Summary
Для того, чтобы понять патофизиологию инсульта, важно использовать надежные модели. Эта статья будет описывать один из наиболее часто используемых моделей инсульта у мышей, называемая мозговая закупорка артерии (МСАО) модель среднего (также называемый внутрипросветного нить или шовный модель) с реперфузией.
Abstract
Инсульт является ведущей причиной смерти во всем мире и продолжает оставаться одной из основных причин долгосрочных взрослых инвалидов. Около 87% инсультов являются ишемические по своему происхождению и происходят на территории средней мозговой артерии (СМА). В настоящее время единственным пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило препарат для лечения этой разрушительной болезни является тканевой активатор плазминогена (ТАП). Тем не менее, ТАП имеет небольшое терапевтическое окно для введения (3 - 6 ч), и эффективен только у 4% пациентов, которые на самом деле его получают. В настоящее время исследование фокусируется на понимании патофизиологии инсульта, чтобы найти потенциальные терапевтические цели. Таким образом, надежные модели имеют решающее значение, и модель MCA окклюзия (MCAO) (также называемый внутрипросветного нити или шовный модель) считается наиболее клинически значимых хирургической модели ишемического инсульта, а также довольно неинвазивным и легко воспроизводимым. Как правило, модель MCAO используется с грызунами, особенно с мышами из-задля всех генетических вариаций, доступных для этого вида. Здесь мы описываем (и присутствует в видео), как успешно выполнить модель MCAO (с реперфузией) у мышей для создания надежных и воспроизводимых данных.
Introduction
Инсульт является пятой ведущей причиной смерти во всем мире, с одним человеком, умирают от этой болезни каждые 4 минуты. Более 800 тысяч американцев страдают от инсульта каждый год, который является не только разрушительно для пациента, но и для их семей. Инсульт является основной причиной инвалидности взрослых и ежегодные расходы оценивается в порядка $ 36,5 млрд 1 , несмотря на очень мало вариантов лечения будут доступны.
Тканевый активатор плазминогена (ТАП) является единственным пищевых продуктов и медикаментов (FDA) лицензирован препарат для ишемического инсульта. Тем не менее, оно является эффективным только при введении пациентам в течение 3-6 часов с момента начала инсульта, и в этих случаях , это приносит пользу только 4% пациентов 2. Поэтому крайне важно, чтобы воспроизводимые, клинически значимых животных моделях инсульта используются для оказания помощи в разработке потенциальных терапевтических стратегий и методов лечения этого заболевания. Важно отметить , что в пробирке в естественных условиях имеют важное значение.
Наиболее распространенным типом инсульта ишемического происхождения, что составляет 87% от общего числа инсультов. Другие штрихи внутримозговое кровоизлияние (9%) и субарахноидальное кровоизлияние (4%), и вызываются чаще всего с помощью эмболов к средней мозговой артерии (СМА). Это связано с видного кривой в корне MCA, который вызывает ламинарный поток крови, поступающей в мозг нарушиться. MCA возникает из внутренней сонной артерии (ВСА) и маршрутам вдоль боковой борозды, где она разветвляется и проекты к базальных ганглиев и боковые поверхности лобной, теменной и височной долей, в том числе первичной моторной и сенсорной коры головного мозга. Круг Уиллис создается задних мозговых артерий, являющихсяподключены к церебральных артерий и задней передачи артерий.
Внутрипросветное нить или шовный модель MCAO является одним из наиболее широко используемых в исследованиях инсульта. Тем не менее, существует несколько различных вариаций этой модели, и они основаны на вставлен ли микрофиламентных в наружную сонную артерию (ECA, называемый метод Лонга) 3, или он вставлен в ICA (называется Коидзуми метод) 4. В методе Коидзуми, общей сонной артерии (ССА) на стороне операции должны быть постоянно связаны , если нить удаляется , чтобы предотвратить кровотечение из разреза в ССА, тогда как в методе Лонга в то ЕСА , которые должны быть постоянно связаны 5 , Здесь метод Лонга будет использоваться, как мы считаем, что это намного лучше и более клинически значимых хирургическая модель ишемического инсульта. Кроме того, использование кремниевого наконечниками мононити, особенно с методом Лонга, производит оченьвоспроизводимая MCAO в отличие от пламени-притупляются мононити, которые часто приводят к неполной закупорки и / или субарахноидальное кровоизлияние 6.
Метод внутрипросветное нить может быть использована в качестве модели постоянного или временной окклюзии 4,6. Для выполнения переходную модель, нить удаляется после периода ишемии (например, 30 мин, 60 мин, или 2 ч), и реперфузии, производятся . Эта модель, в некоторой степени, имитирует восстановление кровотока после спонтанной или терапевтического вмешательства (например, ТАП администрации) лизировать тромбоэмболических тромб в организме человека. Для постоянной модели, нить просто оставляют на месте в течение периода времени (например, 24 ч), так что ни при реперфузии не происходит. Еще одним преимуществом способа внутрипросветного нитей является тот факт, что краниотомию не требуется выполнять, позволяя череп оставить нетронутыми и во избежание каких-либо изменений внутричерепного давления и температуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол и эксперименты сообщили в видео были одобрены Комитетом LSUHSC-S Institutional уходу и использованию животных путем и в соответствии с руководящими принципами NIH.
Примечание: Мужской C57BL / 6 мышей весом 25 - 29 г были использованы в этом исследовании. Мышей содержали на стандартном рационе Chow окатышей со свободным доступом к воде, при 12-часовом цикле свет / темнота в индивидуально вентилируемых клетках. Процедура будет проводиться в стерильных условиях с использованием стерильных методов (например, стерильные перчатки, стерильные инструменты).
1. Предоперационная подготовка
- Индуцировать анестезию, используя комбинацию кетамина (150 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) вводили внутрибрюшинно (IP). Мониторинг глубины анестезии с помощью ног крайнем случае первоначально через каждые 3 - 5 мин и через каждые 10 мин один раз анестезии достигается. В то время как животное находится под наркозом, администрировать стерильной глазной мази, чтобы предотвратить сухость кожи. Начальная доза кетамина / ксилазина обычно длится ABза 30-40 минут. Дополнительная доза может быть введена, если это необходимо, что проверяется с помощью реакции животного на ноги крайнем случае.
- Место мышей в положении лежа на спине на температуры регулируется тепловой мат и поддерживать температуру тела на 36,5 ± 0,1 ° С, что проверяется с помощью ректального зонда.
- Бритье шею и дезинфицировать кожу 70% -ным спиртом.
2. Закупорка MCA (Рисунок 1)
- Сделать надрез по средней линии шеи, используя Iris прямые ножницы и втягивания (с помощью втягивающих) мягкие ткани подвергать сосуды.
- Рассеките ОАС и ECA от окружающих тканей с помощью Дюмон щипцов без повреждения блуждающего нерва.
- Сделайте временный шов, связывая свободный узел вокруг CCA с помощью 6-0 шелка.
- Сделайте постоянный шовный вокруг ЭКА и мелкие сосуды, простирающиеся от него плотно лигирование сосудов (дистальный к раздвоению CCA).
- Сделать шовный Ароунд проксимальных ЭКА развилки ОСО.
- Поместите микрососудов клип вокруг внутренней сонной артерии (ВСА) и крылонебной артерии (PPA).
- Сделайте небольшой надрез в ECA с помощью микро рассекает пружинные ножницы и вставки 180 мкм кремния наконечником мононити с. Сделать разрез как можно ближе к постоянному шовного материала, насколько это возможно для облегчения манипуляций нити.
- Затянуть временный шов вокруг ECA с нити, вставленной и снять клип микрососудов.
- Обрежьте ECA между постоянным, дистальной швом и точкой входа нити с помощью микро рассекает пружинные ножницы.
- Руководство нити через ICA, пока не почувствуете сопротивление (примерно 9 - 10 мкм. За пределы бифуркации ОСА) в MCA.
Примечание: В случае слишком много ощущается сопротивление в то время как большая часть нити остается видимой, нить, возможно, вошли в PPA. Если это произойдет, тянуть нить обратно к развилке, мягко гнойч вперед в ICA с помощью щипцов Дюмон, и продвигать нить, пока она не может быть визуализированы в ICA.
3. реперфузии
- После 30-минутного периода прикуса, удалите нить, осторожно потянув ее обратно, используя Дюмон щипцов и закрепить шовный материал вокруг открытого конца ЭКА.
- Удалите временный шов вокруг CCA тщательно ослабляя лигатуры, используя Дюмон пинцетом и крови поток возобновляется через ОАС.
- Закрыть разрез с непрерывным швом хирургической. Закрытие кожи может быть достигнуто путем непрерывным, так и узловыми швами. скрепок кожи также является приемлемым методом.
- Вводят мышей с 1 мл физиологического раствора подкожно в качестве пополнения объема и с болеутоляющими карпрофена (5 мг / кг, подкожно) для облегчения боли и дискомфорта от хирургической процедуры, знаки, указывающие на дополнительное облегчение боли необходимо включать сутулая спина, неопрятного пальто, снижение активности, нарушениепозерство, и снижение аппетита.
- Обратите внимание мышей по всему восстановления после анестезии в отапливаемом 30 ° C клетки с использованием тепла лампы регулируется с помощью регулятора температуры и поместите растертый чау в чашку Петри на полу клетки, чтобы поощрить еды. Мыши будут размещены по одному в клетку в период реперфузии.
4. Sham хирургия
- Предметные мышей той же процедуре, без вставки моноволокна.
5. Послеоперационные Неврологические результаты (Таблица 1; рис 2)
- Неврологически оценить мышей после соответствующего периода реперфузии с использованием балльной системы 18-балльной оценкой в целом; Мотор; Сенсорная; Проприоцепция. Чем выше балл неврологического соответствует снизился неврологическую функцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, которые оцениваются отвечать на запросы и не в состоянии ходить будут умерщвлены. Другие критерии для гуманной эвтаназии будет включать в себя потерю веса более чем на 20%, респираторно-дистресс, и инфекция вокруг хирургической области. СО 2 камера будет использоваться для эвтаназии и физический метод , чтобы подтвердить смерть будет цервикальный вывих или торакотомии.
6. Измерение мозга Объем инфаркта (Рисунок 3)
- Индуцировать анестезию, используя комбинацию кетамина (150 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) инъецируют глубину Монитор анестезии с помощью ног крайнем случае первоначально через каждые 3 - 5 мин и через каждые 10 мин, как только обезболивание достигается.
- Место мышей в положении лежа на спине и порезать кожу от живота до шеи с последующим брюшины с помощью Iris прямые ножницы.
- Поднимите грудину с помощью Дюмон щипцов и разрезать ребра, чтобы обнажить сердце.
- Откройте левую и правую сторону груди, используя две пары кровоостанавливающих, обнажая сердце.
- Вставка 26 G иглу, присоединенную к 5 мл шприца в левый желудочек и отрезать правое предсердие. Заливать водой комнатной температуры нормального физиологического раствора или фосфатэ-солевой буфер (PBS), пока жидкость не станет ясно (обычно 3 - 5 мин).
- Удалите череп тщательно от головного мозга с помощью Iris прямые ножницы и Дюмон щипцов.
- Отрезанные обонятельные луковицы и мозжечок, используя лезвие бритвы, чтобы мозг будет вписываться в матрице. Используйте эту матрицу, чтобы разрезать мозг даже сегментов. Охладите матрицу перед использованием, чтобы сохранить ткани прохладно. Поместите мозг в матрицу и установить ее на льду.
- Нарезать мозг в 2 мм корональных сегментов с использованием двух бритвенных лезвий. Сделайте первый разрез с помощью лезвия бритвы, начиная 2 мм от верхней и оставить эту лезвие бритвы на месте. Сделайте еще 2 мм, вырезанные за первым. Удалите первый лезвие с тканью прилагается. Повторите этот процесс, пока все ткани не разрезана.
Примечание: Там должно быть 4 - 5 сегментов, когда закончите. - Поместите сегменты в 24-луночные планшеты, содержащие хлорид 2% 2,3,5-triphenyltetrazalium (TTC), который затем помещают в неглубокий на водяной банет 37 ° С в течение 20 мин. Размещение каждого сегмента в отдельную лунку помогает держать их в том порядке, в котором они были вырезаны. Убедитесь в том, что решение TTC полностью покрывает сегменты ткани. Через 10 мин повернуть все кусочки над.
- Поместите небольшое количество 10% -ного формалина в лунки нового 24-луночного планшета и передавать сегменты на этой пластине в том порядке, в котором они были вырезаны.
- Сканирование сегментов в компьютер и анализировать размер инфаркта в процентах от целого среза мозга 6 с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ (NIH 1,57 изображений программное обеспечение) 6.
- Outline области поврежденного для генерирования измерения площади. Затем измерить весь контралатерального полушария, чтобы определить область. Разделить зоны инфаркта на площадь контралатерального полушария и умножить на 100, чтобы определить объем инфаркта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мыши подвергались 30-минутной MCAO-индуцированной ишемией головного мозга (рисунок 1) , за которым следует период реперфузии (24 часа в сутки и 1 неделя представлены здесь, но длина реперфузии может изменяться). Смертность во время MCAO была минимальной (около 2%). Сообщение ишемия, уровень смертности (в пределах первых 24 ч) составила около 26%.
Лазерный доплеровский флоуметрии используется для подтверждения перфузию кровотока на территории MCA до и после МСАО / реперфузии. Рисунок 4 ясно показывает , что , когда временный CCA галстук высвобождается через 30 мин ишемии для удаления нити и реперфузии , чтобы произойти, происходит всплеск в перфузией, который достиг <100% от исходного уровня перфузии (т.е. до операции) 5 мин в реперфузии.
24 ч после начала инсульта (перед измерением объема инфаркта) Neurological оценки , относящиеся к общему, сенсорных, моторных и проприоцептивные дефициты были оценены (таблица 1). Эта система подсчета очков предназначена для обеспечения цели ( «да или нет») критерии оценки. На рисунке 2 показано , что оценка для мышей (п = 27) через 24 часа была 12,56 ± 0,7, и остается высокой 1 неделю спустя (11,50 ± 1,5 ). Чем выше балл неврологического соответствует снизился неврологическую функцию.
Инфаркт объемы отражали аналогичные тенденции к неврологического балла через 24 часа, т.е. больше фиктивных животных. 24 ч после МСАО, мыши имели большие объемы инфаркта (Рисунок 3: 15,9 ± 2,6%), которые были усилены за 1 неделю после инсульта (28,5 ± 1,9%).
Рисунок 1: Схема с указанием местоположения средней церебральной артерии Окклюзия(MCAO) хирургии и большого сосуда васкулатура мозгового кровообращения. A. Хирургическая MCAO достигается путем введения нити в наружную сонную артерию , а затем в проксимального средней сонной артерии. BG. Шаги для индукции МСАО. артерия связи Передней (ACA); средней мозговой артерии (СМА); задняя связи артерии (PcomA); задней мозговой артерии (PCA); низовой артерии (БА); внутренней сонной артерии (ВСА); наружную сонную артерию (ECA); крылонебный артерии (PPA); внутренней сонной артерии (ВСА). (Modified с разрешения Smith и др., Ссылка # 5.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: 18-точечная Stroke Score Это comprehensiве оценка хода оценивает функциональные улучшения в целом, и сенсорных, моторных и проприоцептивные аспекты поведения мыши после инсульта. Данные представляют собой среднее ± SEM. * P <0,05. п = 3 мышей / группа. Данные были проанализированы с использованием ANOVA плюс постфактум тест Бонферрони. (Modified с разрешения Smith и др., Ссылка # 5.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Инфарктом Объемы C57BL / 6 мышей через 24 часа после МСАО мышей подвергали 30-минутной MCAO и 24 ч или 1 неделю реперфузии А) Мозги были удалены, делали срезы и окрашивали 2% 2,3,5-. хлорид трифенилтетразолий (TTC). В живой ткани, дегидрогеназы ферментативно уменьшают TTC до 1,3,5-поездкиhenylformazaon (ТПФ), который является красный цвет, но в ишемизированной ткани фермент не функционирует, так что ткань остается белым. В) На графике показано увеличение объема инфаркта у мышей, что они имели инсульт. Данные представляют собой среднее ± SEM. ** P <0,002, **** P <0,0001 по сравнению с притворство; п = 4 мышей / группа. Данные были проанализированы с использованием ANOVA плюс постфактум тест Бонферрони. Шкала бар = 1 см (Модифицированные с разрешения Smith и др., Ссылка # 5.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Перфузия MCA края На протяжении MCAO и реперфузии мышей подвергали 30-минутной MCAO, и <5 мин реперфузии. Исходные условия были нормализованы до 100%. Как EXPEКТИД, перфузия 5 мин в период реперфузии была выше , чем MCAO, то есть, когда нет перфузию ткани не наблюдалось. Данные представляют собой среднее ± SEM. * P <0,05. п = 3 мышей / группа. Данные были проанализированы с использованием ANOVA плюс постфактум тест Бонферрони. (Modified с разрешения Smith и др., Ссылка # 5.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Неврологические Scoring System Одно очко дается за утвердительный ответ на каждый из тестов.. Marks из 18 7,8.
| Контрольная работа | Краткое описание | Что это проверить? | Рекомендации |
| Моррис водном лабиринте | Процедура водно-лабиринтом открытого поля, где грызуны учатся бежать из воды на скрытой платформе | Пространственная память, управление движением и когнитивное картирование | 19 |
| Rotarod | Горизонтальный вращающийся стержень, где грызуны должны идти вперед, чтобы не упасть | координация движений, баланс, и сила сцепления | 20 |
| полюс | Грызуны, помещенные на полюсе, и наблюдаемые для скольжения или падения, как они делают свой путь вниз в клетку | Двигательные расстройства, вызванные повреждением коры головного мозга | 21, 22 |
| Походка анализ | Как грызуны пересекают стеклянную пластину их Прайнтс захватываются для изучения их движения | Пешеходные узоры (лапа давление, длина шага, ширина и частота, схождение спрэд, походка угол, и вращение тела)и координации движений | 23, 24 |
| Липкий тест этикетки | Полоски ленты, применяемые к безволосой части лапой грызунов записать время, чтобы связаться с каждым лапу, порядок контакта, время удаления, а также порядок снятия | Дефицит лапка чувствительности и сенсомоторные | 25, 26 |
| угол | Грызуны, помещенные между двумя досками, образующими угол 30 °; при входе глубоко в угол с обеих сторон вибрисс стимулируются и грызунах тылов и поворачивает обратно к лицу с открытым концом | Неврологические расстройства и повторяющиеся модели поведения (мониторинг оборотов в одном направлении по отношению к противоположном направлении) | 27, 28 |
| цилиндр | Грызуны помещают в стеклянный цилиндр с передней конечности активностью в то время как выращивание против стены записывается | Опорно-двигательный асимметрии и оценить PoststrОке использование конечности | 28 |
| лестница | Грызуны, помещенные на платформе в коробке с наживкой двойной лестницей; грызуны пищи ограничено в целях содействия движению вверх по лестнице, чтобы собрать наживки | Достигнув способности для каждого независимо друг от друга передних конечностей, требующих сенсорных способностей, ловкости и координации движений | 25, 29 |
| лестница | Грызуны ходить по горизонтальной лестнице, чтобы достигнуть их клетку; нога проскальзывает при ходьбе по лестнице записываются | Неисправности ног во время передвижения; передних конечностей и функции задних конечностей и координация | 30 |
Таблица 2: Примеры мышиных поведенческих тестов.
| Предложение для ГПП выглядит следующим образом : |
| - Конкретные детали которого она была выбрана модель инсульта (например, Лонга против Коидзуми), и штамм, возраст, пол, вес сообщил ясно. |
| - Исследования, проведенные в двойном слепом моды. |
| - Сообщил анализ мощности. |
| - Критерии включения и исключения в исследовании решили до начала исследования, и сообщил. |
| - Животные отслеживаются ежедневно (основной внешний вид, вес тела и поведение) каких-либо признаков бедствия, боли или болезни. |
| - Отчетность о животных исключены из исследования. |
| - Рандомизации животных на группы. |
| - & #160; Отчетность отрицательных и положительных результатов. |
| - Отчетность о продолжительности операции, анестетики, температуры тела и газов крови. |
| - Отчетность экологического обогащения используется, если таковые имеются. |
Таблица 3: Рекомендации по надлежащей практике лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С момента своего зачатия 20 лет назад, модель MCAO для человеческого инсульта с участием вставки нити используется в огромном количестве исследований. Это происходит главным образом из - за того , что он имитирует , что происходит клинически наиболее распространенной формой инсульта (то есть, ишемический инсульт). Стриатуме более чувствительна к ишемии, чем коры головного мозга, и, как таковые, длина ишемического времени переведет будет ли влиять как стриатуме и дорсолатеральная кортекс, или просто стриатуме. Оба инфаркта и реперфузии времена могут быть изменены соответствующим образом, и это дает исследователю возможность быть в состоянии изучить патологические эффекты, связанные с транзиторные ишемические атаки (ТИА) в гораздо больших инфарктов.
На протяжении многих лет модификации и устранение неисправностей метода синтетических нитей MCAO показал важность процедуры проводят в стерильных условиях , чтобы избежать риска заражения 9. Результаты могут отличатьсямежду видами грызунов, штамм (анатомической вариации были показаны) использовали 10,11, вес, и анестетики, но тенденции в результатах , представленных здесь, вероятно, будут отражены в других лабораториях , где выполняется МСАО. Другие важные шаги, чтобы принять во внимание, температуру тела, кровяное давление и газы крови. Хорошо установлено , что температура тела влияет на неврологическое повреждение, с меньшими поражений , связанных с переохлаждением 12 и более серьезных дефицитов был представлен в гипертермии 13. Таким образом, температура должна измеряться и контролироваться, например, с помощью использования регуляторов температуры для животных с тепловым площадку, таким образом, чтобы поддерживать температуру тела при 36,5 ° С. пополнение Объем и поощрение еды путем размещения смягчают чау в нижней части клетки также являются дополнительными факторами для наблюдения. Артериальное давление и газы крови 6,14 оба могут быть легко измерены и контролируется с использованием легко доступного оборудования от CommercIAL поставщиков.
Ограничения метода MCAO включают правильно рассечения блуждающего нерва из артерий без повреждения и избежать продвижения нити в PPA, которые могут повлиять не только способность эффективно вызывать инсульт, но и уровень выживаемости мышей. Наиболее важное значение в отношении альтернативных методов в естественных условиях MCAO является коэффициент выживаемости при использовании метода Лонга , описанной здесь. Мы также обнаружили, что это соответствует увеличению лейкоцит-эндотелиальных взаимодействий клеток и увеличение объемов инфаркта, которые делают эту модель, овладев отличный инструмент для изучения потенциальных терапевтических мишеней для лечения инсульта.
Хотя мы не сообщали о какой - либо здесь, ряд поведенческих тестов также может быть выполнена , например , как Моррис водный лабиринт, Rotarod, полюса испытания, анализа походки, липкого теста этикетки, угол испытания, испытания цилиндра, испытания лестницы и испытания лестницы (см таблицу2 для деталей и ссылок). Sham животные не имеют никаких проблем с заполнением этих поведенческих тестов; Однако, инсульт животные выполняют эти тесты гораздо менее успешно. Исходя из этого, одна область дебатов влияет ли экологическое обогащение не только воспроизводимости модели MCAO, но и будет ли оно повлиять на исход поведенческих тестов 15. Это неясно, но стоит стандартизацию это в лаборатории, и на протяжении всего исследования.
Есть множество различных тестов, доступных для измерения результатов хода. Мы представили занятость лазерной доплеровской для измерения кровотока, 18-балльной шкале неврологического углубленной оценки, а также инфарктом измерения объема. Тем не менее, дополнительные параметры также могут быть использованы, такие как изображения. Мы регулярно используют использование прижизненной флуоресцентной микроскопии для изучения клеточных взаимодействий (характерное воспалительной реакции) 6 в рамках Cerebral микроциркуляции в режиме реального времени, у анестезированных животных 5,6,16. MCAO и реперфузии вызывает повышенную мозговую воспалительную реакцию против фиктивных животных 5,6,16. Другие методы визуализации , такие как магнитно - резонансная томография 17 и позитронно - эмиссионной томографии 18 также могут быть использованы, так как они дают возможность для продольных исследований, которые клинически значимыми.
Гистологический анализ ткани мозга, плазмы и сыворотки крови должны регулярно выполняться, поскольку они позволяют дальнейшую характеристику патофизиологических реакций на ход и механизмы участвуют, но и, возможно, более важно, они позволяют исследователям изучать эффекты соединений на исход инсульта, обеспечивая тем самым важные данные для потенциальных терапевтических мишеней для этого изнурительных и разрушительной болезни. Наконец, мы считаем, что крайне желательно для исследователей рассматривать не только наиболее подходящие модели инсульта баСЭД на требования для их изучения, но и то, что GLP ( «Надлежащая лабораторная практика») является обязательным. Таблицу 3 для предложений GLP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Marks, M. P., et al. Patients with acute stroke trated with intravenous tPS 3-6 hours after stroke onset: correlations between MR angiography findings and perfusion- and diffusion-weighted imaging in the DEFUSE study. Radiology. 249 (2), 614-623 (2008).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimnetal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. (8), 1-8 (1986).
- Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. E. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Meth. 249, 99-105 (2015).
- Gavins, F. N., Dalli, J., Flower, R. J., Granger, D. N., Perretti, M. Activation of the annexin 1 counter-regulatory circuit affords protection in the mouse brain microcirculation. FASEB J. 21 (8), 1751-1758 (2007).
- Chen, J., et al. Atorvastain induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 281-290 (2005).
- Li, Y., et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (9), 1311-1319 (2000).
- Liesz, A., et al. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia; the immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40 (8), 2849-2858 (2009).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44 (2), 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Burk, J., Burggraf, D., Vosko, M., Dichgans, M., Hamann, G. F. Protection of cerebral microvasculature after moderate hypothermia following experimental focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. (1226), 248-255 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthemia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Würbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments? Nat Methods. 6 (4), 257-261 (2009).
- Holloway, P. M., et al. Both MC1 and MC3 receptors provide protection from cerebral ischemia-reperfusion-induced neutrophil recruitment. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, (2015).
- Vandeputte, C., et al. Characterization of the inflammatory response in a photothrombotic stroke model by MRI: implications for stem cell transplantation. Mol Imaging Biol. 13 (4), 663-671 (2010).
- Iwae, Y., et al. Glial cell-mediated deterioration and repair of the nervous system after traumatic brain injury in a rat model as assessed by positron emission tomography. J Neurotrauma. 27 (8), 1463-1475 (2010).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
- Mouzon, B., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in a mouse model produces learning and memory deficits accompanied by histological changes. J Neurotrauma. 29 (18), 2761-2773 (2012).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human α-synuclein. J Neurosci. 24 (42), 9434-9440 (2004).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 125 (1-2), 109-125 (2001).
- Toon, L., Silva, M., D'Hooge, R., Aerts, J. M., Berckmans, D. Automated gait analysis in the open-field test for laboratory mice. Behav Res Methods. 41 (1), 148-153 (2009).
- Lubjuhn, J., et al. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184 (1), 95-103 (2009).
- Bouët, V., Freret, T., Toutain, J., Divoux, D., Boulouard, M., Schumann-Bard, P. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203 (2), 555-567 (2007).
- Freret, T., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: usefulness of adhesive removal test. Behav Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosci. 17, 400-406 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow. 33, 330-338 (2012).
- Wiessner, C., et al. Anti-nogo-a antibody infusion 24 hours after experimental stroke imporved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 154-165 (2003).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp Transl Stroke Med. 2 (13), (2010).
