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Bioengineering

Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54331
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

La capacità di mantenere la funzione degli epatociti in vitro, allo scopo di testare citotossicità xenobiotici ', studiando virus e sviluppare farmaci mirati al fegato, richiede una piattaforma in cui le cellule ricevono adeguati segnali biochimici e meccanici. sistemi recenti ingegneria dei tessuti del fegato hanno impiegato tridimensionali (3D) impalcature composte da idrogeli sintetici o naturali, data la loro ritenzione idrica e la loro capacità di fornire gli stimoli meccanici necessari da parte delle cellule. C'è stato un crescente interesse nella scaffold invertito cristallo colloidale (ICC), uno sviluppo recente, che consente un'elevata organizzazione spaziale, omotipica e interazioni cellula heterotypic, così come matrice di interazione cellula-extracellulare (ECM). Qui, descriviamo un protocollo per fabbricare patibolo ICC utilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) e il metodo di lisciviazione delle particelle. Brevemente, un reticolo è costituito da particelle di microsfere, dopo di che un pre-polymesi aggiunge soluzione r, correttamente polimerizzato, e le particelle vengono poi rimosso o dilavati, utilizzando un solvente organico (ad esempio, tetraidrofurano). La dissoluzione dei risultati reticolari in un ponteggio altamente porosa con dimensione dei pori controllati e interconnectivities che permettono media per raggiungere le cellule più facilmente. Questa struttura unica permette elevata area superficiale per le cellule di aderire come pure facile comunicazione tra i pori, e la capacità di rivestire il ICC scaffold PEGDA con proteine ​​mostra anche un effetto marcato sulla prestazioni della cella. Analizziamo la morfologia del patibolo, così come la cella di epatocarcinoma comportamento (Huh-7.5) in termini di fattibilità e la funzione di esplorare l'effetto della struttura ICC e rivestimenti ECM. Nel complesso, questo documento fornisce un protocollo dettagliato di una impalcatura emergente che ha ampie applicazioni in ingegneria dei tessuti, in particolare l'ingegneria dei tessuti del fegato.

Introduction

Il fegato è un organo altamente vascolarizzato con una moltitudine di funzioni, tra cui la disintossicazione del sangue, metabolismo di xenobiotici, e la produzione di proteine ​​del siero. tessuto epatico ha un complesso microstruttura tridimensionale (3D), composto da più tipi di cellule, canalicoli biliari, sinusoidi, e zone di diversa composizione biomatrice e concentrazioni di ossigeno differenti. Data questa struttura elaborata, è stato difficile creare un modello di fegato corretta in vitro 1. Tuttavia, vi è una crescente domanda di funzionale in modelli in vitro di hosting epatociti umani come piattaforme per la tossicità test anti-droga 2 e studiare malattie associate con il fegato 3.

Piattaforme di ingegneria tissutale epatica corrente hanno semplificato la complessità del fegato isolando uno, o concentrandosi su alcuni, dei parametri del fegato, cioè co-coltura delle cellule 4, composizione biochimica della zonaL microambienti 5, dinamica del flusso 6,7 e la configurazione del Biomatrice 8. Configurazione della biomatrice può essere suddiviso in parametri quali materiali impalcatura, la composizione di matrice extracellulare (ECM) proteine, matrice di rigidezza nonché la progettazione e la struttura del ponteggio. C'è stato un aumento negli studi di ingegneria dei tessuti utilizzando idrogel sintetici, in particolare poli (glicole etilenico) (PEG) idrogel 9, data la possibilità di regolare le proprietà meccaniche, bioattività, e velocità di degradazione del idrogel. Per quanto riguarda la ricerca di fegato legati, l'idrogel biocompatibile è stata applicata per lo studio infezione da virus della malattia epatica 3. Come un design della piattaforma degli epatociti, numerosi studi hanno utilizzato epatociti panino culture 10,11 e l'incapsulamento delle cellule all'interno di un idrogel 12,13 per fornire l'ambiente 3D e cellula-ECM e l'interazione cellula-cellula, che sono essenziali per imitare nel microambiente vivo. However, queste piattaforme non possiedono un alto grado di controllo e organizzazione spaziale, portando a proprietà non uniformi attraverso l'impalcatura 14.

Il colloidale cristallo invertita (ICC) 14 patibolo è un'impalcatura 3D altamente organizzato per coltura cellulare che è stato introdotto nei primi anni 2000. struttura unica del ponteggio può essere attribuito al semplice processo di fabbricazione utilizzando un cristallo colloidale, un reticolo ordinata di particelle colloidali di diametro variabile. In breve, per riassumere il processo, le particelle sono disposti in modo ordinato e ricotta usando il calore in modo da formare un reticolo. La lisciviazione del lattice, da un solvente organico, in polimerizzati risultati idrogel in cavità sferiche esagonale confezionati 15 con elevata area superficiale. Questa impalcatura altamente ordinato è già stato fatto con entrambi i materiali sintetici e naturali, incluso ma non limitato a poli (acrilammide) 16-21, poli (lattico-co-glicolico acido) 15,22-30, Poli (glicole etilenico) 31,32, poli (2-idrossietil metacrilato) 21,33-35, e chitosano 36-39. Impalcature ICC in materiali non sottomarina tendono a promuovere sferoidi cellulari all'interno delle cavità 14,23,40. Tipi di cellule multiple hanno dimostrato di proliferare successo, differenziare e funzione all'interno di questa configurazione, compresi condrociti 41, cellule stromali del midollo osseo 42, e cellule staminali 43,44. Per quanto riguarda epatociti, gli studi sono stati condotti con impalcature ICC fatte di Na 2 SiO 3 e poli (acrilammide), ma non PEG. Con semplici strategie bioconjugation (vale a dire, l'accoppiamento ammina attraverso EDC / NHS), ponteggi PEG basati su ECM proteine-coniugati possono essere fabbricate, che può rivelarsi siti di legame più cellulari per essere un più vivo come l'ambiente e migliorare la funzione epatica.

In questo manoscritto e il video associato, dettagliamo la fabbricazione del ponteggio ICCutilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato idrogel (PEGDA) e un reticolo di polistirolo microsfere, ottimizzato per epatocarcinoma (Huh-7.5) cultura. Dimostriamo le differenze tra i generalmente non adesivo nude ponteggi ICC PEGDA e il collagene rivestite PEGDA ICC impalcatura in termini di topologia patibolo e le prestazioni delle cellule. La vitalità cellulare e la funzione sono misurati qualitativamente e quantitativamente per valutare il comportamento delle cellule Huh-7.5.

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Protocol

1. ICC Scaffold Fabrication (Figura 1)

  1. Preparare il polistirolo (PS) reticoli (diametro = 6 mm; 8-13 strati di perline).
    1. Per preparare lo stampo, tagliare le punte fuori da 0,2 ml microprovette prova di bollire a livello di 40 ml. Far aderire la parte superiore del taglio tubi a 24 x 60 mm 2 microscopio scivola in vetro di copertura con colla impermeabile.
    2. Mettere le sfere PS (diametro = 140 micron) contenuti all'interno di una sospensione acquosa in un flaconcino da 20 ml, con attenzione pipetta la sospensione acquosa, e aggiungere 18 ml di soluzione al 70% di etanolo nel flaconcino. Mettere la soluzione sfera in un bagno a ultrasuoni per allentare sfere aggregati. Ripetere questo passaggio di lavaggio più volte per rimuovere completamente acqua ei componenti idrosolubili.
    3. Dispensare 100 ml di etanolo negli stampi.
    4. Tagliare la parte superiore di una punta micropipetta 200 microlitri di 4 mm. Pipettare 25 microlitri delle sfere nello stampo due volte con 200 microlitri micropipetta per raggiungere unvolume totale di 50 microlitri di ogni stampo.
    5. Mettere gli stampi su un agitatore oscillante a 120 rpm durante la notte.
    6. Controllare la disposizione delle sfere in ogni stampo sotto un microscopio ottico. Se le sfere non sono ordinati esagonale, aggiungere 50 ml di etanolo al 70% e agitare manualmente nella direzione longitudinale e laterale per correggere la disposizione.
    7. Lasciare evaporare l'etanolo a temperatura ambiente (RT) per due notti. Posizionare lo stampo e complesso tallone in un forno a 130 ° C per 6 ore per temprare le perline PS.
  2. Preparazione nude e ECM rivestite impalcature PEGDA.
    1. Sintetizzare macromeri PEGDA utilizzando protocolli stabiliti 45,46 per acrylating macromeri PEG lineari (M w = 4,6 kDa).
    2. Preparare 50% (w / v) PEGDA in acqua deionizzata (DI) e consentire il macromero sciogliere correttamente per centrifugazione a 4.713 xg fino a completa dissoluzione.
      1. Per ECM coniugato ponteggi ICC, sciogliere un ulteriore10% (w / v) Acryloyl-PEG-NHS (M w = 3,4 kDa) nella soluzione PEGDA 50%.
    3. Preparare un 20% (w / v) stock soluzione di 2-idrossi-4 '- (2-idrossietossi) -2-methylpropiophenone (PI) in etanolo al 70%.
    4. Aggiungere 50 ml di 20% (w / v) PI magazzino per 1 ml di 50% (w / v) di PEGDA. Regolare la quantità necessaria di soluzione PI in base al peso molecolare di PEGDA.
    5. Vortex il composto in provetta da centrifuga per 1 min per raggiungere una soluzione omogenea.
    6. Sbucciare gli stampi dal vetrino (dal punto 1.1.7), rimuovere la colla dagli stampi, spingere i reticoli con cura utilizzando una spatola e mettere ciascuno di essi in una provetta da 1,5 ml. Pipettare 300 microlitri della soluzione PEGDA e centrifugare a 845 xg per 5 minuti per consentire la corretta PEGDA soluzione di infiltrazione nel reticolo.
    7. Rimuovere il reticolo dal tubo con una pinzetta e accuratamente asciugare soluzione PEGDA eccesso sui guanti. Posizionare il reticolo su un vetro pellicola rivestita di paraffina con il cir piattasuperficie lare rivolta verso l'alto.
    8. Esporre la soluzione PEGDA patibolo infiltrato a 365 nm raggi ultravioletti (UV) (10.84 mW / cm 2) per 5 minuti utilizzando una lampada UV spot.
    9. Posizionare reticoli cristallini PEGDA-polimerizzati in nuove fiale (circa 10 tralicci per flaconcino) e aggiungere 20 ml di tetraidrofurano (THF). Agitare i flaconi in un agitatore orbitale a 300 rpm. Cambiare THF almeno 3 volte con un intervallo di 1-2 ore.
      Nota: Non rimuovere completamente THF quando si cambia il THF per evitare bolle di entrare i ponteggi, che a sua volta può causare la rimozione incompleta di PS. Lasciare abbastanza soluzione per coprire i reticoli e aggiungere nuovi THF.
      Attenzione: THF è tossico. Indossare guanti, un camice da laboratorio e occhiali. Evitare l'inalazione operando sotto la cappa.
    10. Controllare se sfere PS sono sciolti da mettere l'acqua nella soluzione THF utilizzato e osservando il colore della soluzione. Ripetere il punto 1.2.9 se le sfere PS non sono adeguatamente sciolti.
      Nota: Il colore soluzione cambieràbianco se ci sono sfere PS rimanenti.
  3. Pulire i ponteggi nell'armadio biosicurezza (BSC).
    1. Per sterilizzare i ponteggi, preparare una provetta da centrifuga da 50 ml con 2 ml di etanolo al 70% per ponteggio e posizionare i ponteggi nel tubo con una spatola. Lasciare i ponteggi in ammollo in etanolo per 1 ora. Da questo punto in avanti, effettua tutte le procedure del BSC.
    2. Versare con cautela l'etanolo e sostituirlo con tampone fosfato (PBS) (2 ml per impalcature) e centrifugare a 524 xg per 3 minuti per rimuovere le bolle. Conservare in frigorifero e cambiare il PBS alcune volte con un intervallo di 1-2 ore.
      1. Per collagene di tipo I ponteggi rivestite, preparare un altro 50 ml tubo da centrifuga contenente collagene di tipo 1 di soluzione (1 ml per ponteggio), trasferire i ponteggi sterilizzati per questo tubo con una spatola, e centrifugare a 524 xg per 3 min. Agitare i ponteggi a 400 rpm su un agitatore orbitale per 30 min e mantenere il tubo nella attrezzao durante la notte.
      2. Lavare i ponteggi con PBS due volte prima di utilizzare immergendo i ponteggi in PBS fresco e poi aspirare il PBS.
        Nota: Altre proteine ​​ECM possono anche essere usati al posto di collagene tipo I, perché la chimica NHS richiede un gruppo amminico per formare il legame (Figura 2).

Figura 1
Figura 1. Panoramica ICC fabbricazione. Impalcature ICC PEG-based sono fabbricati con tecniche di microfabbricazione con e senza ECM-funzionalizzazione. Ponteggi ICC ECM rivestite richiedono PEG-NHS nonché PEGDA (come indicato nella figura 2). Il reticolo PS ha un diametro di 6 mm e un'altezza di 8-13 strati tallone. PS, polistirolo; PEGDA, poli (glicole etilenico) diacrilato; UV, raggi ultravioletti; THF, tetraidrofurano; ECM, matrice extracellulare. Questo dato è stato modificato e utilizzato con il permesso di WiLey 47. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Struttura ICC Caratterizzazione

  1. Per analizzare la struttura ICC con o senza proteine ​​coniugate, utilizzare la microscopia elettronica a scansione (SEM) 47.
    1. Fissare i ponteggi con 4% paraformaldeide (PFA), serialmente li disidratano in 25, 50, 75, 95 e 100% etanolo soluzioni, e conservare a -80 ° C fino alla etanolo evapora completamente.
    2. campioni asciutti in un essiccatore di congelamento per 48 ore.
    3. Fissare il campione sul supporto del campione con del nastro di carbonio e mettere in un dispositivo a induzione polverizzazione.
    4. Dopo aspirapolvere automatico, ricoprirlo con un film di Pt di spessore 10 nm per sputtering per 60 sec a 20 mA.
    5. Ponteggi Immagine ICC utilizzando SEM a una tensione di 5 kV (Figura 3A, Figura 4A).
  2. Per misurare il poro ediametro interconnessione di cavità, analizzare micrografie SEM utilizzando immagine software di analisi 48 (ad esempio, ImageJ; la figura 3B, C).
  3. Per visualizzare il collagene coniugato al patibolo, senza cellule, etichetta fluorescente il collagene utilizzando anticorpi (1: 100) nei confronti del collagene di tipo I e di immagine con scansione laser confocale microscopia a 47 (CLSM; Figura 4B).

3. Huh-7.5 coltura cellulare e semina

  1. Culture Huh-7,5 cellule ad una densità di semina di 2-2,5 x 10 6 cellule / ml in piastre di coltura di cellule 100 mm con 10 ml Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 U / ml di Dulbecco la penicillina-streptomicina (terreni di coltura) a 37 ° C e 5% di CO 2. Modificare i media ogni tre giorni nel BSC fino a quando non hanno raggiunto il 75-80% di confluenza.
  2. Preparare i ponteggi per la semina delle cellule nel BSC.
    1. posizionare con cura il Scaffolds in un 24-pozzetti con la superficie piatta rivolta verso l'alto.
    2. Per lavare il patibolo, pipetta 2 ml di PBS a ciascun pozzetto contenente un ponteggio. Aspirare il PBS e pipetta 2 ml di PBS fresco in tutti i pozzetti.
    3. Aspirare il PBS e pipetta 2 ml di terreni di crescita (vedi punto 3.1) e lasciar riposare per 30 minuti. Aspirare i media e consentire l'impalcatura asciugare per 1 ora.
  3. Staccare confluenti Huh-7,5 cellule (dal punto 3.1) dalla piastra di coltura nel BSC utilizzando il metodo di digestione tripsina.
    1. supporti Aspirare dal piatto, aggiungere 4 ml di PBS per lavare cellule aderenti e quindi aspirare PBS.
    2. Pipetta 0.75-1 ml 0,25% tripsina e posto in un incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2 per 3 min.
    3. Rimuovere la piastra da incubatore e pipetta 5 ml mezzi per arrestare la reazione tripsina. mezzi Pipetta, cellule indipendenti, e la miscela di tripsina in un tubo da 15 ml.
    4. Centrifugare a 524 xg per 3 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di media.
  4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e calcolare il volume della sospensione cellulare contenente cellule al numero di destinazione, N 0, per 25 microlitri (per l'esperimento di serie, N 0 è 1 x 10 6 cellule).
    Volume di sospensione cellulare = (numero di celle di destinazione) / (concentrazione di sospensione cellulare)
  5. Lentamente pipettare 25 ml di sospensione cellulare (contenente N 0 celle) direttamente sulla parte superiore di ogni impalcatura (dal punto 3.1.4). Posizionare la piastra 24 pozzetti in incubatrice.
  6. Dopo 12 ore, trasferire i ponteggi attenzione con l'uso di una spatola in un nuovo 24-pozzetti e pipetta 2 ml di supporti in ogni pozzetto. Posizionare la piastra 24 pozzetti in incubatrice.
  7. Modificare i media ogni 3 giorni o seconda quando il supporto viene raccolto per l'analisi di secrezione delle proteine ​​(vedi punto 5.1).

4. vitalità cellulare

  1. Per analizzare qualitativamente vitalità cellulare, utilizzare fluorescenti live / kit di colorazione morti per colorare le cellule e l'immagine usando CLSM.
    1. A seguito di istruzioni kit, preparare una soluzione con 4 mM calceina AM e 8 micron etidio omo-dimero-1 nei media (vedi punto 3.1.3).
      Nota: ottimizza a seconda del numero di cellule. Utilizzare il doppio della quantità di reagente se le cellule proliferano e doppio di numero (circa 2 milioni).
    2. Nel BSC, i media aspirare in ogni pozzetto con un'impalcatura (passo 3.7) e pipetta 500 ml di soluzione preparata. Incubare i campioni in un incubatore a 37 ° per 1 ora.
    3. Coprire le piastre in stagnola per proteggere i campioni dalla luce quando si rimuove la piastra fuori dell'incubatore. campioni di immagine utilizzando CLSM49.
  2. Per valutare quantitativamente vitalità cellulare, misurare l'attività enzimatica (in cellule vive) mediante saggi colorimetrici 50 (cioè, 2- (2-metossi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolio (reagente monosodico-sale)).
    1. Creare una curva standard per la piattaforma ICC (cioè, un grafico di assorbanza (OD) versus determinato numero di cellulare).
      Nota: Cell semina non è efficiente al 100% in confronto ad altre piattaforme, poiché le cellule possono passare attraverso le cavità di ponteggi.
      1. Determinare i numeri di semina delle cellule, N 0 che verranno utilizzati per rendere la curva standard.
        Nota: scegliere una gamma che comprende il numero di cellule che si stima nell'esperimento. Ad esempio, se il numero di cellule iniziale è 5 x 10 5 cellule e vi è una stima ~ 3 volte maggiore entro l'ultimo giorno dell'esperimento, scegliere 2.5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 6, e 2 x 10 6 cellule come N 0.
      2. Eseguire semina cellulare nelle impalcature ICC (una N 0 per ponteggio con un volume di semina di 25 mL) come descritto nei passaggi 3.1-3.6.
      3. Dopo 6 ore, trasferire i ponteggi ad un altro 24-pozzetti bene. Selezionare un tempo che permette l'adesione delle cellule, ma non la proliferazione cellulare.
      4. Eseguire il conteggio delle cellule sul patibolo ICC trasferito.
        1. Diluire 10X soluzione (MSR) monosodico sale reagente a 1x con i media del BSC e pipetta 500 microlitri soluzione 1x MSR in tutti i pozzetti con un'impalcatura. Incubare la piastra 24 pozzetti a 37 ° C per 1 ora.
        2. Da ogni bene, trasferire 100 ul in una piastra da 96 pozzetti bene. Come un vuoto, pipetta 100 ml di soluzione di reagente 1x monosodico sale fresco in diversi pozzetti sulla piastra a 96 pozzetti. rimuovere manualmente eventuali bolle attuale utilizzando un puntale a secco e coprono la piastra a 96 pozzetti in un foglio per proteggerlo dalla luce.
        3. Misurare OD a λ = 450 nm lettura utilizzando uno spettrofotometro. Sottrarre il diametro esterno in bianco da altri valori per trovare la OD accurata 51.
      5. Contare il numero di cellule (N L) rimanendo nel pozzo dopo il trasferimento del ponteggio (passo 4.2.1.3) con un emocitometro.
        Nota: utilizzare 300 ml di tripsina per trypsinize cellule.
      6. Calcolare il numero di cellule effettivo, N A.
        = effettiveiniziale - lasciato in bene
        N A = N 0 -N L
      7. Fai la curva standard riportando OD ottenuto nel passaggio 4.2.1.4.3 rispetto al numero di cellule effettivo (N A) e usare questo per stimare il numero di cellule negli esperimenti.
        Nota: Creare una nuova curva standard, se i parametri ICC (ad esempio, le dimensioni porogen, dimensioni del patibolo, proteine ​​ECM, ecc) vengono modificate.

Funzione 5. cellulare

  1. Analizzare la secrezione di proteine ​​da parte delle cellule Huh-7.5 (vale a dire, l'albumina, urea) da parte dei media raccolti (dal punto 3.7) da enzima saggio di immunoassorbimento (ELISA) 52.
    Nota: Diluire la carta, in funzione del numero di cellule seminate e la quantità di materiale raccolto. Per 5 x 10 5 cellule seminate in ICC, utilizzare un ~ rapporto 1: 25, prima di introdurlo ai pozzetti anticorpi preverniciata.
  2. Per analizzare qualitativamente la funzione delle cellule, immunostain specifiche proteine ​​intracellulari(Cioè, l'albumina), enzimi (cioè CYP450), componenti strutturali macchia (cioè, actina cellulare) così come i nuclei e immagine utilizzando CLSM 49.
    1. supporti Aspirare (dal punto 3.7) e pipetta 2 ml di PBS per lavare i ponteggi ICC cellulari carichi.
    2. Pipettare 1 ml di 4% PFA e incubare per 5 min a temperatura ambiente per il fissaggio.
    3. Lavare 3x con 2 ml di PBS.
    4. Permeabilize membrane incubando i ponteggi in 1 ml di 0,1% 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilene glicole (tensioattivo) per 30 min.
    5. Lavare 3x con 2 ml di PBS per rimuovere eventuali perdite proteine.
    6. Dispensare 500 microlitri 1% di albumina sierica bovina (BSA) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora per bloccare legame non specifico.
    7. Preparare anticorpo primario diluito (vale a dire, l'albumina, CYP450) soluzione.
      1. Pipettare 500 ml di soluzione di BSA 1% in una provetta da 15 ml e aggiungere 4,5 ml di 0,1% di soluzione di tensioattivo per preparare un 5 ml di 0,1% BSA soluzione totale.
      2. Pipettare 98 ml di soluzione di BSA allo 0,1% in una provetta da microcentrifuga 200 microlitri e 2 ml di anticorpo primario per produrre un 01:50 (anticorpo primario: 0,1% BSA) soluzione di anticorpo primario.
    8. Pipettare 40 microlitri della soluzione di anticorpo primario sull'impalcatura e coprire il substrato con parafilm. Avvolgere la piastra 24 e con un foglio di alluminio e conservare il piatto a 4 ° C durante la notte.
    9. Lavare 3x con 2 ml di PBS e agitare delicatamente la piastra in mezzo di lavaggio.
    10. Preparare diluito anticorpo secondario biotinilato (vale a dire, anti-topo anticorpi) stock soluzione.
      1. Pipettare soluzione BSA 198 microlitri 0,1% e 2 microlitri secondo anticorpo per produrre un 1: 100 (anticorpo secondario: 0,1% BSA) soluzione di anticorpo secondario.
      2. Preparare una soluzione madre 0,1% di rodamina o fluoresceina phalloidin marcato (a macchiare i filamenti di actina cellulari) nella soluzione di BSA 0,1%.
      3. Pipettare 25 ml di ogni soluzione in un tubo e mescolare well.
    11. Pipettare 50 ml di soluzione di anticorpo secondario magazzino sul patibolo. Coprire il patibolo con una pellicola di paraffina, avvolgere il piatto con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente per 2 ore.
    12. Lavare 3x con 2 ml di PBS.
    13. Pipettare 200 ml di 0,2% 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, una macchia di nucleo) soluzione sul patibolo e mantenere a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Coprire la piastra con un foglio di alluminio.
    14. Lavare 2x con 2 ml di PBS.
    15. Utilizzando un contagocce, una goccia di mezzo di montaggio sul substrato.
    16. Attentamente mettere il ponteggio su un vetrino e immagine utilizzando CLSM 47.
  3. Valutare l'espressione genica mediante la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR). Utilizzare i kit standard per la trascrittasi inversa PCR (RT-PCR) 53 e qPCR 54 secondo le istruzioni del produttore. Estrarre il RNA dalle cellule come descritto di seguito.
    1. Posizionare il patibolo (dal punto 3.7) in una provetta da 1,5 ml.
    2. Pipettare 200 ml di cloroformio in ogni provetta e agitare vigorosamente la provetta in mano per 15-20 sec. Conservare le provette a temperatura ambiente per ~ 3 min fino a quando le fasi separate.
    3. Centrifugare il campione a 13.000 xg, 4 ° C per 15 minuti e rimuovere con attenzione i tubi in modo che le fasi non si mescolano.
    4. Pipettare attentamente 500-600 ml della fase acquosa superiore dal primo tubo in una seconda provetta.
    5. Aggiungere un volume equivalente (500-600 ml) di isopropanolo a questo secondo tubo.
    6. Capovolgere la provetta 3-5 volte e lasciare il tubo in piedi a temperatura ambiente per 10 min.
    7. Centrifugare il campione a 13.000 xg, a 4 ° C per 15 min.
      1. Se un pellet non è visibile nella parte inferiore della provetta, centrifugare ancora per 5 min.
        Nota: Se non vi è ancora alcuna pellet visibile, la quantità di RNA può essere insufficiente.
    8. iotubi nvert con il tappo aperto di scartare il surnatante e pipetta in 1 ml di etanolo al 70% diluito in acqua DEPC nel tubo.
    9. Leggermente vortice il tubo in modo che il pellet stacca dalla parete del tubo e poi lasciare che l'aria secca tubo.
    10. Aggiungere 50 ml di acqua DPEC per risospendere il pellet.
    11. Mantenere pipettaggio fino a quando si scioglie pellet.
    12. Mantenere per 10 min a 55 ° C per denaturare l'RNA a doppio filamento in RNA a singolo filamento.
    13. Leggermente drum dita sul fondo della provetta e centrifugare brevemente tubi (7.500 xg, 4 min, 4 ° C).
    14. Mantenere i tubi in ghiaccio fino a quando l'esecuzione della trascrittasi inversa 55 e real-time PCR, come descritto nel 56.

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Representative Results

I risultati rappresentativi per la caratterizzazione strutturale del ponteggio CPI e il confronto di efficacia ogni ICC di condizione di ponteggio in coltura epatociti sono illustrati e spiegati di seguito. Le condizioni ICC scaffold utilizzati in questi risultati sono rivestimenti collagene 0 pg / ml (Bare), 20 mg / ml (collagene 20), 200 mg / ml (collagene 200), e 400 mg / ml (collagene 400) e l'iniziale huh-7.5 numero di semina cellulare è 1x10 6.

Caratterizzazione delle interconnessioni pori ICC e topologia patibolo.

immagini SEM, dopo la fissazione e la liofilizzazione dei ponteggi ICC, è stato utilizzato per la prima di determinare se si sono formate le interconnessioni tra i pori adeguati ICC e per vedere l'effetto della coniugazione delle concentrazioni di collagene varie sulla topologia patibolo. Analisi quantitativa dei due-dimensional immagini nude ICC SEM (Figura 3A) utilizzando il software ImageJ, ha rivelato un diametro medio dei pori di 102,3 ± 9,3 micron e un diametro medio interconnessione di 38,6 ± 4,3 micron (Figura 3B, C). Questa interconnessione tra i pori gioca un ruolo significativo nella corretta diffusione delle sostanze nutritive alle cellule così come l'interazione cellula-cellula in tutta l'impalcatura. Il rivestimento di collagene comportato una rete mesh fibra che era più definito a concentrazioni più elevate di collagene coniugazione (Figura 4A). Immagini confocali rivelano anche strati di collagene sulla superficie della cavità e una maggiore copertura superficie con aumenti nella concentrazione di collagene (Figura 4B).

Effetto delle condizioni di piattaforma ICC su Huh-7.5 vitalità delle cellule e la funzione.

Huh-7,5 cellule sono state sottoposte al fluorescente macchia Live / Deading dosaggio (4 mM calceina AM e 8 mM EthD-1) e ripreso con CLSM, come mostrato in Figura 5. Le cellule seminate in scaffold nuda, ICC non adesivo tendeva ad aggregare al centro dell'interconnessione pori e cellula-cellula tra pori è stato visto negli ultimi tempi (giorni 7 e 10). La presenza di un rivestimento collagene sui ponteggi ICC permesso cellule di aderire alla superficie scaffold così un'interazione cellula-cellula inter-pori fin dal giorno 1. La vitalità cellulare, indicato dalla macchia verde, aumenta con il tempo e era generalmente superiore in scaffold di collagene rivestite, come indicato da una maggiore fluorescenza verde. la Figura 6 mostra i risultati quantitativi MSR per ulteriori indagini dell'effetto della concentrazione struttura e proteine ​​ICC 3D sulla vitalità cellulare. Un test di vitalità cellulare colorimetrica è stata effettuata su cellule coltivate in condizioni ICC scaffold nonché sulla dati di targa cultura polistirene e assorbanza 2D (misurato a 450 nm) è stato normalizzato a tha il controllo (1 ° giorno). Cellule coltivate su piastre 2D mantenuti vitalità cellulare, ma è stato osservato alcun aumento nella proliferazione cellulare. 3D nudo ICC scaffold notevolmente migliorata proliferazione cellulare rispetto alla condizione 2D, indicando l'importanza della matrice 3D. Con l'aggiunta del rivestimento collagene, la proliferazione cellulare è aumentata nel tempo a tutte le concentrazioni di collagene ed è stata trovata la proliferazione massimo nel 200 ug / ml rivestita scaffold ICC il giorno 14. Ciò conferma osservazioni qualitative in Figura 5.

Funzione degli epatociti è stata valutata monitorando i cambiamenti nella secrezione di albumina così il profilo di espressione genica di tre proteine ​​di adesione nelle diverse condizioni ICC ponteggi. La Figura 7 illustra la correlazione positiva tra albumina sierica secreto, quantificata dalla albumina ELISA, e la concentrazione di collagene coniugato patibolo. Il giorno 14, eh-7,5 cellule coltivate in400 mcg / ml ponteggi ICC rivestite secreti più di tre volte la quantità di albumina come quelli coltivati ​​in patibolo nudo. Risultati per i profili di espressione genica di E-caderina, N-caderina, e integrine proteine ​​b1 nelle diverse condizioni ICC scaffold appaiono nella Figura 8. Il tasso di espressione dell'mRNA E-caderina in 400 mcg / ml scaffold ICC rivestite aumentata di più di 4 pieghe rispetto alle altre condizioni di rivestimento (Figura 8A). Il cambiamento volte l'espressione del gene N-caderina è stata maggiore nelle alte concentrazioni di rivestimento collagene. Tuttavia, l'integrina β1 espressione genica rimasto relativamente costante o diminuita in tutte le condizioni ponteggi ICC tranne 200 mcg / ml ponteggi ICC rivestite.

Figura 32
Figura 2. Coniugazione del collagene al patibolo PEGDA tramite NHS la chimica. scaffold bioattivi utilizzano PEG-NHS che ha un estere ammina reattiva succinimidil (NHS) che reagisce al gruppo amminico in collagene permettendo coniugazione al ponteggio. PEG, poli (glicole etilenico); NHS, N -hydroxysuccinimide; UV, raggi ultravioletti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Analisi delle dimensioni delle cavità ICC e interconnessioni. (A) micrografie SEM della scaffold ICC (scala bar = 100 micron) sono stati analizzati utilizzando il software ImageJ e quantitativamente rappresentato come istogrammi di (B) pori di diametro e (C) diametro di interconnessione. Questo dato è stato modificato e utilizzato con il permesso di Wiley 47.target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Influenza del rivestimento collagene sulla topologia ICC scaffold. (A) immagini SEM e (B) immagini confocali sono state prese per valutare qualitativamente la topologia superficiale di scaffold rivestite con 20 ug / ml, 200 pg / ml e 400 mg / ml di collagene. Caselle rosse circondano la cavità mostrato nelle immagini ingrandimento superiori sotto. Barre di scala sono (A) 5 um, (B) 200 micron e 100 micron (ingrandimento più). Questo dato è stato modificato e utilizzato con il permesso di Wiley 47. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 5. Effetto delle condizioni di piattaforma ICC sulla vitalità cellulare e la morfologia utilizzando qualitativo test Live / Morto. Immagini confocale dei morti / macchiati Huh-7,5 cellule vive seminate in ponteggi ICC con diversi rivestimenti concentrazione di collagene (0, 20, 200, e 400 ug / ml) sono state prese 1, 4, 7, e 10 giorni dopo la semina. Verde macchia (calceina) indica cellule vive e macchia rossa (etidio omodimero-1) indica la morte delle cellule. Barre di scala indicano 200 micron. [Questo dato è stato modificato e utilizzato con il permesso di Wiley 47] Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Effettodi tipo di piattaforma e piattaforma ICC condizioni vitalità cellulare utilizzando un dosaggio quantitativo vitalità cellulare colorimetrica. Huh-7,5 cellule seminate su una piastra di coltura di polistirene 2D e in ponteggi ICC con diversi rivestimenti concentrazione di collagene (0, 20, 200, e 400 mg / ml ) sono stati sottoposti al saggio colorimetrico MSR vitalità 1, 4, 7, 10, e 14 giorni dopo la semina. Assorbanza è stata misurata a 450 nm ei dati sono stati normalizzati al Giorno 1 valori di assorbanza. (n = 3, media ± SD; ***: P <0.001 rispetto al MSR soluzione assorbanza lettura per il giorno 1 di ogni gruppo.) [Questo dato è stato modificato e utilizzato con il permesso di Wiley 47] Clicca qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Effetto della ICC pcondizione latform su Huh-7.5 funzione utilizzando secreto albumina concentrazione analisi ELISA. L'albumina ELISA è stato utilizzato per quantificare la secrezione di albumina sierica in mezzi raccolti da impalcature ICC cellule cariche con differenti rivestimenti concentrazione collagene (0, 20, 200, e 400 mg / ml) nei giorni 1, 4, 7, 10 e 14 dopo la semina. Ciascun punto di dati rappresenta una media di 3 campioni ed è normalizzato al numero di cellule trovati usando il test di vitalità cellulare MSR colorimetrica e la curva standard creato (n = 3, media ± SD). [Questo dato è stato modificato e utilizzato con il permesso di Wiley 47] Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8. Effetto della ICC condizione piattaforma on-Huh 7.5funzione utilizzando analisi di espressione genica. Real-time PCR quantitativa è stata usata al profilo di espressione genica di cellule coltivate in scaffold ICC con differenti rivestimenti concentrazione collagene (0, 20, 200, e 400 mg / ml) nei giorni 1, 4, e 7 dopo semina. Tre proteine ​​di giunzione sono stati scelti, vale a dire (A) E-caderina, (B) N-caderina, e Beta (C) integrina 1. L'mRNA livelli di espressione sono stati normalizzati per GAPDH. (n = 3, media ± SD *:. P <0,05 **:.. P <0,01 rispetto al espressione genica di giorno 1 ogni gruppo) [Questo dato è stato modificato e utilizzato con il permesso di Wiley 47] Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ponteggi ingegneria dei tessuti sono in rapida evoluzione per fornire tutti i segnali fisici e biochimici necessari per rigenerare, mantenere o riparare tessuti per l'applicazione della sostituzione di organi, lo studio delle malattie, lo sviluppo di farmaci, e molti altri 57. In ingegneria dei tessuti del fegato, epatociti umani primari rapidamente perdono le loro funzioni metaboliche, una volta isolati dal corpo, creando un grande bisogno di ponteggi di ingegneria e sviluppo di piattaforme per mantenere la funzione epatica. La corrente nelle piattaforme di coltura di epatociti in vitro hanno utilizzato diversi biomateriali. La ricerca in questo settore è stata centrata sulla imitando varie caratteristiche del microambiente epatica in vivo, come la configurazione di proteine ​​ECM 58,59, co-coltura 60,61, e micropatterning 62. Tuttavia, vi è stata una mancanza di ponteggi con porosità controllata ed alta organizzazione spaziale. A questo proposito, la Corte penale internazionale coltura cellulare piattaf descrittoorm, con le sue proprietà isotrope ed elevata organizzazione, affronta questo vuoto. Dimostriamo il patibolo ICC PEGDA è una piattaforma adatta per la coltura di cellule epatocarcinoma, un tipo di cellula modello di epatociti, e che un ulteriore rivestimento di collagene migliora il comportamento delle cellule 47.

In pratica, la dimensione della cavità del ponteggio ICC può essere regolato dalla dimensione di microsfere PS. Inoltre, la dimensione interconnesso del ponteggio può essere controllato dal tempo e la temperatura del processo di ricottura; temperatura di ricottura più alta o più risultati in tempo di ricottura a diametri di interconnessione più grandi. Pertanto, questi parametri devono essere selezionati con cura dai diametri più grandi di interconnessione potranno compromettere la stabilità meccanica del patibolo. In questo lavoro, PS sfere di diametro 140 micron sono stati scelti per coltura cellulare di epatociti di limitare le dimensioni delle hepatospheres conseguente ponteggi ICC nudi per prevenire la necrosi di cellule al centro del luipatocyte sferoide. 63 Come mostrato nei risultati rappresentativi, l'architettura 3D del patibolo ICC consente maggiore Huh-7.5 proliferazione cellulare in confronto alla coltura cellulare lastra di polistirene 2D. I risultati suggeriscono che le cavità uniformi interconnessi del ponteggio ICC consentono l'interazione cellula-cellula efficiente e diafonia tra le cavità.

La concentrazione del collagene di tipo I rivestimento interessata morfologia cellulare, la vitalità e la funzione. Collagene di tipo I è una proteina importante ECM trovato nello spazio di Disse, un'area adiacente agli epatociti 64. Non adesivo, nude ponteggi ICC PEGDA promossi formazione sferoide epatociti, mentre, un rivestimento di collagene reso il bioattivo patibolo e Huh-7,5 cellule aderito alla superficie del patibolo, utilizzando la grande superficie attuale. L'ECM proteina-rivestito ICC ponteggi migliorato sia cellula-cellula interazione così come cellula-ECM interazione, come indicato dalla upregulated E-caderina, N-cadherin e integrina β1 gene espressioni, che svolgono un ruolo nella regolazione delle cellule comportamento. collagene tipo I concentrazioni di 200 ug / ml e 400 pg / ml erano adatti per Huh-7.5 coltura, migliorando sia la proliferazione cellulare e la secrezione di albumina.

Il principale limite posto dalla CPI di fabbricazione è il controllo della PS sfera allineamento e il numero al momento della reticoli. La rapida evaporazione dell'etanolo durante il caricamento del sfere negli stampi possono causare diversi sfera densità, risultando in un diverso numero di strati di sfere in reticoli. Tuttavia, l'uso di meno volatile soluzione come l'acqua ha anche svantaggi. Si portano a meno ordinato CC in Floating assemblaggio del sistema 65, e vi è un'elevata possibilità di un altamente curvo impalcatura superficie a causa del menisco formazione. Un'altra limitazione è il corretto allineamento delle sfere in stampi per garantire la massima efficienza delle interconnessioni. L'agitazione passo (step 1.1.5 e 1.1.6) è quindi critical alla tecnica ICC fabbricazione. Se un buon accordo non è osservato al microscopio, ripetere il punto 1.1.6.

Nel complesso, il patibolo ICC PEGDA, con la sua semplice protocollo di fabbricazione, può essere utilizzato comodamente come piattaforma per le applicazioni di coltura cellulare 3D. Bioactivation del patibolo nuda con le proteine ​​migliora ulteriormente le sue caratteristiche funzionali 14. In questo manoscritto, abbiamo adattato il protocollo fabbricazione di e scelto test di valutazione delle cellule per l'applicazione ingegneria dei tessuti del fegato. Tuttavia, una gamma di tipi di cellule può essere coltivato in questo scaffold unico e ogni tipo di cellula può richiedere la modifica di alcuni parametri. Anche i livelli di complessità in termini di più tipi di proteine ​​ECM, co-coltura e cultura dinamica utilizzando un bioreattore possono essere aggiunti per migliorare ulteriormente le prestazioni delle cellule. Questa piattaforma ha il potenziale per aiutare nella rigenerazione dei tessuti e lo sviluppo di farmaci, per studiare malattie del fegato, e da utilizzare per il trapianto.

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Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il sostegno di un Research Foundation Fellowship nazionale (NRF -NRFF2011-01) e Programma di ricerca competitiva (NRF-CRP10-2012-07).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR tube Axygen Scientific PCR-02D-C Boil-proof
Gorilla Glue Gorilla Glue, Inc. Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slides VWR 631-1575 Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheres Fisher Scientific TSS#4314A Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
Ethanol Merck 1.00983.1011 absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic Bath Elma S10H Equiment
Furnace Nabertherm N7/H Equipment
200 µl pipette tip Axygen Scientific T-210-Y-R-S
Rocking shaker VWR 444-0142
Polyethylene Glycol (PEG) Merck 1.09727.0100 Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
Centrifuge Beckman Coulter 392932 Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate Laysan Bio ACRL-PEG-SVA-3400-1g Mw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma Aldrich 410896
Vortex VWR 58816-123 Equipment
Microcentrifuge Eppendorf 5404 000.413
Paraffin Film Parafilm M  #PM996 Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlight Blaze Technology  120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF) Merck 107025
Orbital shaker Heidolph 543-123120-00-5
Collagen Type I Sigma Aldrich C3867-1VL From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 20012-027 16% W/V AQ. 10 x 10 ml
Paraformaldehyde VWR 43368.9M Equipment
Freezone 4.5 freeze drier Labconco 7750020 Equipment
Sputter coater Jeol Ltd. JFC-1600 Equipment
Scanning Electron Microscope Jeol Ltd. JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam ab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Life Technologies A21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)  Bio-Rev PTE LTD 3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2.5 g/L Glucose w/ L-Gln		 Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S) Life Tchnologies 15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishes Sigma Aldrich CLS430591
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators Thermofisher Scientific 371
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer Thermofisher Scientific 02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells Life Technologies L3224 
CCK-8 Assay Dojindo Laboratories CK04-11 Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader  Tecan
Albumin Human ELISA kit Abcam ab108788
Triton X-100 Bio-Rad #1610407
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) Santa Cruz Biotechnology sc-53850; sc-271605
DAPI Life Technologies D3571
Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin Life Technologies A34055
Trizol Life Technologies 15596-026
Chloroform VWR 22706.326
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
DPEC water Thermofisher Scientific AM9916
Nanodrop 2000c Spectrophotometer Thermofisher Scientific ND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix  Bio-Rad Laboratories 1708840
SYBR select Master Mix for CFX Life Technology 4472937
Primers (to be chosen)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler Bio Rad Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH 

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References

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Bioingegneria l'ingegneria dei tessuti del fegato poli (glicole etilenico) idrogel cristallo colloidale invertito epatociti coltura cellulare biofunzionalizzazione
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Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon, W. Y., Kim, M. H., Lee, J. H., Ng, S. S., Tabaei, S. R., Cho, N. J. Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (114), e54331, doi:10.3791/54331 (2016).

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