Introduction
트리파노소마 (Trypanosoma) brucei는 가축에서 인간의 아프리카 trypanosomasis 및 nagana을 일으키는 원생 동물 기생충이다. T. brucei 인해 고품질 게놈 수많은 프로테오믹스 및 transcriptomics 데이터 세트와 잘 개발 툴 1-3 분자의 결합으로 단백질 기능 분석을위한 이상적인 유기체이다. 단백질 체학 및 시퀀싱의 발전은 잠재적으로 흥미있는 유전자 4-6 강조 대규모 데이터 세트 이어질; 그러나, 많은 유전자는 기존의 데이터베이스와 연관된 최소한의 정보를 가지고있다. 단백질의 기능적 특성을 돕기 위해 고 처리량 방법이 요구된다.
태그가 단백질의 발현은 단백질의 기능에 대한 통찰력의 다양성을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 단백질 또는 에피토프 태그 단백질은 PROT에 대한 정보를 제공 형광 현미경에 의해 국부적 수EIN은 생물학적 효과를 발휘 될 수 있습니다. 대안 적으로, TAP 7 태그 단백질은 HaloTag 8 또는 그의 태그 생화학 분석법과의 상호 작용 파트너의 식별을 위해 정제 될 수있다.
우리는 최근 T.에 대한 강력한 태그 방법론을 개발 brucei 9. 이 형질의 DNA를 생성하기 위해 긴 프라이머 PCR을 사용하여 병렬 단백질의 수십개의 태그 허용 - 기존 프로토콜에 대한 주요 개선. 우리는 지금 크기의 순서에 의해 procyclic 형태의이 프로토콜의 확장 성을 개선했다. 여기서, 우리는 24 웰 플레이트에서 발생 회수 및 선택과 함께 96 웰 플레이트에 PCR 및 형질 전환을 수행하는 우리의 방법을 제시한다. 단백질 수백 이제 병렬로 태그 될 수있는 바와 같이,이 방법은 전체 게놈 트리파노소마 태그를위한 비용 효율적이고 실현 가능한 방법을 제공한다.
Protocol
1. 96 웰 긴 뇌관 PCR
- -80 ° C의 냉동고에서 사전 동결 96 웰 PCR 쿨러.
- 10 ML 튜브에서, 마스터 섞어 준비 : 2,100 μL의 DDH 2 O, 105 ㎕의 PCR 학년 DMSO, 접시 당 2,415 μL의 총 부피 105 μL 10 밀리미터의 dNTPs, 105 ㎕의 pPOT 템플릿 (25 NG / μL) 9 .
- 분취 량을 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 23 μL.
- 각각 P20 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 잘로드에 프라이머를 풀링 100 μM의 2 μl를 추가합니다. 사전 냉장 PCR 쿨러에 필름, 장소 플레이트 인감 및 -80 ° C에서 20 분의 최소 고정 할 수 있습니다.
- 10 ML 튜브에서, 마스터 믹스 B를 준비 : 2,048 μL의 DDH 2 O, 525 ㎕의 10 배 버퍼, 접시 당 2,626 μL의 총 볼륨의 52.5 μl를 중합 효소.
- -80 ° C 냉장고에서 플레이트와 PCR 쿨러를 제거합니다.
- PCR을 쿨러에 여전히 판으로, 동결의 상단에 25 μl의 마스터 믹스 B를 추가N 마스터 믹스 50 μL의 총 반응 볼륨. 이 시간이 중요하고, 혼합 A는 해동하기 전에 완료해야합니다. 필름 플레이트를 밀봉합니다.
- 다음과 같이 열 자전거 타는 사람을 설정 10 분 동안 94 ° C를, 다음 7 분 72 ° C의 최종 연장 기간 다음 2 분 15 초, 30 초 동안 65 ° C, 72 ° C 94 ° C의 30주기 .
- 블록이 94 °의 C에 도달 한 후 PCR 플레이트를 넣습니다.
96 웰 긴 뇌관 PCR 2. 검증
- 큰 1 % 캐스트 트리스 아세테이트 EDTA (TAE)에서 아가로 오스 겔 (/ V 승) 4 × 28 웰 빗으로 버퍼를 실행하는 우물의 4 행으로 겔을 제공 할 수 있습니다. 12 채널 멀티 채널 피펫의 팁 빗의 대체 치아를 맞 춥니 다. 차선가로드 된 후 조심스럽게 버퍼를 실행 TAE에서 젤 잠수함.
- 1 차 및 28 일도의 각 행에로드 1킬로바이트의 DNA 사다리.
- P20 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여, PCR 생성물의 DIR 2 μL를 전송할ectly 겔 (그림 1A)의 각 레인에. 앰플 리콘 오염의 가능성을 줄이기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다.
- (- 레인 3, A2 - 레인 5 ...... A11 - 레인 (23), A12 - 레인 (25) A1) 및 PCR 제품을로드 겔의 첫 번째 행의 홀수 차선으로 PCR 플레이트의 행 A로부터 PCR 제품을로드 겔의 1 차 행의 짝수 레인에 PCR 플레이트의 행 B에서 (B1 - 레인 4, A2 - 레인 6 ...... B11 - 레인 24, B12 - 레인 (26)).
- 짝수 번째의 차선에 차선 행 D 홀수 행으로 C와, 상술 한 바와 같은 패턴을 사용하여 PCR 플레이트의 로우 C 및 D에서 PCR 제품로드. PCR을 플레이트의 각 웰 겔 상에 로딩 될 때까지 로딩 패턴을 계속한다. DNA 로딩 버퍼는이 겔을로드 할 필요가 없습니다.
- 실행중인 탱크에 젤을 놓고 겔 침수 될 때까지 버퍼를 실행 TAE와 탱크를 채우십시오. 30 분 동안 100 V에서 실행하고UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 시각화. 예를 들어 겔 그림 1B를 참조하십시오.
주 : PCR 제품 몇 주 전에 형질 감염을 위해 -20 ℃에서 저장 될 수있다
3. 96 - 웰 형질
- T.를 사용하여 brucei procyclic 형태 세포주이 절차 SMOXP9 10 FCS 10 10 % 함유 SDM-79 미디어에서 성장.
- 형질 당 1 × 10 7 세포를 사용 (1.1 × 109 세포의 총) N 개의 단백질의 말단 및 형질 당 2 × 10 7 세포에 태그 (2.2 × 109 세포의 합계)의 C 말단에 태그 단백질. 형질 감염 전에 몇 일 동안 중앙 로그 (1.2 × 10 6 -1 × 10 7 세포 / ㎖)의 세포를 유지하고, 5-8 × 106 세포 / ml의 밀도로 형질 감염을 위해 세포를 수확.
- 형질 전환을위한 냉동 PCR 제품은 실온에서 해동하도록 허용합니다.
- 헴를 사용하여 세포를 계산ocytometer 또는 자동 세포 계수기.
- 10 분 동안 800 XG에 여러 50 ml의 튜브에 세포 펠렛 필요한 수.
- 원심 폐기 상등액 후 10 ㎖의 세포를 재현 탁 변성 cytomix (0.8 mM의 EGTA, 24 mM의 KCl을 0.15 mM의 CaCl2를 10 mM의 인산 칼륨 완충액 pH7.6, 25 mM의 HEPES-KOH pH7.6, 2.6 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 % (W / V) 포도당, 튜브 당 100 μg의 / ㎖ BSA, 1 ㎜의 하이포크 산틴, 144 MM의 자당). 하나의 관에 대한 모든 셀 솔루션을 전송하고 10 분 동안 800 × g으로 다시 스핀.
- 원심 분리 후, 상등액을 버리고 5 × 107 세포 / ㎖의 최종 농도를 위해 수정 cytomix 23 ㎖ 중의 세포를 재현 탁.
- 세포가 회전하는 동안, 4 × 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 SDM-79 미디어 1 ㎖를 추가한다. 판의 AD 레이블 및 플레이트 방향을 돕기 위해 영구 마커의 각 접시에 주위에 잘 A1을 반지를 그립니다.
- electroporator에 판 핸들러를 연결합니다. electropora에토 부 1500 V의 전압을 100 마이크로 초까지의 펄스 길이와 12의 펄스 수 500 밀리의 펄스 간격을 설정한다. 판 핸들러에서이 그 electroporator가 전기 판의 12 열 각각에 단일 펄스를 적용 할 것을 보장 1에 펄스 수를 설정합니다.
- P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트의 일회용 전기, 4mm 간격으로 PCR 플레이트에서 PCR 반응을 옮긴다.
- 세포가 스펀 및 5 × 107 세포 / ㎖ (단계 3.7)의 최종 농도로 재현 탁 될 때, 시약 저장 용기에 옮긴다. 피펫 P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여 전기 천공 플레이트의 각 웰에 세포 용액 200 μL를, 피펫 팅하여 PCR 생성물과 함께 혼합한다.
- 조직을 사용하여 단락을 방지하기 위해 판의 상부에서 모든 액 적을 제거한다.
- 일렉트로 플레이트, POS의 상단 플레이트 패키지에 제공되는 밀봉 막 적용이를 itioning 각 기둥의 상단과 하단에 드러난 전극 용 구멍 남도록. 필름을 가이드하는 데 상승 점을 덮는 피.
- 판 핸들러에 전기 플레이트를 넣고 뚜껑을 닫습니다. electroporator 유닛을 눌러 '펄스'.
- 전기 천공 후, 신속하게 4 × 24 웰 조직 배양 플레이트의 96 웰 플레이트에서 전기 천공 된 세포를 옮긴다. 셀을 전송하려면, 다른 모든 팁 누락으로 P200 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하는 등 나머지 6 팁 24 잘 조직 배양 접시에 6 행으로 줄 것이다. 24 웰 조직 배양 플레이트 (도 2A)에 미리 정의 된 패턴으로 96- 웰 플레이트에서 electroporations 일렉트릭 세포 이동.
- P200 피펫 팁을 준비 - 각 96 웰의 형질을 제거 다른 모든 컬럼 (96) 팁이 상자를 준비합니다.
- 96 웰 전기 판에 전송 우물 A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11에행 B로 24 웰 조직 배양 플레이트의 행 A, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11를 접시, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 행 C로 및 D1 / D3 / D5 / D7 24 웰 플레이트의 96 웰 플레이트를 6 웰의 각 세트의 전송 후에 행 D.로 / D9는 / D11, 96 웰 플레이트의 웰을 다음 24에 해당하는 웰로부터 매체로 세척 웰 플레이트 및 세척 후, 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다.
- 행 B에 E1은 / E3가 / E5는 / E7이 / E9 / E11 96 - 웰 전기 판에 24 웰 플레이트 B 행 (A)에, F1은 / F3는 / F5는 / F7은 / F9가 / F11 전송 우물, G1 / G3 / G5 / 96에서 행 C와 H1 / H3는 / H5 / H7은 / H9 24 웰 플레이트에 96 웰 플레이트 6 우물의 각 세트의 전송 후 행 D.에 / H11, 우물에 G7은 / G9 / G11 웰로 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다.
- 24 웰 플레이트 C 행 A, B2 / B4 / B6 / B에 96 웰 전기 판에 전송 우물 A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12 행 B에, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 행 C와 96에서 6 우물의 각 세트의 전송 후 행 D.에 D2가 / D4는 / D6는 / D8은 / D10 / D12에 24 웰 플레이트 웰로는 96- 웰 플레이트의 웰을 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다.
- 전송 우물 E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24 웰 플레이트 D 행 (A)에 96 - 웰 전기 판에, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / 행 B에 F12, G2 / G4 / G6 / 행 C로 G8 / G10 / G12 및 H2는 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 행 D.로 24 웰 플레이트에 96 웰 플레이트 6 우물의 각 세트의 전송 후, 96 웰 웰로 다음 24 웰 플레이트에 대응하는 웰로부터 매체로 세척하고, 세척 한 다음 24 웰 플레이트에 웰에 다시 전송된다.
- 역 위상차 현미경을 사용하여 세포를 확인하기 위해 각각의 열로부터도 1을 검토한다. A의 라이브와 죽은 세포의 혼합물이있을 것이다세포 파편의 상당량. 그들은 위상차 현미경 하에서 밝은 것 및 이동되기 때문에 생균 사균과 구별 될 수있다.
- 꽉 밀봉을 형성하는 뚜껑 깨끗하고 플라스틱 상자에 24 웰 플레이트를 놓습니다. 28 ° C 배양기에서 상자를 넣습니다.
- 시간 6-8 년 사이에 후, 각 웰에 2 배 선택적 항생제를 포함하는 10 % FCS와 SDM-79 1 ㎖를 추가합니다. 우리의 경험에서, 유전자의 N 말단에 태그 된 세포주 선택적 약물의 높은 농도에 내성이다. 따라서, N 말단에 태깅, 예를 들어 블라스트 사용하여 용액 및 C 말단에 태깅 / ㎖ 블라스트 10 μg의 최종 농도를 필요로 블라스트 / 20 μg의 최종 농도를 필요로한다.
참고 : 형질 전환 세포주가 형질 전환 후 볼 수 9-10일 될 것입니다. - 회 이상 신선한 미디어 약물 및 사전 분석 통로.도 2b는 전형적인 96- 웰 transfe의 결과를 나타낸다상기 N 말단에 96 서로 다른 단백질을 태그에 대한 ction. 건강한, 약제 내성 세포가 포함되어 있는지 확인 위상차 현미경으로 각 웰을 평가합니다. 건강 잘 위상 계약 현미경의 밝은 주로 (<95 %)이 높은 활성 셀이 포함되어 있습니다. 표면 형광 현미경 또는 웨스턴 블롯에 의해 후속 분석 단백질에 태그가되었는지를 결정하기 위해 요구된다.
Representative Results
이 대표 형질에서, 프라이머는 TagIt 펄 스크립트 (9)를 사용하여 설계 및 상업적으로 합성 하였다. 96 웰 PCR 수행되고 설명 (도 1a)로 확인되었다; 이 예에서, 95/96의 PCR (그림 1B)에 성공했습니다. 우리의 경험에 의하면, 성공적인 PCR 발생하지 않습니다 원래 프라이머 또는 재 합성 프라이머와 하나 실패 반응을 반복.
앰플 리콘은 전기 (도 2A)에 대해 96- 웰 전기 판에 전사 한 후 회수 및 선택 24- 웰 배양 플레이트로 옮겼다. 선택이 발생할 수 있도록 충분한 시간 후, 우물은 추가 분석을하기 전에 생존을 득점했다. 이 예에서, 96분의 88 웰 (92 %)는 15 일 선택 후옵니다.
도 2 : 96 웰 전기 및 선택 96- 웰 전기 천공 전기 천공 작은지면으로부터 세포를 전달하기위한 (A) 패턴.24- 웰 조직 배양 플레이트에 전자. (B) 개략적 인 24 웰 플레이트의 선택 15 일 후 일반적인 라이브 / 죽은 득점을 표시합니다. 녹색 회색은 죽은 세포로 잘이고, 성공적인 형질을 나타냅니다. 이 예에서, 우물 96분의 88 (92 %)을 성공적으로 형질 기생충이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
지난 5-10년에서 단백질 체학 및 transcriptomics 방법의 감도에 극적인 개선은 유전자와 그들의 제품의 수천에 중요한 데이터를 제공하고 있습니다. 그러나 도구는이 단백질의 기능이 속도를 유지하지 않은 해결합니다.
단백질에 태그를 지정하면 그 기능을 결정하기 위해 다양한 실험을 용이하게한다. 예를 들어, 단백질은 지역화 공동 지역화 연구를 용이하게하기 위해 서로 다른 색상의 다양한 형광 단백질에 융합 될 수있다. 태그는 APEX2 또는 miniSOG 11, 12 등의 전자 현미경을 위해 개발 된 태그 단백질의 미세 현지화 할 수 있습니다. 같은 TAP 태그 및 ProtC-TEV-의 동지 (PTP) 등의 생화학에 대한 태그, 7,13 바인딩 파트너의 식별 또는 생체 외 생화학 적 분석에서 단백질과 관련된 단지의 정화를 허용 태그.
protoc의 성공에 중요한 특정 단계상기 PCR 마스터 믹스 (1)에 DMSO 혼입 마스터 믹스 (2), 마스터 믹스 (2)의 상업용 폴리머의 사용과 cytomix 전기 천공 버퍼의 변형 예의 첨가하기 전에 PCR 마스터 믹스 한 동결 : 올이다. 우리의 경험에서, 양성의 웰과 유사한 비율을 달성하기 위해 N 말단 태깅 형질 감염 용으로 C 말단 태깅을 위해 형질 세포의 두 수를 사용하는 것이 필요하다. 따라서 설명한 모든 단계가 수행되어야한다.
이 기술은 곤충 procyclic 양식 트리파노소마를 형질 때 성공에만 가능성이있다. 혈류 형태는 또한 그들이 때문에 선택적 약물 관련이 농도 의존적 독성 선택시 사망 할 가능성이 낮은 형질 전환 효율 (14)이있다. 따라서, 우리의 이전 프로토콜은 혈류 형태의 트리 파노 솜 (9)의 태그의 현재 최고의 기술을 나타낸다. 또한 트랜스 것으로 보인다fection 효율은 특정 트리파노소마의 분리에 의존 달라질 수 있습니다. 다른 균주 추가 최적화를 요구할 수있다 -이 프로토콜은 927 SMOX procyclic 양식을 사용하여 최적화 하였다. 성공 확률을 증가시킬 조치 포함, PCR 증폭 물 양을 증가 형질 감염에 포함되는 세포의 수를 증가시킨다.
우리는 단백질의 수백 병렬로 태그 할 수있는 방법을 제시한다. 이는 기존의 대규모 데이터 세트를 보완하고 지역 사회에 귀중한 정보를 제공, 현지화 및 상호 작용에 대규모 연구를 촉진 할 것이다. 프라이머 템플릿 요청 및 플라스미드 템플릿 목록에 따라 사용할 수 있습니다에서 사용할 수 http://www.sdeanresearch.com/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
- Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
- Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
- Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
- Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
- Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
- Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
- Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197 (2015).
- Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037 (2012).
- Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
- Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
- Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).
