Summary
Per comprendere la fisiopatologia di ictus, è importante utilizzare modelli affidabili. Questo documento descrive uno dei modelli di ictus più frequentemente utilizzati nei topi, chiamato il modello cerebrale media occlusione dell'arteria (MCAO) (anche chiamato il filamento intraluminale o modello di sutura) con riperfusione.
Abstract
L'ictus è una delle principali cause di morte nel mondo e continua ad essere una delle principali cause di disabilità per adulti a lungo termine. Circa 87% degli ictus ischemico sono di origine e si verificano nel territorio dell'arteria cerebrale media (MCA). Attualmente l'unico Food and Drug Administration (FDA) ha approvato farmaco per il trattamento di questa malattia devastante è attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Tuttavia, tPA ha una piccola finestra terapeutica per l'amministrazione (3-6 ore), ed è efficace solo nel 4% dei pazienti che effettivamente ricevono. La ricerca attuale si concentra sulla comprensione della fisiopatologia di ictus al fine di trovare potenziali bersagli terapeutici. Così, modelli affidabili sono cruciali, e il modello MCA occlusione (MCAO) (anche definito il filamento o di sutura modello endoluminale) è considerato il modello più clinicamente rilevante chirurgica di ictus ischemico, ed è abbastanza non invasiva e facilmente riproducibile. Tipicamente il modello MCAO viene utilizzato con i roditori, in particolare con i topi dovutea tutte le variazioni genetiche disponibili per questa specie. Qui si descrive (e presente nel video) come eseguire con successo il modello MCAO (con riperfusione) nei topi per generare dati affidabili e riproducibili.
Introduction
L'ictus è la causa quinta di morte nel mondo, con una persona che muore dalla malattia ogni 4 minuti. Oltre 800.000 americani soffrono un ictus ogni anno, che non solo è devastante per il paziente, ma anche per le loro famiglie. L'ictus è la principale causa di disabilità adulta e la spesa annua è stimata nell'ordine dei $ 36500000000 1 nonostante poche opzioni di trattamento che sono disponibili.
Attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) è l'unico Food and Drug Administration (FDA) concesso in licenza farmaco per l'ictus ischemico. Tuttavia, è efficace solo se somministrato a pazienti entro 3-6 ore dall'inizio della corsa, e in questi casi avvantaggia solo il 4% dei pazienti 2. Pertanto, è imperativo che riproducibile, clinicamente rilevanti modelli animali di ictus sono utilizzati per aiutare nello sviluppo di strategie terapeutiche potenziali e trattamenti per questa malattia. È importante notare che in vitro in vivo sono essenziali.
Il tipo più comune di ictus ischemico è di origine, che rappresentano il 87% degli ictus totali. Altri colpi sono emorragia intracerebrale (9%) e di emorragia subaracnoidea (4%), e sono causati spesso da emboli all'arteria cerebrale media (MCA). Ciò è attribuibile alla curva prominente alla radice del MCA, che provoca il flusso sanguigno laminare entrare nel cervello per diventare perturbato. La MCA nasce dalla arteria carotide interna (ICA) e percorsi lungo il solco laterale, dove ramifica e progetti alle gangli della base e le superfici laterali del frontale, parietale e lobi temporali, tra il motore primario e corteccia sensoriale. Il circolo di Willis è stato creato da arterie cerebrali posteriori essendocollegato alle arterie cerebrali e comunicante posteriore arterie.
Il filamento o di sutura modello intraluminale di MCAO è uno dei più ampiamente utilizzato nella ricerca ictus. Tuttavia, ci sono un paio di diverse varianti di questo modello, e questi sono basati sul fatto che il micro-filamento viene inserito nell'arteria carotide esterna (ECA, chiamato il metodo Longa) 3, oppure se viene inserita nella ICA (denominato Koizumi metodo) 4. Nel metodo di Koizumi, l'arteria carotide comune (CCA) sul lato della chirurgia deve essere legato in modo permanente se il filamento viene rimosso per prevenire le emorragie dall'incisione nella CCA, mentre nel metodo Longa è l'ECA che deve essere legato in modo permanente 5 . Qui il metodo Longa sarà utilizzato come riteniamo che questo è un gran lunga superiore e un modello più clinicamente rilevante chirurgica di ictus ischemico. Inoltre, l'uso di un monofilamento di silicio a punta, in particolare con il metodo Longa, produce moltoriproducibile MCAO rispetto ai monofilamenti fiamma smussati, che spesso producono occlusione incompleta e / o emorragia subaracnoidea 6.
Il metodo filamento intraluminale può essere utilizzato come modello di permanente o transitorio 4,6 occlusione. Per eseguire il modello transitorio, il filamento viene rimosso dopo un periodo di ischemia (ad esempio, 30 min, 60 min, o 2 ore), e riperfusione è permesso che accada. Questo modello, in qualche misura, simula il ripristino del flusso sanguigno dopo l'intervento spontaneo o terapeutico (ad esempio, la somministrazione tPA) per lisare un coagulo tromboembolico nell'uomo. Per il modello permanente, il filamento viene semplicemente lasciato in posizione per un periodo di tempo (ad esempio, 24 ore), quindi si verifica nessuna riperfusione. Un altro vantaggio del metodo filamento intraluminale è il fatto che una craniotomia non deve essere eseguito, permettendo al cranio per essere lasciata intatta ed evitando eventuali variazioni della pressione intracranica e temperatura.
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Protocol
Questo protocollo e gli esperimenti riportati nel video sono stati approvati dal Comitato LSUHSC-S Institutional Animal Care e Uso e sono in conformità con le linee guida del NIH.
NOTA: Maschio C57BL / 6 topi che pesano 25 - 29 g sono stati utilizzati in questo studio. I topi sono stati mantenuti su una dieta chow pellet di serie con libero accesso all'acqua, sotto un / buio ciclo 12 ore di luce in gabbie a ventilazione individuale. La procedura viene eseguita in condizioni di sterilità utilizzando tecniche sterili (ad esempio, guanti sterili, strumenti sterili).
Preparativi 1. Pre-chirurgiche
- Indurre l'anestesia utilizzando una combinazione di ketamina (150 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) iniettato per via intraperitoneale (ip). Monitorare profondità dell'anestesia per pizzico piedi inizialmente ogni 3-5 minuti e ogni 10 minuti una volta che si ottiene l'anestesia. Mentre l'animale è sotto anestesia, somministrare una pomata oculare sterile per prevenire la secchezza. La dose iniziale di ketamina / xylazina solito dura abfuori 30-40 minuti. Una dose aggiuntiva può essere somministrata se necessario, verificata dalla risposta dell'animale ad una presa piede.
- Posizionare topi in posizione supina su un tappetino temperatura regolata e mantenere la temperatura corporea a 36,5 ± 0,1 ° C, che è stato verificato utilizzando una sonda rettale.
- Radere al collo e disinfettare la pelle con il 70% di alcol etilico.
2. occlusione della MCA (figura 1)
- Effettuare una incisione collo linea mediana utilizzando Iris forbici diritte e ritrarre (con divaricatori) i tessuti molli per esporre i vasi.
- Sezionare il CCA e l'ECA dal tessuto circostante con pinze Dumont senza danneggiare il nervo vago.
- Fare una sutura temporanea da un nodo sciolto intorno al CCA con 6-0 seta.
- Fare una sutura permanente intorno alla Corte dei conti e le imbarcazioni più piccole che si estendono da esso legando strettamente i vasi (distale alla biforcazione del CCA).
- Fare un aro suturaund prossimale ECA alla biforcazione CCA.
- Posizionare una clip microvasi intorno all'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria pterigopalatino (PPA).
- Fai una piccola incisione nella ECA utilizzando micro dissezione forbici a molla e inserire un monofilamento di silicio a punta 180 micron. Eseguire il taglio più vicino alla sutura permanente possibile per facilitare la manipolazione del filamento.
- Stringere la sutura temporaneo intorno ECA con il filamento inserito e rimuovere la clip dei microvasi.
- Tagliare la Corte dei conti tra il, sutura distale permanente e il punto di ingresso del filamento utilizzando micro dissezione forbici a molla.
- Guida il filamento attraverso l'ICA fino a quando si avverte resistenza (circa 9 -. 10 micron al di là della biforcazione del CCA) nel MCA.
NOTA: Nel caso troppa resistenza è sentita mentre la maggior parte del filamento è ancora visibile, il filamento può essere entrata nella PPA. In questo caso, tirare il filo di nuovo alla biforcazione, delicatamente push in avanti nelle ICA con pinze Dumont, e far avanzare il filamento fino a che non può essere visualizzato nella ICA.
3. riperfusione
- Dopo un periodo di occlusione di 30 minuti, togliere il filamento tirando delicatamente indietro con pinze Dumont e garantire la sutura intorno l'estremità aperta della Corte dei conti.
- Rimuovere la sutura temporaneo intorno CCA allentando con attenzione la legatura con Dumont pinze e sangue flusso viene ripreso attraverso il CCA.
- Chiudere l'incisione con una sutura chirurgica continuo. Chiusura della pelle può essere realizzata sia suture continue o interrotte. graffette cutanee sono anche un metodo accettabile.
- Iniettare topi con 1 ml di via sottocutanea soluzione salina come il volume di rifornimento e con le carprofen analgesici (5 mg / kg, sc) per il sollievo del dolore e il disagio dalla procedura chirurgica, segni che indicano è necessario un sollievo dal dolore includono schiena curva, il cappotto non battuti, ridotta attività, anormaleatteggiamento, e diminuzione dell'appetito.
- Osservare topi durante il recupero dall'anestesia in una gabbia riscaldata a 30 ° C utilizzando una lampada di calore regolata mediante un regolatore di temperatura e posizionare purè chow in una capsula di Petri sul pavimento della gabbia per incoraggiare un'alimentazione. I topi sarà alloggiato uno per gabbia durante il periodo di riperfusione.
4. Chirurgia Sham
- topi soggetti alla stessa procedura, senza l'inserimento monofilamento.
Neurologici 5. post-operatorie punteggi (Tabella 1; Figura 2)
- Neurologicamente valutare topi dopo il periodo di riperfusione adeguato utilizzando un sistema di punteggio 18 punti la valutazione del generale; Il motore; Sensoriale; Propriocezione. Un punteggio neurologico più alto corrisponde ad una riduzione della funzione neurologica.
NOTA: I topi che sono giudicati non risponde e in grado di camminare saranno sacrificati. Altri criteri di eutanasia umano includeranno una perdita di peso superiore al 20%, di respiratoriastress e infezione intorno all'area chirurgica. Una camera di CO 2 sarà utilizzato per l'eutanasia e il metodo fisico per confermare la morte sarà dislocazione cervicale o toracotomia.
6. Misurazione del cervello Infarct Volume (Figura 3)
- Indurre l'anestesia utilizzando una combinazione di ketamina (150 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) iniettato ip profondità Monitor di anestesia pinch piedi inizialmente every 3 - 5 minuti e ogni 10 minuti una volta raggiunto l'anestesia.
- Posizionare topi in posizione supina e tagliare la pelle dall'addome al collo seguito dal peritoneo utilizzando iris forbici diritte.
- Sollevare lo sterno con pinze Dumont e tagliare le costole per esporre il cuore.
- Aprire il sinistro e il lato destro del torace utilizzando due coppie di emostatici, esponendo il cuore.
- Inserire un ago 26 G attaccato ad una siringa da 5 ml nel ventricolo sinistro e tagliare l'atrio destro. Profumato con temperatura ambiente o soluzione fisiologica phosphate salina tamponata (PBS) finché il fluido diventa chiaro (di solito 3 - 5 minuti).
- Rimuovere il cranio con cautela fuori dal cervello utilizzando iris forbici diritte e pinze Dumont.
- Tagliare i bulbi olfattivi e il cervelletto con una lama di rasoio in modo che il cervello si adatta nella matrice. Utilizzare questa matrice per tagliare il cervello in anche segmenti. Raffreddare la matrice prima dell'uso per mantenere il tessuto fresco. Posizionare il cervello nella matrice e impostarlo su ghiaccio.
- Tagliate il cervello in segmenti coronale 2 mm con due lame di rasoio. Effettuare il primo taglio con una lama di rasoio a partire da 2 mm dalla parte superiore e lasciare questo lama di rasoio sul posto. Fare un altro 2 mm taglio dietro la prima. Rimuovere la prima lama di rasoio con il tessuto allegata. Ripetere questo processo fino a quando tutto il tessuto è stato tagliato a fette.
NOTA: Ci dovrebbe essere di 4 - 5 segmenti al termine. - Posizionare i segmenti in 24 pozzetti contenenti 2% 2,3,5-triphenyltetrazalium cloruro (TTC), che viene poi posta in un bagno d'acqua superficiale unt 37 ° C per 20 min. Posizionamento ciascun segmento in un pozzo individuo aiuta a tenerli nell'ordine in cui sono stati tagliati. Assicurarsi che la soluzione TTC copre completamente i segmenti di tessuto. Dopo 10 min girare tutte le fette su.
- Mettere una piccola quantità di formalina al 10% nei pozzetti di una nuova piastra da 24 pozzetti e trasferire i segmenti da questa piastra nell'ordine in cui sono stati tagliati.
- Scansione segmenti nel computer e analizzare le dimensioni dell'infarto come percentuale della fetta intera cervello 6 utilizzando il software di analisi ImageJ (NIH 1,57 Immagine Software) 6.
- Outline dell'area infartuata per generare una misura dell'area. Successivo misurare l'intero emisfero controlaterale per determinare l'area. Dividere la zona infartuata dalla zona dell'emisfero controlaterale e moltiplicare per 100 per determinare il volume dell'infarto.
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Representative Results
I topi sottoposti a 30 minuti di ischemia cerebrale MCAO-indotta (Figura 1), seguito da un periodo di riperfusione (24 hr e 1 sett sono presentati qui, ma la lunghezza della riperfusione può essere variata). La mortalità durante MCAO è stato minimo (circa il 2%). ischemia Post, il tasso di mortalità (entro le prime 24 ore) è stato di circa il 26%.
Laser Doppler flussimetria stata utilizzata per confermare sangue perfusione flusso nel territorio MCA prima e dopo MCAO / riperfusione. La Figura 4 dimostra chiaramente che quando il legame temporanea CCA viene rilasciato dopo 30 min di ischemia per la rimozione filamento e riperfusione a verificarsi, vi è un aumento in perfusione, che ha raggiunto <100% della perfusione basale (vale a dire, prima di un intervento chirurgico) 5 min in riperfusione.
24 ore dopo l'insorgenza dell'ictus (prima della misurazione del volume dell'infarto) Neurolpunteggi ogical di competenza generale, sensoriali, motorie e deficit propriocettivi sono stati valutati (Tabella 1). Questo sistema di punteggio è destinato a fornire criteri di valutazione oggettiva ( 'sì o no'). La figura 2 mostra che il punteggio per i topi (n = 27) a 24 ore era di 12,56 ± 0,7, e sono rimasti elevati dopo 1 settimana (11.50 ± 1.5 ). Un punteggio neurologico più alto corrisponde ad una riduzione della funzione neurologica.
Volumi infarto mirroring modelli simili al punteggio neurologico a 24 ore, vale a dire, maggiore di animali sham. 24 ore dopo MCAO, topi ha avuto grandi volumi infarto (Figura 3: 15,9 ± 2,6%), che sono stati accresciuta 1 settimana dopo ictus (28,5 ± 1,9%).
Figura 1: Schema mostra la località dei occlusione dell'arteria cerebrale media(MCAO) Chirurgia e Vasculature grandi vasi della circolazione cerebrale. A. chirurgica MCAO è ottenuta tramite l'inserimento di un filamento in arteria carotide esterna e poi nel prossimale carotide mezzo. BG. Passi per indurre MCAO. arteria di comunicazione anteriore (ACA); dell'arteria cerebrale media (MCA); posterior arteria di comunicazione (PcomA); cerebrale posteriore (APC); arteria basilare (BA); arteria carotide interna (ICA); carotide esterna (ECA); pterigopalatino arteria (PPA); arteria carotide interna (ICA). (Modificata con il permesso di Smith et al., Riferimento # 5.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Il 18-punto Stroke Vota questo comprehensive punteggio ictus valuta miglioramenti funzionali in generale, e sensoriali, motori e gli aspetti propriocettivi del comportamento del mouse a seguito di un ictus. I dati sono media ± SEM. * P <0,05. n = 3 topi / gruppo. I dati sono stati analizzati con ANOVA più un test di Bonferroni post hoc. (Modificata con il permesso di Smith et al., Riferimento # 5.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Volumi infarto C57BL / 6 topi 24 ore dopo MCAO topi sono stati sottoposti a 30 min MCAO e 24 ore o 1 sett di cervelli) riperfusione A sono stati rimossi, sezionati e colorati con 2% 2,3,5-. trifeniltetrazolio cloruro (TTC). In tessuto vivente, deidrogenasi enzimaticamente riducono TTC a 1,3,5 e ritornohenylformazaon (TPF), che è un colore rosso, ma nel tessuto ischemico l'enzima non è funzionale, quindi il tessuto rimane bianca. B) Il grafico mostra un aumento in volume di infarto in topi aver avuto un ictus. I dati sono media ± SEM. ** P <0.002, **** p <0,0001 vs sham; n = 4 topi / gruppo. I dati sono stati analizzati con ANOVA più un test di Bonferroni post hoc. Scala grafica = 1 cm (Modificata con il permesso di Smith et al., Riferimento # 5.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Perfusione di MCA Territorio Durante MCAO e riperfusione I topi sono stati sottoposti a 30-min MCAO, e <5 min di riperfusione. Le linee di base sono stati normalizzati al 100%. come espeCTED, perfusione 5 min nel periodo di riperfusione era superiore MCAO, cioè quando si è verificato nessun perfusione del tessuto. I dati sono media ± SEM. * P <0,05. n = 3 topi / gruppo. I dati sono stati analizzati con ANOVA più un test di Bonferroni post hoc. (Modificata con il permesso di Smith et al., Riferimento # 5.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Neurological Sistema di punteggio Un punto espressa un sì risposta a ciascuna delle prove.. Punti su 18 7,8.
| Test | Breve descrizione | Che cosa prova per? | Riferimenti |
| Labirinto acquatico di Morris | Una procedura water-maze campo aperto in cui i roditori imparano a fuggire da acqua su una piattaforma nascosta | memoria spaziale, controllo del movimento, e la mappatura cognitiva | 19 |
| rotarod | Una canna rotante orizzontale in cui i roditori devono camminare in avanti in modo da non cadere | coordinazione motoria, l'equilibrio e la forza di presa | 20 |
| polo | Roditori posti su un palo e osservati per scivolare o cadere come si fanno strada verso il basso in una gabbia | Disturbi del movimento causati da danni corticale | 21, 22 |
| analisi del cammino | Come roditori attraversano una lastra di vetro le loro impronte vengono catturati per esaminare i loro movimenti | i modelli a piedi (pressione zampa, la lunghezza del passo, la larghezza e la frequenza, la diffusione punta, angolo di portamento, e la rotazione del corpo)e coordinazione motoria | 23, 24 |
| Test etichetta adesiva | Strisce di nastro adesivo applicato alla parte senza peli delle zampe anteriori dei roditori di registrare il tempo di mettersi in contatto ogni zampa, l'ordine di contatto, tempo di rimozione e ordine di rimozione | deficit di sensibilità zampa anteriore e senso-motorie | 25, 26 |
| Angolo | Roditori poste tra due assi che formano un angolo di 30 °; quando si entra in profondità in un angolo entrambi i lati del vibrisse sono stimolati ed i retri roditori e si gira di nuovo verso l'estremità aperta | disturbi dello sviluppo neurologico e comportamenti ripetitivi (monitoraggio si trasforma in una direzione rispetto alla direzione opposta) | 27, 28 |
| Cilindro | Roditori sono posti in un cilindro di vetro con l'attività forelimb mentre allevamento contro la parete viene registrato | Locomotore asimmetria e valutare Poststrl'uso degli arti oke | 28 |
| Scala | Roditori posto su una piattaforma in una scatola con una doppia scala esca; roditori sono cibo limitate a promuovere il movimento su per le scale per raccogliere l'esca | Raggiungendo abilità per ogni zampa anteriore che richiedono in modo indipendente capacità sensoriali, destrezza e coordinazione motoria | 25, 29 |
| Scala | Roditori a piedi attraverso una scala orizzontale per raggiungere il loro gabbia; piede scivola mentre si cammina attraverso la scala sono registrati | difetti piede durante la locomozione; zampa anteriore e la funzione degli arti posteriori e il coordinamento | 30 |
Tabella 2: Esempi di test comportamentali murini.
| Suggerimento per GLP è la seguente: |
| - I dettagli specifici di cui è stato scelto il modello di ictus (ad esempio, Longa contro Koizumi), e il ceppo, età, sesso, peso riferito chiaramente. |
| - Gli studi effettuati in modo doppio cieco. |
| - Analisi di potenza riportato. |
| - Criteri di inclusione ed esclusione nello studio hanno deciso prima dello studio, e riportati. |
| - Animali monitorati quotidianamente (aspetto di base, il peso corporeo e il comportamento) per eventuali segni di sofferenza, di dolore o di malattia. |
| - Segnalazione di animali esclusi dallo studio. |
| - La randomizzazione degli animali in gruppi. |
| - & #160; Comunicazione dei risultati negativi e positivi. |
| - Segnalazione di durata della chirurgia, anestesia, la temperatura corporea e di gas del sangue. |
| - Segnalazione di arricchimento ambientale utilizzati, se del caso. |
Tabella 3: Suggerimenti per la buona pratica di laboratorio.
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Discussion
Dal suo concepimento 20 anni fa, il modello MCAO di ictus umana coinvolge l'inserimento di un filamento è stato utilizzato in un gran numero di studi. Ciò è principalmente dovuto al fatto che imita ciò accade clinicamente nella forma più comune di ictus (cioè, ictus ischemico). Il corpo striato è più sensibile all'ischemia rispetto alla corteccia cerebrale, e come tale, la lunghezza del tempo ischemico si tradurrà in se sia il striato e la corteccia dorsolaterale saranno interessati, o solo il corpo striato. Entrambe le volte infarto e riperfusione possono essere variati di conseguenza, e questo offre il ricercatore la capacità di essere in grado di studiare gli effetti patologici associati ad un attacco ischemico transitorio (TIA) per infarti molto più grandi.
Nel corso degli anni modifiche e risoluzione di problemi del metodo filamento di MCAO ha dimostrato l'importanza della procedura viene eseguita in condizioni sterili per evitare il rischio di infezione 9. I risultati possono variaretra le specie di roditori, (è stato dimostrato anatomica variazioni) ceppo 10,11, peso, e anestetici utilizzati, ma le tendenze nei risultati qui presentati sono suscettibili di riflettersi in altri laboratori in cui viene eseguita MCAO. Altri passaggi critici da tenere in considerazione sono la temperatura corporea, la pressione sanguigna e gas del sangue. E 'ben noto che la temperatura corporea influenza danni neurologici, con lesioni più piccole associati ipotermia 12 e deficit più gravi presentati in ipertermia 13. Come tale, la temperatura deve essere misurata e controllata, per esempio, tramite l'utilizzo di termoregolatori animale con un pad di calore, in modo da mantenere la temperatura corporea a 36,5 ° C. Volume rifornimento e l'incoraggiamento di mangiare ponendo chow ammorbidire sul fondo della gabbia sono anche altri fattori da osservare. La pressione sanguigna e gas del sangue 6,14 possono entrambi essere facilmente misurato e monitorato utilizzando prontamente disponibili attrezzature da commercfornitori IAL.
Limiti della tecnica MCAO includono sezionare correttamente il nervo vago dalle arterie senza danni ed evitando avanzare il filamento nel PPA, che può influenzare non solo la capacità di indurre efficacemente ictus, ma anche il tasso di sopravvivenza del mouse. Il significato più importante rispetto a metodi alternativi in MCAO vivo è il tasso di sopravvivenza quando si utilizza il metodo Longa qui descritto. Abbiamo anche scoperto che questo corrisponde a un aumento delle interazioni cellulari leucociti-endotelio e maggiori volumi infarto, che rendono questo modello, una volta padroneggiato, un ottimo strumento per lo studio delle potenziali bersagli terapeutici per il trattamento di ictus.
Anche se non hanno segnalato alcun qui, una serie di test comportamentali può essere eseguita anche come Morris labirinto d'acqua, rotarod, prova di polo, analisi del cammino, test di etichetta adesiva, corner test, test del cilindro, test della scala, e test di scala (vedi tabella2 per i dettagli e riferimenti). animali Sham non hanno problemi con il completamento di questi test comportamentali; Tuttavia, gli animali di ictus eseguire questi test molto meno successo. A seguito di questo, una zona del dibattito è se l'arricchimento ambientale non riguarda solo la riproducibilità del modello MCAO, ma anche se essa possa influire sul risultato del test comportamentali 15. Questo è chiaro, ma vale standardizzazione questo all'interno del laboratorio, e tutto lo studio.
Ci sono una pletora di diversi test per misurare il risultato ictus. Abbiamo presentato l'impiego di doppler laser per misurazioni del flusso sanguigno, un 18-point punteggio di valutazione neurologica in profondità, e anche infarto misurazioni del volume. Tuttavia, altre opzioni sono anche utili, come imaging. Noi abitualmente impiegare l'uso della microscopia a fluorescenza intravitale per studiare le interazioni cellulari (caratteristici di una risposta infiammatoria) 6 all'interno del Ceremicrocircolazione BRAL in tempo reale, in animali anestetizzati 5,6,16. MCAO e riperfusione produce una risposta infiammatoria cerebrale accresciuta contro gli animali sham 5,6,16. Altre modalità di imaging come la risonanza magnetica 17 e la tomografia ad emissione di positroni 18 possono anche essere utilizzati, in quanto forniscono l'opportunità di studi longitudinali che sono clinicamente rilevante.
L'analisi istologica del tessuto cerebrale, i campioni di plasma e siero devono essere routinariamente eseguite in quanto consentono ulteriore caratterizzazione delle risposte fisiopatologiche per ictus e meccanismi coinvolti, ma anche, e forse più importante, permettono ai ricercatori di studiare gli effetti dei composti sul risultato di ictus, fornendo così dati importanti per i potenziali bersagli terapeutici per questa malattia debilitante e devastante. Infine, riteniamo che sia altamente consigliabile per i ricercatori a prendere in considerazione non solo le più appropriate ba modello ictussed sui requisiti per il loro studio, ma anche che GLP ( "buona pratica di laboratorio") è reso obbligatorio. Vedere la Tabella 3 per suggerimenti GLP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
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- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
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