Introduction
Trypanosoma brucei är en protozo parasit som orsakar mänskligt afrikansk trypanosomasis och nagana hos nötkreatur. T. brucei är en idealisk organism för analys av proteinfunktion på grund av kombinationen av en hög kvalitet genom, talrika proteomik och transkriptomik datauppsättningar och väl utvecklade molekylära verktyg 1-3. Framsteg inom proteomik och sekvensering har resulterat i stora datamängder som framhäver potentiellt intressanta gener 4-6; Men många gener har minimal information i samband med dem i befintliga databaser. Det finns därför ett behov av en hög genomströmning metod för att underlätta protein funktionell karakterisering.
Uttryck av ett märkt protein kan ge en mångfald av insikter i ett proteins funktion. Till exempel kan ett protein märkt med ett fluorescerande protein eller epitop lokaliseras genom fluorescensmikroskopi, som ger information om var protein kan utöva sin biologiska verkan. Alternativt kan ett protein märkt med en TAP 7, HaloTag 8 eller His tag kan renas för biokemiska analyser och identifiering av dess interaktion partners.
Vi utvecklade nyligen en robust märkning metod för T. brucei 9. Detta används lång primer PCR för att generera DNA för transfektion och tillät märkning av dussintals proteiner parallellt - en stor förbättring av befintliga protokoll. Vi har nu förbättrat skalbarhet av detta protokoll i procyclic former av en storleksordning. Här presenterar vi vår metod där vi utföra PCR och transfektion in i 96-brunnsplattor, med återhämtningen och urval som uppträder i 24-brunnsplattor. Som hundratals proteiner kan nu märkas parallellt denna metod ger en kostnadseffektiv och genomförbar metod för att märka hela trypanosom genomet.
Protocol
1. 96 brunnar Long Primer PCR
- Pre-freeze 96 brunnar PCR svalare på -80 ° C frys.
- I ett 10 ml rör, förbereda Master Mix A: 2100 ^ il DDH 2 O, 105 | il PCR-kvalitet DMSO, 105 ^ il 10 mM dNTP, 105 pl pPot mall (25 ng / | il) 9, för en total volym av 2415 | il per platta .
- Alikvotera 23 ul i varje brunn på en 96-håls PCR-platta.
- Tillsätt 2 pl 100 iM poolade primers till varje laddad brunn med en P20 12 kanal multikanalpipett. Täta med film, placera plattan på pre-kyld PCR kylare och låt frysa i minst 20 minuter vid -80 ° C.
- I ett 10 ml rör, förbereda Master Mix B: 2048 | il DDH 2 O, 525 | j, l 10 x buffert, 52,5 ul polymeras för en total volym av 2626 | il per platta.
- Ta bort plattan och PCR kylare från -80 ° C frys.
- Med plattan fortfarande på PCR kylaren, tillsätt 25 | il Master Mix B på toppen av frösn Huvudblandning A för en total reaktionsvolym av 50 | il. Detta är tidskritisk, och bör vara avslutad före Mix A kan tina. Försegla plattan med film.
- Inställd anordning för cyklisk värmebehandling enligt följande: 94 ° C under 10 min, därefter 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 65 ° C under 30 sek, 72 ° C under 2 min följt av en slutlig förlängningsperiod på 72 ° C under 7 min .
- Ladda PCR-plattan efter blocket har nått 94 ° C.
2. Validering av 96 brunnar Long Primer PCR
- Kasta en stor 1% (vikt / volym) agarosgel i Tris-acetat EDTA (TAE) körningsbuffert med 4 x 28-brunnars kammar för att ge en gel med 4 rader av brunnar. Rikta alternativa tänderna på kammen med spetsarna på en 12 kanals multikanalpipett. Noggrant dränka gelen i TAE löpande buffert efter banorna laddas.
- Belastning 1 kb DNA-stege i 1: a och 28: e väl i varje rad.
- Med hjälp av en P20 12 kanal flerkanalig pipett 2 pl PCR-produkt dirrekt till varje bana av gelén (Figur 1A). Göra detta snabbt för att minska risken för kontaminering av amplikoner.
- Ladda PCR-produkterna från rad A i PCR-plattan i de udda numrerade gränderna i den 1: a raden av gelen (A1 - bana 3, A2 - lane 5 ...... A11 - bana 23, A12 - spår 25) och ladda PCR-produkter från rad B i PCR-plattan i jämna gränderna i 1: a raden av gelén (B1 - spår 4, A2 - spår 6 ...... B11 - bana 24, B12 - spår 26).
- Ladda de PCR-produkterna från rad C och D i PCR-plattan med användning av samma mönster som beskrivits ovan, med rad C in i den udda numrerade körfält och rad D i de jämnt numrerade körfält. Fortsätt denna lastningsmönster tills varje brunn i PCR-plattan laddas på gelén. DNA buffert behöver inte läsa denna gel.
- Placera gelen i bränsletanken och fylla tanken med TAE löpande buffert tills gelén är nedsänkt. Kördes vid 100 V under 30 min ochvisualisera med hjälp av en UV-transilluminator. Se figur 1B för ett exempel gel.
Notera: PCR-produkter kan förvaras vid -20 ° C under flera veckor före transfektion
3. 96-väl transfektion
- Använd T. brucei procyclic formen cellinje SMOXP9 10 för detta förfarande och växa i SDM-79-medium innehållande 10% FCS 10.
- Använd 1 x 10 7 celler per transfektion (totalt 1,1 x 10 9 celler) när taggning på N-terminalen av proteinet och 2 x 10 7 celler per transfektion (totalt 2,2 x 10 9 celler) när taggning på C-terminalen i proteinet. Upprätthålla cellerna i mitten av log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 celler / ml) i flera dagar före transfektion och skörda cellerna för transfektion med en täthet av 5-8 x 10 6 celler / ml.
- Tillåt frysta PCR-produkter för transfektion att tina vid rumstemperatur.
- Räkna celler med användning av en haemocytometer eller automatisk cellräknare.
- Pellet erforderliga antalet celler i flera 50 ml rör vid 800 xg under 10 min.
- Efter centrifugering kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml modifierad cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM kaliumfosfatbuffert pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl2, 0,5% (vikt / volym) glukos, 100 | ig / ml BSA, 1 mM hypoxantin, 144 mM sackaros) per rör. Överföra alla celllösningar till ett enda rör och snurra igen vid 800 x g under 10 min.
- Efter centrifugering, kasta supernatanten och resuspendera cellerna i 23 ml modifierat cytomix för en slutlig koncentration av 5 x 10 7 celler / ml.
- Medan celler snurrar, tillsätt 1 ml SDM-79 media till varje brunn i 4 x 24-brunnars vävnadsodlingsplattor. Märk plattorna AD och rita en ring runt väl A1 på varje platta i permanent markör för att hjälpa platta orientering.
- Anslut plattan hanterare till elektroporator. På electroporator enheten inställd spänningen till 1500 V, pulslängden till 100 ^ sek och antalet pulser till 12 och pulsintervallet till 500 msek. På plattan hanteraren, ställa in pulstalet till 1. Detta säkerställer att den elektroporator kommer att tillämpa en enda puls till var och en av de 12 kolumnerna av elektroporation plattan.
- Med hjälp av en P200 12 kanal multikanalpipett, överföra PCR-reaktioner från PCR-plattan till 96 brunnar engångs elektroporering plattor, 4 mm spalt.
- När cellerna har spunnits och återsuspenderas till den slutliga koncentrationen av 5 x 10 7 celler / ml (steg 3,7), överför till en reagensbehållare. Pipettera 200 ul av cellen lösningen i varje brunn av elektroporation plattan med hjälp av en P200 12 kanal multikanalpipett, blanda med PCR-produkten genom pipettering.
- Med användning av vävnad avlägsna eventuella droppar från toppen av plattan för att undvika kortslutningar.
- Tillämpa den tätande filmen anordnad i plattan förpackningar till toppen av elektroporation plattan, positioning det för att lämna hålen för elektrod avslöjats vid toppen och botten av varje kolonn. Undvik att täcka de upphöjda punkter som används för att styra filmen.
- Ladda elektroporering plattan i platt handler och stäng locket. Tryck på 'Pulse "på elektroporator enheten.
- Efter elektroporering, snabbt överföra celler från 96-brunnars elektroporation plattan till 4 x 24-brunnars vävnadskulturplattor. Att överföra celler, använder en P200 12 kanal flerkanalspipett med varannan spets saknas så att de återstående 6 tips radas upp med 6 rader på en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. Överför electroporated celler i 96-brunns electroporations plattor i fördefinierade mönster till 24-brunnars vävnadsodlingsplattor (Figur 2A).
- Förbered P200 pipettspetsar - För varje 96-brunn transfektion förbereda 2 lådor med 96 tips med varannan kolumn bort.
- Överför brunnar A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 på 96 brunnar elektroporering platta tillplatta En rad A i 24-brunnsvävnadsodlingsplattor, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 i rad B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 i rad C och D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 i rad D. Efter överföring av varje uppsättning av 6 brunnar från 96-brunnar till 24-brunnar, brunnarna i 96-brunnar tvättades sedan med media från motsvarande brunnar i 24- brunnars platta och tvättvätskan överförs sedan tillbaka till brunnarna i 24-brunnar.
- Överför brunnar E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 på 96 brunnar elektroporering plattan till 24-brunnar B rad A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 i rad B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 i rad C och H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 i rad D. Efter överföring av varje uppsättning av 6 brunnar från 96-brunnar till 24-brunnar, brunnarna i 96 -Jo plattan tvättas sedan med media från motsvarande brunnar i 24-brunnar och tvättvätskan överförs sedan tillbaka till brunnarna i 24-brunnar.
- Överför brunnar A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 på 96 brunnar elektroporering platta till 24-brunnar C rad A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 i rad B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 i rad C och D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 i rad D. Efter överföring av varje uppsättning av 6 brunnar från 96 -Jo plattan till 24-brunnar, brunnarna i 96-brunnar tvättades sedan med media från motsvarande brunnar i 24-brunnar och tvättvätskan överförs sedan tillbaka till brunnarna i 24-brunnar.
- Överföringsbrunnar E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 på 96-brunnars elektroporation plattan till 24-brunnar D rad A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 i rad B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 i rad C och H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 i rad D. Efter överföring av varje uppsättning av 6 brunnar från 96-brunnar till 24-brunnar, brunnarna i 96 -Jo plattan tvättas sedan med media från motsvarande brunnar i 24-brunnar och tvättvätskan överförs sedan tillbaka till brunnarna i 24-brunnar.
- Med ett inverterat faskontrastmikroskop undersöka ett väl från varje kolumn för att kontrollera cellerna. Det kommer att vara en blandning av levande och döda celler med enväsentlig mängd av cellrester. Levande celler kan skiljas från döda celler, eftersom de kommer att vara ljus i faskontrastmikroskopi och kommer att flytta.
- Placera de 24-brunnsplattor i en ren, plastlåda med ett lock som bildar en tät försegling. Placera lådan i en 28 ° C inkubator.
- Mellan 6-8 timmar senare, tillsätt 1 ml SDM-79 med 10% FCS innehållande 2x selektiv antibiotikum till varje brunn. Enligt vår erfarenhet, cellinjer där generna är taggade på N-terminalen är resistenta mot högre koncentrationer av selektiva läkemedel. Därför, med hjälp blasticidin som ett exempel, märkning på N-terminalen kräver en slutlig koncentration av 20 | ig / ml blasticidin och märka på C-terminalen kräver en slutlig koncentration av 10 | ig / ml blasticidin.
Notera: Transgena cellinjer kommer att bli synliga 9-10 dagar efter transfektion. - Passage åtminstone två gånger i färskt läkemedel och media före analys. Figur 2B visar resultaten från en typisk 96 brunnar överfInsatser för att märka 96 olika proteiner på N-terminalen. Utvärdera varje brunn genom faskontrastmikroskopi för att avgöra om det innehåller friska, läkemedelsresistenta celler. En hälsosam brunn innehåller övervägande (<95%) högaktiva celler som är ljusa i fas kontrakt mikroskopi. Efterföljande analys av epifluorescensmikroskopi eller western blot krävs för att avgöra om proteinet har framgångsrikt taggade.
Representative Results
I detta representativa transfektion primrarna utformas genom Märken perl script 9 och syntetiseras kommersiellt. Den 96-brunnars PCR utfördes och validerats såsom beskrivits (figur 1 A); i detta exempel, 95/96 PCR var framgångsrika (Figur 1B). I vår erfarenhet, att upprepa misslyckade reaktioner antingen med de ursprungliga primers eller åter syntetiserade primers inte leder till en framgångsrik PCR.
De amplikoner överfördes till 96-brunnars elektroporation plattor för elektroporering (Figur 2A) och överfördes sedan till 24-brunnars odlingsplattor för återvinning och urval. Efter tillräcklig tid för att tillåta val att inträffa, brunnarna scored för överlevnad före ytterligare analys. I detta exempel, 88/96 brunnar (92%) var positiva efter 15 dagar urval.
Figur 1: Validering av långa primer PCR (A) Mönster för överföring av PCR-produkter från 96 brunnar PCR plattan agarosgelen för validering av PCR.. (B) Ett representativt 96-brunnars PCR-validering gel för att märka 95 gener på N-terminalen, och ett amplikon som inte innehåller något 5 'targeting homologi för att verka som en negativ kontroll i transfektion. Proverna laddades på en 1% (vikt / volym) agarosgel och lösas på 100 V under 30 minuter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: 96-väl elektroporering och val (A) Mönster för överföring av electroporated celler från 96 brunnar elektroporering plat.e till 24-brunnars vävnadskulturplattor. (B) En schematisk visar en typisk Live / Dead scoring efter 15 dagars val i 24-brunnsplattor. Grönt representerar en framgångsrik transfektion, grå representerar en brunn med bara döda celler. I det här exemplet, 88/96 (92%) av brunnar innehöll framgångsrikt transfekterade parasiter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Dramatiska förbättringar i känslighet proteomik och transkriptomik metoder under de senaste 5-10 åren har gett värdefulla data på tusentals gener och deras produkter. Men de verktyg itu med funktionen av dessa proteiner har inte hållit jämna steg.
Märka ett protein underlättar många experiment för att bestämma dess funktion. Till exempel kan ett protein fuseras till ett fluorescerande protein i en mängd olika färger för att underlätta lokalisering och co-lokaliseringsstudier. Taggar utvecklad för elektronmikroskopi, såsom APEX2 eller miniSOG 11,12, tillåter ultrastrukturell lokalisering av det märkta proteinet. Taggar för biokemi, såsom TAP-taggen och ProtC-TEV-ProtA (PTP) märka 7,13 medge rening av komplex associerade med proteinet för identifiering av bindningspartners eller in vitro biokemiska analyser.
De specifika stegen som är avgörande för framgången för protocol är: införlivandet av DMSO i PCR Master Mix 1, frysning av PCR Master Mix en före tillsatsen av Master Mix 2, användning av kommersiella polymeras i Master Mix 2 och modifiering av cytomix elektroporering buffert. I vår erfarenhet, är det nödvändigt att använda dubbelt så många celler för C terminal tagg transfektioner som för N terminal tagg transfektioner i syfte att uppnå en lika stor andel av positiva brunnar. Därför bör alla steg utföras som beskrivits.
Denna teknik är endast sannolikt att bli framgångsrika när transfektion insekten procyclic formen trypanosom. Blodomloppet former har en lägre transfektionseffektivitet 14 dessutom de sannolikt kommer att dö under val på grund av densitetsberoende toxicitet som inte har samband med den selektiva drogen. Därför representerar vår tidigare protokoll dagens bästa teknik för att märka av blodomloppet bildar trypanosomer 9. Det är också troligt att transfection effektivitet varierar beroende på den specifika trypanosom isolat. Detta protokoll har optimerats med hjälp av 927 SMOX procyclic former - andra stammar kan kräva ytterligare optimering. Åtgärder som kan öka sannolikheten för framgång är: att öka mängden PCR-amplikon, vilket ökar antalet celler som ingår i transfektion.
Vi presenterar en metod där hundratals proteiner kan märkas parallellt. Detta kommer att underlätta storskaliga studier om lokalisering och interaktion, som kompletterar befintliga stora datamängder och ge ovärderlig information till samhället. Primer mallar finns tillgängliga på begäran och en förteckning över plasmider mallar är tillgänglig från: http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
- Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
- Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
- Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
- Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
- Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
- Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
- Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197 (2015).
- Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037 (2012).
- Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
- Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
- Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).
