Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei er en protozo parasitten som forårsaker menneskelig afrikanske trypanosomasis og nagana hos storfe. T. brucei er en ideell organisme for analyse av protein funksjon på grunn av kombinasjonen av høy kvalitet genomet, mange proteomforskning og transcriptomics datasett og vel utviklede molekylære verktøy 1-3. Fremskritt innen proteomikk og sekvensering har resultert i store datasett som synliggjør potensielt interessante gener 4-6; imidlertid mange gener har minimal informasjon assosiert med dem i de eksisterende databaser. Det er derfor et behov for en high-throughput-metoden for å hjelpe til protein funksjonell karakterisering.
Ekspresjon av et merket protein som kan gi en flerhet av innsikt i en proteinets funksjon. For eksempel kan et protein merket med en fluorescerende protein eller epitop lokaliseres ved fluorescens mikroskopi, som gir informasjon om hvor protein kan utøve sin biologiske effekt. Alternativt, et protein merket med en TAP 7, HaloTag 8 eller His tag kan renses for biokjemiske analyser og identifisering av sine interaksjonspartnere.
Vi har nylig utviklet en robust merking metodikk for T. brucei 9. Dette pleide lang primer PCR for å generere DNA for transfeksjon og tillot merking av dusinvis av proteiner i parallell – en stor forbedring til eksisterende protokoller. Vi har nå forbedret skalerbarhet av denne protokollen i procyclic former av en størrelsesorden. Her presenterer vi vår metode hvor vi utføre PCR og transfeksjon inn i 96-brønners plater, med utvinning og seleksjon forekommer i 24-brønners plater. Som hundrevis av proteiner kan nå merkes parallelt denne metoden gir en kostnadseffektiv og gjennomførbare metoden for merking hele trypanosom genom.
Dramatiske forbedringer i følsomheten av proteomikk og transcriptomics metoder i de siste 5-10 årene har gitt verdifulle data på tusenvis av gener og deres produkter. Imidlertid verktøy for å ta opp funksjonen til disse proteinene ikke har holdt tritt.
Tagging et protein letter mange eksperimenter for å bestemme sin funksjon. For eksempel kan et protein bli fusjonert til en fluorescerende protein i en rekke forskjellige farger for å lette lokalisering og co-lokaliseringsstudier. Tags utviklet for elektronmikroskopi, som APEX2 eller miniSOG 11,12, la ultrastructural lokalisering av merket protein. Koder for biokjemi, som TAP-taggen, og ProtC-TEV-PROTA (PTP) tag 7,13 tillate rensing av komplekser forbundet med proteinet for å identifisere bindingspartnere eller in vitro biokjemiske analyser.
De konkrete tiltak som er avgjørende for å lykkes i protocol er: inkorporering av DMSO i PCR Master Mix 1, frysing av PCR Master Mix 1 før tilsetningen av Master Mix 2, bruk av den kommersielle polymerase i Master Mix 2 og modifikasjon av cytomix electroporation buffer. I vår erfaring, er det nødvendig å bruke doble antall celler for C-terminal tagging trans som for N-terminal tagging transfections for å oppnå en tilsvarende andel av positive brønner. Derfor skal alle trinnene utføres som beskrevet.
Denne teknikken er bare sannsynlig å være vellykket når trans insekt procyclic skjema trypanosom. Blodet former har en lavere transfeksjonseffektivitet 14, dessuten er de sannsynligvis til å dø i løpet av valget på grunn av tetthetsavhengig toksisitet som er relatert til den selektive stoffet. Derfor representerer vår forrige protokollen dagens beste teknologi for merking av blodet skjema trypanosomer 9. Det er også sannsynlig at transsjon effektivitet vil variere avhengig av den spesifikke trypanosom isolatet. Denne protokollen ble optimalisert ved hjelp av 927 SMOX procyclic former – andre stammer kan kreve ytterligere optimalisering. Tiltak som kan øke sannsynligheten for suksess omfatter: å øke mengden av PCR-amplikon, øke antall celler som inngår i transfeksjon.
Vi presenterer en metode der hundrevis av proteiner kan bli merket parallelt. Dette vil lette store studier på lokalisering og samhandling, supplerer eksisterende store datasett og gi uvurderlig informasjon til samfunnet. Primer maler er tilgjengelig på forespørsel og en liste over plasmider maler er tilgjengelig fra: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |