Abstract
Pattedyrcellekultur i monolag er almindeligt anvendt til at undersøge forskellige fysiologiske og molekylære processer. Men denne tilgang til at studere voksende celler ofte genererer uønskede artefakter. Derfor cellekultur i en tredimensional (3D) miljø, ofte ved hjælp ekstracellulære matrixkomponenter, dukket op som et interessant alternativ på grund af sin store lighed med det native in vivo væv eller organ. Vi udviklede et 3D cellekultursystem under anvendelse af to kamre, nemlig (i) en central rum indeholdende cancerceller indlejret i en kollagengel virker som en pseudo-primært macrospherical tumor og (ii) en perifer cellefri rum fremstillet af et fibrin-gel, dvs. en ekstracellulær matrixkomponent forskellig fra den, der anvendes i centrum, hvor cancerceller kan migrere (invasion foran) og / eller danne mikrosfæriske tumorer repræsenterer sekundære eller satellit tumorer. Dannelsen af satellit tumorer i det perifere rum erbemærkelsesværdigt korreleret til den kendte aggressivitet eller metastatisk oprindelse af de native tumorceller, hvilket gør denne 3D kultursystem unik. Denne cellekultur fremgangsmåde kan anses for at vurdere cancercelle invasionsevne og motilitet, celle-ekstracellulær matrix-interaktioner og som en metode til at evaluere anti-cancer drug egenskaber.
Introduction
Undersøge de grundlæggende og biomedicinske karakteristika cancercelleinvasion / migration og efterfølgende metastaser virksomhed er genstand for en intens forskning 1,2. Metastase er den ultimative stadium af kræft og dens kliniske behandling forbliver undvigende. En bedre forståelse af metastaser på de cellulære og molekylære plan vil gøre det muligt at udvikle mere effektive behandlingsformer 3.
Adskillige egenskaber af metastatiske celler kan udforskes in vitro 4 herunder deres stemness og potentiale til at erhverve en overgang tilstand (f.eks epithelioid-mesenchymale overgang) til at migrere og invadere inden for og fra den primære tumor fem. Imidlertid har in vitro vurdering af invasion / metastase processer været en udfordring, da det næsten udelukker bidraget fra blod / lymfe cirkulation. Organotypiske kulturer, der integrerer tumor fragmenter i kollagengeler har previously blevet anvendt til at overvåge kræft aggressivitet. Selv kompleksiteten af tumorer bevares (fx tilstedeværelsen af ikke-cancerceller), tumorfragmenter udsættes for begrænset medium diffusion, til variation prøveudtagning, og til en overvækst af stromaceller 6. En alternativ metode består i dyrkning cancerceller inden komponenter af den ekstracellulære matrix (ECM), som efterligner det tredimensionale (3D) celle miljø. Spredningen af brystcancercellelinier i en kollagengel og / eller en basalmembran-afledt matrix er blandt de bedst karakteriserede eksempler på 3D cellekultur. Ved at bruge specifikke 3D cellekultur miljøer, kan det uorganiseret samling observeret for brystkræftceller dyrket under standardbetingelser vendes til den spontane dannelse af brystkirtler acini og rørformede strukturer 7-10. Endvidere dannelsen af multicellulære tumor sfæroider afledt fra adenocarcinom cancerceller congregated hjælp af forskellige teknikker (fx hængende dråber, flydende sfæroider, agar indlejring) nu er den mest almindeligt anvendte 3D celledyrkningsassay 11-13. Imidlertid er dette assay begrænset af det begrænsede sæt af cancer cellelinjer, der kan danne sfæroider og af den korte periode til rådighed til at studere celler under disse forhold.
I denne visualiseret teknik, vi heri indføre en sofistikeret 3D celledyrkningsanalyse hvor cancerceller af interesse er indlejret i en kollagengel for at tillade in vitro dannelse af et pseudo-primær tumor, der kan alternativt coates med en basalmembran-afledt matrix. Når det er dannet, er den pseudo-primær tumor derefter klemt i en acellulær matrix (fibrin gel i den foreliggende sag), der tillader kræftceller at krydse grænsefladen mellem de to matrix rum (se figur 1). Interessant sekundære tumor-lignende strukturer, der stammer fra den pseudo-primær tumor sammen med aggressive kræftceller vises ifibrin gel. Et sådant 3D kultur-system giver fleksibilitet forpligtet til at undersøge, fx lægemidler mod cancer, genekspression og celle-celle og / eller celle-ECM interaktioner 14-16.
Figur 1:.. Oversigt over metode Skematisk oversigt over den metode til at generere 3D cellekultur-system som en model for kræft studier Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Ingen etik betragtning, da dyrs og menneskers cancerceller blev købt eller venligt givet os.
1. Gør Collagen stik (Pseudo-primær tumor)
- Forbered en kollagen spredning. Type I kollagen fra rotte hale sener (RTT) kan enten udvindes og steriliseret som tidligere rapporteret 17, eller købes. Dispergere frysetørret RTT collagen (3,25-3,50 mg / ml i 0,02 N eddikesyre) ved anvendelse af en blender (indstilling højhastighedstog, fem 2 min kørsler) til en ensartet blanding.
- Harvest (trypsin-EDTA, sædvanligvis) og bruge trypanblåteksklusion til tælling af levedygtige celler under anvendelse af et hæmocytometer. Indstil til ønsket celledensitet (5 x 10 4 celler pr stik).
- Forbered alle løsninger (NaOH, føtalt bovint serum, DMEM 5x, NaHCO3) separat (tabel 1) under sterile forhold og holde kølet på is. Bemærk: Rækkefølgen for tilsætning af de forskellige opløsninger er vigtigt at forhindre osmotiske eller sure stød i celler.
- Udfør celle dispersion (1,25 x 10 6 celler) i den endelige collagen-opløsning (5 ml) så hurtigt som muligt. Bland godt (ved pipettering op og ned) samtidig undgå luftbobler, og derefter hurtigt distribuere 200 pi af klar-til-brug-opløsning i hver brønd på en plade med 96 brønde. slå forsigtigt multi-brønds plade i arbejdsområdet overflade af cellekulturen hætte for at fjerne luftbobler og for at sprede opløsningen jævnt i brøndene.
- Efter opfyldning alle brøndene (dette trin tager omkring 15-20 min pr plade med 96 brønde), skal den opbevares i inkubatoren.
- Inkubér pladen ved 37 ° C fra 2 timer til natten over. Kollagen gelering (dvs. fibrillogenese) indenfor 30 min. Tilføj dyrkningsmedium (100 gl / brønd) til kulturen til at udføre en inkubation natten over.
2. Første lag af fibrin Gel
- Fibrinogen Fremstilling af opløsning.
BEMÆRK: samme batch af fibrin gel bør ideelt set bruges til mere reproducerbar results, kan som fibrin geldannelse variere mellem forskellige batches af kommerciel frysetørret fibrinogen.- Brug altid en frisklavet fibrinogenopløsning. Bring den frysetørrede fibrinogen til stuetemperatur inden åbning af hætteglasset for at undgå hydrat krystaldannelse.
- Gradvis opløse fibrinogenet i foropvarmede (37 ° C) Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med Ca2 + / Mg2 + ved en arbejdskoncentration på 3 mg / ml (overveje fremstilling af en 15% overskud af den mindste endelige rumfang : for eksempel, 17,25 mg i 5,75 ml til en 5 ml opløsning).
- Tilføj forvarmet HBSS dråbevis ved først at solubilisere fibrinogenfragmenter. Nedbryde større fragmenter med en spatel i bægeret. Omrør bægerglasset fra tid til anden for at lette blanding. Brug ikke en omrører plade under proceduren. det resterende pulver opløses ved pipettering af suspensionen op og ned.
- Hold fibrinogenopløsning lunken mens Sterilisering af opløsningen ved passage gennem et 0,22 um filter. Bemærk: Hvis HBSS ikke er varm nok, eller fibrinogenet ikke fuldstændigt opløst, kan opløsningen tilstoppe filteret. Hvis det er relevant, udskift filter en gang eller to gange, hvilket kan reducere fibrinogen koncentration, og dermed fibrin koagel stivhed.
- Suspendere cellerne af interesse (f.eks endotelceller) i klar-til-brug fibrinogenopløsning mens justere dens slutvolumen, som alternativ procedure.
- Forberedelse thrombin Solutions.
- Der fremstilles en stamopløsning i Hedeselskabet 2 O (50 NIH enheder / ml), derefter sterilisere den anvendelse af et 0,22 um filter.
- Brug en fibrinogen / thrombin-forhold ≥1: 0,0075 (v / v) for at generere fibringelen.
- Generering fibringelen.
- Hold den sterile fibrinogen og thrombin stamopløsninger på is i alle de næste skridt. De fibringeler får lov at dannes i 24-brønds plader.
- Straks overlay the overflade af hver brønd med fibrinogen-opløsning (200 pi / brønd) og samtidig undgå luftboble formation. Proces 6 brønde ad gangen.
- Når fibrinogenopløsningen fuldstændigt dækker overfladen af brøndene, vippe pladen i en 45 ° vinkel, og der tilsættes 1,5 pi thrombinopløsning til den første brønd ved at droppe thrombin ind til centrum af brønden, og derefter forsigtigt hvirvel pladen vandret for 1-2 sek.
- Efterlad pladen i en stabil stilling under laminar flow hætte (5-10 min), indtil gelering / koagulation er fuldført (NB: polymerisationsprocessen må ikke forstyrres, fx ved at transportere pladen til inkubatoren).
- Når de første seks brønde har polymeriseret, gentage den samme sekvens (dvs. de 3 foregående trin) for de næste seks brønde indtil alle brønde er blevet behandlet.
3. andet lag af fibrin Gel og klemt Collagen Plug
- ValgmulighedA: (Brug af Collagen Plug Straks).
- Sørg for, at det første lag af fibrin gelen er polymeriseret i alle brønde ved forsigtigt at vippe pladen. Placer 96-brønds plade indeholdende kollagengelen plugs side om side med den 24-brønds plade (indeholdende fibringeler) for at lette overførsel af kollagen stikpropper.
- Tilsæt en dråbe HBSS i hver brønd i pladen indeholdende kollagen stikpropper.
- Fjern hvert kollagen stik fra brønden med en tynd nål monteret på en sprøjte (anvendt som et håndtag), eller ved anvendelse af en mikro-ske (se video). Overfør hver kollagen stik på det første fibringel lag ved hjælp en eller to mikro-skeer, samtidig sikre, at kollagen stikket er godt centreret i brønden, og at sterilitet er godt vedligeholdt.
- Overlejre tidligere dannede fibrin gel med det andet lag af fibrinogen-opløsning (300 ul / brønd) og indføre thrombin som beskrevet i 2.3, holder en minimal 1:. 0,0075 forholdet og en sekvens af seks brønde ad gangen </ Li>
- Mulighed B (Belægning af Collagen Plug med et tyndt lag af vækstfaktor-reduceret Basement Membrane (GFRBM)).
- Cool alle de udarbejdede løsninger og instrumenter forhånd og holde dem ved 4 ° C eller på is (f.eks pipetter, tips, reagensglas) under håndteringen, da frosne portioner af GFRBM er meget følsomme over for overdreven opvarmning sats under optøning (følg producentens anvisninger) .
- Efter fjernelse fra pladen brønde, sættetid hver kollagen stik i 2 min i et 1,5-ml centrifugerør på is indeholdende 100 pi af en ren GRFBM opløsning.
- Overfør hver belagt stik på det første fibrin lag samtidig sikre det er godt centreret, som beskrevet tidligere. Inkubér plug-holdige plader ved 37 ° C i 5 minutter for at tillade den GRFBM at danne en gel. Tilsæt den anden fibrin lag som i trin 3.1.4.
4. celledyrkningsmedium Betingelser
- Fyld hver brønd med dyrkningsmedium (400 pi). Dyrkningsmediet og supplementer vil blive udvalgt på grundlag af cellelinjen og forsøgsbetingelser.
- Tilføj aprotinin, et antifibrinolytisk middel, til dyrkningsmediet i en slutkoncentration på 100 kallikrein inhibitor enheder (KIE) / ml.
BEMÆRK: pladerne opbevares i en cellekultur inkubator under de anvendte betingelser for den testede cellelinie. - Fyld kulturer med frisk medium hver anden dag eller efter den eksperimentelle tidsplan, og tilsæt aprotinin. Før tilsætning af frisk medium, let vippe pladen (ved en 30-35 ° vinkel) og hælder pipetten mod siden af brønden, mens omhyggeligt sugning det konditionerede medium under konstant observation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som tidligere nævnt, en interessant træk ved denne 3D celledyrkningsassay er, at kræftcellerne ikke kun kan vandre fra kollagen stikket til den tilstødende fibringel, men også etablere sekundære tumorer (f.eks satellit tumor-lignende strukturer). Dette kan observeres direkte med et omvendt fasekontrastmikroskop ved lave og høje forstørrelser gennem gelen tykkelse, især med en lang arbejdsafstand kondensator (figur 2). Brug af denne 3D cellekultur fremgangsmåde kan opførslen af kendte metastatiske celler let sammenlignet med den, der findes i ikke-metastatiske celler, som påvist gentagne gange med forskellige forsøgsopstillinger 15. For eksempel er talrige satellit tumorer fundet tilfældigt dispergeret i fibringelen med metastatisk cellelinie B16F10 mens kan så detekteres kun meget få små satellit tumorer med dens ikke-metastatisk modstykke, B16F0 cellelinie (figur 2).
Figur 2:. Behavior of Mouse melanom B16F10 (A) og B16F0 (B) Celler i 3D cellekultursystem B16F10 og B16F0 cellelinier er kendt for at være metastatisk og svagt metastatisk hhv. En øvre visning af den sammensatte gel er vist efter 15 dage i kultur i 24-brønds plade. Kollagenet prop (*) støder op til en fibrin-gel lag, i hvilket cellerne er migreret (pile) og dannede satellit tumorer som ses ved højere forstørrelse. Ganske bekvemt, disse cellelinjer udtrykker et højt niveau af melanin, der giver mulighed for direkte visualisering (dvs. uden farvning). Klik her for at se en større version af dette tal.
Formen af migrationen foran og satellit tumorer kan variere som en funktion af cellelinie egenskaber. For eksempel er de murine mælkekirtel carcinoma 4T07 celler, som er dårligt metastatisk men er meget invasive lokalt, danner en migration front, der strækker sig radialt ind i fibrin-gel (figur 3A). Efter 14 dages kultur, har de celler trukket væk fra vandrende fronten til at danne stjernernes-form strukturer tæt op ad mælkekirtler strukturer (figur 3B-D).
Figur 3: Mus mælkekirtelkarcinom hos 4T07 Cells. Disse celler udviser en stærk evne til at migrere i fibrin gel (A). Den stiplede linje afgrænser kollagen stikket, og pilene viser retningen af migrationen front. Cellerne jævnt invadere fibrinmatrixen (A), og velorganiseret, kan observeres stjernernes-form rørformede strukturer i 3D (B end C). Views under fasekontrastmikroskopi. (A - C) og histologiske snit farvet med hæmatoxylin og eosin (D) er vist Klik her for at se en større version af dette tal.
Cellestrukturerne observeret med denne 3D kultursystem, især satellit tumorer, kan kvantificeres ved plane projektion efter farvning af gelerne med en opløsning af methylenblåt som tidligere 16 vist. Farvning gelprøver med Hoechst 33258 i forskellige faser af cellekulturen gør det muligt at visualisere cellekerner under epifluorescens inverteret mikroskopi (figur 4).
Figur 4: hormonresponsive brystcancerceller. humane bryst-Kræft MCF-7 celler blev udsat for forskellige koncentrationer af Tamoxifen. Satellit tumorer i fibrin geler (øverste række) blev observeret ved fasekontrastmikroskopi. DNA fra kollagengeler (indikerer tilstedeværelsen af celler i pseudo-primære tumorer) (nederste række), blev farvet med Hoechst 33258 og visualiseret ved hjælp af epifluorescens mikroskopi. Som forventet, tamoxifen inducerede DNA-fragmentering som følge af apoptose. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagenser | Bind |
| DMEM 5x (ingen bikarbonat) Forbered fra pulver | 1 ml |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M NaHCO3 | 0,5 ml |
| 1 N NaOH | 20 pi |
| ddH2O | 100 pi |
| Denne opløsning opbevares på is | |
| cellesuspension | 880 pi |
| Nå mix på is og til sidst hurtigt at tilføje: | |
| RTT Collagen (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| totalvolumen | 5 ml |
Tabel 1:. Collagen Stik reagenser kræves og udarbejdelse af en kollagen løsning til 18-19 stik. Bland godt umiddelbart efter tilsætning af collagen (ved at vende beholderen op og ned), og samtidig undgå luftbobler, og derefter straks distribuere 200 pi til hver brønd.
| Steps | | Mulige årsager | Løsninger | |
| Trin 1. Collagen stik | luftbobler | Upassende pipettering * | Bland godt og samtidig undgå for store bobler. |
| Tegn hver 200 pi med pipette stempel hele vejen ned, og slip kun 200 pi (omvendt pipettering). * | |||
| Collagen plug sammentrækning | Kollagen plug krymper med visse cellelinier, især når de inkuberes natten over. | Kontroller, om celler inducerer kollagen sammentrækning før start eksperiment. Det anbefales at overvåge sammentrækning over et par dage. Ellers kan propper kontrakt i klemt gel. | |
| Gelering forekommer ikke | Check reagenser til friskhed, molaritet, pH, etc.); sørg ingen reagens er udeladt. | Start igen fra beginning. | |
| Trin 2. Første lag af fibrin-gel | luftbobler | Samme kommentarer *; brug praksis. | Samme løsning. * Luftbobler kan forblive i fibringelen, men de forsvinder normalt over tid ved 37 ° C. |
| Gelering forekommer ikke | Forkert mængde fibrinogen anvendes; tjek thrombin koncentration eller nedbrydning. | Start igen fra begyndelsen. | |
| Antag thrombin løsning er utilstrækkelig; lidt øge koncentrationen og / eller volumen af thrombin (f.eks to gange). | |||
| Resterende flydende fase efter gelering | Fibrinogenopløsning og thrombin blandes ikke godt. | Start igen fra begyndelsen. | |
| Fibrin er ikke homogen (dvs. fibrillære strukturer, agglomerater) | Thrombin har utilstrækkeligt diffunderet i gelen; exFor store eller utilstrækkelig agitation | Behov praksis; starte igen fra begyndelsen. | |
| Trin 3. Sandwich / 2 nd fibrinlag | Samme bemærkninger som i trin 2. | ||
| Collagen stik er hurtigt (få timer) omgivet af tomme områder i fibrin | Fibrin har ikke polymeriseret tilstrækkeligt i kontakt med collagen gel | Start igen fra start | |
| Kollagen stik kan være progressivt (dage-uger) omgivet af tomme områder i fibrin | Lokal lysis; | Hvis det er begrænset til et par steder rundt omkring i stikket, kan eksperimentet fortsætte. Ellers overveje at starte fra begyndelsen. Kan skyldes secernerer stor mængde af plasminogenaktivator. | |
| Glem ikke den antifibrinolytisk agent! | |||
| Trin 4 og 5. cell kultur og opfølgning | fibrinolyse | Problem med antifibrinolytisk middel (nedbrydning, suboptimal dosis, osv.). | Hvis omfattende mængde satellit tumorer eller invasion, øge dosis af antifibrinolytisk middel. |
| Forsuring | Overdreven cellevækst. | Skift celledyrkningsmedium oftere. | |
Tabel 2: Fejlfinding Mulige problemer og løsningsforslag..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som et vigtigt teknisk fodnote, er det vigtigt, at noget mellemrum er til stede ved grænsefladen mellem det centrale og de perifere geler. Ellers kan det reducere kapaciteten af cellerne til at migrere / invadere fibrin-gel. Et mellemrum mellem kollagen og fibringeler kan dannes under de første 24 timer af kultur, hvis thrombin ikke er blevet passende fortyndet. Det er også muligt, at den testede kunne føre kollagengelen cellelinie at trække sig sammen under dyrkning, hvorved en relativt stor plads til at danne mellem begge geler. Dette er især forventes, når stromaceller blandes i kollagengelen sammen med cancerceller som følge af myofibroblastisk-lignende aktivitet 18. For at undgå denne artefakt, bør kollagenet plug inkuberes ved 37 ° C i en længere periode (≥48 timer ) for at inducere gelkontraktion før samling af fibrin sandwich.
Et problem også optræder ved assayet er tilstedeværelsenaf skelnelige fibrin fibriller eller agglomerater. Dette giver en uklar stedet for gennemskinnelig aspekt til fibrin gel, hvilket vanskeliggør datafortolkning grund forstyrrelse af cancercellen vandrende veje. Sådanne spørgsmål kan skyldes utilstrækkelig eller overdreven omrystning af fibrinogenopløsningen under polymerisationsprocessen i dyrkningsplader. Det kan også skyldes ukorrekt tilsætning af thrombin i fibrinogenopløsningen (trin 2.3). En forkert form eller uklar fibrin gel kan ikke fastsættes en gang størknet. Collagen eller fibrin-geler kan indeholde luftbobler at i de fleste tilfælde vil blive spontant befriet ud efter et par dage i inkubatoren; ikke desto mindre, ordentlig pipettering minimerer deres forekomst. Det anbefales at indføre et anti-fibrinolytisk middel ved begyndelsen af cellekulturen periode. Fibrinolyse kan forekomme efter en lang periode med cellekultur grund cellulær aktivitet og aktivering af proteolytiske enzymer (dvs. plasminogenaktivator) inden for Collagen stik og satellitten tumorer, afhængigt af kræft celletyper og aggressiviteten 19 .Den frigivelse af kollagen stikket fra det forringede fibrin gel og cellebinding til bunden af pladerne er to konsekvenser af overdreven fibrinolyse (se afsnittet om fejlfinding i tabel 2). En begrænsning af den foreliggende teknik er tykkelsen af fibrin-gel, som kan gøre det vanskeligt at observere celler gennem hele gelen. brug et mikroskop med en lang arbejdsafstand kondensator hjælper dog at omgå denne begrænsning og overvåge celler langs hele Z-aksen. Konfokal eller intravital mikroskopi kan også give et alternativ til at visualisere cellerne i fibrin-gel.
Et af de vigtigste mål for udvikling af denne 3D cellekultur-model var at give en ekstracellulær matrix rum, hvorigennem kræftceller er i stand til frit at migrere og udvikle sig. Fibrin blev valgt på grund af sin tilstedeværelse i tumorer,som skylder at øge vaskulær permeabilitet induceret af inflammation, nekrose og ændret angiogenese, og eftersom fibrin også er kendt for at lette tumorcelleinvasion 20,21. Grænsefladen mellem de to rum viser stor interesse som det efterligner produktion af nye støttende matrix, såsom fibrin, i tumorer. Desuden oxygen og næringsstoffer diffusion, og på længere sigt, pH-stabilitet, er muligvis dysreguleret i kollagen rum i forhold til det perifere fibrin rum, hvor diffusion lettes. På grund af det store antal cancerceller oprindeligt samlet i et centralt kollagen prop, er tegn på nekrose / apoptose observeret inden for den primære tumor under dyrkning, simulerer fænomenet observeret under ekspansionen af primære tumorer hos patienter 22. Endvidere er dannelsen af satellit tumorer bemærkelsesværdigt relateret til aggressiviteten af kræftceller samt deres metastatiske adfærd. Afhængigt af cellelinjen og type of eksperiment, inkubationstiden er nødvendig for at observere relevante metastatiske processer kan være så længe som 30 dage. Dette er normalt længere end for andre 3D assays, men den tilføjede forsinkelse bringer den fordel at studere en model mere repræsentative for in situ tumorer.
Det er velkendt, at celler dyrket i 3D kulturmodeller vise forskelle i cellesignalering og genekspression sammenlignet med monolag cellekulturer 5,23. Voksende cancerceller i 3D påvirker også deres følsomhed over for kemoterapeutiske midler 24-26. Et vigtigt og attraktivt element i denne 3D cellekultur-model består i muligheden for at modificere ECM koncentration og dermed stivheden af gelen, hvilket kan være af interesse for dem, der arbejder på de biomekaniske egenskaber af celle-celle- og celle-ECM interaktioner, samt effekten af matrix ejendomme i celle invasion / migration processer 27. 3D celledyrkningsassay præsenteres her kan tilpasseed, der passer til forskellige indstillinger og / eller eksperimentelle betingelser. For eksempel kan assayet skaleres op til at rumme undersøgelser kræver et stort antal celler; ved at fordoble mængden af materiale og antallet af celler, kan collagen propper fremstilles i en 48-brønds plade og lagdelt på en fibrin-gel i en 6-brønds plade. På den anden side kan det være vanskeligt at miniaturisere dyrkningssystemet for high-throughput undersøgelser og målinger på grund af uoverensstemmende homogenitet af fibrin gel.
Indførelsen af ikke-kræftceller i en af de to gel rum kan ændre adfærd kræftceller. For eksempel er dannelsen af satellit tumorer forværres når prostatacancer-cellelinie PC3 blandes med fibroblaster og endotelceller 14. Alternativt kan fluorescens-mærkede cellelinier indføres i gelen rum til at undersøge celle-celle-interaktioner og / eller til at spore cellerne under dyrkningsperioden. Endvidere histological sektioner kan udarbejdes efter gel fiksering; dog kan kvaliteten af immunhistokemi resultaterne varierer mellem antistoffer da der kan forekomme krydsreaktioner med fibrin. Rutinemæssig farvning af histologiske snit, såsom med hematoxylin og eosin (H & E) kan afsløre celle organisation inde i gelmatricer (figur 3D).
Det er relativt let at fjerne kollagen stik fra fibrin gel (fx ved at trække stikket ud med en glaspipette). Således kan celler og satellit tumorer til stede i fibringelen dyrkes separat fra dem, der findes i kollagen stikket. Celler fra satellitten kolonier kan høstes ved at ekstrahere kolonierne med kirurgiske saks eller en skalpel og dyrke dem i dyrkningsmedium uden aprotinin til frie celler fra fibrin gel. Indsamling celler fra de forskellige rum i det sammensatte gel kan tillade forskellige yderligere undersøgelser, herunder gen og protein udtryk analyse. Det kanogså anvendes til at isolere cellepopulationer med aggressive fænotyper for yderligere in vitro eller in vivo-undersøgelser. For eksempel blev denne 3D dyrkningsmodel anvendes til at identificere gener involveret i melanom-metastase 16. Alle disse repræsentative anvendelser viser tydeligt den fleksibilitet, som en bi-kompartment 3D cellekultur system, hvor celle co-kultur kan udføres.
Afslutningsvis udformningen af vores 3D dyrkningssystem er fleksibelt og kan tilbyde nye veje til at undersøge biologiske og molekylære begivenheder under cancercelle apoptose, migration og metastase samt for anticancer evaluering lægemiddel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
- Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).
- Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Shaw, L. M.
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
- Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
- Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
- Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
- Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
- Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).
- Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).
- Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
- Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
- Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
- Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).
