Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tillverkning av Inverted kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Scaffold: En tredimensionell cellkultur plattform för levervävnad Engineering

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54331
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

Förmågan att upprätthålla hepatocyte funktion in vitro, i syfte att testa xenobiotika "cytotoxicitet, studera virusinfektion och utveckla läkemedel som riktar sig till levern, kräver en plattform där celler får rätt biokemiska och mekaniska signaler. Senaste levervävnad tekniska system har använt tredimensionella (3D) ställningar bestående av syntetiska eller naturliga hydrogeler, med tanke på deras höga vattenbindande och deras förmåga att ge de mekaniska stimuli som behövs av cellerna. Det har funnits ett växande intresse för den inverterade kolloidalt kristallen (ICC) byggnadsställning, en ny utveckling, vilket möjliggör hög rumslig organisation, homotypisk och hetero cell interaktion, liksom cell extracellulärt matrix (ECM) interaktion. Häri beskriver vi ett protokoll för att tillverka ICC ställningen med användning av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) och urlakningspartikelmetoden. Kortfattat är ett gitter tillverkat av mikrosfärpartiklar, varefter en i förväg polymer lösning tillsättes, korrekt polymeriseras, och partiklarna avlägsnas därefter, eller urlakas, med användning av ett organiskt lösningsmedel (t.ex. tetrahydrofuran). Upplösningen av gitterresulterar i en mycket porös scaffold med kontrollerade porstorlekar och interconnectivities som tillåter medier för att nå cellerna lättare. Denna unika struktur tillåter en hög ytarea för cellerna att vidhäfta till samt enkel kommunikation mellan porerna, och möjligheten att belägga PEGDA ICC scaffold med proteiner visar också en markant effekt på cellprestanda. Vi analyserar morfologi ställningen samt hepatokarcinom cellen (Va-7,5) beteende när det gäller lönsamhet och funktion för att undersöka effekten av ICC struktur och ECM beläggningar. Sammantaget ger detta papper ett detaljerat protokoll av en framväxande byggnadsställning som har breda tillämpningar inom tissue engineering, särskilt levervävnadsteknik.

Introduction

Levern är ett mycket vaskulariserad organ med en mängd funktioner, inklusive avgiftning av blodet, metabolism av xenobiotika, och produktionen av serumproteiner. Levervävnad har en komplex tredimensionell (3D) mikrostruktur, bestående av flera celltyper, gallcanaliculi, sinuskurvor, och zoner med olika biomatris sammansättning och olika syrekoncentrationer. Med tanke på detta noggrant struktur, har det varit svårt att skapa en ordentlig levermodell in vitro en. Det finns dock en ökande efterfrågan på funktionella in vitro-modeller värd humana hepatocyter som plattformar för att testa läkemedelstoxicitet 2 och studera sjukdomar associerade med levern 3.

Aktuell levervävnadstekniska plattformar har förenklat komplexiteten av levern genom att isolera en eller fokusera på ett fåtal av leverns parametrar, nämligen co-odling av celler 4, biokemisk sammansättning zonal mikromiljöer 5, flödesdynamik 6,7 och konfigurationen av biomatris 8. Konfiguration av biomatris kan delas in parametrar såsom ställningsmaterial, sammansättningen av extracellulär matris (ECM) -proteiner, matris styvhet samt utformningen och konstruktionen av byggnadsställningen. Det har skett en ökning i vävnadsingenjörsstudier med syntetiska hydrogeler, särskilt poly (etylenglykol) (PEG) hydrogeler 9, ges möjlighet att ställa hydrogelen mekaniska egenskaper, bioaktivitet och nedbrytning takt. När det gäller leverrelaterad forskning, var det biokompatibla hydrogelen ansökt om virusinfektion studie av leversjukdom 3. Som en hepatocyte plattform konstruktion, har många studier utnyttjade levercell sandwich kulturer 10,11 och cell inkapsling i en hydrogel 12,13 för att ge 3D-miljö och cell ECM och interaktion cell-cell som är nödvändiga för att efterlikna in vivo mikromiljö. However, dessa plattformar inte har en hög grad av kontroll och fysisk planering, vilket leder till icke-likformiga egenskaper genom ställningen 14.

Den inverterade kristall kolloidalt (ICC) 14 Ställningen är en mycket organiserad 3D byggnadsställning för cellodling som först introducerades i början av 2000-talet. Ställningen unika struktur kan hänföras till den enkla tillverkningsprocessen med användning av en kolloidal kristall, en ordnad gitter av kolloidala partiklar av varierande diameter. I korthet, för att sammanfatta processen partiklar är prydligt ordnade och glödgade hjälp av värme för att bilda ett galler. Urlakningen av detta gitter, genom ett organiskt lösningsmedel, i en polymeriserad hydrogel resulterar i hexagonalt packade sfäriska kaviteter 15 med hög ytarea. Denna höggradigt ordnad scaffold tidigare har gjorts med både syntetiska och naturliga material, inklusive men inte begränsat till poly (akrylamid) från 16 till 21, poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) 15,22-30, Poly (etylenglykol) 31,32, poly (2-hydroxietylmetakrylat) 21,33-35, och kitosan 36-39. ICC byggnadsställningar tillverkade av icke-fouling material tenderar att främja cellulära sfäroider inuti håligheterna 14,23,40. Flera celltyper har visat sig framgångsrikt proliferera, differentiera och fungera inom denna konfiguration, inklusive kondrocyter 41, benmärgsstromaceller 42, och stamceller 43,44. Beträffande hepatocyt, har studier utförts med ICC ställningar gjorda av Na 2SiO 3 och poly (akrylamid), men inte PEG. Med enkla biokonjugering strategier (dvs aminkoppling via EDC / NHS), kan ECM-proteiner-konjugerade PEG-baserade stödstrukturer tillverkas, som kan visa sig vara mer cellbindningsställen för att vara en mer in vivo liknande miljö och förbättra leverfunktion.

I detta manuskript och tillhörande video, är vi i detalj tillverkningen av ICC ställningenmed användning av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) hydrogel och en polystyren mikrosfärer galler, optimerad för hepatokarcinom (Va-7,5) kultur. Vi visar skillnaderna mellan de i allmänhet icke-adhesiva nakna PEGDA ICC byggnadsställningar och det kollagenbelagda PEGDA ICC scaffold i form av byggnadsställning topologi och cellprestanda. Cellviabilitet och funktion mäts kvalitativt och kvantitativt bedöma Huh-7,5 cellens beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ICC Scaffold Fabrication (figur 1)

  1. Förbered polystyren (PS) gitter (diameter = 6 mm, 8-13 lager av pärlor).
    1. För att förbereda formen, klippa tips bort från 0,2 ml koka säkra mikrocentrifugrör på 40 pl nivå. Vidhäfta toppen av cut-rören till 24 x 60 mm 2 mikroskop täckglas halk med vattentätt lim.
    2. Sätt PS sfärer (diameter = 140 pm) som finns i en vattensuspension i en 20 ml flaska, försiktigt pipett ur vattnet fjädring, och tillsätt 18 ml av 70% etanollösning in i flaskan. Sätt sfären lösning i ett ultraljudsbad för att lossa aggregerade sfärer. Upprepa detta tvättsteg flera gånger för att avlägsna vatten och vattenlösliga komponenter helt.
    3. Pipettera 100 | il av etanol i formarna.
    4. Skär toppen av en 200 | j, l mikropipett spets genom 4 mm. Pipett 25 ul av sfärerna i formen två gånger med 200 pl mikropipett för att uppnå entotal volym av 50 | j, l i varje form.
    5. Placera formarna på en gungande skakapparat vid 120 rpm över natten.
    6. Kontrollera arrangemanget av sfärer i varje form under ett optiskt mikroskop. Om sfärerna inte beställs hexagonalt, tillsätt 50 pl 70% etanol och skaka manuellt i längs- och sidled axelriktning för att korrigera arrangemanget.
    7. Låt etanolen avdunsta vid rumstemperatur (RT) under två nätter. Placera formen och pärla komplex i en 130 ° C ugn under 6 timmar för att härda PS pärlor.
  2. Förberedelser nakna och ECM-belagda PEGDA ställningar.
    1. Syntetisera PEGDA makromerer med hjälp av etablerade protokoll 45,46 för akryle linjära PEG makromerer (M = 4,6 kDa).
    2. Förbered 50% (vikt / volym) PEGDA lösning i avjoniserat (DI) vatten och låt makromeren att ordentligt upplösa genom centrifugering vid 4713 x g till dess att den är helt upplöst.
      1. För ECM konjugerad ICC ställningar, upplösa en ytterligare10% (vikt / volym) akryloyl-PEG-NHS (M ^ = 3,4 kDa) i 50% PEGDA lösning.
    3. Bered en 20% (vikt / volym) stamlösning av 2-hydroxi-4 '- (2-hydroxietoxi) -2-metylpropiofenon (PI) i 70% etanol.
    4. Tillsätt 50 | il av 20% (vikt / volym) PI stamlösning per 1 ml av 50% (vikt / volym) av PEGDA. Justera den nödvändiga mängden PI stamlösning baserat på molekylvikten för PEGDA.
    5. Vortex blandningen i centrifugeringsröret under 1 minut för att nå en homogen lösning.
    6. Skala formarna från glasskivan (från steg 1.1.7), ta bort limmet från formarna, driva gitter ut försiktigt med en spatel och placera var och en av dem i ett 1,5 ml rör. Pipette 300 ul av PEGDA lösning och centrifugera vid 845 xg under 5 min för att medge korrekt PEGDA lösning infiltration i gittret.
    7. Ta bort gallret från röret med hjälp av en pincett och försiktigt torka överskott PEGDA lösningen på handskar. Placera gallret på en paraffinfilm täckt glas med den platta cirCular yta vänd uppåt.
    8. Exponera PEGDA lösning infiltrerade scaffold till 365 nm ultraviolett (UV) ljus (10,84 mW / cm 2) under 5 minuter med användning av en UV-fläck lampa.
    9. Placera PEGDA-polymeriserade kristallgitter i nya flaskor (cirka 10 gitter per flaska) och tillsätt 20 ml tetrahydrofiiran (THF). Skaka flaskorna på en orbitalskak vid 300 rpm. Ändra THF minst 3 gånger med ett intervall på 1-2 timmar.
      Obs: Ta inte bort THF helt vid byte av THF för att förhindra bubblor från att komma in i ställningar, som i sin tur kan orsaka ofullständig borttagning av PS. Lämna tillräckligt lösning för att täcka gitter och lägga till nya THF.
      Varning: THF är giftig. Använd handskar, skyddsrock och skyddsglasögon. Undvik inandning genom att arbeta under dragskåp.
    10. Kontrollera om PS sfärer löses genom att sätta vatten till den använda THF-lösning och observera lösning färg. Upprepa steg 1.2.9 Om PS sfärer inte är ordentligt löst.
      Obs: Lösningen färg ändras tillvit om det återstår några PS sfärer.
  3. Rengör ställningar i biosäkerhet skåpet (BSC).
    1. Att sterilisera byggnadsställningar, framställa en 50 ml centrifugrör med 2 ml av 70% etanol per byggnadsställning och placera de ställningar i röret med hjälp av en spatel. Låta de ställningar i blöt i etanol under 1 timme. Från detta steg framåt, genomföra alla förfaranden i BSC.
    2. Häll försiktigt etanolen ut och ersätta med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (2 ml per byggnadsställning) och centrifugera vid 524 xg under 3 min för att avlägsna bubblor. Förvara den i kylskåp och ändra PBS några gånger med ett intervall på 1-2 timmar.
      1. För kollagen typ I-belagda byggnadsställningar, förbereda en annan 50 ml centrifugrör innehållande Kollagen typ 1 stamlösning (1 ml per scaffold), överför de steriliserade byggnadsställningar till detta rör med hjälp av en spatel, och centrifugera vid 524 xg under 3 min. Skaka ställningar vid 400 rpm på en orbital shaker i 30 min och hålla röret i refrigerateller över natten.
      2. Tvätta ställningar med PBS två gånger före användning genom att sänka de ställningar i färsk PBS och sedan aspirerande PBS.
        Anmärkning: Andra ECM-proteiner kan också användas i stället för kollagen typ I, eftersom NHS kemi kräver en amingrupp för att bilda bindningen (figur 2).

Figur 1
Figur 1. Översikt över ICC tillverkning. PEG-baserade ICC byggnadsställningar tillverkas med hjälp av mikrotillverkningstekniker med och utan ECM-funktionalisering. ECM-belagda ICC ställningar kräver PEG-NHS samt PEGDA (så detaljerat i figur 2). PS gitter har en diameter på 6 mm och en höjd av 8-13 pärla skikt. PS, polystyren; PEGDA, poly (etylenglykol) diakrylat; UV ultraviolett; THF, tetrahydrofuran; ECM, extracellulära matrisen. Denna siffra har ändrats och används med tillstånd från Wiley 47. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. ICC Structure Characterization

  1. För att analysera ICC struktur med eller utan konjugerade proteiner, använder svepelektronmikroskop (SEM) 47.
    1. Fäst ställningar med 4% paraformaldehyd (PFA), seriellt torka dem i 25, 50, 75, 95 och 100% etanollösningar, och förvara dem vid -80 ° C tills etanolen avdunstar helt.
    2. Torra prover i en frystork under 48 timmar.
    3. Fäst provet på provhållaren med hjälp av kol tejp och placera i en sputter beläggaren.
    4. Efter automatisk dammsugning, päls det med en Pt film av 10 nm tjocklek genom sputtring under 60 sekunder vid 20 mA.
    5. Bild ICC ställningar med hjälp av SEM vid en spänning på 5 kV (figur 3A, figur 4A).
  2. För att mäta porer ochsammankoppling diameter av håligheter, analysera SEM-mikrofotografier med hjälp av bildanalys programvara 48 (t.ex. ImageJ, figur 3B, C).
  3. För att visualisera den konjugerade kollagen till byggnadsställningen utan celler, fluorescerande tagg kollagenet med användning av antikroppar (1: 100) mot kollagen typ I och bild med konfokal laserscanningsmikroskopi 47 (CLSM; figur 4B).

3. Huh-7,5 Cell Culture och sådd

  1. Kultur Huh-7,5-celler med en såddtäthet av 2-2,5 x 10 6 celler / ml i 100 mm cellodlingsskålar med 10 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100 U / ml penicillin-streptomycin (tillväxtmedia) vid 37 ° C och 5% CO 2. Ändra media var tre dagar i BSC tills de har nått 75-80% konfluens.
  2. Förbereda ställningar för cellsådd i BSC.
    1. Placera försiktigt scaffolds i en 24-brunnsplatta med den plana ytan vänd uppåt.
    2. Att tvätta scaffold, pipett 2 ml PBS till varje brunn innehållande en byggnadsställning. Aspirera PBS och pipett 2 ml färsk PBS i varje brunn.
    3. Aspirera PBS och pipettera 2 ml tillväxtmedium (se steg 3.1) och låt stå i 30 min. Suga ut mediet och låta ställningen torka i en timme.
  3. Lossa konfluenta Huh-7,5-celler (från steg 3,1) från odlingsplattan i BSC med hjälp av trypsin matsmältning metod.
    1. Aspirera media från plattan, tillsätt 4 ml PBS för att tvätta vidhäftande celler och sedan aspirera PBS.
    2. Pipettera 0,75-1 ml 0,25% trypsin och placera i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 under 3 min.
    3. Ta bort plattan från inkubatorn och pipett 5 ml medium för att stoppa trypsin reaktion. Pipett media, lösgjorda celler, och trypsin blandningen i ett 15 ml rör.
    4. Centrifugera vid 524 xg under 3 min, avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 5 ml medium.
  4. Räkna celler med användning av en hemocytometer och beräkna volymen av cellsuspensionen som innehåller celler vid målnummer, N 0, per 25 | il (för standard experiment, N 0 är 1 x 10 6 celler).
    Volym av cellsuspension = (mål antal celler) / (koncentration av cellsuspension)
  5. Långsamt pipettera 25 | il av cellsuspension (innehållande N 0-celler) direkt på toppen av varje byggnadsställning (från steg 3.1.4). Placera 24-brunnar i inkubatorn.
  6. Efter 12 h, överföra ställningar försiktigt med användning av en spatel i en ny 24-brunnars platta och pipettera 2 ml medium i varje brunn. Placera 24-brunnar i inkubatorn.
  7. Ändra media varje 3 dagar eller beroende på när media samlas för proteinutsöndring analys (se steg 5,1).

4. Cell Viability

  1. För att kvalitativt analysera cellviabilitet, använda fluorescerande levande / döda färgningskit för att färga cellerna och bild med hjälp av CLSM.
    1. Efter kit instruktion, bereda en lösning med 4 iM kalcein AM och 8 iM etidium homo-dimer-1 i media (se steg 3.1.3).
      Obs: Optimera beroende på antalet celler. Använd dubbla mängden reagens om celler förökar sig och dubbla antalet (cirka 2 miljoner).
    2. I BSC, aspirera media i varje brunn med en byggnadsställning (steg 3,7) och pipetten 500 ul av den beredda lösningen. Inkubera proverna i en 37 ° C inkubator i en timme.
    3. Täck plattorna i folie för att skydda proverna från ljus när du tar bort plattan från inkubatorn. Bild prover med CLSM49.
  2. För att kvantitativt bedöma cellviabilitet, mäta enzymatisk aktivitet (i levande celler) med användning av kolorimetriska analyser 50 (dvs., 2- (2-metoxi-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium (mononatriumsalt-reagens)).
    1. Skapa en standardkurva för ICC plattformen (dvs en kurva över absorbansen (OD) versus givet antal celler).
      Obs: Cell seeding är inte 100% effektiv i jämförelse med andra plattformar, eftersom celler kan passera genom hålrummen i byggnadsställningar.
      1. Bestämma cellsådd nummer, N 0 som kommer att användas för att göra standardkurvan.
        Obs: Välj ett område som omfattar cellantal som uppskattas i experimentet. Till exempel, om den ursprungliga cellantalet är 5 x 10 5 celler och det finns uppskattningsvis ~ 3-faldig ökning av den sista dagen för experimentet, välja 2,5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 6, och 2 x 10 6 celler som N 0.
      2. Utför cellsådd i ICC ställningar (en N 0 per byggnadsställning med sådd volym 25 l) som beskrivs i steg 3,1-3,6.
      3. Efter 6 h, överföra ställningar till en annan 24-brunnars platta väl. Välja en tid som tillåter cellvidhäftning men inte cellproliferation.
      4. Utför cellräkning på den överförda ICC schavotten.
        1. Späd 10x monosaltreagens (MSR) lösning till 1x med media i BSC och pipetten 500 l 1x MSR lösning i varje brunn med en byggnadsställning. Inkubera 24-brunnars platta vid 37 ° C under 1 timme.
        2. Från varje brunn, överföra 100 pl i en 96-brunnars platta väl. Som en blank, pipett 100 pl färsk 1x mononatrium-salt reagenslösning in i olika brunnar på 96-brunnsplatta. Manuellt avlägsna eventuella bubblor med en torr pipettspets och täcka 96-brunnar i folie för att skydda den mot ljus.
        3. Mät OD vid λ = 450 nm läsning med hjälp av en spektrofotometer. Subtrahera tomma OD från andra värden för att hitta den exakta OD 51.
      5. Räkna antalet celler (N L) som återstår i brunnen efter överföring av byggnadsställning (steg 4.2.1.3) med användning av en hemocytometer.
        Obs: Använd 300 pl trypsin att trypsinize cellerna.
      6. Beräkna den faktiska cellantalet, N A.
        faktiska =initial - kvar i väl
        N A = N 0-N L
      7. Göra standardkurva genom att plotta OD erhållen i steg 4.2.1.4.3 vs. faktiska cellantal (N A) och använda detta för att uppskatta antalet celler i experimenten.
        Obs: Gör en ny standardkurva om några ICC parametrar (dvs porogen storlek, dimensioner ställningen, ECM protein, etc.) ändras.

5. Cell Funktion

  1. Analysera proteinsekretion av Huh-7.5-celler (dvs, albumin, urea) från de uppsamlade medier (från steg 3,7) genom enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) 52.
    Notera: Späd media, beroende på antalet celler som inokulerats och mängden media uppsamlades. 5 x 10 5 celler såddes i ICC, använd en ~ 1: 25-förhållande, innan dess införande till antikropps förbelagda brunnarna.
  2. Att kvalitativt analysera cellfunktionen, immunostain specifika intracellulära proteiner(Dvs, albumin), enzymer (dvs CYP450), fläck strukturella komponenter (dvs cellulära aktin) samt kärnor och bild med hjälp av CLSM 49.
    1. Aspirera media (från steg 3,7) och pipett 2 ml PBS för att tvätta cell lastat ICC ställningar.
    2. Pipettera 1 ml av 4% PFA och inkubera under 5 min vid rumstemperatur för fixering.
    3. Tvätta 3x med 2 ml PBS.
    4. Permeabilize membran genom inkubering av byggnadsställningar i 1 ml av 0,1% 4- (1,1,3,3-tetrametylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (ytaktivt medel) under 30 min.
    5. Tvätta 3x med 2 ml PBS för att avlägsna eventuella läckande proteiner.
    6. Pipettera 500 | il 1% bovint serumalbumin (BSA) och inkubera vid RT i 1 h för att blockera icke-specifik bindning.
    7. Förbereda utspädda primära antikroppen (dvs., albumin, CYP450) lösning.
      1. Pipettera 500 | il 1% BSA-lösning i en 15 ml rör och tillsätt 4,5 ml av 0,1% -ig lösning ytaktivt ämne för att framställa en total 5 ml 0,1% BSA-lösning.
      2. Pipett 98 ul av BSA-lösningen 0,1% i en 200 pl mikrocentrifugrör och 2 pl av den primära antikroppen för att producera en 01:50 (primär antikropp: 0,1% BSA) primär antikropp lösning.
    8. Pipetten 40 pl av den primära antikroppen lösning på ställningen och täcka substratet med paraffinfilm. Linda 24-brunnsplatta med aluminiumfolie och lagra skålen vid 4 ° C över natten.
    9. Tvätta 3x med 2 ml PBS och skaka plattan försiktigt i mellan tvätt.
    10. Förbereda utspädd biotinylerad sekundär antikropp (dvs Anti-mus-antikropp) förrådslösning.
      1. Pipettera 198 | il 0,1% BSA-lösning och 2 | il andra antikropp för att producera en 1: 100 (sekundär antikropp: 0,1% BSA) sekundär antikropp lösning.
      2. Bered en 0,1% stamlösning av rodamin eller fluoresceinmärkt phalloidin (för att färga de cellulära aktinfilament) i BSA lösning 0,1%.
      3. Pipettera 25 | il av varje lösning i ett rör och blanda waln.
    11. Pipettera 50 | il av den sekundära antikroppen stamlösning på ställningen. Täck ställningen med paraffin film, linda skålen med aluminiumfolie och förvara vid rumstemperatur under 2 timmar.
    12. Tvätta 3x med 2 ml PBS.
    13. Pipett 200 pl 0,2% 4'-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, en kärna fläck) lösning på ställningen och hålla vid RT i 2-3 min. Täck plattan med aluminiumfolie.
    14. Tvätta 2x med 2 ml PBS.
    15. Hjälp av en pipett, placera en droppe av montering media på substratet.
    16. Noggrant sätta ställningen på en glasplatta och bild med CLSM 47.
  3. Bedöm genuttryck genom realtids-polymeraskedjereaktion (qPCR). Använd standard kit för omvänt transkriptas-PCR (RT-PCR) 53 och qPCR 54 enligt tillverkarens instruktioner. Extrahera RNA från cellerna såsom beskrivs nedan.
    1. Placera ställningen (från steg 3,7) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    2. Pipett 200 ul kloroform till varje mikrocentrifugrör och skaka röret kraftigt i hand för 15-20 sekunder. Hålla rören vid RT under ~ 3 min tills faserna separerar.
    3. Centrifugera provet vid 13.000 xg, 4 ° C under 15 minuter och ta bort rören försiktigt så att faserna inte blanda.
    4. Noggrant pipettera 500-600 | il av den övre vattenfasen från det första röret till ett andra mikrocentrifugrör.
    5. Lägg en ekvivalent volym (500-600 l) isopropanol till denna andra röret.
    6. Vänd röret 3-5 gånger och lämna röret stå vid RT under 10 min.
    7. Centrifugera provet vid 13000 xg, 4 ° C under 15 min.
      1. Om en pellet inte syns vid botten av röret, centrifugera igen under 5 min.
        Obs: Om det finns fortfarande ingen synlig pellet, kan mängden RNA vara otillräcklig.
    8. jagnvert rör med locket öppet för kassera supernatanten och pipettera i 1 ml 70% etanol utspätt i DEPC vatten in i röret.
    9. Något Vortexa röret så pelleten lossnar från väggen av röret och sedan låta röret lufttorka.
    10. Tillsätt 50 pl av DPEC vatten för att suspendera pelleten.
    11. Håll pipettering tills pellets löser sig.
    12. Hålla i 10 min vid 55 ° C för att denaturera det dubbelsträngade RNA till enkelsträngat RNA.
    13. Lätt trumma fingrarna på tuben botten och sedan centrifugera kort rören (7500 xg, 4 min, 4 ° C).
    14. Håll rören i is tills utföra omvänt transkriptas 55 och realtids-PCR som beskrivs i 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representativa resultat för strukturbestämning av ICC ställningen och jämförelse av varje ICC ställnings tillstånd effektivitet i odling hepatocyter visas och förklaras nedan. ICC ställnings betingelser som användes i dessa resultat är kollagen beläggningar av 0 | ig / ml (Bare), 20 | ig / ml (Kollagen 20), 200 | ig / ml (Kollagen 200), och 400 | ig / ml (Kollagen 400) och den initiala va-7,5 cell sådd antal är 1x10 6.

Karakterisering av ICC pore sammankopplingar och byggnadsställning topologi.

SEM avbildning, efter fixering och frystorkning av ICC ställningar, användes först för att avgöra om rätt sammankopplingar mellan ICC porer bildades och att se effekten av konjugering av olika kollagenkoncentrationer på ställningen topologi. Kvantitativ analys av två-dimensional nakna ICC SEM-bilder (figur 3A) med ImageJ mjukvara, avslöjade en genomsnittlig pordiameter av 102,3 ± 9,3 pm och en genomsnittlig sammankoppling diameter på 38,6 ± 4,3 | j, m (Figur 3B, C). Denna sammankoppling mellan porer spelar en betydande roll i korrekt diffusion av näringsämnen till cellerna samt interaktionen cell-cell genom hela ställningen. Beläggningen av kollagen resulterade i en fiber mesh-nätverk som mer definierade vid högre koncentrationer av kollagen konjugering (Figur 4A). Konfokala bilder visar även lager av kollagen på hålrumsytor och högre yta täckning med ökningar i kollagenkoncentrationen (figur 4B).

Effekt av ICC plattform villkor Huh-7,5 cellviabilitet och funktion.

Va-7.5-celler utsattes för fluorescerande Live / Dead fläckening-analys (4 uM kalcein AM och 8 ^ M EthD-1) och avbildas med CLSM, såsom visas i figur 5. Celler sådda i kalt, icke-adhesivt ICC byggnadsställningar tenderade att aggregera i centrum av poren och cell-cell sammankoppling mellan porer sågs i senare tider (dagarna 7 och 10). Närvaron av en kollagenbeläggning på ICC ställningar tillåts celler att vidhäfta till schavotten yta samt en inter-por cell-cell interaktion så tidigt som dag 1. Cellviabilitet, indikeras av den gröna fläcken, ökade med tiden och var i allmänhet högre i kollagenbelagda ställningar, vilket framgår av högre grön fluorescens. Figur 6 visar de kvantitativa MSR resultat ytterligare undersökning av effekten av ICC 3D-strukturen och proteinkoncentration på cellviabilitet. En kolorimetrisk cellviabiliteten analys utfördes på celler odlade i ICC ställningsbetingelser såväl som på en 2D-polystyren odlingsplatta och absorbansdata (mätt vid 450 nm) normaliserades till than kontroll (Dag 1). Celler odlade på 2D plattor underhålls cellviabilitet men ingen ökning av celltillväxt observerades. 3D nakna ICC scaffold förbättras avsevärt cellproliferation jämfört med 2D tillstånd, vilket indikerar betydelsen av 3D-matris. Med tillägg av den kollagenbeläggning, cellproliferation ökade med tiden vid alla kollagenkoncentrationer och den maximala proliferationen hittades i 200 | ig / ml belagd ICC scaffold på dag 14. Detta bekräftar kvalitativa observationer i figur 5.

Hepatocyt-funktion bedömdes genom övervakning av förändringar i albuminutsöndring samt genen uttrycksprofilen för tre adhesionsproteiner i de olika ICC ställningsförhållanden. Figur 7 illustrerar den positiva korrelationen mellan serum-albumin utsöndras, såsom kvantifierades genom albumin ELISA och kollagenkoncentrationen konjugerad till ställningen. Dag 14, va-7.5-celler odlade i400 ug / ml belagda ICC byggnadsställningar utsöndras mer än tre gånger så mycket albumin som de odlade i nakna ställningen. Resultaten för de genuttrycksprofilerna av E-cadherin, N-cadherin, och integrin p 1 proteiner i de olika ICC ställningsförhållandena visas i figur 8. Graden av E-cadherin mRNA-expression i 400 pg / ml belagda ICC ställningar ökade med mer än 4 veck jämfört med de andra beläggningsförhållanden (figur 8A). Faldsförändringen i N-cadherin-genuttryck var större i de högre koncentrationerna av kollagen beläggning. Men det integrin β1 genuttryck stannade relativt konstant eller minskat i alla ICC ställningar betingelser förutom 200 pg / ml belagda ICC ställningar.

Figur 32
Figur 2. Konjugering av kollagen till PEGDA schavotten via NHS kemi. Bioaktiva byggnadsställningar använda PEG-NHS som har en aminreaktiv succinimidyl (NHS-ester), som reagerar till amingruppen i kollagen som tillåter konjugation till ställningen. PEG, poly (etylenglykol); NHS, N-hydroxisuccinimid; UV ultraviolett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Analys av storleken på ICC håligheter och sammankopplingar. (A) SEM-mikrofotografier av ICC schavotten (skala bar = 100 nm) analyserades med ImageJ programvara och kvantitativt representerade som histogram av (B) pordiameter och (C) sammankoppling diameter. Denna siffra har ändrats och används med tillstånd från Wiley 47."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Inverkan av kollagen beläggning på ICC ställnings topologi. (A) SEM-bilder och (B) konfokala bilder togs för att kvalitativt bedöma ytan topologin av byggnadsställningar belagda med 20 mikrogram / ​​ml, 200 pg / ml, och 400 mikrogram / ​​ml av kollagen. Röda rutor omger hålrummet som visas i högre förstoring bilderna nedan. Skalstrecken är (A) 5 ^ m, (B) 200 | j, m och 100 | j, m (högre förstoring). Denna siffra har ändrats och används med tillstånd från Wiley 47. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 5. Effekt av ICC plattformsförhållanden på cellviabilitet och morfologi med hjälp av kvalitativ Live / Dead analys. Confocal bilder av Live / Dead färgade Huh-7,5 celler såddes i ICC ställningar med olika kollagenkoncentrations beläggningar (0, 20, 200 och 400 | ig / ml) togs 1, 4, 7, och 10 dagar efter sådd. Grön fläck (calcein) indikerar levande celler och röd fläck (Ethidium homodimer-1) indikerar celldöd. Skalstrecken anger 200 | j, m. [Denna siffra har ändrats och används med tillstånd från Wiley 47] Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. EffektPlattformens typ och ICC plattformsförhållanden på cellviabilitet med användning av en kvantitativ kolorimetrisk cellviabilitet analys. Huh-7.5-celler sådda på en 2D polystyren odlingsplatta och i ICC ställningar med olika kollagenkoncentrations beläggningar (0, 20, 200 och 400 | ig / ml ) utsattes för den kolorimetriska MSR viabilitetsanalys 1, 4, 7, 10, och 14 dagar efter sådd. Absorbansen mättes vid 450 nm och data normaliserades till Dag 1 absorbansvärden. (n = 3, medelvärde ± SD, ***: P <0,001 jämfört med MSR lösning absorbans läsning för Dag 1 av varje grupp.) [Denna siffra har ändrats och används med tillstånd från Wiley 47] Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Effekt av ICC platform tillstånd på Huh-7,5 funktionen med utsöndrade albuminkoncentration ELISA-analys. Albumin ELISA användes för att kvantifiera serumalbuminutsöndring i media som samlats in från cell-lastat ICC ställningar med olika kollagenkoncentrations beläggningar (0, 20, 200, och 400 | j, g / ml) på dag 1, 4, 7, 10 och 14 efter sådd. Varje datapunkt representerar ett genomsnitt av 3 prov och normaliseras till antalet celler hittas med hjälp av kolorimetrisk MSR cellviabiliteten analysen och den skapade standardkurvan (n = 3, medelvärde ± SD). [Denna siffra har ändrats och används med tillstånd från Wiley 47] Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Effekt av ICC plattform tillstånd på Huh-7,5funktion med hjälp genuttrycksanalys. Real-time kvantitativ PCR användes för att profilera genuttryck av celler odlade i ICC ställningar med olika kollagenkoncentrations beläggningar (0, 20, 200, och 400 | j, g / ml) på dagarna 1, 4 och 7 efter sådd. Tre kopplings proteiner valdes, nämligen (A) E-cadherin, (B) N-cadherin, och (C) Grin Beta 1. mRNA expressionsnivåer normaliserades av GAPDH. (n = 3, medelvärde ± SD *. P <0,05 **:.. P <0,01 jämfört med genuttrycket av dag 1 varje grupp) [Denna siffra har ändrats och används med tillstånd från Wiley 47] Klicka här för att en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vävnadstekniska byggnadsställningar utvecklas snabbt för att ge alla de fysiska och biokemiska signaler som är nödvändiga för att regenerera, underhålla eller reparera vävnad för tillämpningen av ersättnings organ, studera sjukdomar, utveckling av läkemedel och många andra 57. I levervävnadsteknik, primära humana hepatocyter förlorar snabbt deras metaboliska funktioner när isolerade från kroppen, vilket skapar ett stort behov av tekniska ställningar och utveckla plattformar för att upprätthålla leverfunktion. Den nuvarande in vitro levercell kulturplattformar har utnyttjat olika biomaterial. Forskningen inom detta område har varit inriktat på att efterlikna olika funktioner i levermikro in vivo, såsom ECM protein konfiguration 58,59, co-kultur 60,61, och micropatterning 62. Däremot har det funnits en brist på ställningar med kontrollerad porositet och hög fysisk planering. I detta avseende, den beskrivna ICC cellodlings Platform, med dess isotropa egenskaper och hög organisation behandlar detta tomrum. Vi visar ICC PEGDA Ställningen är en lämplig plattform för odling av hepatokarcinom celler, en modell celltyp för hepatocyter, och att ytterligare kollagenbeläggning förbättrar cellens beteende 47.

I praktiken kan hålrummet storleken på ICC ställningen stämmas av storleken på PS-mikrosfärer. Dessutom kan det sammankopplade storleken av byggnadsställningen styras av tiden och temperaturen för glödgningsprocessen; högre glödgningstemperatur eller längre glödgning tid resulterar i större sammankopplings diameter. Därför bör dessa parametrar väljas noggrant som större sammankopplings diametrar äventyrar den mekaniska stabiliteten hos ställningen. I detta arbete, var PS sfärer med en diameter 140 um valdes för hepatocyte cellodling att begränsa storleken på de resulterande hepatospheres i de kala ICC ställningar för att förhindra nekros av celler i mitten av hanpatocyte sfäroid. 63 Såsom visas i representativa resultat, gör 3D arkitektur ICC ställningen högre Huh-7,5 celltillväxt i jämförelse med 2D polystyrenplatta cellodling. Resultaten tyder på att de sammankopplade enhetliga håligheter ICC ställningen möjliggöra en effektiv cell-cell interaktion och överhörning mellan hålrummen.

Koncentrationen av den typ kollagen I beläggning påverkade cellmorfologin, viabilitet och funktion. Kollagen typ I är en viktig ECM protein som finns i rymden av Disse, ett område som gränsar till levercellerna 64. Icke vidhäftande, nakna PEGDA ICC ställningar främjas hepatocyte sfäroid bildning medan en kollagenbeläggning återges ställningen bioaktiva och Huh-7,5 celler vidhäftade till ytan av ställningen, som utnyttjar den stora ytan närvarande. ECM proteinbelagda ICC byggnadsställningar förbättrat både interaktionen cell-cell såväl som cell-ECM-interaktion, såsom indikeras av uppreglerad E-cadherin, N-cadheRin och Grin p1 genuttryck, som spelar en roll i regleringen av cellens beteende. Kollagen typ I koncentrationer av 200 ng / ml och 400 pg / ml var lämplig för Huh-7,5 kultur, förbättra både celltillväxt och albuminutsöndring.

Den största begränsningen som orsakas av ICC tillverkning är kontroll över PS sfären inriktning och nummer när du gör de gitter. Den snabba avdunstning av etanol vid inläsning sfärerna i formarna kan orsaka olika sfärtäthet, vilket resulterar i ett annat antal lager av sfärer i gitter. Emellertid har användningen av mindre flyktig lösning som vatten också nackdelar. Det leda till mindre ordnade CCS i monteringssystem 65 flytande, och det finns en stor möjlighet att ett högt krökt scaffold ytan på grund av menisken bildning. En annan begränsning är den korrekta inriktningen av sfärer i formarna för att säkerställa högsta effektivitet av sammanlänkningar. Den skakar (steg 1.1.5 och 1.1.6) är därför critical till ICC tillverkningstekniken. Om ett bra arrangemang inte observeras genom mikroskopi, upprepa steg 1.1.6.

Sammantaget ICC PEGDA scaffold, med sin enkla tillverkning protokollet kan lämpligen användas som en plattform för 3D-cellodlingstillämpningar. Bioaktivering av den nakna ställningen med proteiner ökar ytterligare sin funktionella egenskaper 14. I detta manuskript, anpassade vi tillverkningsprotokoll och valde analyser bedömning cell för levervävnad engineering ansökan. Däremot kan en rad olika celltyper odlas inom denna unika byggnadsställning och varje celltyp kan kräva ändring av vissa parametrar. Även lager av komplexitet i form av flera ECM proteintyper, co-kultur och dynamisk kultur med hjälp av en bioreaktor kan alla tillsättas för att förbättra cellprestanda ytterligare. Denna plattform har potential att hjälpa till vid vävnadsregenerering och utveckling av läkemedel, för att studera leversjukdomar, och som skall användas för transplantation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna stöd från en National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) och konkurrenskraftig forskning (NRF-CRP10-2012-07).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR tube Axygen Scientific PCR-02D-C Boil-proof
Gorilla Glue Gorilla Glue, Inc. Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slides VWR 631-1575 Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheres Fisher Scientific TSS#4314A Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
Ethanol Merck 1.00983.1011 absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic Bath Elma S10H Equiment
Furnace Nabertherm N7/H Equipment
200 µl pipette tip Axygen Scientific T-210-Y-R-S
Rocking shaker VWR 444-0142
Polyethylene Glycol (PEG) Merck 1.09727.0100 Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
Centrifuge Beckman Coulter 392932 Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate Laysan Bio ACRL-PEG-SVA-3400-1g Mw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma Aldrich 410896
Vortex VWR 58816-123 Equipment
Microcentrifuge Eppendorf 5404 000.413
Paraffin Film Parafilm M  #PM996 Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlight Blaze Technology  120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF) Merck 107025
Orbital shaker Heidolph 543-123120-00-5
Collagen Type I Sigma Aldrich C3867-1VL From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 20012-027 16% W/V AQ. 10 x 10 ml
Paraformaldehyde VWR 43368.9M Equipment
Freezone 4.5 freeze drier Labconco 7750020 Equipment
Sputter coater Jeol Ltd. JFC-1600 Equipment
Scanning Electron Microscope Jeol Ltd. JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam ab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Life Technologies A21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)  Bio-Rev PTE LTD 3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2.5 g/L Glucose w/ L-Gln		 Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S) Life Tchnologies 15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishes Sigma Aldrich CLS430591
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators Thermofisher Scientific 371
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer Thermofisher Scientific 02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells Life Technologies L3224 
CCK-8 Assay Dojindo Laboratories CK04-11 Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader  Tecan
Albumin Human ELISA kit Abcam ab108788
Triton X-100 Bio-Rad #1610407
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) Santa Cruz Biotechnology sc-53850; sc-271605
DAPI Life Technologies D3571
Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin Life Technologies A34055
Trizol Life Technologies 15596-026
Chloroform VWR 22706.326
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
DPEC water Thermofisher Scientific AM9916
Nanodrop 2000c Spectrophotometer Thermofisher Scientific ND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix  Bio-Rad Laboratories 1708840
SYBR select Master Mix for CFX Life Technology 4472937
Primers (to be chosen)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler Bio Rad Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
  2. Abboud, G., Kaplowitz, N. Drug-induced liver injury. Drug Safety. 30 (4), 277-294 (2007).
  3. Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
  4. Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
  5. Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
  6. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
  7. Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  9. Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
  10. Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  11. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
  12. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  13. Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
  14. Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
  15. Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
  16. Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
  17. da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
  18. da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
  19. Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
  20. Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
  21. Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
  22. Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
  23. Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
  24. Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
  25. Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
  26. Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
  27. Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
  28. Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
  29. Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
  30. Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
  31. Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
  32. Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
  33. Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
  34. Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
  35. Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
  36. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
  37. Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
  38. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  39. Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
  40. Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
  41. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  42. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
  43. Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
  44. Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
  45. Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
  46. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
  47. Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
  48. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.1 (2012).
  49. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  50. Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
  51. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  52. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  53. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
  54. JoVE Science Education Database. Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  55. JoVE Science Education. Essentials of Environmental Microbiology. , JoVE. (2015).
  56. Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
  57. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering--current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
  58. Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
  59. Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
  60. Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
  61. Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
  62. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  63. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  64. Martinez-Hernandez, A., Amenta, P. The hepatic extracellular matrix. Vichows Archiv A Pathol Anat. 423, 1-11 (1993).
  65. Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).

Tags

Bioteknik lever tissue engineering poly (etylenglykol) hydrogel inverterad kolloidalt kristall hepatocyte cellodling biofunctionalization
Tillverkning av Inverted kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Scaffold: En tredimensionell cellkultur plattform för levervävnad Engineering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon,… More

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon, W. Y., Kim, M. H., Lee, J. H., Ng, S. S., Tabaei, S. R., Cho, N. J. Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (114), e54331, doi:10.3791/54331 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter