVA plus een Bonferroni post hoc-test. (Gewijzigd met toestemming van Smith et al., Referentie # 5.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Neurologische Scoring System Een punt gegeven voor een ja antwoord op elk van de tests.. Marks van de 18 7,8.
| Proef | Korte beschrijving | Wat betekent het testen? | Referenties |
| Morris water maze | Een open-field water-maze procedure waarbij knaagdieren leren om te ontsnappen aan het water op een verborgen platform | Ruimtelijk geheugen, bewegingscontrole, en cognitieve mapping | 19 |
| rotarod | Een horizontale roterende staaf, waar knaagdieren vooruit moet lopen om niet af te vallen | Motorische coördinatie, balans en grip sterkte | 20 |
| Pool | Knaagdieren geplaatst op een paal en waargenomen voor schuiven of vallen als ze hun weg naar beneden in een kooi | Bewegingsstoornissen veroorzaakt door corticale schade | 21, 22 |
| ganganalyse | Aangezien knaagdieren kruis een glasplaat hun pootafdrukken worden gevangen om hun bewegingen te onderzoeken | Wandelen patronen (poot druk, paslengte, breedte en de frequentie, teen spread, gang hoek, en het lichaam rotatie)en motorische coördinatie | 23, 24 |
| Sticky label-test | Stroken van tape aangebracht op de haarloze deel van voorpoot van de knaagdieren om de tijd te nemen om contact op elke poot, orde van contact, de tijd van verwijdering, en de volgorde van de verwijdering | tekorten voorpoot gevoeligheid en sensomotorische | 25, 26 |
| Hoek | Knaagdieren geplaatst tussen twee platen die een hoek van 30 °; toen diep het aangaan van de hoek aan beide zijden van de vibrissae worden gestimuleerd en het knaagdier steigert en keert terug naar het gezicht van de open einde | Neurologische aandoeningen en repetitieve gedragingen (controle draait in een richting tegen de tegenovergestelde richting) | 27, 28 |
| Cilinder | Knaagdieren worden in een glazen cilinder met de voorpoot activiteit terwijl fokken tegen de wand wordt opgenomen | Bewegingsapparaat asymmetrie en Poststr evaluerenoke ledematen gebruik | 28 |
| Trappenhuis | Knaagdieren geplaatst op een platform in een doos met een aas dubbele trap; knaagdieren zijn voedsel beperkt om beweging te bevorderen de trap op naar het aas te verzamelen | Het bereiken van vaardigheden voor elke voorpoot onafhankelijk vereisen zintuiglijke capaciteiten, handigheid, en motorische coördinatie | 25, 29 |
| Ladder | Knaagdieren lopen over een horizontale ladder om hun kooi te bereiken; voet glijdt tijdens het lopen over de ladder worden vastgelegd | Foot fouten gedurende beweging; voorpoot en achterbeen functie en coördinatie | 30 |
Tabel 2: Voorbeelden van Murine gedragstesten.
| Suggestie voor GLP is als volgt: |
| - Specifieke nader model van stroke is gekozen (bijv Longa vs. Koizumi) en de stam, leeftijd, geslacht, gewicht duidelijk gerapporteerd. |
| - Studies uitgevoerd in een double-blind mode. |
| - Voeding analyse gemeld. |
| - Criteria voor het in- en uitsluiting in de studie besloten voorafgaand aan het onderzoek, en gerapporteerd. |
| - Dieren per dag (basic uitstraling, lichaamsgewicht en gedrag) gecontroleerd op tekenen van angst, pijn of ziekte. |
| - Rapportage van de dieren uitgesloten van de studie. |
| - Randomisatie van de dieren in groepen. |
| - & #160; Rapportage van negatieve en positieve resultaten. |
| - Rapportage van de lengte van de operatie, anesthesie, lichaamstemperatuur en bloed gassen. |
| - Rapportage van milieu-verrijking wordt gebruikt, indien aanwezig. |
Tabel 3: Tips voor Good Laboratory praktijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinds dat 20 jaar geleden, is de MCAo model voor humane slag met inbrengen van een filament gebruikt in een groot aantal studies. Dit is voornamelijk te wijten aan het feit dat het bootst wat klinisch gebeurt in de meest voorkomende vorm van een beroerte (dat wil zeggen, ischemische beroerte). Het striatum is gevoeliger voor ischemie dan de cerebrale cortex, en als zodanig zal de lengte van ischemische tijd vertalen in of zowel het striatum en de dorsolaterale cortex worden beïnvloed, of alleen het striatum. Zowel infarct en reperfusie tijd dienovereenkomstig gewijzigd, en dit heeft de onderzoeker de mogelijkheid om te kunnen pathologische effecten geassocieerd met voorbijgaande ischemische aanvallen (TIA) studie veel grotere infarcten.
Door de jaren modificaties en oplossen van de gloeidraad werkwijze MCAo blijkt het belang van de procedure worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden het risico op infectie 9 voorkomen. De resultaten kunnen variërentussen soorten knaagdieren, stam (zijn anatomische verschillen aangetoond) 10,11, gewicht en verdovingsmiddelen gebruikt, maar de trends in de hier gepresenteerde resultaten zijn waarschijnlijk worden weerspiegeld in andere laboratoria, waar MCAo wordt uitgevoerd. Andere kritische stappen rekening te houden zijn lichaamstemperatuur, bloeddruk en bloedgassen. Het staat vast dat de lichaamstemperatuur van invloed op neurologische schade, met kleinere laesies in verband met onderkoeling 12 en meer ernstige tekorten wordt gepresenteerd in hyperthermie 13. Als zodanig moet de temperatuur worden gemeten en gecontroleerd, bijvoorbeeld via het gebruik van dierlijke temperatuur regelaars met warmte-pad, om lichaamstemperatuur te handhaven op 36,5 ° C. Volume replenishment en het stimuleren van het eten door het plaatsen verzachten chow op de bodem van de kooi zijn ook extra factoren om te observeren. Bloeddruk en gassen 6,14 kunnen beide gemakkelijk worden gemeten en gecontroleerd met behulp van gemakkelijk beschikbare apparatuur van commercial leveranciers.
Beperkingen van de MCAo techniek omvatten de nervus vagus van de slagaders goed ontleden zonder schade en het vermijden voortbewegen van de draad in de PPA, die die niet alleen de mogelijkheid tot een beroerte effectief induceren, maar ook de overleving van de muizen. De belangrijkste betekenis wat betreft de alternatieve in vivo MCAo werkwijzen is het overlevingspercentage bij gebruik van de Longa hier beschreven methode. We hebben ook gevonden dat dit overeenkomt met verhoogde leukocyt-endotheelcel interacties en grotere infarct volumes, die dit model eenmaal onder de knie, een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van mogelijke therapeutische doelwitten voor de behandeling van een beroerte maken.
Hoewel we geen hier hebben gemeld, kan een aantal gedragstesten ook worden uitgevoerd zoals Morris water doolhof, Rotarod, pole test, ganganalyse, kleverig label test, hoek test, cilinder test, trap test, en ladder-test (zie tabel2 voor meer informatie en referenties). Sham dieren hebben geen problemen met het uitvoeren van deze gedragstesten; echter, beroerte dieren uit te voeren deze tests veel minder succesvol. Naar aanleiding van dit, een deel van het debat is de vraag of het milieu verrijking beïnvloedt niet alleen de reproduceerbaarheid van de MCAo model, maar ook of zij de uitkomst van gedragstesten 15 zal beïnvloeden. Het is onduidelijk, maar het is goed standaardiseren dit in het laboratorium, en gedurende het onderzoek.
Er zijn een overvloed aan verschillende tests beschikbaar voor het meten van een beroerte uitkomst. We hebben presenteerde de tewerkstelling van laser doppler voor metingen van de bloedstroming, een diepgaande 18-punts neurologische assessment score, en ook infarctvolume metingen. Echter extra opties zijn ook bruikbaar, zoals beeldvorming. We routinematig dienst van het gebruik van intravitale fluorescentie microscopie om cellulaire interacties te bestuderen (kenmerk van een ontstekingsreactie) 6 binnen de cereBral microcirculatie in real-time, in verdoofde dieren 5,6,16. MCAo en reperfusie produceert een verhoogde cerebrale ontstekingsreactie versus sham dieren 5,6,16. Andere beeldvormingsmodaliteiten zoals magnetische resonantie beeldvorming 17 en positronemissietomografie 18 kunnen ook worden gebruikt, omdat zij de mogelijkheid voor longitudinale studies die klinisch relevant zijn.
Histologische analyse van hersenweefsel, moet plasma- en serummonsters routinematig uitgevoerd zoals zij verdere karakterisering van de pathofysiologische reacties op beroerte zodat de mechanismen, maar ook, en misschien nog belangrijker, ze kunnen onderzoekers de effecten van verbindingen op de uitkomst bestuderen van een beroerte, waardoor belangrijke gegevens voor potentiële therapeutische doelen voor deze slopende en verwoestende ziekte. Tot slot zijn wij van mening is het zeer aan te raden voor onderzoekers om niet alleen de meest geschikte beroerte model ba overwegensed op de vereisten voor hun studie, maar ook dat GLP ( "Good Laboratory practice") verplicht is gesteld. Zie tabel 3 voor GLP suggesties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Marks, M. P., et al. Patients with acute stroke trated with intravenous tPS 3-6 hours after stroke onset: correlations between MR angiography findings and perfusion- and diffusion-weighted imaging in the DEFUSE study. Radiology. 249 (2), 614-623 (2008).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimnetal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. (8), 1-8 (1986).
- Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. E. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Meth. 249, 99-105 (2015).
- Gavins, F. N., Dalli, J., Flower, R. J., Granger, D. N., Perretti, M. Activation of the annexin 1 counter-regulatory circuit affords protection in the mouse brain microcirculation. FASEB J. 21 (8), 1751-1758 (2007).
- Chen, J., et al. Atorvastain induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 281-290 (2005).
- Li, Y., et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (9), 1311-1319 (2000).
- Liesz, A., et al. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia; the immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40 (8), 2849-2858 (2009).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44 (2), 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Burk, J., Burggraf, D., Vosko, M., Dichgans, M., Hamann, G. F. Protection of cerebral microvasculature after moderate hypothermia following experimental focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. (1226), 248-255 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthemia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Würbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments? Nat Methods. 6 (4), 257-261 (2009).
- Holloway, P. M., et al. Both MC1 and MC3 receptors provide protection from cerebral ischemia-reperfusion-induced neutrophil recruitment. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, (2015).
- Vandeputte, C., et al. Characterization of the inflammatory response in a photothrombotic stroke model by MRI: implications for stem cell transplantation. Mol Imaging Biol. 13 (4), 663-671 (2010).
- Iwae, Y., et al. Glial cell-mediated deterioration and repair of the nervous system after traumatic brain injury in a rat model as assessed by positron emission tomography. J Neurotrauma. 27 (8), 1463-1475 (2010).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
- Mouzon, B., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in a mouse model produces learning and memory deficits accompanied by histological changes. J Neurotrauma. 29 (18), 2761-2773 (2012).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human α-synuclein. J Neurosci. 24 (42), 9434-9440 (2004).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 125 (1-2), 109-125 (2001).
- Toon, L., Silva, M., D'Hooge, R., Aerts, J. M., Berckmans, D. Automated gait analysis in the open-field test for laboratory mice. Behav Res Methods. 41 (1), 148-153 (2009).
- Lubjuhn, J., et al. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184 (1), 95-103 (2009).
- Bouët, V., Freret, T., Toutain, J., Divoux, D., Boulouard, M., Schumann-Bard, P. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203 (2), 555-567 (2007).
- Freret, T., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: usefulness of adhesive removal test. Behav Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosci. 17, 400-406 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow. 33, 330-338 (2012).
- Wiessner, C., et al. Anti-nogo-a antibody infusion 24 hours after experimental stroke imporved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 154-165 (2003).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp Transl Stroke Med. 2 (13), (2010).
