الإنتاجية العالية جين توصيف في<em> المثقبية البروسية</em
Summary
Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Abstract
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Introduction
المثقبية البروسية هو طفيلي المسبب trypanosomasis افريقيا البشرية وناغانا في الماشية. ت. البروسية هو كائن حي مثالية لتحليل وظيفة البروتين بسبب مزيج من العوامل الوراثية ذات جودة عالية، والعديد من البروتينات ومجموعات البيانات transcriptomics والأدوات الجزيئية متطورة 1-3. وقد أدى التقدم في البروتينات والتسلسل في مجموعات كبيرة من البيانات التي تبرز يحتمل أن تكون جينات مثيرة للاهتمام 4-6. ومع ذلك، فإن العديد من الجينات لديهم الحد الأدنى من المعلومات المرتبطة بها في قواعد البيانات الموجودة. ولذلك هناك حاجة إلى طريقة الإنتاجية العالية للمساعدة توصيف وظيفي البروتين.
التعبير عن بروتين الموسومة يمكن أن تعطي تعدد الرؤى إلى وظيفة البروتين و. على سبيل المثال، وهو بروتين الموسومة ب بروتين فلوري أو حاتمة يمكن أن تكون مترجمة بواسطة المجهر مضان، الذي يعطي معلومات عن مكان وجود بروتعين يمكن ممارسة التأثير البيولوجي. بدلا من ذلك، وهو بروتين ذات الكلمات الدلالية مع TAP 7، 8 HaloTag أو علامة يمكن ان يكون له تنقيته لفحوصات الكيمياء الحيوية وتحديد الشركاء تفاعلها.
وضعنا مؤخرا منهجية وضع علامات قوية لT. البروسية 9. تستخدم هذه التمهيدي طويلة PCR لتوليد الحمض النووي لترنسفكأيشن ويسمح وضع علامات على العشرات من البروتينات في موازاة – تحسنا كبيرا على البروتوكولات الحالية. ونحن قد تحسنت الآن قابلية هذا البروتوكول في أشكال procyclic بأمر من حجمها. هنا، نقدم طريقة لدينا حيث أننا أداء PCR وترنسفكأيشن في لوحات 96-جيدا، مع انتعاش واختيار تحدث في 24 لوحات جيدا. كما يمكن الآن الموسومة مئات من البروتينات بشكل متواز وهذه الطريقة توفر وسيلة فعالة من حيث التكلفة وقابلا للعلامات الجينوم المثقية بأكمله.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وفرت تحسينات كبيرة في حساسية البروتينات وطرق transcriptomics في 5-10 سنوات الماضية بيانات قيمة عن الآلاف من الجينات ومنتجاتها. ومع ذلك، فإن أدوات للتصدي لها وظيفة هذه البروتينات لا تواكب.
وضع علامات على بروتين يسهل العديد من التجارب لتحديد وظيفتها. على سبيل المثال، وهو بروتين يمكن أن تنصهر لبروتين فلوري في مجموعة متنوعة من الألوان المختلفة لتسهيل توطين وشارك في توطين الدراسات. الكلمات وضعت لالمجهر الإلكتروني، مثل APEX2 أو miniSOG 11،12، تسمح توطين التركيبية للبروتين الكلمات الدلالية. الكلمات الدلالية لالكيمياء الحيوية، مثل علامة TAP، وProtC-TEV-ProtA (PTP) علامة 7،13 تسمح تنقية المجمعات المرتبطة البروتين لتحديد الشركاء ملزمة أو في فحوصات البيوكيميائية في المختبر.
الخطوات المحددة التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح protocرأ هي: إدماج DMSO في مزيج PCR ماستر 1، تجميد PCR ميكس ماجستير 1 قبل إضافة ميكس ماستر 2، واستخدام البلمرة التجاري في ميكس ماجستير 2 وتعديل المخزن المؤقت cytomix Electroporation لل. في تجربتنا، فمن الضروري استخدام ضعف عدد الخلايا للC تعداء محطة العلامات بالنسبة للN تعداء محطة العلامات من أجل تحقيق نسبة مماثلة من الآبار إيجابية. لذلك، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات كما هو موضح.
ومن المرجح فقط أن تكون ناجحة عندما transfecting والحشرات procyclic شكل المثقية هذه التقنية. أشكال مجرى الدم لديهم أقل كفاءة ترنسفكأيشن 14، وعلاوة على ذلك فهي عرضة للوفاة خلال اختيار نظرا لسمية التي تعتمد على كثافة أن لا علاقة للدواء انتقائية. وبالتالي، يمثل بروتوكول لدينا السابق أفضل التقنيات الحالية لوضع علامات على شكل المثقبيات مجرى الدم 9. ومن المرجح أيضا أن العابرةوكفاءة الخمج (العدوى) تختلف يعتمد على عزل المثقية محددة. وكان محسن هذا البروتوكول باستخدام 927 SMOX أشكال procyclic – سلالات أخرى قد تتطلب التحسين إضافية. التدابير التي قد تزيد من احتمال النجاح وتشمل: زيادة كمية PCR amplicon، وزيادة عدد الخلايا المدرجة في ترنسفكأيشن.
ونحن نقدم وسيلة حيث مئات من البروتينات يمكن الموسومة بشكل متواز. وهذا سيسهل دراسات واسعة النطاق على توطين والتفاعل، واستكمال قواعد البيانات الكبيرة القائمة وتوفير معلومات لا تقدر بثمن للمجتمع. هي قوالب التمهيدي متوفرة عند الطلب وقائمة قوالب البلازميدات هو متاح من: http://www.sdeanresearch.com/
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Materials
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
- Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
- Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
- Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).
- Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
- Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
- Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
- Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197 (2015).
- Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037 (2012).
- Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
- Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
- Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).
