Introduction
Trypanosoma ब्रुसे एक प्रोटोजोआ परजीवी है कि मानव अफ्रीकी trypanosomasis और पशु में nagana का कारण बनता है। टी ब्रुसे एक उच्च गुणवत्ता जीनोम, कई प्रोटिओमिक्स और transcriptomics डेटासेट और अच्छी तरह से विकसित आणविक उपकरण 1-3 के संयोजन के कारण प्रोटीन समारोह के विश्लेषण के लिए एक आदर्श जीव है। प्रोटिओमिक्स और अनुक्रमण के क्षेत्र में अग्रिम बड़े डेटासेट कि संभावित दिलचस्प जीन 4-6 उजागर में हुई है; हालांकि, कई जीनों मौजूदा डेटाबेस में उनके साथ जुड़े कम से कम जानकारी है। इसलिए प्रोटीन कार्यात्मक लक्षण वर्णन सहायता करने के लिए एक उच्च throughput विधि के लिए एक की जरूरत है।
एक टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति एक प्रोटीन के समारोह में अंतर्दृष्टि की बहुलता दे सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या मिलान के साथ टैग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो जहां prot के बारे में जानकारी देता है द्वारा अनुवादित किया जा सकताein अपनी जैविक प्रभाव exerting किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक प्रोटीन एक नल 7 के साथ टैग, HaloTag 8 या उनकी टैग जैव रासायनिक assays और अपनी बातचीत भागीदारों की पहचान के लिए शुद्ध किया जा सकता है।
हमने हाल ही में टी के लिए एक मजबूत टैगिंग पद्धति विकसित की ब्रुसे 9। यह अभिकर्मक के लिए डीएनए उत्पन्न करने के लिए लंबे समय तक प्राइमर पीसीआर का इस्तेमाल किया और समानांतर में प्रोटीन की दर्जनों की टैगिंग की अनुमति दी - मौजूदा प्रोटोकॉल के लिए एक बड़ा सुधार। अब हम परिमाण के एक आदेश से procyclic रूपों में इस प्रोटोकॉल के scalability में सुधार हुआ है। यहाँ, हम हमारे विधि, जहां हम 96 अच्छी तरह प्लेटों में पीसीआर और अभिकर्मक प्रदर्शन, वसूली और 24 अच्छी तरह से प्लेट में होने वाली के साथ प्रस्तुत करते हैं। प्रोटीन के सैकड़ों अब समानांतर में टैग किया जा सकता रूप में इस विधि पूरे जीनोम trypanosome टैगिंग के लिए एक लागत प्रभावी और व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है।
Protocol
1. 96 अच्छी तरह से लंबे समय प्राइमर पीसीआर
- -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पूर्व फ्रीज 96 अच्छी तरह से पीसीआर कूलर।
- एक 10 मिलीलीटर ट्यूब में, मास्टर मिक्स एक को तैयार: 2,100 μl DDH 2 हे, 105 μl पीसीआर ग्रेड DMSO, 105 μl 10 मिमी dNTPs, 105 μl pPOT टेम्पलेट (25 एनजी / μl) 9, प्लेट प्रति 2,415 μl की कुल मात्रा के लिए ।
- विभाज्य एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के प्रत्येक कुएं में 23 μl।
- 100 माइक्रोन के प्रत्येक अच्छी तरह से भरी हुई एक P20 12 चैनल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए प्राइमरों जमा के 2 μl जोड़ें। पूर्व ठंडा पीसीआर कूलर पर फिल्म, जगह थाली के साथ सील और -80 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट की एक न्यूनतम के लिए फ्रीज करने के लिए अनुमति देते हैं।
- एक 10 मिलीलीटर ट्यूब में, मास्टर मिक्स बी को तैयार: 2,048 μl DDH 2 हे, 525 μl 10x बफर, प्लेट प्रति 2626 μl की कुल मात्रा के लिए 52.5 μl पोलीमर्स।
- -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से थाली और पीसीआर कूलर निकालें।
- पीसीआर कूलर पर थाली के साथ अभी भी जम के शीर्ष पर 25 μl मास्टर मिक्स बी जोड़नेn मास्टर मिक्स एक 50 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए। इस समय महत्वपूर्ण है, और इससे पहले कि मिक्स एक पिघलना कर सकते हैं पूरा किया जाना चाहिए। फिल्म के साथ थाली सील।
- इस प्रकार के रूप में थर्मल साइक्लर सेट: 10 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, तो 15 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्रों 7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के अंतिम विस्तार की अवधि के द्वारा पीछा 2 मिनट के लिए ।
- पीसीआर प्लेट लोड करने के बाद ब्लॉक 94 डिग्री सेल्सियस पर पहुंच गया है।
2. 96 अच्छी तरह से लंबे समय प्राइमर पीसीआर के मान्यकरण
- कास्ट एक बड़ी 1% (w / v) Tris एसीटेट EDTA (TAE) में agarose जेल 4 x 28-अच्छी तरह कंघी के साथ चल बफर कुओं की 4 पंक्तियों के साथ एक जेल देने के लिए। एक 12 चैनल मल्टीचैनल पिपेट के सुझावों के साथ कंघी के वैकल्पिक दांत संरेखित करें। ध्यान से चल बफर TAE में जेल डूब के बाद गलियों भरी हुई हैं।
- 1 सेंट और 28 वीं में अच्छी तरह से प्रत्येक पंक्ति में लोड 1 केबी डीएनए सीढ़ी।
- एक P20 12 चैनल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, पीसीआर उत्पाद दीर के 2 μl हस्तांतरणectly जेल (चित्रा 1 ए) के प्रत्येक लेन करने के लिए। क्या यह जल्दी amplicons को दूषित करने की संभावना को कम करने के लिए।
- जेल के 1 पंक्ति की अजीब गिने गलियों में पीसीआर प्लेट की पंक्ति एक से पीसीआर उत्पादों लोड (A1 - 3 लेन, A2 - 5 लेन ...... A11 - लेन 23, A12 - लेन 25) और पीसीआर उत्पादों लोड जेल के 1 सेंट पंक्ति के भी गिने गलियों में पीसीआर थाली की पंक्ति बी से (बी 1 - 4 लेन, A2 - 6 लेन ...... B11 - लेन 24, बी 12 - लेन 26)।
- के रूप में भी गिने गलियों में अजीब गिने गलियों और पंक्ति डी में ऊपर वर्णित है, पंक्ति सी के साथ पंक्ति सी और पीसीआर थाली में एक ही पैटर्न का उपयोग कर के विकास से पीसीआर उत्पादों लोड। इस लोडिंग पैटर्न जारी रखें जब तक पीसीआर थाली के प्रत्येक अच्छी तरह जेल पर लोड किया जाता है। डीएनए लोडिंग बफर इस जेल को लोड करने की आवश्यकता नहीं है।
- जेल चल रहा टैंक में डाल दिया है और बफर चलाने TAE साथ टैंक को भरने जब तक जेल डूबे हुए है। 30 मिनट के लिए 100 वी पर चलाने के लिए औरएक यूवी transilluminator का उपयोग करते हुए कल्पना। एक उदाहरण के लिए जेल चित्रा 1 बी देखें।
नोट: पीसीआर उत्पादों कई हफ्तों अभिकर्मक के लिए पहले के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता
3. 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक
- टी का प्रयोग करें ब्रुसे procyclic प्रपत्र सेल लाइन इस प्रक्रिया के लिए SMOXP9 10 और एसडीएम-79 10% से युक्त एफसीएस 10 मीडिया में हो जाना।
- (1.1 x 10 9 कोशिकाओं की कुल) अभिकर्मक प्रति 1 10 x 7 कोशिकाओं का उपयोग करें (2.2 x 10 9 कोशिकाओं की कुल) जब प्रोटीन के एन टर्मिनस और अभिकर्मक प्रति 2 एक्स 10 7 कोशिकाओं पर टैगिंग जब सी टर्मिनस पर टैगिंग प्रोटीन। अभिकर्मक के लिए पहले कई दिनों के लिए मध्य लॉग (1.2 x 10 6 -1 एक्स 10 7 कोशिकाओं / एमएल) में कोशिकाओं को बनाए रखें और 5-8 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं फसल।
- अभिकर्मक के लिए जमे हुए पीसीआर उत्पादों कमरे के तापमान पर पिघलना करने की अनुमति दें।
- एक haem का उपयोग कोशिकाओं गणनाocytometer या स्वचालित सेल काउंटर।
- 10 मिनट के लिए 800 XG पर कई 50 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं की गोली अपेक्षित संख्या।
- Centrifugation सतह पर तैरनेवाला त्यागें के बाद और 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend संशोधित cytomix (0.8 मिमी EGTA, 24 मिमी KCl, 0.15 मिमी CaCl 2, 10 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर pH7.6, 25 मिमी HEPES-कोह pH7.6, 2.6 मिमी 2 MgCl, 0.5% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज, 100 माइक्रोग्राम / एमएल बीएसए, 1 मिमी hypoxanthine, 144 मिमी sucrose) ट्यूब प्रति। एक एकल ट्यूब के लिए सभी सेल समाधान स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए 800 XG पर फिर से स्पिन।
- Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 5 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए संशोधित cytomix की 23 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
- कोशिकाओं कताई रहे हैं, वहीं 4 एक्स 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एसडीएम-79 मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें। प्लेटों विज्ञापन लेबल और एक अंगूठी के आसपास अच्छी तरह से थाली की ओर रुख मदद करने के लिए स्थायी मार्कर में एक थाली पर A1 आकर्षित।
- electroporator के लिए थाली हैंडलर कनेक्ट करें। electropora परटो इकाई 1,500 वी करने के लिए वोल्टेज, 100 μsec को पल्स लंबाई और 12 के लिए दालों की संख्या और 500 मिसे के लिए नाड़ी अंतराल निर्धारित किया है। प्लेट हैंडलर पर, नाड़ी गिनती करने के लिए 1. यह सुनिश्चित करता है कि उस electroporator electroporation थाली के 12 कॉलम के प्रत्येक के लिए एक एकल पल्स लागू होगी निर्धारित किया है।
- एक P200 12 चैनल मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, 96 अच्छी तरह से डिस्पोजेबल electroporation प्लेटें, 4 मिमी की खाई को पीसीआर थाली से पीसीआर प्रतिक्रियाओं हस्तांतरण।
- कोशिकाओं काता किया गया है और 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं / एमएल (3.7 चरण) के अंतिम एकाग्रता के लिए resuspended हैं, एक अभिकर्मक जलाशय के लिए स्थानांतरण। पिपेट एक P200 12 चैनल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग electroporation प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल के समाधान के 200 μl, pipetting द्वारा पीसीआर उत्पाद के साथ मिश्रण।
- ऊतक का उपयोग प्लेट शॉर्ट-सर्किट से बचने के लिए के ऊपर से किसी भी बूंदों को हटा दें।
- electroporation प्लेट, स्थिति के शीर्ष करने के प्लेट पैकेजिंग में प्रदान की सील फिल्म लागू करेंइलेक्ट्रोड शीर्ष और प्रत्येक स्तंभ के नीचे खुला लिए छेद छोड़ने के लिए इतनी के रूप में यह itioning। फिल्म का मार्गदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता उठाए गए मुद्दों को कवर करने से बचें।
- प्लेट हैंडलर में electroporation प्लेट लोड और ढक्कन बंद करें। electroporator इकाई पर प्रेस 'पल्स'।
- electroporation के बाद, जल्दी से 4 एक्स 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों के लिए 96 अच्छी तरह से थाली से electroporation कोशिकाओं को हस्तांतरण। ऐसी कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए, हर दूसरे टिप याद आ रही के साथ एक P200 12 चैनल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें कि शेष 6 युक्तियाँ 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर 6 पंक्तियों के साथ लाइन। 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट (2A चित्रा) के लिए पूर्व निर्धारित पैटर्न में 96 अच्छी तरह से electroporations प्लेटों में electroporated कोशिकाओं स्थानांतरण।
- P200 विंदुक युक्तियाँ तैयार करें - के लिए प्रत्येक 96 अच्छी तरह से अभिकर्मक हटा हर दूसरे स्तंभ के साथ 96 सुझावों में से 2 बक्से तैयार करते हैं।
- स्थानांतरण कुओं A1 / ए 3 / ए 5 / ए 7 / ए 9 / A11 96 अच्छी तरह से थाली पर electroporation के लिएपंक्ति बी में थाली 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों की एक पंक्ति ए, बी 1 / बी 3 / बी 5 / बी 7 / B9 / B11, सी 1 / सी 3 / सी 5 / सी 7 / C9 पंक्ति सी में / सी 11 और डी 1 / डी 3 / D5 / D7 / D9 / पंक्ति डी में D11 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली से 6 कुओं के प्रत्येक सेट के हस्तांतरण के बाद, 96 अच्छी तरह से थाली में कुओं तो मीडिया के साथ इसी कुओं से 24 में धो रहे हैं अच्छी तरह से थाली और धोने तो 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं को वापस सौंप दिया है।
- स्थानांतरण कुओं E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 96 अच्छी तरह से थाली पर electroporation 24 अच्छी तरह से थाली बी पंक्ति किसी के लिए, एफ 1 / F3 / F5 / F7 / F9 / पंक्ति बी में F11, G1 / जी 3 / g5 / G7 / G9 / पंक्ति सी और 96 में एच 1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 पंक्ति डी में 96 अच्छी तरह से थाली से 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 6 कुओं के प्रत्येक सेट के हस्तांतरण के बाद, कुओं में G11 -अच्छी तरह से थाली तो 24 अच्छी तरह से थाली में इसी कुओं से मीडिया के साथ धो रहे हैं और धोने तो 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं को वापस सौंप दिया है।
- स्थानांतरण कुओं A2 / ए 4 / ए 6/8 / A10 / A12 24 अच्छी तरह से थाली सी पंक्ति ए, बी 2 / बी 4 / बी -6 / बी करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली पर electroporation8 / B10 / बी 12 बी पंक्ति में, सी 2 / सी 4 / सी 6 / सी 8 / C10 / पंक्ति सी और डी 2 / D4 / डी 6 / D8 / D10 / पंक्ति डी में D12 96 से 6 कुओं के प्रत्येक सेट के हस्तांतरण के बाद में C12 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए -अच्छी तरह से थाली, 96 अच्छी तरह से थाली में कुओं तो मीडिया के साथ इसी कुओं से 24 अच्छी तरह से थाली में धो रहे हैं और धोने तो 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं को वापस सौंप दिया है।
- स्थानांतरण कुओं E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24 अच्छी तरह से थाली डी पंक्ति के लिए 96 अच्छी तरह से थाली पर electroporation, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / पंक्ति बी में F12, G2 / जी -4 / G6 / जी -8 / G10 / G12 पंक्ति सी में और एच 2 / एच 4 / H6 / H8 / एच 10 / पंक्ति डी में H12 96 अच्छी तरह से थाली से 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 6 कुओं के प्रत्येक सेट के हस्तांतरण के बाद, 96 में कुओं -अच्छी तरह से थाली तो 24 अच्छी तरह से थाली में इसी कुओं से मीडिया के साथ धो रहे हैं और धोने तो 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं को वापस सौंप दिया है।
- एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, 1 अच्छी तरह से कोशिकाओं की जांच करने के लिए प्रत्येक स्तंभ से जांच करते हैं। वहाँ एक साथ रहते हैं और मृत कोशिकाओं का एक मिश्रण किया जाएगासेल मलबे की पर्याप्त राशि। जीवित कोशिकाओं मृत कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, क्योंकि वे चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत उज्ज्वल हो जाएगा और बढ़ जाएगा।
- एक साफ, प्लास्टिक के डिब्बे में 24 अच्छी तरह प्लेटें एक ढक्कन है कि एक तंग सील रूपों के साथ रखें। एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बॉक्स रखा।
- 6-8 घंटा के बीच बाद में, 10% अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 2x चयनात्मक एंटीबायोटिक युक्त एफसीएस के साथ एसडीएम-79 के 1 मिलीलीटर जोड़ें। हमारे अनुभव में, सेल लाइनों जहां जीन एन टर्मिनस पर टैग कर रहे हैं चयनात्मक दवा की उच्च सांद्रता के लिए प्रतिरोधी रहे हैं। इसलिए, एक उदाहरण के रूप में उपयोग करते हुए blasticidin एन टर्मिनस पर टैगिंग 20 माइक्रोग्राम के अंतिम एकाग्रता / एमएल और blasticidin सी टर्मिनस पर टैगिंग 10 माइक्रोग्राम / एमएल blasticidin के अंतिम एकाग्रता की आवश्यकता की आवश्यकता है।
नोट: ट्रांसजेनिक सेल लाइनों अभिकर्मक के बाद दिखाई 9-10 दिनों में हो जाएगा। - पारित होने में कम से कम दो बार नए सिरे से दवा और मीडिया में विश्लेषण करने से पहले। चित्रा 2 बी एक ठेठ 96 अच्छी तरह से transfe परिणामों से पता चलताएन टर्मिनस पर 96 अलग प्रोटीन टैगिंग के लिए ction। निर्धारित करने के लिए अगर यह स्वस्थ, दवा प्रतिरोधी कोशिकाओं चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा अच्छी तरह से प्रत्येक का आकलन करें। एक स्वस्थ अच्छी तरह से मुख्य रूप से (<95%) अत्यधिक सक्रिय कोशिकाओं है कि चरण अनुबंध माइक्रोस्कोपी में उज्ज्वल हो गए हैं। epifluorescence माइक्रोस्कोपी या पश्चिमी धब्बा बाद के विश्लेषण के लिए तय अगर प्रोटीन सफलतापूर्वक चिह्नित किया गया है की आवश्यकता है।
Representative Results
इस प्रतिनिधि अभिकर्मक में, प्राइमरों TagIt पर्ल स्क्रिप्ट 9 का उपयोग कर बनाया गया है और व्यावसायिक रूप से संश्लेषित कर रहे थे। 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्रदर्शन किया और वर्णित (चित्रा 1 ए) के रूप में मान्य किया गया था; इस उदाहरण में, 95/96 PCRs सफल रहे थे (चित्रा 1 बी)। हमारे अनुभव में, या तो मूल प्राइमरों या फिर से संश्लेषित प्राइमरों के साथ विफल प्रतिक्रियाओं दोहरा एक सफल पीसीआर में परिणाम नहीं करता है।
Amplicons electroporation (2A चित्रा) के लिए 96 अच्छी तरह से electroporation प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया और उसके बाद वसूली और चयन के लिए 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर दिया। पर्याप्त समय चयन घटित करने के लिए अनुमति देने के लिए करने के बाद, कुओं अस्तित्व आगे के विश्लेषण से पहले रन बनाए थे। इस उदाहरण में, 88/96 कुओं (92%) के बाद 15 दिनों के चयन सकारात्मक थे।
चित्रा 2: 96 अच्छी तरह से electroporation और चयन (ए) 96 अच्छी तरह से electroporation बेनी से electroporated कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए पैटर्न।24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों के लिए ई। (बी) के एक योजनाबद्ध 24 अच्छी तरह प्लेटें में चयन के 15 दिनों के बाद एक ठेठ लाइव / मृत स्कोरिंग दिखा। ग्रीन एक सफल अभिकर्मक का प्रतिनिधित्व करता है, ग्रे केवल मृत कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से एक का प्रतिनिधित्व करता है। इस उदाहरण में, 88/96 (92%) कुओं का सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट परजीवी होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
पिछले 5-10 वर्षों में प्रोटिओमिक्स और transcriptomics तरीकों की संवेदनशीलता में नाटकीय सुधार जीन और उनके उत्पादों के हजारों पर मूल्यवान डेटा प्रदान की गई है। हालांकि, उपकरण को संबोधित करने के लिए इन प्रोटीनों के समारोह में तालमेल नहीं रखा है।
एक प्रोटीन टैगिंग अपने कार्य को निर्धारित करने के लिए कई प्रयोगों की सुविधा। उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन अलग अलग रंग की एक किस्म स्थानीयकरण और सह स्थानीयकरण के अध्ययन की सुविधा के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से इनकार किया जा सकता है। टैग ऐसी APEX2 या miniSOG 11,12 के रूप में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, के लिए विकसित की है, टैग प्रोटीन की ultrastructural स्थानीयकरण अनुमति देते हैं। इस तरह के नल टैग, और ProtC-TEV-ProtA (PTP) के रूप में जैव रसायन के लिए टैग, टैग 7,13 बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए या इन विट्रो जैव रासायनिक assays में प्रोटीन के साथ जुड़े परिसरों की शुद्धि के लिए अनुमति देते हैं।
विशिष्ट कदम है कि protoc की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैंराजभाषा हैं: पीसीआर मास्टर मिक्स 1 में DMSO के समावेश, मास्टर मिक्स 2, मास्टर मिक्स 2 में वाणिज्यिक पोलीमर्स के उपयोग और cytomix electroporation बफर के संशोधन के अलावा पहले पीसीआर मास्टर मिक्स 1 की ठंड। हमारे अनुभव में, यह क्रम सकारात्मक कुओं की एक समान अनुपात हासिल करने के लिए एन टर्मिनल टैगिंग transfections के लिए के रूप में सी टर्मिनल टैगिंग transfections के लिए कोशिकाओं की संख्या दोगुनी का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, सभी कदम के रूप में वर्णित किया जाना चाहिए।
इस तकनीक को केवल जब कीट procyclic प्रपत्र trypanosome परासंक्रमित सफल होने की संभावना है। खून रूपों एक कम अभिकर्मक दक्षता 14 है, इसके अलावा वे घनत्व पर निर्भर विषाक्तता कि चयनात्मक दवा से संबंधित नहीं है के कारण चयन के दौरान मरने की संभावना है। इसलिए, हमारे पिछले प्रोटोकॉल खून प्रपत्र Trypanosomes 9 की टैगिंग के लिए वर्तमान सर्वश्रेष्ठ प्रौद्योगिकी का प्रतिनिधित्व करता है। यह भी कि ट्रांस संभावना हैfection दक्षता विशिष्ट trypanosome अलग पर निर्भर अलग अलग होंगे। अन्य नस्लों अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है - इस प्रोटोकॉल 927 SMOX procyclic रूपों का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था। उपाय है कि सफलता की संभावना को बढ़ा सकते हैं शामिल हैं: पीसीआर amplicon की मात्रा बढ़ती है, अभिकर्मक में शामिल कोशिकाओं की संख्या बढ़ रही है।
हम एक तरीका है जहां प्रोटीन के सैकड़ों समानांतर में टैग किया जा सकता उपस्थित थे। इस स्थानीयकरण और बातचीत पर बड़े पैमाने पर अध्ययन की सुविधा होगी, मौजूदा बड़े डेटासेट के पूरक और समुदाय के लिए अमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं। प्राइमर टेम्पलेट्स अनुरोध और plasmids टेम्पलेट्स की एक सूची पर उपलब्ध हैं से उपलब्ध है: http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
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