Summary
על מנת להבין את פתופיזיולוגיה של שבץ, חשוב להשתמש במודלים אמינים. מאמר זה יתאר את אחד דגמי שבץ הנפוצים ביותר בשימוש בעכברים, כינה את חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo) המודל (המכונה גם נימת intraluminal או מודל תפר) עם reperfusion.
Abstract
שבץ מוחי הוא גורם מוביל למוות ברחבי העולם וממשיך להיות אחד הגורמים העיקריים של מוגבלויות הבוגרת לטווח ארוך. כ -87% ממקרי השבץ הם איסכמיים במקורו להתרחש בשטח של עורק המוח האמצעי (MCA). כיום מינהל המזון והתרופות רק (FDA) אישר תרופה לטיפול המחלה ההרסנית הזאת הוא מפעיל plasminogen רקמות (tPA). עם זאת, tPA יש חלון טיפולי קטן עבור הממשל (3 - 6 שעות), והוא יעיל רק ב 4% מהחולים שבאמת לקבלו. המחקר הנוכחי מתמקד בהבנת הפתופיזיולוגיה של שבץ כדי למצוא מטרות טיפוליות פוטנציאליים. לפיכך, מודלים אמינים הם קריטיים, ואת חסימת MCA (MCAo) המודל (המכונה גם מודל הנימה או intraluminal תפר) נחשב למודל כירורגית הרלוונטי ביותר מהבחינה הקליני של שבץ איסכמי, והיא די פולשני לשחזור בקלות. בדרך כלל מודל MCAo משמש עם מכרסמים, במיוחד עם עכברים בשללכל הווריאציות הגנטיות זמינות עבור מין זה. כאן אנו מתארים (ובהווה בסרטון) כיצד לבצע את מודל MCAo בהצלחה (עם reperfusion) בעכברים כדי להפיק נתונים אמינים לשחזור.
Introduction
שבץ מוחי הוא הגורם החמישי המוביל למוות ברחבי העולם, עם אדם אחד מת מהמחלה בכל 4 דקות. מעל 800,000 אמריקאים סובלים משבץ בכל שנה, אשר לא הרסני רק עבור המטופל, אך גם עבור משפחותיהם. שבץ מוחי הוא הגורם העיקרי למוגבלות מבוגרות ואת ההוצאה השנתית מוערכת בסדר גודל של 36.5 מיליארדים $ 1 למרות אפשרויות טיפול מעט מאוד להיות זמין.
מפעיל רקמות plasminogen (tPA) הוא מנהל המזון והתרופות רק (FDA) מורשה תרופה לשבץ איסכמי. עם זאת, הוא יעיל רק אם ניתן לחולים תוך 3-6 שעות מתחילת האירוע המוחי, ובמקרים אלה הם פועלים לטובת רק 4% מהחולים 2. לכן, קיים הכרח כי במודלים של בעלי חיים לשחזור, משמעות קלינית של שבץ משמשים כדי לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות וטיפולים למחלה זו. חשוב לציין כי במבחנה in vivo מודלים חיוניים.
הסוג הנפוץ ביותר של שבץ איסכמי הוא במקורו, והיווה 87% ממקרי שבץ הכולל. משיכות אחרות הן דימום תוך-מוחי (9%) ודימום תת-עכבישי (4%), ו נגרמות לרוב על ידי תסחיפים אל עורק המוח האמצעי (MCA). זהו המיוחס העקום הבולט בשורש MCA, מה שגורם זרימת דם למינרית הנכנס למוח כדי להיות מופרות. MCA נובעת עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת) ומסלולים לאורך מענית לרוחב, שם סניפים ופרויקטים בגרעיני הבסיס ואת משטחים לרוחב של חזיתית, הקודקודית האונה הטמפורלית, כולל המנוע הראשוני בקליפה המוטורית. המעגל ויליס נוצר על ידי מעורקים אחוריים להיותמחובר אל עורקי המוח ועורקי תקשורת האחוריים.
מודל הנימה או תפר intraluminal של MCAo הוא אחד הנפוץ ביותר במחקר שבץ. עם זאת, יש כמה וריאציות שונות מודל זה, ואלה המבוססים על אם microfilament מוכנס לתוך העורק הראשי החיצוני (ECA, כינה את שיטת Longa) 3, או אם זה מוכנס לתוך ICA (כינה את קואיזומי שיטה) 4. בשיטה של קואיזומי, עורק התרדמה המשותף (CCA) בצד של הניתוח חייב להיות קשור באופן קבוע אם נימה מוסר כדי למנוע דימום מן החתך של המרכז לאמנות עכשווית, ואילו שיטת Longa הוא ECA כי חייב להיות קשור באופן קבוע 5 . הנה שיטת Longa תשמש אנחנו מרגישים את זה הוא עדיף בהרבה ומודל כירורגית רלוונטי יותר קליני של שבץ איסכמי. יתר על כן, השימוש של monofilament הטה-סיליקון, במיוחד עם שיטת Longa, מייצר מאוד לשחזור MCAo בניגוד monofilaments-הקהה להבה, אשר לעתים קרובות לייצר חסימה חלקית ו / או דימום תת-עכבישי 6.
שיטת נימת intraluminal יכולה לשמש כמודל של 4,6 חסימה קבועה או חולף. כדי לבצע את המודל החולף, הנימה יוסרה לאחר תקופה של איסכמיה (למשל, 30 דקות, 60 דקות, או שעה 2), ו reperfusion מותר לקרות. מודל זה, במידה מסוימת, המדמה את ששבת זרימת דם לאחר התערבות ספונטנית או טיפולית (למשל, ממשל tPA) כדי lyse קריש תרומבואמבוליים בבני אדם. עבור הדגם הקבוע, הנימה נשארת פשוט במקום במשך פרק זמן מסוים (למשל, 24 שעות), ולכן אין reperfusion מתרחשת. יתרון נוסף של שיטת נימת intraluminal הוא העובדה כי craniotomy לא צריך להתבצע, המאפשר הגולגולת כדי להיות שלמה שמאל והימנעות מכל שינויים בלחץ תוך גולגולתי וטמפרטורה.
= ילדה "jove_content"> בסרטון הזה אנחנו מדגימים כיצד לבצע את שיטת נימת intraluminal Longa לגרום MCAo ו reperfusion. כמו כן, אנו מראים כיצד לבצע את ציון נוירולוגיות 18 נקודות וכן לקבוע את ההיקף האוטם באמצעות כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazalium מכתים (TTC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה והניסויים שדווח וידאו אושרו על ידי LSUHSC-S מוסדיים בעלי חיים לטיפול ושימוש הוועדה עומדות בהנחיות של NIH.
הערה: זכר C57BL / 6 עכברים במשקל 25 - 29 גרם שימשו במחקר זה. העכברים היו מתוחזקים על דיאטה גלולה צ'או רגילה עם גישה חופשית למים, תחת מחזור 12 שעות אור / חושך בכלובים מאווררים בנפרד. ההליך יבוצע בתנאים סטריליים באמצעות טכניקות סטרילי (למשל, כפפות סטריליות, בכלים סטריליים).
תכשירי 1. טרום ניתוחיים
- להשרות הרדמה באמצעות שילוב של קטמין (150 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) מוזרק intraperitoneally (IP). צג עומק ההרדמה ברגל קמצוץ בתחילה כל 3 - 5 דקות וכל 10 דקות פעם מושגת ההרדמה. בעוד החיה בהרדמה, לנהל משחה עינית סטרילי כדי למנוע יובש. המינון הראשוני של קטמין / xylazine נמשך בדרך כלל abמתוך 30-40 דקות. מנה נוספת יכולה להינתן במידת הצורך, אשר מאומתים על ידי התגובה של החיה כדי קמצוץ רגל.
- מניחים עכברים במצב שכיבה על מחצלת חום מוסדר טמפרטורה לשמור על טמפרטורת הגוף על 36.5 ± 0.1 מעלות צלזיוס, אשר מאומתת באמצעות בדיקה רקטלית.
- לגלח את הצוואר ולחטא את העור עם כוהל אתילי 70%.
2. ספיגה של MCA (איור 1)
- ביצוע חתך בצוואר קו אמצע באמצעות מספריים ישר איריס לסגת (באמצעות כתיבה) הרקמות הרכות כדי לחשוף את הכלי.
- לנתח את CCA ואת ECA מן הרקמה הסובבת באמצעות מלקחיים דומון מבלי לפגוע העצב התועה.
- הפוך תפר זמני על ידי קשירת קשר רופף סביב המרכז לאמנות עכשווית באמצעות משי 6-0.
- הפוך תפר קבע ברחבי ECA והכלים הקטנים המשתרעים אותו בחוזקה ligating הכלי (דיסטלי אל ההסתעפות של CCA).
- ערכו Aro תפרund הפרוקסימלי ECA אל הסתעפות המרכז לאמנות עכשווית.
- מניחים קליפ microvessel סביב עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת) ואת העורק pterygopalatine (PPA).
- ביצוע חתך קטן ECA באמצעות מיקרו לנתח מספריים האביב והכניסו monofilament סיליקון שקצהו 180 מיקרומטר. עובר את הסינון קרוב התפר קבע ככל האפשר עבור מניפולציה קלה יותר של הנימה.
- הדק את התפר הזמני סביב ECA עם הנימה המוכנסת ולהסיר את הקליפ microvessel.
- חותכים את ECA בין תפר קבע, דיסטלי ואת נקודת כניסה של נימה באמצעות מיקרו לנתח מספריים האביב.
- מדריך הנימה באמצעות הרשפ"ת עד התנגדות מורגשת (כ 9 -. 10 מיקרומטר מעבר ההסתעפות של CCA) של MCA.
הערה: במקרה גם בהתנגדות רבה מורגשת בעוד שרוב הנימה עדיין גלוי, הנימה ייתכן נכנסה PPA. אם זה יקר, למשוך את חוט הלהט בחזרה אל ההסתעפות, בעדינות מוגליתh קדימה לתוך מלקחי דומון באמצעות הרשפ"ת, ולהתקדם הנימה עד שניתן דמיינו הרשפ"ת.
Reperfusion 3.
- לאחר תקופת חסימה של 30 דקות, להסיר את הנימה באמצעות משיכה עדינה אותו בחזרה באמצעות מלקחי דומון ולאבטח את התפר סביב הקצה הפתוח של ECA.
- הסר תפר זמני סביב המרכז לאמנות עכשווית על ידי שחרור ליגטורה בזהירות באמצעות זרימת מלקחיים דומון ודם יתחדש דרך המרכז לאמנות עכשווית.
- סגירת החתך עם תפר כירורגים רציף. סגירת העור יכולה להתבצע על ידי אחד תפרים רציפים או מופרעים. סיכות עור הן גם שיטה מקובלת.
- להזריק עכברים עם 1 מ"ל של תת-עורית מלוחים כמו חידוש נפח עם carprofen כאבים (5 מ"ג / ק"ג, SC) לשיכוך כאבים ואי נוחות מן ההליך הכירורגי, סימנים המעידים לשיכוך כאבים נוסף נדרש כוללות רכון לאחור, מעיל ungroomed, ירידה בפעילות, לא נורמליפוזה, וירידה בתיאבון.
- שימו עכברים במהלך ההתאוששות מן ההרדמה בכלוב C מחוממת 30 מעלות באמצעות מנורת החום מוסדר באמצעות בקר טמפרטורה ומניחים צ'או מחית בצלחת פטרי על רצפת הכלוב כדי לעודד אכילה. העכברים ישוכנו אחד בכל כלוב בתקופת reperfusion.
4. ניתוח דמה
- עכברים כפופים לאותם ההליך ללא החדרת monofilament.
5. ציוני נוירולוגיות לאחר ניתוח (טבלה 1; איור 2)
- מבחינת נוירולוגית להעריך עכברים לאחר תקופת reperfusion המתאימה באמצעות שיטת ניקוד 18 נקודות בהערכת הכללי; מָנוֹעַ; חוּשִׁי; פרופריוספציה. ציון נוירולוגיות גבוה תואם לירידה בתפקוד הנוירולוגי.
הערה: עכברים נשפטים מגיב מסוגל ללכת יהיה מורדמים. קריטריונים נוספים להמתת חסד אנושי יכללו הרזיה של יותר מ -20%, די נשימהמתח, ודלקת סביב אזור הניתוח. בתא 2 CO ישמש להמתת חסד והשיטה הפיסית כדי לאשר מוות יהיה נקע בצוואר רחם או פתיחת בית חזה.
מדידת 6. נפח המוחי (איור 3)
- להשרות הרדמה באמצעות שילוב של קטמין (150 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) מוזרק עומק צג ה- IP של הרדמה על ידי צביטה ברגל בתחילה כל 3 - 5 דקות וכל 10 דקות פעם מושגת הרדמה.
- מניחים עכברים במצב שכיבה וחותכים את העור מהבטן לצוואר ואחריו הצפק באמצעות איריס מספריים ישר.
- הרימו את עצם החזה באמצעות מלקחיים דומון לחתוך את הצלעות כדי לחשוף את הלב.
- פתח שמאל בצד ימין של החזה באמצעות שני זוגות hemostats, חושף את הלב.
- הכנס מחט 26 G מצורף מזרק 5 מ"ל לתוך החדר השמאלי וחתך את אטריום ימין. Perfuse עם מלח רגיל בטמפרטורת החדר או phosphate שנאגר מלוח (PBS) עד שהנוזל הופך ברורות (בדרך כלל 3 - 5 דקות).
- הסר את הגולגולת בזהירות מן המוח באמצעות איריס מספריים ישר מלקחיים דומון.
- חותכים את נורות חוש הריח ואת המוח הקטן באמצעות סכין גילוח כך שהמוח יתאים במטריצה. השתמש מטריצה זו כדי לחתוך את המוח לתוך אפילו מגזרים. צ'יל המטריצה לפני השימוש כדי לשמור על הרקמה מגניבה. מניחים את המוח לתוך המטריצה ולהגדיר אותו על קרח.
- פורס את המוח למקטעי עטרת 2 מ"מ באמצעות שני סכיני גילוח. הפוך את החתך הראשון באמצעות סכין גילוח החל מיום 2 מ"מ מהחלק העליון ולהשאיר סכין גילוח זה במקום. לעשות עוד 2 מ"מ חתך מאחורי הראשון. הסר את סכין הגילוח הראשון עם הרקמות מצורפות. חזור על תהליך זה עד שכל הרקמה כבר פרוסה.
הערה: צריך להיות 4 - 5 מגזרים בסיום. - מניחים את פלחי לתוך צלחת 24 היטב המכיל 2% כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazalium (TTC), אשר ממוקם אז באמבט מים רדודיםt 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מיקומה של כל מגזר לתוך באר פרט עוזר לשמור אותם בסדר שבו הם נחתכו. ודא כי פתרון TTC מכסה לחלוטין את קטעי הרקמה. לאחר 10 דקות להפוך את כל הפרוסות על פני.
- מניחים כמות קטנה של פורמלין 10% לתוך הבארות של צלחת 24 באר חדשה ולהעביר המגזרים לצלחת זה הסדר שבו הם נחתכו.
- סרוק את הפלחים לתוך המחשב ולנתח את גודל האוטם כאחוז של פרוסת המוח כולו 6 באמצעות תוכנת ניתוח ImageJ (תוכנת 1.57 תמונה NIH) 6.
- התווה את האזור האוטם כדי ליצור מדידת שטח. הבא למדוד בחצי הכדור הנגדי כולו כדי לקבוע את האזור. מחלק את האזור אוטם ע"י השטח של האונה הנגדית ולהתרבות על ידי 100 כדי לקבוע את עוצמת הקול האוטמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים שעברו איסכמיה 30 דקות הנגרמת MCAo (איור 1) ואחריה תקופה של רה-פרפוזיה (24 שעות ו 1 wk מוצגים כאן, אבל האורך reperfusion יכול להיות מגוון). התמותה במהלך MCAo הייתה מינימאלית (כ -2%). איסכמיה הודעה, שיעור התמותה (בתוך 24 השעות הראשונות) היה כ -26%.
Flowmetry דופלר לייזר שימש כדי לאשר זלוף זרימת הדם בשטח MCA לפני ואחרי MCAo / reperfusion. איור 4 מראה בבירור כי כאשר עניבה CCA זמני הוא שוחרר לאחר 30 דקות של איסכמיה להסרת נימה ו reperfusion להתרחש, יש גל ב זלוף, אשר הגיע <100% של זלוף הבסיס (כלומר, לפני הניתוח) 5 דקות לתוך reperfusion.
24 שעות לאחר תחילת שבץ (לפני מדידת נפח האוטם) Neurolעשרות ogical הנוגעים כללי, מוטוריים, סנסוריים גירעונות הפרופריוצפטיבית הוערכו (טבלה 1). שיטת ניקוד זה מיועד לספק אובייקטיבי ( 'כן או לא') קריטריונים להערכה. איור 2 מראה כי הניקוד עבור עכברים (n = 27) ב 24 שעות היה 12.56 ± 0.7, ונותר גבוה יותר 1 שבוע (11.50 ± 1.5 ). ציון נוירולוגיות גבוה תואם לירידה בתפקוד הנוירולוגי.
כרכים אוטמים שיקוף דפוס דומה תוצאת הנוירולוגית בבית 24 שעות, כלומר, יותר מאשר בעלי חיים בלוף. 24 שעות לאחר MCAo, היו עכברי כרכים אוטמים גדולים (איור 3: 15.9 ± 2.6%), אשר גברו 1 שבוע שבץ פוסט (28.5 ± 1.9%).
איור 1: סכמטי המראה את המיקום של העורקים התיכון ספיגה מוחין(MCAo) כירורגיה כלי דם-כלי הגדול של Circulation המוחין. א כירורגי MCAo מושגים באמצעות החדרת נימה לתוך העורק הראשי החיצוני ולאחר מכן לתוך העורק הראשי באמצע הפרוקסימלי. BG. צעדי גרימת MCAo. עורק תקשורת Anterior (ACA); עורק המוח האמצעי (MCA); אחורי עורק תקשורת (PcomA); אחורי עורק מוח (PCA); עורק הבסיס (BA); עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת); עורק התרדמה החיצוני (ECA); עורק pterygopalatine (PPA); עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת). (השתנה באישור סמית et al., התייחסות # 5.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. ציון שבץ 18 נקודות זה comprehensiציון שבץ ve מעריך שיפורים פונקציונליים בכלל, מוטוריים, סנסוריים היבטים הפרופריוצפטיבית של התנהגות העכבר בעקבות שבץ. נתונים הם ממוצעים ± SEM. * P <0.05. n = 3 עכברים / קבוצה. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA בתוספת מבחן פוסט הוק Bonferroni. (השתנה באישור סמית et al., התייחסות # 5.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. כרכים אוטמים של C57BL / 6 עכברי 24 שעות לאחר MCAo עכברים היו נתונים של 30 דקות MCAo ו -24 שעות או שבוע 1 של reperfusion א) מוח הוסרו, מחולק ומוכתם 2% 2,3,5-. כלוריד triphenyltetrazolium (TTC). ברקמה חיה, דהידרוגנאז enzymatically להפחית TTC כדי 1,3,5-טיולhenylformazaon (TPF), אשר הוא צבע אדום, אבל ברקמת איסכמית האנזים הוא לא פונקציונלי, כך הרקמה נשארה לבנה. B) הגרף מראה עלייה בנפח אוטם בעכברים לו כתוצאה משבץ. נתונים הם ממוצעים ± SEM. ** P <0.002, **** P <0.0001 מול העמדת פנים; n = 4 עכברים / קבוצה. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA בתוספת מבחן פוסט הוק Bonferroni. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ (השתנה באישור סמית et al., התייחסות # 5.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. זלוף של הטריטוריה MCA לאורך MCAo ו reperfusion עכברים היו נתונים של 30 דקות MCAo, ו- <5 reperfusion דקות. ערכי הבסיס היו מנורמל ל 100%. כפי expected, דקות זלוף 5 לתוך תקופת reperfusion היה גבוה יותר מאשר MCAo, כלומר, כשאף זלוף של רקמת התרחש. נתונים הם ממוצעים ± SEM. * P <0.05. n = 3 עכברים / קבוצה. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA בתוספת מבחן פוסט הוק Bonferroni. (השתנה באישור סמית et al., התייחסות # 5.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: מערכת ניקוד נוירולוגיות נקודה אחת ניתנה עבור תשובה כן כל אחת מהבדיקות.. מרקס מתוך 18 7,8.
| מִבְחָן | תיאור קצר | מה זה לבדוק? | הפניות |
| מבוך מים של מוריס | הליך פתוח בתחום המים מבוך שבו מכרסמים ללמוד להימלט מן המים על גבי פלטפורמת מוסתר | זיכרון מרחבים, בקרת תנועה, מיפוי קוגניטיבי | 19 |
| Rotarod | מוט סיבוב אופקי שבו מכרסמים חייב ללכת קדימה כדי לא ליפול | קואורדינציה מוטורית, שיווי משקל, כוח האחיזה | 20 |
| מוֹט | מכרסמים דגש על מוט וצפו הזזה או נופלים כמו שהם עושים את דרכם לתוך כלוב | הפרעות תנועה שנגרם נזק קליפת המוח | 21, 22 |
| ניתוח הליכה | כמו מכרסם לחצות צלחת זכוכית טביעות האצבעות המטונפות שלהם נלכדות לבחון את תנועותיהם | הליכת דפוסים (לחץ כפה, אורך צעד, רוחב ותדירות, ממרח בוהן, זווית הליכה, וסיבוב גוף)ותיאום מנוע | 23, 24 |
| מבחן תווית דביק | רצועות של נייר דבק מוחלות על החלק ללא שיער של בכפו של המכרסמים להקליט זמן ליצור קשר עם כל כף רגל, סדר הקשר, בעת ההרחקה, והסדר של הסרה | גירעונות הרגישות הסנסורית בכפו | 25, 26 |
| פינה | מכרסמים הממוקמים בין שני לוחות להרכיב בזווית של 30 מעלות; כאשר נכנסים עמוק לתוך הפינה משני צידי vibrissae מגורה ואת מתנשא מכרסם ופונה שוב אל הקצה הפתוח | הפרעות נוירו-התפתחותי והתנהגויות חוזרות (ניטור פונה בכיוון אחד מול בכיוון ההפוך) | 27, 28 |
| צִילִינדֶר | מכרסמים ממוקמים בתוך גליל זכוכית עם פעילות forelimb תוך גידול נגד החומה נרשם | אסימטריה של תנועה ולהעריך poststrשימוש איבר oke | 28 |
| גרם מדרגות | מכרסמי דגש על פלטפורמה בתוך קופסא עם גרם מדרגות כפול תגרה; מכרסמים מזון מוגבלים לקדם תנועה במעלה המדרגות כדי לאסוף את הפיתיון | הגעת יכולות לכל forelimb הדורשות יכולות חושיות עצמאי, כשרון, ואת קואורדינציה מוטורית | 25, 29 |
| סוּלָם | מכרסמים לחצות סולם אופקי להגיע לכלוב שלהם; רגל מחליק תוך כדי הליכה על פני הסולם נרשמים | תקלות רגל בזמן התנועה; forelimb ותפקוד hindlimb ותיאום | 30 |
טבלה 2: דוגמאות של בדיקות התנהגותיות Murine.
| הצעה עבור GLP היא כדלקמן: |
| - פרטים ספציפיים של איזה דגם של שבץ נבחר (למשל, Longa לעומת קואיזומי), ואת המתח, גיל, מין, משקל באופן ברור. |
| - מחקרים שבוצעו באופן כפול סמיות. |
| - ניתוח צריכת חשמל דווח. |
| - קריטריונים להכללה והדרה במחקר החליטו לפני המחקר, ודיווח. |
| - בעלי החיים במעקב יומי (משקל מראה, גוף בסיסי והתנהגות) עבור סימנים של מצוקה, כאב או מחלה. |
| - דיווח של חיות מהמחקר. |
| - רנדומיזציה של חיות לקבוצות. |
| - & #160; דיווח של תוצאות שליליות וחיוביות. |
| - דיווח בדבר משך הניתוח, ההרדמה, טמפרטורת הגוף וגזים בדם. |
| - דיווח של העשרה סביבתית בשימוש, אם בכלל. |
טבלה 3: הצעות לתרגול טוב מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאז ראשיתה לפני 20 שנים, מודל MCAo לשבץ אדם מעורב החדרת חוט להט נעשה שימוש מספר עצום של מחקרים. זאת בעיקר בשל העובדה כי זה מחק מה קורה קליני הצורה הנפוצה ביותר של שבץ (כלומר, שבץ איסכמי). הסטריאטום הוא יותר רגיש לאיסכמיה מ קליפת המוח, וככזה, את משך הזמן איסכמי יתורגם אם הן הסטריאטום ואת קליפת דורסולטרלי תושפע, או רק את הסטריאטום. פעמים האוטם ו reperfusion שניהם יכולים להיות מגוונים בהתאם, ואת זה מציע החוקר את היכולת להיות מסוגל ללמוד תופעות פתולוגיות הקשורות התקפות איסכמי חולף (TIAs) כדי אוטמים הרבה יותר גדול.
במהלך שנתי שינויים ופתרון בעיות של שיטת הנימה של MCAo הוכיחו את החשיבות של ההליך מתבצעת בתנאים סטריליים כדי למנוע את הסיכון לזיהום 9. התוצאות עשויות להשתנותבין מינים מכרסמים, זן (וריאציות אנטומיות הוכחו) 10,11, משקל הרדמה המשמשות, אבל מגמות התוצאות המוצגות כאן צפויות להשתקף במעבדות אחרות בן MCAo מתבצע. צעדים קריטיים נוספים לקחת בחשבון הן את טמפרטורת הגוף, לחץ הדם ואת רמת הגזים בדם. היא מבוססת היטב כי טמפרטורת גוף משפיעה ניזק נוירולוגים, עם נגעים קטנים הקשורים היפותרמיה 12 וגירעונות חמורים יותר שהוצגו ב היפרתרמיה 13. ככזה, הטמפרטורה צריכה להיות נמדדת ומבוקרת, למשל, באמצעות שימוש בקרי טמפרטורה חיה עם כרית חום, כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 36.5 מעלות צלזיוס. חידוש נפח ועידוד אכילה על ידי הצבת צ'או לרכך בתחתית הכלוב הם גם גורמים נוספים להתבונן. לחץ דם וגזים בדם 6,14 הן ניתנות למדידה בקלות לנטר באמצעות ציוד מוכן כבר מ commercספקי ial.
מגבלות טכניקת MCAo כוללות לנתח עצב התועה כראוי מהעורקים ללא ניזק והימנעות לקידום הנימה לתוך PPA, אשר יכול להשפיע לא רק את יכולתו להשפיע על שבץ ביעילות, אלא גם את שיעור ההישרדות של העכבר. המשמעות החשובה ביותר ביחס אלטרנטיבית בשיטות vivo MCAo הוא שיעור ההישרדות בעת השימוש בשיטת Longa המתואר כאן. מצאנו גם כי זה מתאים אינטראקציות תא לויקוציטים-אנדותל מוגברות כרכי אוטם גדלו, אשר הופכות את המודל הזה, פעם משתלט עליו, כלי מצוין ללימוד מטרות טיפוליות פוטנציאל לטיפול בשבץ מוחי.
למרות שאנו לא דווח על שום כאן, מספר בדיקות התנהגותיות יכול גם להתבצע כגון מבוך המים של מוריס, Rotarod, מבחן מוט, ניתוח הליכה, מבחן תווית דביק, מבחן בפינה, מבחן גליל, מבחן המדרגות, ולבדוק סולם (ראה טבלה2 לפרטים והפניות). אין חיות Sham בעיות עם השלמת בדיקות התנהגותיות אלה; עם זאת, מלטפים בעלי חיים לבצע בדיקות אלה הרבה פחות בהצלחה. בהמשך לכך, שטח של דיון אחד הוא האם העשרת הסביבה משפיעה לא רק על השחזור של מודל MCAo, אבל גם אם זה ישפיע על התוצאה של בדיקות התנהגותיות 15. זה ברור, אבל זה שווה את הקיבוע הזה בתוך המעבדה, לאורך כל תקופת המחקר.
יש שפע של מבחנים שונים זמינים למדידת תוצאת שבץ. הצגנו העסקת דופלר לייזר למדידות זרימת הדם, ציון הערכה מעמיקה 18 נקודות נוירולוגיות, וגם האוטם מדידות נפח. עם זאת, קיימות אפשרויות נוספות גם שימושיות, כגון הדמיה. אנו שגרתי להעסיק את השימוש של מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital ללמוד אינטראקציות הסלולר (מאפיין של תגובה דלקתית) 6 בתוך והנוזלמיקרו bral בזמן אמת, בחיות הרדים 5,6,16. MCAo ו reperfusion מייצר תגובה דלקתית מוח מוגבר לעומת חיות דמה 5,6,16. שיטות הדמיה אחרות כגון תהודה מגנטית 17 ו- PET 18 יכול לשמש גם, כפי שהם מספקים הזדמנות עבור מחקרים ארוכי טווח שאינן רלוונטיות קלינית.
ניתוח היסטולוגית של רקמת המוח, דגימות פלזמה וסרום צריכות להתבצע באופן שיגרתי, מאחר שהם מאפשרים אפיון נוסף של תגובות pathophysiological ללטף ואת המנגנונים מעורבים, אלא גם, ואולי יותר חשוב, הם ייאפשרו למדענים לחקור את ההשפעות של תרכובות על התוצאה לשבץ, ובכך לספק נתונים חשובים עבור מטרות טיפוליות פוטנציאל זה מתיש ומחלות הרסניות. לבסוף, אנו מאמינים רצוי מאוד לחוקרים לשקול לא רק את ba מודל שבץ המתאים ביותרsed על דרישות המחקר שלהם, אלא גם כי GLP ( "תרגול טוב מעבדה") נעשה חובה. ראה לוח 3 עבור הצעות GLP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Marks, M. P., et al. Patients with acute stroke trated with intravenous tPS 3-6 hours after stroke onset: correlations between MR angiography findings and perfusion- and diffusion-weighted imaging in the DEFUSE study. Radiology. 249 (2), 614-623 (2008).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimnetal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. (8), 1-8 (1986).
- Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. E. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Meth. 249, 99-105 (2015).
- Gavins, F. N., Dalli, J., Flower, R. J., Granger, D. N., Perretti, M. Activation of the annexin 1 counter-regulatory circuit affords protection in the mouse brain microcirculation. FASEB J. 21 (8), 1751-1758 (2007).
- Chen, J., et al. Atorvastain induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 281-290 (2005).
- Li, Y., et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (9), 1311-1319 (2000).
- Liesz, A., et al. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia; the immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40 (8), 2849-2858 (2009).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44 (2), 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Burk, J., Burggraf, D., Vosko, M., Dichgans, M., Hamann, G. F. Protection of cerebral microvasculature after moderate hypothermia following experimental focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. (1226), 248-255 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthemia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Würbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments? Nat Methods. 6 (4), 257-261 (2009).
- Holloway, P. M., et al. Both MC1 and MC3 receptors provide protection from cerebral ischemia-reperfusion-induced neutrophil recruitment. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, (2015).
- Vandeputte, C., et al. Characterization of the inflammatory response in a photothrombotic stroke model by MRI: implications for stem cell transplantation. Mol Imaging Biol. 13 (4), 663-671 (2010).
- Iwae, Y., et al. Glial cell-mediated deterioration and repair of the nervous system after traumatic brain injury in a rat model as assessed by positron emission tomography. J Neurotrauma. 27 (8), 1463-1475 (2010).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
- Mouzon, B., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in a mouse model produces learning and memory deficits accompanied by histological changes. J Neurotrauma. 29 (18), 2761-2773 (2012).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human α-synuclein. J Neurosci. 24 (42), 9434-9440 (2004).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 125 (1-2), 109-125 (2001).
- Toon, L., Silva, M., D'Hooge, R., Aerts, J. M., Berckmans, D. Automated gait analysis in the open-field test for laboratory mice. Behav Res Methods. 41 (1), 148-153 (2009).
- Lubjuhn, J., et al. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184 (1), 95-103 (2009).
- Bouët, V., Freret, T., Toutain, J., Divoux, D., Boulouard, M., Schumann-Bard, P. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203 (2), 555-567 (2007).
- Freret, T., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: usefulness of adhesive removal test. Behav Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosci. 17, 400-406 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow. 33, 330-338 (2012).
- Wiessner, C., et al. Anti-nogo-a antibody infusion 24 hours after experimental stroke imporved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 154-165 (2003).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp Transl Stroke Med. 2 (13), (2010).
