Introduction
Trypanosoma brucei הוא טפיל protozoan שגורמת trypanosomasis אדם אפריקאי nagana בבקר. ט brucei הוא אורגניזם אידיאלי לניתוח תפקוד חלבון עקב השילוב של הגנום באיכות גבוהה, פרוטאומיקה רב מערכי נתוני transcriptomics וכלים מולקולריים מפותחים 1-3. התקדמות פרוטאומיקה וסדר גרמה מערכי נתונים גדולים המדגישים גנים מעניינים פוטנציאל 4-6; יש עם זאת, גנים רבים מידע מינימאלי הקשורים בהם במסדי הנתונים הקיימים. לכן יש צורך שיטת תפוקה גבוהה כדי לסייע ואפיון חלבונים פונקציונלי.
ביטוי של חלבון מתויג יכול לתת ריבוי תובנה הפונקציה של חלבון. לדוגמה, חלבון מסומן בחלבון או epitope ניאון יכול להיות מקומי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר נותן מידע על המקום ממנו protעין עלולה להיות הפעלת ההשפעה הביולוגית שלה. לחלופין, חלבון מתויג עם ברז 7, HaloTag 8 או התג שלו יכול להיות מטוהר עבור מבחני ביוכימיים ואיתור שותפי האינטראקציה שלה.
אנחנו לאחרונה פתחנו מתודולוגיה תיוג חזקה ט brucei 9. זה זמן רב בשימוש פריימר PCR על מנת ליצור את ה- DNA עבור transfection ואפשר התיוג של עשרות חלבונים במקביל - שיפור משמעותי כדי פרוטוקולים קיימים. עכשיו שיפרנו את יכולת ההרחבה של פרוטוקול זה בצורות procyclic ידי סדר גודל. כאן, אנו מציגים את השיטה שלנו שבו אנחנו מבצעים את PCR ו transfection לתוך צלחות 96-היטב, עם ההתאוששות והבחירה המתרחשים 24 גם צלחות. צירופם של מאות חלבונים יכול עכשיו להיות מתויג במקביל שיטה זו מספקת חסכונית ריאלי שיטה תיוג הגנום trypanosome כולו.
Protocol
1. 96-היטב ארוך פריימר PCR
- להקפיא קדם 96-היטב קריר PCR במקפיא -80 ° C.
- בתוך צינור 10 מ"ל, להכין מיקס מאסטר: 2,100 μl DDH 2 O, 105 μl PCR כיתה DMSO, 105 μl 10 מ"מ dNTPs, 105 μl תבנית pPOT (25 ng / μl) 9 עבור בנפח כולל של 2,415 μl לכל צלחת .
- Aliquot 23 μl לבאר כל צלחת 96-היטב PCR.
- הוסף 2 μl של 100 מיקרומטר ונקוו פריימרים לכל טעון היטב בעזרת פיפטה רבה P20 12 ערוץ. חותם עם הסרט, מקום צלחת על קריר PCR מראש צונן ולאפשר להקפיא למשך תקופה מינימלית של 20 דקות ב -80 מעלות צלזיוס.
- בתוך צינור 10 מ"ל, להכין מיקס מאסטר B: 2,048 μl DDH 2 O, 525 μl 10x חיץ, 52.5 פולימראז μl עבור בנפח כולל של 2,626 μl לכל צלחת.
- הסר את הצלחת קרירה PCR מהמקפיא -80 ° C.
- עם הצלחת עדיין על מקרר PCR, להוסיף 25 μl מיקס מאסטר B על גבי קפאn מיקס מאסטר A עבור נפח תגובה כולל של 50 μl. זהו זמן קריטי, ואת אמור להסתיים לפני לערבב יכול להפשיר. חותם צלחת עם סרט.
- גדר Cycler תרמית כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ° C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואחריו תקופת הארכה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות .
- טען את צלחת ה- PCR לאחר הבלוק הגיע 94 מעלות צלזיוס.
2. אימות של 96-היטב ארוך פריימר PCR
- עופרת 1% גדול (w / v) agarose ג'ל טריס Acetate EDTA (TAE) הפעלת המאגר במסרקות 4 x 28-גם לתת ג'ל עם 4 שורות של בארות. יישר שיניים חלופיות של המסרק בקצות טפטפו רב 12 ערוץ. בזהירות להטביע את ג'ל בטאי הפעלת המאגר לאחר נתיבים נטענים.
- סולם DNA 1 טען kb לתוך -1 ו -28 th היטב של כל שורה.
- בעזרת פיפטה רב ערוצי P20 12 ערוץ, להעביר 2 μl של dir המוצר PCRectly לכל נתיב של (איור 1 א) ג'ל. עשה זאת מהר כדי לצמצם את האפשרות של זיהום amplicons.
- טען את מוצרי ה- PCR משורה א 'של הצלחת ה- PCR לתוך נתיבי בעל מספר אי זוגי של השורה ה -1 של ג'ל (A1 - מסלול 3, A2 - מסלול 5 ...... A11 - ליין 23, A12 - ליין 25) ולטעון את מוצרי ה- PCR משורה ב 'של הצלחת ה- PCR לתוך נתיבי הזוגיים של שורה 1 st של הג'ל (B1 - מסלול 4, A2 - מסלול 6 ...... B11 - ליין 24, B12 - ליין 26).
- טען את מוצרי ה- PCR מן השורה C ו- D של הצלחת ה- PCR באמצעות אותו דפוס כפי שתואר לעיל, עם שורה C לתוך נתיבי האי-זוגיים ושורה D לתוך נתיבי הזוגיים. המשך דפוס טעינה זה עד היטב כל צלחת ה- PCR נטען על ג'ל. חיץ טעינת ה- DNA אינו נדרש לטעון ג'ל זה.
- מניחים את הג'ל לתוך הטנק ריצה למלא את המיכל עם TAE הפעלת המאגר עד ג'ל הוא שקוע. הפעל ב -100 V למשך 30 דקות ולאחרלדמיין באמצעות transilluminator UV. ראה איור 1B עבור ג'ל למשל.
הערה: מוצרי ה- PCR יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות לפני transfection
3. Transfection 96-היטב
- השתמש ט תא brucei טופס procyclic קו 10 SMOXP9 עבור הליך זה ולגדול התקשורת SDM-79 המכיל 10% 10 FCS.
- השתמש 1 x 10 7 תאים לכל transfection (סה"כ 1.1 x 10 9 תאים) בעת תיוג על הקצה האמין של החלבון ו -2 x 10 7 תאים לכל transfection (סה"כ 2.2 x 10 9 תאים) בעת תיוג על התחנה הסופית ג ' החלבון. לשמור על התאים ב-יומן באמצע (1.2 x 10 6 -1 x 10 7 תאים / מ"ל) במשך כמה ימים לפני transfection ו לקצור את התאים עבור transfection בצפיפות של 5-8 x 10 6 תאים / מ"ל.
- אפשר מוצרי ה- PCR קפוא עבור transfection להפשיר בטמפרטורת החדר.
- ספירת תאים באמצעות haemocytometer או נגד תא אוטומטי.
- גלולה נדרש מספר תאי צינורות 50 מ"ל מספר 800 XG במשך 10 דקות.
- לאחר צנטריפוגה להשליך supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ"ל cytomix שונה (0.8 מ"מ EGTA, 24 KCl מ"מ, 0.15 מ"מ CaCl 2, 10 מ"מ pH7.6 חיץ אשלגן פוספט, 25 מ"מ HEPES-KOH pH7.6, 2.6 מ"מ MgCl 2, 0.5% (w / v) גלוקוז, 100 מיקרוגרם / מ"ל BSA, 1 מ"מ hypoxanthine, 144 סוכרוז מ"מ) לכל צינור. להעביר את כל פתרונות לתא צינור יחיד ספין שוב ב 800 XG במשך 10 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, להשליך supernatant ו resuspend התאים 23 מ"ל של cytomix שונה ריכוז סופי של 5 x 10 7 תאים / מ"ל.
- בעוד התאים ספינינג, להוסיף 1 מ"ל של SDM-79 התקשורת היטב כל 4 x 24 גם צלחות בתרבית רקמה. לייבל צלחות לספירה ולהסיק טבעת סביב היטב A1 על כל צלחת בטוש לסייע להתמצאות צלחת.
- חבר את המטפל הצלחת אל electroporator. על electroporaיחידת טור להגדיר את המתח ל -1,500 V, אורך הפולס ל -100 μsec ומספר פולסים עד 12 ואת המרווח הדופק ל -500 מילי-שניות. על מטפל הצלחת, להגדיר את ספירת הדופק ל -1 זה מבטיח כי electroporator יחול דופק יחיד בין 12 העמודים של צלחת electroporation.
- בעזרת פיפטה רב ערוצי ערוץ 12 P200, להעביר את התגובות PCR מהצלחת PCR על צלחות electroporation הפנויה 96-היטב, 4 מ"מ הפער.
- כאשר התאים כבר הסתובב הם resuspended לריכוז סופי של 5 x 10 7 תאים / מ"ל (שלב 3.7), להעביר למאגר מגיב. פיפטה 200 μl של פתרון התא לתוך הבאר כל צלחת electroporation באמצעות פיפטה רב ערוץ 12 P200, לערבב עם מוצר ה- PCR על ידי pipetting.
- באמצעות רקמות להסיר כל טיפות מהחלק העליון של הצלחת להימנע-קצר.
- החל בסרט איטום מסופק באריזה צלחת לראש צלחת electroporation, positioning זה כדי להשאיר את החורים עבור אלקטרודות שנחשפו בחלק העליון והתחתון של כל עמודה. הימנע מכסה את הנקודות שהועלו נהג להנחות את הסרט.
- טען את צלחת electroporation לתוך מטפל הצלחת ולסגור את המכסה. 'דופק' לחץ על יחידת electroporator.
- לאחר electroporation, במהירות ולהעביר את התאים מצלחת electroporation 96-היטב צלחות תרבית 4 x 24 גם רקמה. כדי להעביר את התאים, להשתמש פיפטה רב ערוץ 12 P200 עם כל הטיפ השני חסר כאלה כי 6 טיפים הנותרים ליישר קו עם 6 שורות על צלחת בתרבית רקמה 24 גם. העברת תאי electroporated ב צלחות electroporations 96-היטב תבנית מוגדרת מראש על הצלחות בתרבית רקמת 24 גם (איור 2 א).
- הכן את הטיפים פיפטה P200 - לכל transfection 96-גם להכין 2 קופסאות של 96 טיפים עם כל עמודה אחרים יוסרו.
- בארות העברת A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 על צלחת electroporation 96-היטבצלחת שורת הצלחות תרבות 24 גם רקמות, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 לתוך שורה B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 לתוך שורה C ו- D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, בארות בצלחת 96-היטב ולאחר מכן נשטפים עם התקשורת מבארות מקביל 24- גם צלחת ואת לשטוף מועבר בחזרה אל בארות בצלחת 24 גם.
- בארות העברת E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 על צלחת electroporation 96-היטב 24 גם שורת צלחת B, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 לתוך שורה B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 לתוך שורה C ו- H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, מהבארות 96 צלחת "טוב הם מכן לשטוף עם תקשורת מבארת המקבילה צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועברה לאחר מכן חזרה אל הבארות בצלחת 24 גם.
- בארות העברת A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 על צלחת electroporation 96-היטב לשורה C צלחת 24 גם, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 לתוך שורה B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 לתוך שורה C ו- D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מן 96 צלחת "טוב לצלחת 24 באר, בארות בצלחת 96-היטב ולאחר מכן לשטוף עם התקשורת מבארות מקביל צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועבר לאחר מכן חזרה אל בארות בצלחת 24 גם.
- בארות העברת E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 על צלחת electroporation 96-היטב 24 גם שורת צלחת D, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 לתוך שורה B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 לתוך שורה C ו- H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, מהבארות 96 צלחת "טוב הם מכן לשטוף עם תקשורת מבארת המקבילה צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועברה לאחר מכן חזרה אל הבארות בצלחת 24 גם.
- באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך, לבחון 1 היטב מכל עמודה לבדוק את התאים. יהיו תערובת של תאים חיים ומתים עםכמות משמעותית של פסולת התא. ניתן להבחין בתאי חיים מן התאים מתים משום שהם יהיו בהירים תחת מיקרוסקופ לעומת השלב יתקדמו.
- מניח את 24 גם צלחות בקופסא נקיה, פלסטיק עם מכסה המהווה חותם חזק. להניח את התיבה C חממה 28 °.
- בין 6-8 שעות מאוחר יותר, להוסיף 1 מ"ל של SDM-79 עם 10% FCS המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית 2x היטב כל אחד. מניסיוננו, שורות תאים שבם הגנים מתויגים על הקצה האמין עמידות ריכוזים גבוהים יותר של תרופה סלקטיבית. לכן, באמצעות blasticidin כדוגמא, תיוג על הקצה האמין דורש ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin ותיוג על התחנה הסופית C דורש ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin.
הערה: שורות תאים מהונדסות תהפוכנה 9-10 ימים גלויים לאחר transfection. - מעבר לפחות פעמי תרופה טריה תקשורת לפני הניתוח. איור 2B מראה את התוצאות של transfe 96-היטב טיפוסיction לתיוג 96 חלבונים שונים על הקצה האמין. להעריך כל טוב על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לקבוע אם הוא מכיל תאים עמידים בריאים, סמים. באר בריא מכיל בעיקר (<95%) תאים פעילים מאוד כי הם בהירים במיקרוסקופ חוזה שלב. ניתוח לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או כתם המערבי נדרש לקבוע אם החלבון תויג בהצלחה.
Representative Results
בשנת transfection נציג זה, פריימרים תוכננו באמצעות סקריפט perl תגית 9 ו מסונתז מסחרית. 96-גם PCR בוצע ומאומת כמתואר (איור 1 א); בדוגמה זו, 95/96 PCRs היו מוצלחים (איור 1B). מניסיוננו, חוזר תגובות נכשלו גם עם פריימרים המקורי או פריימרים-מסונתז מחדש לא לגרום PCR מוצלח.
Amplicons הועבר לתוך צלחות electroporation 96-היטב עבור electroporation (איור 2 א) ולאחר מכן מועבר צלחות תרבות 24 גם להתאוששות ובחירה. אחרי מספיק זמן כדי לאפשר את הבחירה להתרחש, הבארות דורגו להישרדות לפני ניתוח נוסף. בדוגמה זו, 88/96 בארות (92%) היו חיוביות לאחר בחירת 15 ימים.
איור 2: 96-היטב electroporation ובחירה (א) תבנית להעברת תאי electroporated מ -96 היטב plat electroporation.דואר צלחות בתרבית רקמה 24 גם. (ב) סכימטי מראה ניקוד חי / מת בדרך כלל אחרי 15 ימים של בחירת 24 גם צלחות. הירוק מייצג transfection מוצלח, אפור מייצג היטב עם תאים מתים בלבד. בדוגמא זו, 88/96 (92%) של בארות כלולות טפילי transfected בהצלחה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
שיפור דרמטי את הרגישות של חקר החלבונים ושיטות transcriptomics ב 5-10 השנים האחרונות סיפקה נתונים חשובים על אלפי גנים ומוצריהם. עם זאת, את הכלים כדי להתמודד עם תפקודם של חלבונים אלה לא עמדו בקצב.
תיוג חלבון הופך לפשוט ניסויים רבים כדי לקבוע את תפקידו. לדוגמא, חלבון יכול להיות התמזג חלבון פלואורסצנטי במגוון צבעים שונים כדי להקל על מחקרי לוקליזציה שיתוף לוקליזציה. תגיות שפותחו עבור במיקרוסקופ אלקטרונים, כגון APEX2 או miniSOG 11,12, לאפשר לוקליזציה ultrastructural של החלבון המתויג. תגיות עבור ביוכימיה, כגון תג TAP, ו ProtC-TEV-ProtA (PTP) לתייג 7,13 לאפשר טיהור של מתחמים הקשורים החלבון לזיהוי שותפים מחייבים או מבחני ביוכימיים במבחנה.
הצעדים הספציפיים הם קריטיים להצלחת protocol הוא: השילוב של DMSO לתערובת 1 מאסטר PCR, מקפיא של מיקס מאסטר PCR 1 לפני התוספת של מיקס מאסטר 2, השימוש פולימראז המסחרי מיקס מאסטר 2 ואת השינוי של חיץ electroporation cytomix. מניסיוננו, יש צורך להשתמש כפול ממספר תאים עבור transfections תיוג מסוף C ובאשר transfections תיוג מסוף N על מנת להשיג שיעור דומה של בארות חיוביות. לכן, כל הצעדים צריכים להתבצע כפי שתוארו.
טכניקה זו עשויה היחידה להצליח כאשר transfecting trypanosome טופס procyclic חרקים. יש צורות דם יעילה transfection נמוך 14, יתר על כן הם צפויים למות במהלך בחירה בשל רעילויות צפיפות תלויה כי אינה קשורה לתרופה סלקטיבית. לכן, הפרוטוקול הקודם שלנו מייצג את הטכנולוגיה הטובה ביותר הנוכחית עבור תיוג של trypanosomes טופס דם 9. כמו כן סביר להניח כי טרנסיעילות fection תשתנה תלוי לבודד trypanosome הספציפי. פרוטוקול זה היה מותאם באמצעות 927 SMOX צורות procyclic - זנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. צעדים שעשויים להגביר את סיכויי הצלחת כוללים: הגדלת הסכום של amplicon PCR, הגדלת מספר התאים הכלולים transfection.
אנו מציגים שיטה שבה מאה חלבונים יכולים להיות מתויגות במקביל. זה יקל מחקרים בקנה מידה גדול על לוקליזציה ואינטראקציה, המשלימה מערכי נתונים גדולים קיימים ומתן מידע שלא יסולא בפז לקהילה. תבניות פריימר יימסרו לכל מבקש ורשימת תבניות פלסמידים זמין מ: http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
- Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
- Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
- Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
- Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
- Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
- Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
- Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197 (2015).
- Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037 (2012).
- Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
- Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
- Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).
